MİKROORGANİZMALARIN ASEPTİK TRANSFERİ VE ÇİZGİ EKİM

Ġ.Ü. MÜHENDĠSLĠK FAKÜLTESĠ
ÇEVRE MÜHENDĠSLĠĞĠ BÖLÜMÜ
Çevre Mikrobiyolojisi Dersi Laboratuvar Uygulama – 4
MĠKROORGANĠZMALARIN ASEPTĠK TRANSFERĠ VE ÇĠZGĠ EKĠM
1. ASEPTĠK TEKNĠKLER
Mikroorganizmalar, teneffüs ettiğimiz havada, yiyecek ve içeceklerde, etrafımızda,
üzerimizde ve hatta içimizde mevcut olduklarından, çalışmalar esnasında, istenmeyen
organizmaların kültürümüze karışması için aseptik tekniklerin uygulanması gerekir. Saf
kültürlerimizin saf olarak kalması ve kendimizi herhangi bir enfeksiyondan korumamız için
aşırı derecede dikkatli olmak zorundayız. İstenmeyen mikroorganizmaların çalışma
ortamlarına bulaşmaları genellikle elimizle veya steril olmayan herhangi bir objenin
besiyerine veya tüplerin içerisine dokundurulmasıyla olur. Aynı zamanda bakteriler hava
içerisinde mevcut olduklarından, hava akımıyla da malzemelerin içerisine girebilirler.
İstenmeyen mikroorganizmaları çalışma ortamından uzak tutmak için uygulanması
zorunlu metotlar aseptik teknikler olarak adlandırılırlar. Aseptik teknikler kültürümüzü
istenmeyen
mikroorganizmalardan
korumanın
yanında,
zararlı
mikroorganizmaların
laboratuvara yayılmasını da önler. Böylece, hem bizim hem de başkalarının tehlikeli
olabilecek enfeksiyonlardan korunması sağlanır. Eğer aseptik teknikler kurallarına göre
uygulanırsa, büyük tehlikelere yol açabilecek pek çok kaza da önlenmiş olur.
Bakterilerle nasıl çalışılacağı doğru bir şekilde öğrenilip uygulanılırsa, kültürlerde
sadece arzu edilen mikroorganizmaların büyümesi sağlanmış olur. Sadece arzu edilen
organizmayı ihtiva eden bir kültür saf kültür olarak adlandırılır.
Bu laboratuvar çalışmanızda saf kültür transferini nasıl yapabileceğinizi öğreneceksiniz.
Dolayısıyla kendinizi, saf kültürünüzü, laboratuvarınızı ve aynı yerde çalışan diğer
arkadaşlarınızı herhangi bir bakteri kontaminasyonundan korumuş olacaksanız.
7
2.ÇĠZGĠ EKĠM
Çizgi ekim, birbiriyle karışmış organizmalardan saf kültür elde edebilmek için steril
agar besiyerleri (ör: TSA, BHI, NA gibi) ihtiva eden steril petri kaplarına öze kullanılarak
yapılan inokülasyondur. Bu, herhangi bir ortamdaki mikroorganizmaların izolasyonu ve
karakterizasyonu için ilk yapılan işlemdir. Karışık mikroorganizmaları ihtiva eden sıvı veya
katı kültürlerden itina ile özel bir şekilde petri kaplarına ekim yapılır. Bunun neticesinde tek
bir organizma mekanik olarak besiyeri üzerine ekilmiş olur. İnkübasyon neticesinde ekimi
yapılmış her bakteriden bir koloni gelişir. Eğer, bir koloni sadece bir tek bakterinin
çoğalmasından oluşmuş ise üretilen bu hücre topluluğu saf kültür veya klon olarak bilinir.
DENEYLER
Deney 1 - Mikroorganizmaların aseptik transferi
Materyaller
EMB agar
LSB
İnokülasyon özesi
Bek alev, tüplük
Gece kültürleri Escherichia coli
Metot:
1- Mikroorganizmayı bir tüpten diğer tüpe transfer etmek için, kültür ihtiva eden ve
kültürü inoküle edeceğiniz tüpleri teker teker sol eliniz ile tutunuz. Bileğinizi oynatarak
tüplerin 45˚de olmasını sağlayınız.
2- İnokülasyon özesini sağ elinizle bir kalem gibi tutunuz ve tel kısmı kırmızı
oluncaya kadar alevde bekletiniz. (şekil 1)
3- Sol elinizdeki tüpün kapağını sağ elinizle açınız. Bunu sağ elinizin özeyi tutmayan
parmakları ile yapınız. Kapağın açık kısımlarına parmağınızı dokunmayınız.(şekil 2)
4- Kapaksız olan bu tüpün ağzını alevin üzerinden birkaç defa geçerek ısıtınız. Tüpleri
yaklaşık 45˚lik bir açıda tutarak bu işlemi yapınız.
5- İnokülasyon özesini saf kültüre dokundurup geri çekiniz (şekil 3). Bu esnada öze
üzerine bulaşmış olan inokülümü (az miktarda bakteri) diğer tüpte bulunan slant besiyeri
üzerine zig zag yaparak inoküle ediniz.
6- Tüplerin ağızlarını alev üzerinden birkaç defa geçirerek tekrar ısıtınız ve kapaklarını
kapatınız. İnokülasyondan sonra özeyi alevde kızarıncaya kadar tekrar ısıtınız (şekil 1).
8
7- İnoküle ettiğiniz kültürlerin üzerlerine yazmayı unutmayınız. Yazma işlemini cam
üzerine yapınız, kapaklara kesinlikle yazmayınız ve tüpleri muhafazalığına yerleştiriniz.
8- Kültürlerinizi eğer özel bir sıcaklık ve süre belirtilmemiş ise her zaman 37˚C‟de 24
saat bekletmeniz (inkübe) en uygundur.
9- Bu süre sonunda kültürleri 4˚C‟de muhafaza ediniz.
Not: Tecrübe kazanmak amacıyla sıvı, petri (çizgi ekim tekniğini okuyarak) kültür transferi
tekniklerini de yukarıda izah edildiği şekilde tekrarlayınız.
Şekil 1
Şekil 2
Şekil 3
Deney 2- Çizgi ekim
Materyaller
EMB plakları
İnokülasyon özesi, bek alevi
Karışık kültür
Metot:
1- İnokülasyon özesini kızarıncaya kadar ısıtıp, soğutunuz ve kültürden bir öze dolusu
transfer ediniz.
2- EMB ihtiva eden petrinin bir kenarını hafifçe kaldırıp, çizgiler çizerek inokülasyon
yapınız.(şekil 5a)
3- İnokülasyon özenizi tekrar alevde kızarıncaya kadar ısıtınız ve soğuduktan sonra,
birkaç defa çizgiler çizerek seyreltme yapınız. (şekil 5b)
4- İnokülasyon özenizi tekrar alevde kızarıncaya kadar ısıtınız ve soğuduktan sonra,
diğer bölümlerden doğru birkaç defa çizgiler çizerek tekrar seyreltme yapınız. (şekil 5c, 5d)
Not: Bölgeden bölgeye geçişlerde çizgilerin üst üste gelmemesine özen gösteriniz.
9
6- Çizgi ekimi bittikten sonra, petri kabınızı kapak alta gelecek şekilde 37˚C‟de 24
saat inkübe ediniz.
Not: Böylece, İnkübasyon esnasında oluşacak buhar damlacıkları besiyeri üzerine ekilmiş
olan bakterilerin bir yerden bir yere sürüklenmesine engel olduğu için, izole edilmiş koloniler
düzgün bir çizgi üzerinde oluşmuş olur. Eğer çizgi üzerinde değil de rastgele koloniler
oluşmuş ise bu kontaminasyon olduğunu gösterir.
Şekil 4. Çizgi ekimde kolonilerin düzgün çizgilerde oluşmaları
Şekil 5. Çizgi Ekim esasları
10
UYGULAMA - 4
1. Şekilde gösterilen malzemeleri tanımlayınız. Yaptığınız ekimdeki ayrıntıları yazınız.
2. İnkubasyon sonrasında oluşabilecek koloni tipleri nelerdir? Sizin besiyerinizde üreyen
kolonileri tanımlayınız.
11