MBKY II-9 Western blotting

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II
(“WESTERN BLOTTING”
(WESTERN EMDİRİMİ)
ve
İMMÜNODETEKSİYON
Western blotting:
Akrilamit jeldeki protein bantlarının daha kararlı ve sabit bir ortama (örneğin, nitroselüloz kağıda) aktarılması. Western blotting
• Böylece jelde yürütülmesi mümkün olmayan ya da güç
olan analitik teknikler uygulanabilir. Örneğin;; işaretli DNA
veya RNA problar ile işaretleme, antikorlarla saptama,
özel boyama yöntemleri uygulama, otoradyografi
yöntemlerini uygulama gibi.
• Belirteçler membran yüzeyindeki proteinlerle daha kolay
etkileşir. Böylece jelin içinde gömülü durumdayken
saptanamayan, ancak membrana aktarıldıktan sonra
yüzeyde toplanan çok az miktardaki proteinler bile
kolaylıkla belirlenebilir.
• İşlemler daha az belirteçle daha kısa sürede
gerçekleştirilir.
• Membran jele göre daha dayanıklı olduğundan uzun
süre saklanabilir.
Yöntem genel olarak iki aşamadan
oluşur:
• Birinci aşamada jel üzerindeki proteinler
boyama yapılmaksızın membrana aktarılır.
• 2. aşamada hedeflenen proteine ÖZGÜ bir
belirteçle(örneğin, spesifik bir antikorla)
işlemle saptama yapılır.
Aktarımda çeşitli tipte membranlar kullanılır (ayrıntı için bkz. Tablo 7-­1)
Örneğin:
Nitroselüloz,
Polivinilidin diflorür (PVDF),
Modifiye edilmiş naylon,
Karboksimetilselüloz (CM)
Uygulama temelde iki yöntemle yapılır:
• Pasif (kapiler) emdirim
• Elektro-­emdirim (electroblotting)
PASİF EMDİRİM
• Membranla jel tam üstüste getirilerek filtre kağıtları arasında paketlenir. ELEKTRO-­EMDİRİM
• Daha hızlı ve etkin olan bu yöntem iki farklı şekilde uygulanabilir.
• Tank aktarım sistemi (tank transfer veya wet blotting),
• Yarı-­kuru emdirim
(semi-­dry blotting)
TANK AKTARIM SİSTEMİ
Tank
sisteminde;;
aktarım
jel-­membran
paketi
aktarım tamponu ile
dolu tanka dikey olarak
yerleştirilir.
Akım geçirilerek işlem
tamamlanır.
Yarı-­kuru sistemde
elektrotlarla temas
halindeki tamponla
ıslatılmış
filtre
kağıtları
arasına
yerleştirilmiş
jel-­
membran
paketi
yatay durumda iken
akım geçirilir.
İMMÜNODETEKSİYON
Hedeflenen protein immünolojik etkileşimle saptanacaksa:
• Bu işlemden önce membrana aktarılmış
proteinlerin
bulunduğu
yerler
dışındaki
boşlukların kapatılması gerekir. (“BLOCKING”)
Çünkü hedeflenen proteine (antijene) özgü
antikor da bir proteindir ve işlem sırasında
antijeni
yerine
membrandaki
boşluklara
bağlanabilir.
• Bu amaçla en çok BSA, yağsız süt tozu, jelatin
ve deterjanlar kullanılır. Membrana ve saptama
yöntemine uygun kapatma ajanları için bkz.
Tablo 7.12)
Saptamaya hazır hale getirilmiş membran:
• Önce hedeflenen proteine
özgü
birincil
antikor
(örneğin, IgG) ile işleme
sokulur.
• Daha sonra enzim (örneğin,
alkalin fosfataz (AP) veya
yabanturpu
peroksidazı
(HRP) bağlı veya radyoaktif
işaretli ikincil antikorla
(anti-­IgG) işleme sokulur.
• Saptamanın
son
aşamasında antijen-­antikor
etkileşimienzim bağlı antikor
kullanılmışsa enzimatik bir
dönüşüm
aracılığıyla,
radyoaktif
etiket
kullanılmışsa
ootoradyografik
yöntemle
belirlenir.
Enzim deneylerine örnekler:
5-­Bromo-­4-­kloro-­3-­indolil fosfat + nitroblue tetrazolium (NBT)oks
AP
5-­Bromo-­4-­kloro-­3-­indol + Pi + NBTred
4-­Kloro-­1-­naftolred + H2O2
HRP
4-­Kloro-­1-­naftoloks + H2O + 1/2O2
Son yıllarda geliştirilmiş saptama yöntemleri duyarlılığı ~1000 kat artırmıştır.
İkincil antikorlar substratları fotoğraf filmi üzerinde ışık sinyali
(kemiluminesans) oluşturacak ürünlere dönüştüren enzimlerle işaretlenir.
Ör., HRP bağlı ikincil antikor kemiluminesans substrat luminol ile reaksiyona
sokulur.
Alternatif Saptama Yöntemleri
• I125 ile işaretlenmiş ikincil antikorlar, otoradyografi ile,
• Fluoresanlı izotiyosiyanatla işaretlenmiş ikincil antikorlar, fluoresanın UV ışık altında gözlenmesiyle,
• Altınla kaplanmış ikincil antikorlarmembran üzerinde oluşan kırmızı rengin doğrudan gözlenmesiyle,
• Biotin (yumurta proteini avidin ile çok sıkı bağ oluşturabilen küçük bir vitamin) ile etiketlenmiş ikincil antikorlar, enzim bağlı avidinin belirlenmesiyle,
• İkincil antikor yerine kullanılan I125 ile işaretlenmiş protein A (S. aureus’tan izole edilen ve IgG’lere özgün şekilde bağlanan bir protein), otoradyografi ile saptanabilir.
• Radyoaktif işaretli DNA, özellikle DNA bağlayan proteinlerin saptanmasında kullanılır.
Glikoproteinlerin saptanması
Membrana aktarılmış glikoproteinlerin
saptanması
• Glikoproteinlerin karbohidrat kalıntılarına seçinimli
şekilde bağlanan lektinlerden (bitkisel veya
bakteriyel kaynaklı proteinler) yararlanılır.
• Örneğin, bitkisel bir lektin olan konkanavalin A
(Con A) mannoz kalıntılarına özgül şekilde
bağlanır. Con A HRP ile bağlı durumdadır. İşlem
sonunda HRP substratı eklenir. HRP bağlı Con
A’nın bulunduğu yerlerde renkli ürün oluşumu
gözlenir.
LEKTİN “ARRAY”
Farklı şeker kalıntılarına özgü lektinlerin yanyana dizilmesinden oluşan çip örnekle bir dizi işleme sokulur, örnekte hangi glikoproteinlerin bulunduğu anlaşılır.