hematolojide akış sitometrisi

HEMATOLOJİDE AKIŞ SİTOMETRİSİ
Zafer Başlar
İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Anabilim Dalı, Hematoloji Bilim Dalı, İstanbul
Akış sitometrisi (flow cytometry) gerek hematolojide gerekse hematoloji dışında giderek artan
oranda çeşitli uygulama noktaları bulmuş olan ve
hızla gelişen bir alandır (Tablo 1). Sunumda, önce
akış sitometrisi ile ilgili bazı temel bilgiler verilecek
daha sonra da akış sitometrisinin hematolojideki
uygulama alanlarına değinilecektir.
Akış sitometrisi
Yöntem, süspansiyon halindeki bir örneğin
içerdiği partiküllerin bir ışık demeti içinden geçiriTablo 1. Akış sitometrisinin uygulama alanları
Hematolojideki uygulama alanları:
Hematolojik maliniteler
İmmün yetmezlik hastalıkları
Hematopoetik kök hücre sayımı
Paroksismal noktürnal hemoglobinüri
Otoantikorların gösterilmesi
Retikülosit analizleri
Trombosit analizleri
DNA ploidi ve hücre döngüsü analizi
Diğer uygulamalar
Hematoloji-dışı uygulama alanları:
Kan bankacılığı uygulamaları
Bileşenlerin lökosit içeriği
Eritrositlerle ilgili ölçümler
HIV enfeksiyonu
Gidişinin ve tedavi etkinliğinin izlenmesi
Feto-maternal kanama
Solid organ transplantasyonu
T hücreli cross-match
Postoperatif monitörizasyon
DNA ploidi ve hücre döngüsü analizi Diğer uygulamalar
Mikrobiyoloji
Genetik
Diğer alanlar
48
lirken bazı fiziksel özelliklerinin saptanması temeline dayanmaktadır. Bu partiküller, hücreler, hücre
altı yapılar ya da hücresel olmayan maddeler olabilmektedir. Aynı temel ortamı kullanarak, fiziksel
özelliklerin yanında partiküller ile ilişkili herhangi bir yapının varlığı ya da yokluğu bilgisi de
edinilebilmektedir.
Hücredeki belirli bir yapının (= antijenin) varlığı,
kendisine karşı üretilmiş olan proteine (= antikora)
eklenmiş olan, boya/enzim aracılığıyla immünhistokimya ya da floresan madde aracılığıyla immünfloresan mikroskopi / akış sitometrisi yöntemleri
ile immünolojik olarak gösterilebilmektedir.
Akış sitometrisinde, bu amaca yönelik olarak
(bakınız Şekil 1); hücre süspansiyonu, önce, varlığı
araştırılmak istenen hücre / antijen(ler) için uygun
antikor(lar)la bir araya getirilmekte (a);
daha
sonra, bu şekilde hazırlanmış olan süspansiyon bir
başka sıvı içine püskürtülerek hücrelerin tek sıra
halinde ilerlemeleri sağlanmaktadır (b).
Hücreler, bu geçiş yolu üzerine yönlendirilen
ışık demetinin karşısından teker teker geçerlerken
(c):
1- ışık demetinde, boyutları ile sitoplazmik
ve çekirdek yapılarına göre, ışığın geçirilmemesi ya
da yönünün saptırılması şeklinde bazı değişikliklere neden olmaktalar ve bu özellikler, uygulanan
ışığın yönüne göre belirli açılarda yerleştirilmiş
dedektörler tarafından kaydedilmektedir. 2- daha
önceden bir araya konuldukları floresan madde ile
işaretli antikorların hedefi olan antijen(ler)e sahipseler, ışık önce soğurulup daha sonra da başka
bir dalga boyunda ortama yayılmakta (= floresans)
ve oluşan yayılım da floresans dedektörlerince
algılanmaktadır.
XXXVIII. Ulusal Hematoloji Kongresi
Örnekten elde edilen fiziksel ve floresan özellikler özel bilgisayarlar tarafından işlendikten
sonra (d) çeşitli sayılar ve histogramlar şeklinde
sunulmaktadır(e). Bu veri toplamının analizi sonucunda, örneğin hücresel dağılımı ile hangi antijenlerin ilgili hücrelerde hangi oranlarda bulunduğu bilgileri edinilmiş olmaktadır (Şekil 2).
Sunum çerçevesinde verilen örnekler sonrasında akış sitometrisi ile ilgili bazı kavramlar ve terimlerin (daha) tanıdık / anlaşılır olacakları düşünülmektedir (Tablo 2). (Bu örneklere daha sonra THD
sitesinden ulaşılabilecektir.)
Akış sitometrisinin hematolojideki uygulama
alanları
Şekil 1. Akış sitometrisi yönteminin şematik olarak ana
hatları
Akış sitometrisinin hematolojideki uygulama
alanları arasında hematolojik maliniteler önemli
bir yer tutmaktadır. Hematolojik malinite şüphesi
olan hastalarda yapılabilecek oldukça geniş ölçüdeki incelemeler arasında yer alan, kan hüc-
Şekil 2. B-lenfoid dizeden ALL tanısı alan bir olgunun çeşitli grafikleri
31 Ekim-03 Kasım 2012, Antalya
49
Tablo 2. Akış sitometrisi ile ilişkili bazı terimler
FS / FSC - FORWARD SCATTER
SS / SSC - SIDE SCATTER
HİSTOGRAM, GRAFİK (DOT-PLOT, KONTUR, VD.)
FLORESANS, FLORESANS DEDEKTÖRÜ
FITC (FL1), PE (FL2), FL3, FL4, FL5, ……
KONTROL (İZOTİPİK/NEGATİF KONTROL)
LAZER (1, 2, 3, ..?), PMT VOLTAJ AYARI
EKSPRESYON
EKSPRESE ET(ME)MEK, KO-EKSPRESYON
ZAYIF/SOLUK, ORTA, KUVVETLİ/PARLAK
“GATE”, “GATING”
KOMPENSASYON
Tablo 3. Akış sitometrisi uygulamalarının hematolojik
malinitelerdeki yeri
A-Tanısal çalışmanın bir parçası olarak:
Patolojinin hücre kökeni hakkında karar vermek:
Lenfoid
Miyeloid
Karışık
Patolojinin reaktif / (mono)klonal olduğuna karar vermek:
Çevre kanında B-lenfoid artış
Kemik iliğinde T-lenfoid artış
Hafif zincirlerde oran değişikliği
T hücre yüzey reseptörlerinin dağılımı
Hücre dağılımlarında anormal oranlar
B- Sınıflama(ya katkı):
Ana yönelimi belirleme:
Lenfoid
Miyeloid
Karışık
Yönelimsiz
Alt gruplardaki yönü / yeri belirleme ve alt grupların ayrıştırılması:
B-lenfoid, T-lenfoid
Pre, pro , “common”, olgun
Kortikal, olgun
Diferansiyonsuz miyeloid, promiyelositik, monositik,
megakaryoblastik, eritroid
C- Prognoza yönelik bilgi sağlama:
Yalnız immünfenotipleme ile elde edilebilecek bilgiyi sağlama
Başka yollarla da elde edilebilecek bilgiyi sağlama
Diğer yollarla elde edilen bilgiyi tamamlama
D- İzlemede bir araç olarak:
Tedavi etkinliğinin saptanması:
Tam yanıt’a karar vermede yardım
Gidişin izlenmesi:
“Minimal residual disease”
lojik yöntem(ler) kullanarak elde etmek amacındaki
immünfenotipleme şeklinde olmaktadır (Tablo 3).
Hematolojik malinitelerin immünolojik ipuçları
Malin hücreler her ne kadar kontrol dışı bir
sürecin sonuçları olsalar da belli ölçülerde kaynaklandıkları hücrenin bulunduğu çoğalma-olgunlaşma basamağındaki bazı özellikleri gösterebilmektedirler. Bu normale benzeyen yapıların varlığı
sayesinde, ki buna dizeye bağlılık (sadakat) denilebilir, malinitenin hücre kökeni tanımlanabilmektedir. Malin süreç tamamen normal olmadığı için
de bazı yapılar normal karşılıklarından farklı olabilmektedir, ki bu da dizeye bağlı kalmama (ihanet) olarak tanımlanmaktadır ve maliniteyi tanımaya, kimi durumda da izini sürmeye yaramaktadır.
Sonuç olarak, malin hücrelerin sahip oldukları ve
Tablo 4. B dizesinden ALL’de EGIL sınıflaması
Alt tip
Tanım
İmmünfenotip
Tüm alt tipler
B-I
B-II
B-III
B-IV
Pro-B
Common
Pre-B
Olgun B
cCD22+
CD79a+
CD10CD10+
CD10+
CD10+/-
cIgMcIgMcIgM+
cIgM+
CD19+
sIg- TdT+
sIg- TdT+
sIg- TdT+/sIg+TdT-
Tablo 5. T dizesinden ALL’de EGIL sınıflaması
Alt tip
Tanım
Tüm alt
tipler
İmmünfenotip
cCD3+ CD7+
T-I
Pro-T
CD1a- CD2- CD3- CD5-
T-II
Pre-T
CD1a- CD2+ CD3- CD5+
T-III
Kortikal T
CD1a+ CD2+ CD3+/- CD5+
T-IVa
Olgun T (THR ab) CD1a- CD2+ CD3+ CD5+ gen. CD4+ / CD8+
T-IVb
Olgun T
(THR gd+)
CD1a- CD2+ CD3+ CD5+ gen. CD4- CD8-
Tablo 6. B-hücreli kronik lenfoproliferatif hastalıklarda
immünfenotipik profiller
B-hücreli kronik lösemiler :
relerinin sayısal ve morfolojik değerlendirilmesi;
tanı koydurabilecek özellikteki doku örneklerinin
(kemik iliği, lenf düğümü, vd.) morfolojik değerlendirilmesi; konvansiyonel sitogenetik, moleküler
genetik yöntemler gibi tanısal özellikte olanlar ile
biyokimyasal/ serolojik incelemeler ve görüntüleme çalışmaları gibi diğer incelemelerin yanında
akış sitometrisinin rolü hücrelerin yüzey ve sitoplazmik yapılarına göre tanıtıcı profillerini immüno-
50
KLL: CD19+ CD5+ CD10- CD11c+ CD22+ CD23+ CD25+ CD103- FMC7+ sIg soluk
PLL: CD19+ CD5+ CD10- CD11c+ CD22+ CD23- CD25- CD103- FMC7+ sIg parlak
HCL: CD19+ CD5- CD10- CD11c+ CD22+ CD23- CD25+ CD103+ FMC7+ sIg parlak
B-hücreli lenfomaların lösemik evreleri : MCL: CD19+ CD5+ CD10- CD11c+ CD22+ CD23- CD25- CD103- FMC7+ sIg parlak
FL:
CD19+ CD5- CD10+ CD11c- CD22+ CD23- CD25- CD103- FMC7+ sIg parlak
MZL: CD19+ CD5- CD10- CD11c+ CD22+ CD23- CD25+ CD103- FMC7+ sIg parlak
KLL, kronik lenfositik lösemi; PLL, prolenfositik lösemi; HCL, hairy-cell lösemi;
MCL, mantle-cell lenfoma; FL, foliküler lenfoma; MZL, marjinal zon lenfoması
XXXVIII. Ulusal Hematoloji Kongresi
olmadıkları antijenik yapılardan oluşan bir profil
elde edilebilmektedir.
Temel yönelim, miyeloid ya da lenfoid olarak
çoğu durumda net olarak belirlenebilmekte ve bazı
alt tipler, normal ontogenezdeki profillere benzer
şekilde sınıflanabilmektedir (Tablo 4, 5, 6 ve 7).
Buna karşılık, oranı farklı hasta toplamlarında
değişmekle birlikte, bir kısım olgularda, temel
yönelim (lenfoid/miyeloid) ile ilgili işaretler yanında
diğer bir yönelime ait işaret(ler) saptanabildiği gibi
(=aberran ekspresyon), bazı olgularda, birden çok
yönelime ait çok sayıda işaret varlığında ara kategoriler (bifenotipik, hibrid, karışık, indifferansiye,
vb.) olduğu da kabul edilmektedir (Tablo 8).
Tablo 7. T-hücreli kronik lenfoproliferatif hastalıklarda
immünfenotipik profiller
PLL:
CD2+ CD3+ CD5+ CD7+ CD4+ CD8- CD25+
SS:
CD2+ CD3+ CD5+ CD7+ CD4+ CD8- CD25-
ATLL:
CD2+ CD3+ CD5+ CD7+ CD4+ CD8- CD25+
T-LGLL:
CD2+ CD3+ CD5+ CD7+ CD4- CD8+ CD25-
PLL, prolenfositik lösemi; SS, Sezary sendromu; ATLL, erişkinin
T-hücreli lösemisi-lenfoması; T-LGLL, T-large granular lenfositli lösemi
Tablo 8. Bifenotipik akut lösemiler için skorlama
sistemi*
Puan
B-lenfoid
T-lenfoid
2
CD79a
(c)/CD3
MPO
Lizozim
1
0.5
Miyeloid
cCD22
THR-ab
cIgM
THR-gd
CD19
D2
CD117
CD20
CD5
CD13
CD10
CD8
CD33
CD10
CD65
TdT
TdT
CD14
CD24
CD7
CD15
CD1a
CD64
* İki ayrı dizeden > 2 puan alınması gereklidir
CD45
Akış sitometrisinin hematolojik malinitelerdeki
yeri açısından CD45 ön plana çıkmaktadır. Akış
sitometrisinin temel parametreleri olan forward
scatter (FS) ve side scatter (SS) özelliklerinin yanında yer alarak çalışma örneğinin hücresel dağılımı
konusunda önemli bir kazanım oluşturmaktadır.
31 Ekim-03 Kasım 2012, Antalya
Bilindiği üzere, çevresel kanın patolojik olmayan koşullardaki ana hücresel bileşenleri eritrositler, trombositler ve lökositler olmakta ve(nötrofil/
eozinofil/bazofil) granülositler ile monositler ve
lenfositler, lökosit alt gruplarını oluşturmaktadır.
CD45’in x ekseninde – SS’ın y ekseninde olduğu
grafiklere göre çevresel kandaki yerleşim aşağıdaki
gibi olmaktadır:
-Nötrofil granülositler, CD45’i
zayıf - orta
düzeyde eksprese ederler ; x eksenindeki yerleri
ortalardadır. Sitoplazmik içeriklerinden (=granüllerinden) dolayı yana saçılımları-side scatter (SS)
(monositler ile lenfositlere göre) çok belirgin olarak
daha fazladır; y eksenindeki yerleri ortadan en
yukarıya doğrudur.
-Eozinofil granülositler, CD45’i (nötrofil granülositlere göre) daha kuvvetli eksprese ederler; x
eksenindeki yerleri (nötrofil granülositlerden) daha
sağdadır. Sitoplazmik içerikleri (=granülleri) nötrofillerden daha çok yana saçılıma neden olduğundan y eksenindeki yerleri (ortalama olarak nötrofil
granülositlerden) biraz daha yukarıdadır.
-Bazofil granülositler, CD45’i (nötrofil granülositlere göre) daha kuvvetli eksprese ederler;
x
eksenindeki yerleri (nötrofil granülositlere göre)
daha sağdadır. Ancak, sitoplazmik granüllerinin
çoğu cihazda kullanılan lazer ışığını abzorbe etmesinden dolayı, yana saçılımları diğer granülositlere
göre çok az olup y ekseninde lenfositlerle monositler arası bir konumda yer alırlar.
-Monositler, CD45’i kuvvetli eksprese ederler ve minimal sitoplazmik granülleri dolayısıyla
yana saçılımları lenfositlere oranla biraz daha
belirgindir.
-Lenfositler, CD45’i kuvvetli eksprese ederler
ve agranüler sitoplazmik içerikleri dolayısıyla yana
saçılımları en azdır.
Öte yandan kemik iliği ise, hematopoetik üretimin nihai sonuçları olan olgun hücreleri içeren
çevresel kana oranla kök hücreler, progenitör
hücreler, granülositler ve öncüleri, monositler ve
öncüleri, lenfositler ve öncüleri, eritrositler ile
eritroblastlar, megakaryositler, plazma hücreleri,
makrofajlar ve dendritik hücreler gibi çok daha
fazla sayıda hücre çeşidi bulundurmaktadır. Bu
toplamın içinde hematopoetik olmayan stromal
bileşenlerin yanı sıra sinüzoidlerde bulunan çevresel kanın şekilli elemanları da yer almaktadır.
51
CD45’in x ekseninde – SS’ın y ekseninde olduğu grafiklere göre, normalde yalnızca kemik iliğinde bulunan hücre gruplarının yerleşim aşağıdaki
gibi olmaktadır:
-
Blastlar (kök hücreler, progenitör hücreler ve
öncü hücreler), CD45’i zayıf-orta düzeyde eksprese ederler ve sitoplazmik granüllerinin durumuna göre düşükten biraz daha yükseğe değişen yana saçılım gösterirler.
-
Plazma hücreleri, çoğunlukla CD45 negatiftirler
ve düşükten biraz daha yükseğe değişen yana
saçılım gösterirler.
-
Eritroblastlar, çoğunlukla CD45 negatiftirler
ve olgunlaşma evresine göre düşük-orta yana
saçılım gösterirler. Eritrositler (ve eritroblastların bir kısmı !) akış sitometrisi için yapılan
işlem sonucu parçalanırlar ve inceleme alanının dışında kalırlar.
CD45’in x ekseninde – SS’ın y ekseninde olduğu bir grafikte durum şematik olarak Şekil 3’te
örneklenmektedir.
52
Şekil 3. Kemik iliği bileşenlerin CD45-SS grafiğindeki
yerleşim bölgeleri
Sunumda bu bilgilerden sonra bazı akut ve
kronik miyelo- / lenfoproliferatif hastalıklarla ilgili örnekler gözden geçirilecektir. Daha sonra da
akış sitometrisinin hematolojideki diğer uygulama
alanlarına kısaca değinilecektir. (Bu örneklere
daha sonra THD sitesinden ulaşılabilecektir.)
XXXVIII. Ulusal Hematoloji Kongresi