240-243 Candida

Candida albicans İzolatlarında
Fosfolipaz Aktivitesinin Saptanması
Sevtap ARIKAN*, Banu SANCAK*, Gülşen HASÇELİK*, Ayfer GÜNALP*
* Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Klinik Mikrobiyoloji ve Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, ANKARA
ÖZET
Fosfolipaz enzimi, Candida albicans sufllar›na ba¤l› infeksiyonlar›n geliflmesinde önemli rol oynayan virulans faktörlerinden biridir. Bu çal›flmada, çeflitli klinik örneklerden (89 idrar, 77 a¤›z lezyonu sürüntüsü, 40 vajinal ak›nt›, 7 kan, 45 di¤er) izole edilen toplam 258 C. albicans izolat›n›n fosfolipaz aktivitesi, modifiye Price
yöntemi ile araflt›r›lm›flt›r. Çal›flmaya al›nan sufllar›n % 78.7’sinde fosfolipaz aktivitesi saptanm›flt›r. Klinik örneklere göre de¤erlendirme yap›ld›¤›nda, idrar, a¤›z, vajinal ak›nt› ve di¤er örneklerden izole edilen sufllarda
s›ras›yla, % 76.4, % 77.9, %82.5 ve %82.2 oranlar›nda ve 7 kan izolat›n›n 5’inde fosfolipaz aktivitesi oldu¤u belirlenmifltir. Yap›lan istatistiksel de¤erlendirme sonucunda de¤iflik klinik örneklerden izole edilen sufllar›n fosfolipaz aktivitesi aç›s›ndan farkl›l›k göstermedi¤i saptanm›flt›r. Bu sonuçlar, fosfolipaz enzim aktivitesinin klinik
C. albicans izolatlar›nda yüksek oranlarda saptanan bir virulans faktörü oldu¤unu göstermektedir.
Anahtar Kelimeler: Fosfolipaz, Candida albicans
SUMMARY
Detection of Phospholipase Activity in Candida albicans Isolates
Secretion of phospholipases is one of the major putative virulence factors of Candida albicans isolates.
The present study was designed to examine the phospholipase activity in 258 C. albicans strains isolated from
miscellaneous clinical sources (89 urine, 77 oral lesion swab, 40 vaginal secretion, 7 blood and 45 samples
other than noted). The activity of the enzyme was measured by modified Price method. Overall, phospholipase activity was detected in 78.7% of the isolates. The enzyme was positive in 76.4%, 77.9%, 82.5%, and
82.2% of the urine, oral swab, vaginal secretion and other isolates, respectively. Five of seven blood isolates
were also noted to produce phospholipase. There was no significant difference between the rates of phospholipase positivities in terms of the clinical source of the isolate. The results of the current study indicate
that, phospholipase enzyme activity is encountered in majority of the clinical C. albicans isolates.
Key Words: Phospholipase, Candida albicans
240
Flora 1998;3(4):240-243
Candida albicans İzolatlarında Fosfolipaz Aktivitesinin Saptanması
Birçok canlı türünde bulunan fosfolipaz enzimi,
hücre membranındaki fosfolipidlerin hidrolizinden
sorumludur. Fosfolipaz A ve B enzimlerinin etkisi sonucu ortaya çıkan lizofosfolipid, hücre membranında lizise yol açar[1].
Fosfolipaz aktivitesi, birçok mantar türünde gösterilmiş önemli bir patojenite faktörüdür. Candida
albicans izolatlarında hem maya hücresi hem de hif
üzerinde enzim aktivitesi saptanmıştır[1,2]. Bunun dışında daha düşük miktarlarda olmakla birlikte C. parapsilosis ve Saccharomyces cerevisiae suşlarının
da fosfolipaz aktivitesine sahip olduğu biyokimyasal
yöntemlerle gösterilmiştir[2]. Fosfolipaz A, fosfolipaz
B, fosfolipaz C, lizofosfolipaz ve lizofosfolipaztransaçilaz C. albicans izolatlarından salgılandığı
gösterilmiş ekstrasellüler fosfolipaz enzimleridir.
Bunlar içerisinde başlıcaları fosfolipaz B ve lizofosfolipaz-transaçilazdır[3-5].
Fosfolipaz enzimi konak hücreyi lizise uğratmakta veya hücrenin yüzey özelliklerini değiştirmektedir.
Ortaya çıkan bu değişikliklerin mantarın dokuya adhezyonuna ve penetrasyonuna yardımcı olduğu düşünülmektedir. Bu etkiler nedeniyle fosfolipaz enzimi
infeksiyonun patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır[3]. Fosfolipaz enziminin varlığı kadar miktarı da virulans açısından önem taşımaktadır[1,2].
Bu çalışma, çeşitli klinik örneklerden izole edilen
C. albicans suşlarında fosfolipaz aktivitesinin mikrobiyolojik yöntemlerle saptanması amacıyla planlanmıştır. Enzimin invazyon ve infeksiyonun patogenezi ile ilişkisi gözönüne alınarak, fosfolipaz aktivitesinin etken suşun izole edildiği klinik örneğe göre değişkenlik gösterme durumu araştırılmıştır.
MATERYAL VE METOD
İzolatlar
Çalışmaya idrar (n: 89), ağız lezyonu (n: 77), vajinal akıntı (n: 40), kan (n: 7) ve diğer örneklerden
(30 pü, 5 derin trakeal aspirasyon materyali, 3 safra, 3 parasentez sıvısı, 2 plevral sıvı, 1 intravasküler
kateter ve 1 özefagiyal sürüntü örneği olmak üzere
toplam 45) izole edilen toplam 258 klinik C. albicans suşu alınmıştır. Suşlar, Sabouraud dekstroz
agar (SDA) ve/veya koyun kanlı besiyerinde izole
edilmiştir. Germ tüp testi pozitif sonuç veren izolatlar C. albicans olarak tanımlanmıştır. Ayrıca mısır
unlu Tween 80 besiyerinde morfolojik görünüm ve
klamidospor oluşturma özellikleri de incelenmiştir[6].
Çalışmaya C. albicans ATCC 90028, C. albicans
ATCC 14053, C. albicans ATCC 64552 ve C. albicans ATCC 64550 referans suşları da dahil edilmiştir.
Flora 1998;3(4):240-243
Arıkan S, Sancak B, Hasçelik G, Günalp A.
Fosfolipaz Aktivitesinin Saptanması
Bu amaçla, yumurta sarısı ve sitrik asit difosfat
tamponu eklenmiş SDA besiyeri ("egg yolk agar",
pH: 4.2) kullanılmış, enzimin aktivitesi modifiye Price yöntemi ile saptanmıştır[3,7]. Test edilecek maya
izolatı SDA’da, 35-37°C’de, 18-24 saat süreyle inkübe edilmiş, bu kültürden serum fizyolojik solüsyonu içinde ve 0.5 Mc Farland standart solüsyonuna
eşdeğer bulanıklıkta süspansiyon hazırlanmıştır. Bu
süspansiyondan "egg yolk agar" besiyerine 0.01 mL
ekim yapılmış ve 37°C’de 4 gün süreyle inkübe edilmiştir. Her plakta 4 ayrı suşun fosfolipaz aktivitesi
test edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda koloni çapı ve koloni çapı ile koloni etrafındaki presipitasyon
zonunun oluşturduğu toplam çap ölçülmüştür. Suşun
fosfolipaz aktivitesi, koloni çapının toplam çapa oranı (Pz değeri) < 1 ise pozitif; 1 ise negatif olarak değerlendirilmiştir[7].
İstatistik
İstatistiksel değerlendirme ki-kare testi ile yapılmıştır.
BULGULAR
Test edilen C. albicans izolatlarının izole edildikleri klinik örneklere göre fosfolipaz sonuçları Tablo
1’de özetlenmiştir. Çalışmaya alınan izolatların %
78.7’sinde fosfolipaz aktivitesi saptanmıştır. Klinik
örneklere göre değerlendirme yapıldığında, fosfolipaz aktivitesinin benzer oranlarda olduğu görülmüştür. Ki-kare testi ile yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda değişik klinik örneklerden izole edilen suşların fosfolipaz aktivitesi açısından farklılık
göstermediği belirlenmiştir.
Fosfolipaz aktivitesi, C. albicans ATCC 90028,
C. albicans ATCC 14053 ve C. albicans ATCC
64552 suşlarında pozitif, C. albicans ATCC 64550
suşunda ise negatif olarak saptanmıştır.
Fosfolipaz aktivitesi pozitif bulunan izolatlarda Pz
değerlerinin 0.31 ve 0.94 arasında değiştiği belirlenmiş, bu değerlerin dağılımı Tablo 2’de özetlenmiştir.
Bu sonuçlar incelendiğinde, Pz değerlerinin en çok
0.41-0.50 aralığında saptandığı ve suşların yarısına
yakın bir kısmının (%47.3) 0.41-0.60 arasında değişen Pz değerleri olduğu görülmektedir.
TARTIŞMA
C. albicans, immün sistemi baskılanmış hastalarda görülen fırsatçı infeksiyonların önemli bir etkenidir. Adherens özelliği, germinasyon tüpü oluşumu ve
proteinaz, fosfolipaz, hyaluronidaz ve kondroitin sülfataz gibi enzim aktivitelerinin, bu mikroorganizma-
241
Candida albicans İzolatlarında Fosfolipaz Aktivitesinin Saptanması
Arıkan S, Sancak B, Hasçelik G, Günalp A.
Tablo 1. Test edilen C. albicans izolatlarında klinik örneklere göre fosfolipaz aktivitesi
Klinik örnek (n)
Fosfolipaz
n (%)
Pozitif
Negatif
• İdrar (89)
68 (76.4)
21 (23.6)
• Ağız lezyonu (77)
60 (77.9)
17 (22.1)
• Diğer* (45)
37 (82.2)
8 (17.8)
• Vajinal akıntı (40)
33 (82.5)
7 (17.5)
• Kan (7)
5 **
2 **
• Toplam (258)
203 (78.7)
55 (21.3)
* 30 pü, 5 derin trakeal aspirasyon materyali, 3 safra, 3 parasentez sıvısı, 2 plevral sıvı, 1 intravasküler kateter ve 1
özefagiyal sürüntü örneği
** Sayıların düşük olması nedeniyle yüzde hesaplanmamıştır.
Tablo 2. Fosfolipaz aktivitesi saptanan 203 suşun Pz değerlerinin dağılımı
Pz Değeri
n
%
0.30-0.40
22
10.8
0.41-0.50
59
29.1
0.51-0.60
37
18.2
0.61-0.70
31
15.3
0.71-0.80
23
11.3
0.81-0.90
14
6.9
0.91-0.99
17
8.4
203
100
nın infeksiyon oluşturmasına yol açan virulans faktörleri olduğu düşünülmektedir[8-10]. Bu faktörlerden
bir kısmı, sadece bazı C. albicans izolatlarında gösterilebilmektedir[3,11].
C. albicans izolatlarında fosfolipaz aktivitesi, biyokimyasal ve mikrobiyolojik yöntemlerle saptanabilmektedir[2,4,5,7,12]. Biyokimyasal yöntemlerin zaman alıcı olması nedeniyle, güvenilir sonuçlar veren
pratik bir yöntem olarak ilk kez Price tarafından
"plak yöntemi" öne sürülmüştür. Bu yöntemde, besiyerine fosfolipaz kaynağı olarak yumurta sarısı eklenmekte, plak üzerine ekilen mikroorganizmanın
fosfolipaz enzimi varsa, yağ asitleri ve kalsiyum
kompleksi, koloni çevresinde bir presipitasyon zonu
oluşturmaktadır[7]. Modifiye Price yönteminde, Price
tarafından önerilen 48 saatlik inkübasyon süresinin
yetersiz kaldığı saptanmış, bu süre 4 gün olarak değiştirilmiştir[13]. Modifiye Price yöntemi ile yapılan
çalışmalar bu yöntemin fosfolipaz aktivitesinin sap-
242
tanmasında güvenilir sonuçlar verdiğini göstermiştir.
Bu yöntem, özellikle fosfolipaz B aktivitesini saptamaktadır[3].
Yapılan çalışmalarda C. albicans izolatlarında
fosfolipaz aktivitesi, %30-94 arasında değişen oranlarda saptanmıştır[7,14]. Ener ve arkadaşlarının çalışmasında 92 klinik C. albicans izolatının %72.8’inde
enzim aktivitesi gösterilmiştir[15]. Sadece ağız örneklerinden izole edilen C. albicans suşlarının test edildiği çalışmalarda da saptanan pozitiflik yüzdeleri
farklılık göstermektedir. Samaranayake ve arkadaşlarının[13] çalışmasında 28 oral izolatın %79’u, Williamson ve arkadaşlarının[14] çalışmasında 100 oral
izolatın %94’ü, Ener ve arkadaşlarının[16] çalışmasında ise 28 oral izolatın %57.1’i fosfolipaz pozitif bulunmuştur. Bizim çalışmamızda tüm örneklerden izole edilen suşlarda %78.7 gibi yüksek bir oranda fosfolipaz aktivitesi saptanmıştır. Bu oran, daha önceki
çalışmalarda saptanan oranların çoğuna benzerlik
göstermekle birlikte, Price ve arkadaşlarının bildirdiği oranlardan dikkati çeker derecede yüksektir. Ancak Price ve arkadaşlarının idrar örneklerinde %30
gibi düşük bir oranda enzim aktivitesini göstermiş olmaları, bu çalışmada 48 saatlik inkübasyon süresinin
uygulanmış olmasına bağlanmaktadır[7,13].
Fosfolipaz aktivitesinin virulans ve invazyon açısından önemli olduğunun gösterilmesinden sonra,
değişik kaynaklardan izole edilen C. albicans suşlarında fosfolipaz aktivitesinin farklılık gösterip göstermeyeceği merak uyandırmıştır. Price ve arkadaşlarının çalışmasında, değişik klinik örneklerden izole
edilen suşlardaki fosfolipaz aktivite oranları arasında
anlamlı bir fark saptanamamıştır[7]. Ener ve arkadaşları ise idrar, balgam, vajinal akıntı, boğaz sürüntüsü
ve diğer örneklerdeki fosfolipaz aktivitesini araştır-
Flora 1998;3(4):240-243
Candida albicans İzolatlarında Fosfolipaz Aktivitesinin Saptanması
mış, diğer örneklere kıyasla balgam örneklerinde
yüksek (%100), boğaz sürüntüsü örneklerinde ise
düşük (%40) oranlar saptadıklarını bildirmişlerdir[15].
Bizim çalışmamızda idrar, ağız lezyonu, vajinal akıntı ve diğer örneklerde sırasıyla %76.4, %77.9,
%82.5 ve %82.2 oranlarında ve 7 kan kültürü örneğinin 5’inde enzim aktivitesi gösterilmiştir. Bu oranlar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır. İbrahim ve arkadaşlarının çalışmasında, 11
kan izolatı ile sağlıklı bireylerin ağız örneklerinden
izole edilmiş 11 izolat karşılaştırıldığında, kan izolatlarındaki fosfolipaz aktivitesinin kommensal ağız izolatlarına göre anlamlı ölçüde yüksek olduğu saptanmıştır[3]. Bu veriler C. albicans’a bağlı gelişen hematojen infeksiyonlarda fosfolipaz aktivitesinin önemli
bir virulans faktörü olduğu görüşünü desteklemektedir. Bizim çalışmamızda, kan izolatı sayısı kısıtlı olmakla birlikte (n: 7) bu izolatların çoğunluğunda (n:
5) sonuç pozitif bulunmuştur. Kan izolatlarındaki fosfolipaz aktivite oranının diğer örneklerden izole edilen suşlara ve kommensal izolatlara göre farklılık
gösterip göstermediğinin saptanabilmesi için, daha
kapsamlı çalışmalara gereksinim vardır.
Fosfolipaz aktivitesi saptanan izolatlardaki Pz değerlerinin 0.31-0.94 aralığında ve en sık 0.41-0.50
değerleri arasında olduğu ve suşların %47.3’ünde
0.41-0.60 arasında değiştiği görülmektedir. Bu sonuçlar, daha önce bildirilen değerlere benzerlik göstermektedir[14].
Sonuç olarak, fosfolipaz enzimi klinik C. albicans izolatlarında yüksek oranlarda saptanan önemli bir patojenite faktörüdür. Bu konuda yapılacak ileri çalışmalar, enzimin infeksiyonun patogenezi ile ilgili diğer yönlerini açıklığa kavuşturacaktır.
KAYNAKLAR
1. Lane T, Garcia JR. Phospholipase production in morphological variants of Candida albicans. Mycoses 1991;
34:217-20.
2. Barrett Bee K, Hayes Y, Wilson RG, Ryley JF. Comparison of phospholipase activity, cellular adherence and
pathogenicity of yeasts. J Gen Microbiol 1985;131:
1217-21.
3. Ibrahim AS, Mirbod F, Filler SG, et al. Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of Candida albicans. Infect Immun 1995;63:1993-8.
Flora 1998;3(4):240-243
Arıkan S, Sancak B, Hasçelik G, Günalp A.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Takahaski M, Banno Y, Nozawa Y. Secreted Candida albicans phospholipases: purification and characterization
of two forms of lysophospholipase-transacylase. J Med
Vet Mycol 1991;29:193-204.
Goyal S, Khuller GK. Phospholipase composition and
subcellular distribution in yeast and mycelial forms of
Candida albicans. J Med Vet Mycol 1992;30:355-62.
Larone DH. Medically Important Fungi. A Guide to Identification. 3rd ed, Washington, DC: ASM Press, 1995.
Price MF, Wilkinson ID, Gentry LO. Plate method for detection of phospholipase activity in Candida albicans.
Sabouraudia 1982;20:7-14.
Cutler JE. Putative virulence factors of Candida albicans. Annu Rev Microbiol 1991;45:187-218.
Hostetter MK. Adhesins and ligands involved in the interaction of Candida spp. with epithelial and endothelial
surfaces. Clin Microbiol Rev 1994;7:29-42.
Odds FC. Pathogenesis of Candida infections. J Am
Acad Dermatol 1994;31:2-5.
Shimizu MT, Almeida NQ, Fantinato V, Unterkircher
CS. Studies on hyaluronidase, chondroitin sulphatase,
proteinase and phospholipase secreted by Candida species. Mycoses 1996;39:161-7.
Banno Y, Yamada T, Nozawa Y. Secreted phospholipases of the dimorphic fungus, Candida albicans; separation of three enzymes and some biological properties.
Sabouraudia: J Med Vet Mycol 1985;23:47-54.
Samaranayake IP, Raeside JM, McFarlane TW. Factors
affecting the phospholipase activity of Candida species
in vitro. Sabouraudia: J Med Vet Mycol 1984;22:201-7.
Willamson MI, Samaranayake LP, McFarlane TW.
Phospholipase activity as a criterion for biotyping Candida albicans. J Med Vet Mycol 1986;24:415-7.
Ener B, Babacan F, Bozok Johansson C. In vitro detection of phospholipase activity in Candida species. Med
Bull Istanbul 1991;24:55-60.
Ener B, Eskitürk A, Aydın O, Delialioğlu N, Bekiroğlu N,
Quint W. Çeşitli Candida albicans izolatlarını suş düzeyinde tiplendirmede virulans faktörlerinin rolü. Mikrobiyol Bült 1996;30:391-8.
Yazışma Adresi:
Dr. Banu SANCAK
Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi
Klinik Mikrobiyoloji ve Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
06100 ANKARA
Makalenin Geliş Tarihi: 25.03.1998
Kabul Tarihi: 28.10.1998
243