MBKY 5 - Erzurum Teknik Üniversitesi

advertisement
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I
DNA POLİMORFİZMİNİN MOLEKÜLER MARKER’LARLA ANALİZİ
DNA Polimorfizminin tanımlanması
• Bireyler arasındaki genetik
belirlenmesini sağlar.
• Polimorfizm
saptanmasında
yöntemlerin
farklılıkların
moleküler
– MORFOLOJİK
– BİYOKİMASAL vb. yöntemlere üstünlükleri:
KESİN sonuç (DNA düzeyinde) vermeleridir.
Bireyler arası genetik tiplendirme
•
•
•
•
•
•
Hastalık tanısı
Kişiye özgü ilaç geliştirilmesi
Adli tanı
Tarımsal önemli genlerin saptanması
Saf ırkların belirlenmesi
Mikroorganizma tiplerinin belirlenmesi-­‐
biyoteknolojik ırkların saptanması
DNA Parmakizi Analizinde PCR kullanımı
• Dizisi bilinmeyen DNA parçaları çoğaltılır.
• Miktarı 1ng olan DNA örnekler kullanılabilir, izole edilebilir.
ÖR: Kan lekesi, saç teli, sperm kalıntısı vb.
• Kısa (10 nükl.) primerler insan genomunda dağınık olarak
birkaç bin bölgeye bağlanır.
(2000 nükl. uzaklıkta bağlanan primerler arası çoğaltılır)
• Minör dizi farklılıkları nedeniyle çoğalan bölgeler arası farklar
oluşur.
• Elektroforezdeki bant motifleri (konum ve sayı)
DNA PARMAKİZİ olarak adlandırılır.
SONUÇ: Populasyondaki bireylerin birbirlerinden ayırt
edilmesi
DNA Parmakizi
ADLİ TIPTAKİ UYGULAMALAR
Minisatellitler (VNTR –Variable Number of Tandem
Repeats) çoğaltılır.
• Tekrar sayıları kişiden kişiye değişir.
• Ard arda tekrarlanırlar.
• İnsan genomunda dağınık olarak bulunurlar.
• Bir lokustaki tekrar sayıları değişiktir.
• Her bir varyasyon bir VNTR allelidir
polimorfizm
• 2-­‐100 nükleotid uzunlukta olabilirler.
ÖR: GGGAAGGGAAGGGAAGGGAA
l l l
l
DNA parmakizi ile akrabalık tayini
M=marker
1,5=ebeveyn
2, 3, 4, 6 = çocuklar
RAPD
Rasgele Çoğaltılmış
Polimorfik
DNA’lar
(Random Amplified Polymophic DNA’s)
• Dizisi rasgele olan primerlerle yapılan PCR
sonucu
genomda
rasgele
bölgelerin
çoğaltılması
RAPD
PRİMERLER
• %GC oranı %50’den fazla
• Tek çeşit X gen çoğaltımında iki çeşit
• Kısa (yaklaşık 10 bazlık) primerler
ANNEALING SICAKLIĞI
• 35 gibi düşük dereceler X gen çoğaltımında daha
yüksek
ÜRÜNLER
• Çeşitli tipte (RAPD’LER=RAPD Markerları) X gen
çoğaltımında genin kendisi (tek çeşit)
RAPD
RAPD markerları
• Genom haritalama
• Genetik tiplendirme
amaçları için kullanılır.
RAPD
Bakteriden insana kadar her çeşit organizmada 10 nükleotidlik rasgele primerlerin bağlanacağı birbirine ters konumlu yeterince bölge vardır.
Birkaç bin baz çifti mesafe ile bağlanan primerler arasında amplifikasyon olur.
Bireylerin nükleotid dizilimleri farklı olduğu için oluşan bantlarda faklı olur.
Bantlar jel elektroforezi ile analiz edilir (RFLP markerlarındaki radyoaktiviteye gereksinim yoktur).
RAPD Markerları
Rasgele primerler kullanarak iki genomun RAPD analizi
RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
• Tek baz değişikliklerini veya farklı büyüklükte
minisatellitleri belirleyebilen bir tekniktir.
• Restriksiyon endonükleazlarla DNA'nın farklı
büyüklüklerdeki
fragmanlara
ayrılarak
incelenmesine dayanmaktadır.
• Genom haritalama, varyasyon (genotipleme,
kalıtsal hastalıklar, adli tıp ve babalık testleri
gibi) ve polimorfizm çalışmalarında yaygın
şekilde kullanılmaktadır.
Restriksiyon Analiz Yöntemi
• Farklı mikroorganizmalar arasındaki genetiksel
ilişkinin ortaya konulmasında da yaygın olarak
kullanılan bir restriksiyon analiz yöntemidir.
• Bu teknikte tüm genom sınırlayıcı enzimler
kullanılarak kesilmekte veya restriksiyon
fragmentleri oluşturulmaktadır.
Restriksiyon Analiz Yöntemi
• Bu teknik düşük sıklıklı restriksiyon fragmenti
analizi (LFRFA; Low Frequency Restriction
Fragment Analysis) olarak da adlandırılmaktadır.
• Kesme
reaksiyonlar
sonucunda
oluşan
restriksiyon parçalar çok büyük olduğundan,
normal agaroz jel elektroforezi yerine değişken
alan jel elektroforezi (PFGE; Pulse Fields Jel
Elektroforezi) ile de ayrıştırılmaktadır.
• Oluşan restriksiyon parçalarının sayısal analiz
sonuçları karşılaştırılarak tür içindeki benzer veya
farklı gruplar ortaya çıkarılmaktadır.
RFLP
RFLP
Restriksiyon Parça Uzunluğu Polimorfizmi
Restriction Fragment Lenght Polymorphism
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN
DNA markerları
kullanımı ile oluşturulan
Restriksiyon Endonükleazları (RE’ler) • Çift iplikli DNA’da özgün ve kısa dizileri tanıyıp, kesen enzimler
• Mikroorganizma kökenli – yabancı DNA’nın yok edilmesi için üretilirler
• Keşfedilmeleri
başlatmıştır.
Rekombinant
DNA
çalışmalarını
• Genellikle üretildikleri mikroorganizmanın isimleri ile
anılırlar.
ÖR: E.coli’nin ürettiği EcoR I
• Tanıma bölgesinde kesim yapan Tip II enzimleri 4-­‐6bç
uzunluğundaki bölgeleri tanır.
Eco RI Kesimi
GAATTC
GAATTC
CTTAAG
CTTAAG
G
CTTA
A
AATT
C
G
C
CTTA
A
AATT
C
G
RE’lerin Kesim Frekansları
Ör: 6 bç’lik tanıma bölgesine sahip bir RE
Her 46=4096 bç’de bir kesim yapabilir
• Pratikte fragment boyutları 1-­‐20.000
• Aynı boyuttaki dizileri tanıyan RE’lerin kesim
frekansları farklı olabilir.
Ör: Dra I (TTTAAA) domates DNA’sını, Sst I (GAGCTC)’den
daha sık keser.
• RE kesimlerinden sonra çok sayıda DNA fragmenti
oluşur (binlerce).
• Aranılan DNA jel elektroforezi ve Southern
hibridizasyonla bulunur.
RAPD/RFLP
RAPD
RFLP
•Primerin tanıma bölgelerinin
toplam
uzunluğu
18-­‐20
nükleotid
•5 bant oluşumu ile sonuçlanan
bir PCR’de 90-­‐100 nükleotid
taranır.
•Bantların
analizi
için
radyoaktivite
(Southern
Blotting) gerekmez.
•Uygulama basit
•Gerekli DNA miktarı az
• RE’lerin tanıdığı kesim bölgeleri
toplam uzunluğu 12 nükleotid
• 5 bant oluşumu ile sonuçlanan
bir kesimde 60 nükleotid taranır.
• Bantların
analizi
için
radyoaktivite
(Southern
Blotting) gerekebilir.
• Uygulama zor
• Gerekli DNA miktarı daha fazla
RAPD, polimorfizm taranması için daha kullanışlıdır.
Moleküler Markerların Tıpta Kullanımı
•
•
•
•
•
•
•
Polimorfizm saptanması
Hastalık tanısı
Mutasyon taraması
Hastalığa eğilim belirlenmesi
Doğum öncesi tanı
Adli tıp
Kişiye özgü ilaç tasarımı
Moleküler markerlarla tanısı yapılabilen hastalıklar
• Kanser türleri (meme kanseri BRCA 1 ve 2 genleri, p53 tümor supressor geni) • Tromboz (faktör V, protrombin mutasyonları)
• β-­‐tallasemi • Orak hücre anemisi (β-­‐globin geni)
• Homosistein metabolizması bozuklukları
• Alzheimer
• Koroner kalp hastalıkları (apolipoprotein E ve B genleri, hepatik lipaz)
• Miyokard infarktüs
• İnme (β-­‐fibrinojen)
• Kistik fibroz (CFTR)
RFLP markeri ile hastalık tanısı
Orak hücre anemisinin moleküler tanısı
Hemoglobin β zinciri
S/S: mutant homozigot, kısa ömür
A/S: taşıyıcı, ekstrem koşullarda hastalık
AFLP •
•
•
•
(Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi )
AFLP tekniği, genomik DNA'nın restriksiyon
enzimleriyle
kesilerek
oluşan
fragmentlerin
amplifikasyonuna dayanır.
Genomik DNA’nın restriksiyon enzimi ile kesimi
sonucu
oluşan
DNA
parçalarının
selektif
amplifikasyonu (çoğaltılması) esasına dayanan bir
genotipleme metodudur.
Bu yöntem “selective restriction fragment
amplification” olarak da bilinir.
Tek nükleotid polimorfizm (SNP) ve insersiyon-­‐
delesyon mutasyonlarının tespitinde yaygın olarak
kullanılır.
Nasıl Çalışır?
AFLP YÖNTEMİ
• PCR’a dayalı bu yöntem 1995 yılında Vos ve
arkadaşları tarafından bulunmuştur.
• AFLP tekniği, RFLP tekniğinin kesme-­‐tanıma
kısımlarının PCR ile çoğaltılmasına dayalı bir
DNA marker tekniğidir.
• Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı veya
polimorfizmi anlamına gelen AFLP tekniği,
RAPD tekniği ile RFLP tekniğinin birleştirilmiş
formu olup RAPD tekniğinin dezavantajlarını
gidermek üzere geliştirilmiştir.
AFLP YÖNTEMİ
• AFLP toplam DNA’nın kesildikten sonra PCR
reaksiyonuyla çoğalması esasına dayanan
güçlü bir tekniktir.
• Bu teknikte genomik DNA genellikle önce birisi
altı, diğeri dört bazı tanıyan iki kesim enzimi
(RE) tarafından kesilir. Akabinde çoğaltma iki
aşamada gerçekleştirilir.
AFLP Tekniği
• İlk aşamada her iki uçtan DNA kesim
enzimlerinin tanıdığı diziden sonraki ilk
nükleotidden kesim yapılır.
• Asıl üretimde ön üretimde elde edilen
parçaların kullanımıyla kesim enzimi tanıma
yerinden sonraki ikinci ve üçüncü nükleotidler
için kesim yapılır.
AFLP Tekniği
• Bütün başlatıcılar sentetik uçların nükleotid
dizilişini de taşıdığı için üretim oldukça spesifik
şartlarda yapılmış olur.
• Amplifikasyon fragmentleri bir baz uzunluğu
farklarını dahi ayırt edebilecek kadar hassas
olduğu için poliakrilamid jel (PAGE) üzerinde
yürütülür.
• Böylece farklı genotiplerde farklılık gösteren
parçacıklar tespit edilebilir.
AFLP ANALİZİNİN BASAMAKLARI
• Genomik DNA’nın RE ile kesilmesi
• Çift sarmallı Adaptör Sekanslarının RE ile kesilmiş olduğu kısımlara eklenmesi
• Ön-­‐Seçici PCR
• Seçici PCR
AFLP PCR’ın Avantajı
• Tek
bir
reaksiyonda
30-­‐150
bölge
tanımlanabilmesi,
• Sonuçların tekrarlanabilir olması en önemli
avantajını oluşturmaktadır.
AFLP PCR’ın Dezavantajı
• Pahalı
• Laboratuvar ekipmanına gereksinim duyulması
• Dominant markör olması
AFLP YÖNTEMİ
•
•
•
•
•
RFLP ve PCR kullanımı tekniklerini içerir,
AFLP kullanılan mevcut RFLP den daha hızlı,
Daha az emek ister,
Daha fazla bilgi sağlar,
RAPD’e oranla da tekrarlanabilirliği fazladır.
AFLP PCR’ın KULLANIM ALANLARI
•
•
•
•
•
•
•
Genom haritaları
Bireysel genotipin tanımlanması
DNA polimorfizminin saptanması
Kantitatif özellik lokuslarının saptanması
Ebeveyn ve akrabalık tespiti
Hastalık ve genetik defektlerin teşhisi
Adli tıp
RFLP-­‐RAPD-­‐AFLP Karşılaştırması
GENOMİK FİNGERPRİNT
Mikroorganizmalarda;
ERIC, REP, BOX, (GTG)5, ITS
rep-­‐PCR
• Son yıllarda yapılan araştırmalar sonucunda,
prokaryot ve ökaryotların büyük bölümünün
genomlarında birçok tekrarlı repetitive DNA
dizisinin bulunduğu tespit edilmiştir.
• Hücre bölünmesinde fonksiyonu olduğu düşünülen
bu diziler, zirai, çevresel, endüstriyel, kliniksel
bakterilerin tür, alt tür, biovar ve hatta patovar
seviyesinde
tanısı,
sınıflandırılması
ve
karakterizasyonunda kullanılmakta olup, rep-­‐PCR
genomik parmak izi analiz yöntemi olarak
adlandırılmaktadır.
rep-­‐PCR
• Bu diziler tekrarlı ekstrajenik polindromik
(REP), enterobakteriyel tekrarlı intergenik
korunmuş diziler (ERIC) ve ilk kez gram pozitif
bir bakteri olan, Streptococcus pneumonia’da
tanılanan box A, box B, box C alt ünitelerinden
oluşan BOX elementlerinden ibaret olup, bu
yöntemlerin tümüne birden rep-­‐PCR adı
verilmektedir.
rep-­‐PCR yöntemi
• ekosistemdeki çeşitliliği,
• suşlar arasındaki filogenetik ilişkiyi ortaya
koymada ve
• genetiksel olarak birbiriyle yakın olan
mikroorganizmaları ayırmada oldukça etkin ve
basit bir yöntemdir.
rep-­‐PCR İçin Gerekli Koşullar
•
•
•
•
•
Çoklu araştırma laboratuvarları,
Donanımlı ve tecrübeli personeller,
Doğru ekipmanlar,
Kalıp DNA miktarı,
DNA izolasyonu öncesinde kültür koşulları oluşturmak.
rep-­‐PCR
• İlk
defa
otomatik
rep-­‐PCR
kullanımı
;
Neisseria meningitidis enfeksiyonu salgını ile ilgili
izolatlar
kullanılarak
klinik
laboratuvar
uygulamalarında gerçekleştirilmiştir.
• N. meningitidis salgını ile ilgili suşları diğer
izolatlardan ayrımı gerçekleştirilmiştir.
rep-­‐PCR
1. ERIC PCR
• Enterobakteriyel
tekrarlayan
intergenik
konsensüs (ERIC) dizileri, özellikle enterik
bakteriler ve vibrio genomlarında bir çok
örnek oluşturur.
• Örn; Shigella, E. coli türlerinin genom
dizilerindeki dağılımı
ERIC PCR
• ERIC elementleri için birbirlerine ters yönde iki
primer tasarlanmıştır.
• 124-­‐127 bç’lik ERIC primerleri kullanılır.
• Bu diziler nükleotid açısından iyi derecede
korunan
bölgeler
olmalarına
karşın,
kromozomlardaki yerleri türden türe farklılık
göstermektedir
• Çoğaltılan bu tekrarlı diziler; türler arasındaki
akrabalık derecelerine göre istatistiksel olarak
değerlendirilir.
ERIC PCR
2. REP-­‐PCR
• Tekrarlayan
ekstragenik
palindromic
(REP)
elemanlarının ilk keşfi E. coli ve Salmonella
genomlarında keşfedilmiştir.
• E. coli veya Salmonella bakteriyel genomunun yaklaşık
% 1'ini oluşturur.
• REP primerleri ortalama uzunluğu 33 bp ila 40 bp olan
genom başına 500 ila 1000 kopyası bulunan
amplikonlardır.
• PCR ile çoğaltılan DNA amplikonları Elektroforez ile
ayrıştırıldıktan sonra oluşan genomik parmak izi,
mikroorganizma alt türlerinin ayırımında ve mikrobiyal
ekoloji araştırmalarında kullanılmaktadır.
Şekil 4.10. Bakterilerin REP PCR Elektroforez Sonuçları.
RK: Referans Kültür (Pss), NK: Negatif Kontrol, Marker: Bant Uzunluğu 100, 200, 300,
400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000
Rep-­‐ERIC Karşılaştırılması
3. BOX-­‐PCR
• İlk olarak Streptococcus pneumonia’da ilk olarak
tanılanan box A, box B, box C alt ünitelerinden oluşan
BOX elementleri bulunmuştur.
• BOX elementleri için tek yönlü primer (154 bç’lik)
tasarlanmıştır.
• BOX-­‐PCR parmak izi analiz yöntemi ile DNA üzerinde
primerin bağlanacağı bölgeler PCR ile çoğaltılıp,
elektroforez ile ayrıştırılarak oluşan genomik
fingerprint türlerin ayırımında kullanılır. Oluşan bant
profillerine göre akraba türler tespit edilebilir. Aynı
zamanda epidemiyolojik çalışmalarda bir tamamlayıcı
olarak kullanılabilir. Örn; Aeromonas
BOX PCR
BOX PCR
4. (GTG)5
• Bir çeşit mikrosatellit primeridir.
• Poli-­‐trinükleotid (GTG)5 bölgesi bakteri
genomlarında mevcut korunmuş bir bölgedir.
• Beş adet GTG tekrarlı diziden oluşur.
• Özellikle Enterik bakteri türlerinde (GTG)5
ayrımsal olarak kullanılır.
(GTG)5
DNA (GTG) 5
primerleri ile amplifiye edilir.
Elde edilen amplifikasyon ürünleri elektroforezde yürütülür ve karşılaştırılır.
(GTG)5
• Bazı yeni çalışmalarda (GTG)5 primerleri
aracılığıyla
Acinetobacter
baumanii,
Salmonella enterica , Campylobacter concisus,
Enterococcus faecium, Escherichia coli,
Streptococcus mutans
ve insan kan
kültürlerinden izole edilen laktik asit
bakterilerinin tespiti, parmak izi analizi ve
moleküler tiplemesi gerçekleştirilmiştir.
5. ITS-­‐PCR
(Internal Transcribed Spacer)
• ITS ilk olarak Staphylococcus aureus suşunda
keşfedilmiştir.
• Ayrıca stafilokokların belirlenmesi için de
kullanılır.
• ITS bölgesi pek çok canlıda bulunan en yaygın
tekrarlı DNA bölgeleridir.
• ITS bölgeleri ITS primerleri ile çoğaltılıp, jel
elektroforezi ile görüntülenir.
ITS-­‐PCR
• Tipik olarak tür sınıflandırmasında ve türler
içinde sistematik olarak sınıflandırmada
kullanılmıştır (örneğin coğrafi ırkları tespit
etmek).
• ITS
rRNA
genlerindeki
tek
zincir
polimorfizimlerinin
analizi
ve
sekans
dizilimlerindeki varyasyonlarını tespit ederek
inceler.
ITS Primerleri
ITS Yöntemi
ITS Yöntemi
Download
Random flashcards
canlılar ve enrji ilişkileri

2 Cards oauth2_google_d3979ca9-59f8-451c-9cf7-08c5056d5753

Merhaba

2 Cards oauth2_google_861773e1-0890-4522-834a-6a5babb58e76

Create flashcards