MBKY 5 - Erzurum Teknik Üniversitesi
advertisement
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I DNA POLİMORFİZMİNİN MOLEKÜLER MARKER’LARLA ANALİZİ DNA Polimorfizminin tanımlanması • Bireyler arasındaki genetik belirlenmesini sağlar. • Polimorfizm saptanmasında yöntemlerin farklılıkların moleküler – MORFOLOJİK – BİYOKİMASAL vb. yöntemlere üstünlükleri: KESİN sonuç (DNA düzeyinde) vermeleridir. Bireyler arası genetik tiplendirme • • • • • • Hastalık tanısı Kişiye özgü ilaç geliştirilmesi Adli tanı Tarımsal önemli genlerin saptanması Saf ırkların belirlenmesi Mikroorganizma tiplerinin belirlenmesi-­‐ biyoteknolojik ırkların saptanması DNA Parmakizi Analizinde PCR kullanımı • Dizisi bilinmeyen DNA parçaları çoğaltılır. • Miktarı 1ng olan DNA örnekler kullanılabilir, izole edilebilir. ÖR: Kan lekesi, saç teli, sperm kalıntısı vb. • Kısa (10 nükl.) primerler insan genomunda dağınık olarak birkaç bin bölgeye bağlanır. (2000 nükl. uzaklıkta bağlanan primerler arası çoğaltılır) • Minör dizi farklılıkları nedeniyle çoğalan bölgeler arası farklar oluşur. • Elektroforezdeki bant motifleri (konum ve sayı) DNA PARMAKİZİ olarak adlandırılır. SONUÇ: Populasyondaki bireylerin birbirlerinden ayırt edilmesi DNA Parmakizi ADLİ TIPTAKİ UYGULAMALAR Minisatellitler (VNTR –Variable Number of Tandem Repeats) çoğaltılır. • Tekrar sayıları kişiden kişiye değişir. • Ard arda tekrarlanırlar. • İnsan genomunda dağınık olarak bulunurlar. • Bir lokustaki tekrar sayıları değişiktir. • Her bir varyasyon bir VNTR allelidir polimorfizm • 2-­‐100 nükleotid uzunlukta olabilirler. ÖR: GGGAAGGGAAGGGAAGGGAA l l l l DNA parmakizi ile akrabalık tayini M=marker 1,5=ebeveyn 2, 3, 4, 6 = çocuklar RAPD Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA’lar (Random Amplified Polymophic DNA’s) • Dizisi rasgele olan primerlerle yapılan PCR sonucu genomda rasgele bölgelerin çoğaltılması RAPD PRİMERLER • %GC oranı %50’den fazla • Tek çeşit X gen çoğaltımında iki çeşit • Kısa (yaklaşık 10 bazlık) primerler ANNEALING SICAKLIĞI • 35 gibi düşük dereceler X gen çoğaltımında daha yüksek ÜRÜNLER • Çeşitli tipte (RAPD’LER=RAPD Markerları) X gen çoğaltımında genin kendisi (tek çeşit) RAPD RAPD markerları • Genom haritalama • Genetik tiplendirme amaçları için kullanılır. RAPD Bakteriden insana kadar her çeşit organizmada 10 nükleotidlik rasgele primerlerin bağlanacağı birbirine ters konumlu yeterince bölge vardır. Birkaç bin baz çifti mesafe ile bağlanan primerler arasında amplifikasyon olur. Bireylerin nükleotid dizilimleri farklı olduğu için oluşan bantlarda faklı olur. Bantlar jel elektroforezi ile analiz edilir (RFLP markerlarındaki radyoaktiviteye gereksinim yoktur). RAPD Markerları Rasgele primerler kullanarak iki genomun RAPD analizi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • Tek baz değişikliklerini veya farklı büyüklükte minisatellitleri belirleyebilen bir tekniktir. • Restriksiyon endonükleazlarla DNA'nın farklı büyüklüklerdeki fragmanlara ayrılarak incelenmesine dayanmaktadır. • Genom haritalama, varyasyon (genotipleme, kalıtsal hastalıklar, adli tıp ve babalık testleri gibi) ve polimorfizm çalışmalarında yaygın şekilde kullanılmaktadır. Restriksiyon Analiz Yöntemi • Farklı mikroorganizmalar arasındaki genetiksel ilişkinin ortaya konulmasında da yaygın olarak kullanılan bir restriksiyon analiz yöntemidir. • Bu teknikte tüm genom sınırlayıcı enzimler kullanılarak kesilmekte veya restriksiyon fragmentleri oluşturulmaktadır. Restriksiyon Analiz Yöntemi • Bu teknik düşük sıklıklı restriksiyon fragmenti analizi (LFRFA; Low Frequency Restriction Fragment Analysis) olarak da adlandırılmaktadır. • Kesme reaksiyonlar sonucunda oluşan restriksiyon parçalar çok büyük olduğundan, normal agaroz jel elektroforezi yerine değişken alan jel elektroforezi (PFGE; Pulse Fields Jel Elektroforezi) ile de ayrıştırılmaktadır. • Oluşan restriksiyon parçalarının sayısal analiz sonuçları karşılaştırılarak tür içindeki benzer veya farklı gruplar ortaya çıkarılmaktadır. RFLP RFLP Restriksiyon Parça Uzunluğu Polimorfizmi Restriction Fragment Lenght Polymorphism RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN DNA markerları kullanımı ile oluşturulan Restriksiyon Endonükleazları (RE’ler) • Çift iplikli DNA’da özgün ve kısa dizileri tanıyıp, kesen enzimler • Mikroorganizma kökenli – yabancı DNA’nın yok edilmesi için üretilirler • Keşfedilmeleri başlatmıştır. Rekombinant DNA çalışmalarını • Genellikle üretildikleri mikroorganizmanın isimleri ile anılırlar. ÖR: E.coli’nin ürettiği EcoR I • Tanıma bölgesinde kesim yapan Tip II enzimleri 4-­‐6bç uzunluğundaki bölgeleri tanır. Eco RI Kesimi GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG G CTTA A AATT C G C CTTA A AATT C G RE’lerin Kesim Frekansları Ör: 6 bç’lik tanıma bölgesine sahip bir RE Her 46=4096 bç’de bir kesim yapabilir • Pratikte fragment boyutları 1-­‐20.000 • Aynı boyuttaki dizileri tanıyan RE’lerin kesim frekansları farklı olabilir. Ör: Dra I (TTTAAA) domates DNA’sını, Sst I (GAGCTC)’den daha sık keser. • RE kesimlerinden sonra çok sayıda DNA fragmenti oluşur (binlerce). • Aranılan DNA jel elektroforezi ve Southern hibridizasyonla bulunur. RAPD/RFLP RAPD RFLP •Primerin tanıma bölgelerinin toplam uzunluğu 18-­‐20 nükleotid •5 bant oluşumu ile sonuçlanan bir PCR’de 90-­‐100 nükleotid taranır. •Bantların analizi için radyoaktivite (Southern Blotting) gerekmez. •Uygulama basit •Gerekli DNA miktarı az • RE’lerin tanıdığı kesim bölgeleri toplam uzunluğu 12 nükleotid • 5 bant oluşumu ile sonuçlanan bir kesimde 60 nükleotid taranır. • Bantların analizi için radyoaktivite (Southern Blotting) gerekebilir. • Uygulama zor • Gerekli DNA miktarı daha fazla RAPD, polimorfizm taranması için daha kullanışlıdır. Moleküler Markerların Tıpta Kullanımı • • • • • • • Polimorfizm saptanması Hastalık tanısı Mutasyon taraması Hastalığa eğilim belirlenmesi Doğum öncesi tanı Adli tıp Kişiye özgü ilaç tasarımı Moleküler markerlarla tanısı yapılabilen hastalıklar • Kanser türleri (meme kanseri BRCA 1 ve 2 genleri, p53 tümor supressor geni) • Tromboz (faktör V, protrombin mutasyonları) • β-­‐tallasemi • Orak hücre anemisi (β-­‐globin geni) • Homosistein metabolizması bozuklukları • Alzheimer • Koroner kalp hastalıkları (apolipoprotein E ve B genleri, hepatik lipaz) • Miyokard infarktüs • İnme (β-­‐fibrinojen) • Kistik fibroz (CFTR) RFLP markeri ile hastalık tanısı Orak hücre anemisinin moleküler tanısı Hemoglobin β zinciri S/S: mutant homozigot, kısa ömür A/S: taşıyıcı, ekstrem koşullarda hastalık AFLP • • • • (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi ) AFLP tekniği, genomik DNA'nın restriksiyon enzimleriyle kesilerek oluşan fragmentlerin amplifikasyonuna dayanır. Genomik DNA’nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan DNA parçalarının selektif amplifikasyonu (çoğaltılması) esasına dayanan bir genotipleme metodudur. Bu yöntem “selective restriction fragment amplification” olarak da bilinir. Tek nükleotid polimorfizm (SNP) ve insersiyon-­‐ delesyon mutasyonlarının tespitinde yaygın olarak kullanılır. Nasıl Çalışır? AFLP YÖNTEMİ • PCR’a dayalı bu yöntem 1995 yılında Vos ve arkadaşları tarafından bulunmuştur. • AFLP tekniği, RFLP tekniğinin kesme-­‐tanıma kısımlarının PCR ile çoğaltılmasına dayalı bir DNA marker tekniğidir. • Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı veya polimorfizmi anlamına gelen AFLP tekniği, RAPD tekniği ile RFLP tekniğinin birleştirilmiş formu olup RAPD tekniğinin dezavantajlarını gidermek üzere geliştirilmiştir. AFLP YÖNTEMİ • AFLP toplam DNA’nın kesildikten sonra PCR reaksiyonuyla çoğalması esasına dayanan güçlü bir tekniktir. • Bu teknikte genomik DNA genellikle önce birisi altı, diğeri dört bazı tanıyan iki kesim enzimi (RE) tarafından kesilir. Akabinde çoğaltma iki aşamada gerçekleştirilir. AFLP Tekniği • İlk aşamada her iki uçtan DNA kesim enzimlerinin tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotidden kesim yapılır. • Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikinci ve üçüncü nükleotidler için kesim yapılır. AFLP Tekniği • Bütün başlatıcılar sentetik uçların nükleotid dizilişini de taşıdığı için üretim oldukça spesifik şartlarda yapılmış olur. • Amplifikasyon fragmentleri bir baz uzunluğu farklarını dahi ayırt edebilecek kadar hassas olduğu için poliakrilamid jel (PAGE) üzerinde yürütülür. • Böylece farklı genotiplerde farklılık gösteren parçacıklar tespit edilebilir. AFLP ANALİZİNİN BASAMAKLARI • Genomik DNA’nın RE ile kesilmesi • Çift sarmallı Adaptör Sekanslarının RE ile kesilmiş olduğu kısımlara eklenmesi • Ön-­‐Seçici PCR • Seçici PCR AFLP PCR’ın Avantajı • Tek bir reaksiyonda 30-­‐150 bölge tanımlanabilmesi, • Sonuçların tekrarlanabilir olması en önemli avantajını oluşturmaktadır. AFLP PCR’ın Dezavantajı • Pahalı • Laboratuvar ekipmanına gereksinim duyulması • Dominant markör olması AFLP YÖNTEMİ • • • • • RFLP ve PCR kullanımı tekniklerini içerir, AFLP kullanılan mevcut RFLP den daha hızlı, Daha az emek ister, Daha fazla bilgi sağlar, RAPD’e oranla da tekrarlanabilirliği fazladır. AFLP PCR’ın KULLANIM ALANLARI • • • • • • • Genom haritaları Bireysel genotipin tanımlanması DNA polimorfizminin saptanması Kantitatif özellik lokuslarının saptanması Ebeveyn ve akrabalık tespiti Hastalık ve genetik defektlerin teşhisi Adli tıp RFLP-­‐RAPD-­‐AFLP Karşılaştırması GENOMİK FİNGERPRİNT Mikroorganizmalarda; ERIC, REP, BOX, (GTG)5, ITS rep-­‐PCR • Son yıllarda yapılan araştırmalar sonucunda, prokaryot ve ökaryotların büyük bölümünün genomlarında birçok tekrarlı repetitive DNA dizisinin bulunduğu tespit edilmiştir. • Hücre bölünmesinde fonksiyonu olduğu düşünülen bu diziler, zirai, çevresel, endüstriyel, kliniksel bakterilerin tür, alt tür, biovar ve hatta patovar seviyesinde tanısı, sınıflandırılması ve karakterizasyonunda kullanılmakta olup, rep-­‐PCR genomik parmak izi analiz yöntemi olarak adlandırılmaktadır. rep-­‐PCR • Bu diziler tekrarlı ekstrajenik polindromik (REP), enterobakteriyel tekrarlı intergenik korunmuş diziler (ERIC) ve ilk kez gram pozitif bir bakteri olan, Streptococcus pneumonia’da tanılanan box A, box B, box C alt ünitelerinden oluşan BOX elementlerinden ibaret olup, bu yöntemlerin tümüne birden rep-­‐PCR adı verilmektedir. rep-­‐PCR yöntemi • ekosistemdeki çeşitliliği, • suşlar arasındaki filogenetik ilişkiyi ortaya koymada ve • genetiksel olarak birbiriyle yakın olan mikroorganizmaları ayırmada oldukça etkin ve basit bir yöntemdir. rep-­‐PCR İçin Gerekli Koşullar • • • • • Çoklu araştırma laboratuvarları, Donanımlı ve tecrübeli personeller, Doğru ekipmanlar, Kalıp DNA miktarı, DNA izolasyonu öncesinde kültür koşulları oluşturmak. rep-­‐PCR • İlk defa otomatik rep-­‐PCR kullanımı ; Neisseria meningitidis enfeksiyonu salgını ile ilgili izolatlar kullanılarak klinik laboratuvar uygulamalarında gerçekleştirilmiştir. • N. meningitidis salgını ile ilgili suşları diğer izolatlardan ayrımı gerçekleştirilmiştir. rep-­‐PCR 1. ERIC PCR • Enterobakteriyel tekrarlayan intergenik konsensüs (ERIC) dizileri, özellikle enterik bakteriler ve vibrio genomlarında bir çok örnek oluşturur. • Örn; Shigella, E. coli türlerinin genom dizilerindeki dağılımı ERIC PCR • ERIC elementleri için birbirlerine ters yönde iki primer tasarlanmıştır. • 124-­‐127 bç’lik ERIC primerleri kullanılır. • Bu diziler nükleotid açısından iyi derecede korunan bölgeler olmalarına karşın, kromozomlardaki yerleri türden türe farklılık göstermektedir • Çoğaltılan bu tekrarlı diziler; türler arasındaki akrabalık derecelerine göre istatistiksel olarak değerlendirilir. ERIC PCR 2. REP-­‐PCR • Tekrarlayan ekstragenik palindromic (REP) elemanlarının ilk keşfi E. coli ve Salmonella genomlarında keşfedilmiştir. • E. coli veya Salmonella bakteriyel genomunun yaklaşık % 1'ini oluşturur. • REP primerleri ortalama uzunluğu 33 bp ila 40 bp olan genom başına 500 ila 1000 kopyası bulunan amplikonlardır. • PCR ile çoğaltılan DNA amplikonları Elektroforez ile ayrıştırıldıktan sonra oluşan genomik parmak izi, mikroorganizma alt türlerinin ayırımında ve mikrobiyal ekoloji araştırmalarında kullanılmaktadır. Şekil 4.10. Bakterilerin REP PCR Elektroforez Sonuçları. RK: Referans Kültür (Pss), NK: Negatif Kontrol, Marker: Bant Uzunluğu 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000 Rep-­‐ERIC Karşılaştırılması 3. BOX-­‐PCR • İlk olarak Streptococcus pneumonia’da ilk olarak tanılanan box A, box B, box C alt ünitelerinden oluşan BOX elementleri bulunmuştur. • BOX elementleri için tek yönlü primer (154 bç’lik) tasarlanmıştır. • BOX-­‐PCR parmak izi analiz yöntemi ile DNA üzerinde primerin bağlanacağı bölgeler PCR ile çoğaltılıp, elektroforez ile ayrıştırılarak oluşan genomik fingerprint türlerin ayırımında kullanılır. Oluşan bant profillerine göre akraba türler tespit edilebilir. Aynı zamanda epidemiyolojik çalışmalarda bir tamamlayıcı olarak kullanılabilir. Örn; Aeromonas BOX PCR BOX PCR 4. (GTG)5 • Bir çeşit mikrosatellit primeridir. • Poli-­‐trinükleotid (GTG)5 bölgesi bakteri genomlarında mevcut korunmuş bir bölgedir. • Beş adet GTG tekrarlı diziden oluşur. • Özellikle Enterik bakteri türlerinde (GTG)5 ayrımsal olarak kullanılır. (GTG)5 DNA (GTG) 5 primerleri ile amplifiye edilir. Elde edilen amplifikasyon ürünleri elektroforezde yürütülür ve karşılaştırılır. (GTG)5 • Bazı yeni çalışmalarda (GTG)5 primerleri aracılığıyla Acinetobacter baumanii, Salmonella enterica , Campylobacter concisus, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Streptococcus mutans ve insan kan kültürlerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin tespiti, parmak izi analizi ve moleküler tiplemesi gerçekleştirilmiştir. 5. ITS-­‐PCR (Internal Transcribed Spacer) • ITS ilk olarak Staphylococcus aureus suşunda keşfedilmiştir. • Ayrıca stafilokokların belirlenmesi için de kullanılır. • ITS bölgesi pek çok canlıda bulunan en yaygın tekrarlı DNA bölgeleridir. • ITS bölgeleri ITS primerleri ile çoğaltılıp, jel elektroforezi ile görüntülenir. ITS-­‐PCR • Tipik olarak tür sınıflandırmasında ve türler içinde sistematik olarak sınıflandırmada kullanılmıştır (örneğin coğrafi ırkları tespit etmek). • ITS rRNA genlerindeki tek zincir polimorfizimlerinin analizi ve sekans dizilimlerindeki varyasyonlarını tespit ederek inceler. ITS Primerleri ITS Yöntemi ITS Yöntemi
