Bitki Moleküler Biyolojisi

Bitki Moleküler Biyolojisi
Prof. Dr. Nermin Gözükırmızı
• Bitki Moleküler Biyolojisi moleküler tekniklere
dayalı bir bilim dalıdır.
– Dizileme, PCR, cDNA, transkriptomik, proteomik,
transformasyon, “high-resolution” yüksek ölçekli
haritalama, mutasyon analizi
• Gen izolasyonu ve Tanımlanması
Benzeri yöntemlerden yararlanır.
Bitki Moleküler Biyolojisinde ilgi alanları
• Biyokimya: protein analizi, yapı işlev ilişkileri
• Gelişim: bitki gelişimini etkileyen moleküler
sinyaller
• Genetik çeşitlilik: populasyonlar, genom veya
genlerdeki genetik çeşitliliğin değerlendirilmesi
• Bitki-mikroorganizma ilişkileri: bitki savunma
mekanizmaları ve bitki-mikroorganizma sinyal
yolları
• Fizyoloji: hormonların işlevleri ve bitkilerdeki
diğer büyüme düzenleyicileri
• Genetik mekanizmalar: rekombinasyon, ploidi,
sentromer işlevleri
• Yetiştirme: uygun rekombinantların bulunması
için aday genleri ve genetik markerları kullanma
• Bitkilerle beslenme ve insan sağlığı: mineral ve
mikrobesin içeriğini değiştirme, bitkilerde aşı
üretimi
• Evolüsyon: genetik ilişkileri değerlendirme, gen
ve genomların orijini ve evolusyoner tarihçesi
• Populasyon genetiği: populasyon yapısı,
seleksiyon etkileri, bağlantı dengesi
Önemli yöntemler
• Otomatik DNA dizileme
– Nobel ödülü (Gilbert, Sanger, Berg, 1980)
• Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
– Nobel ödülü (Mullis, 1993)
• T-DNA veya transpozonlarla gen takibi
– Nobel prize (McClintock, 1983)
• Bitki transformasyonu
• Agrobacterium veya gen tabancası
– RNAi , virus-aracılığı ile gen sessizleştirilmesi (VGS)
– Nobel prize (Fire, Mello, 2006)
– Transkriptomik (cDNA mikroarray)
– Nobel prize (Shimomura, Chalfie, Tsien, 2008)
– Yeşil fluoresan protein (Aequorea victoria)
• Proteomik
The Nobel Prize in Chemistry 2008
"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP"
Osamu Shimomura
1/3 of the prize
USA
Marine Biological Laboratory (MBL)
Woods Hole, MA, USA
b. 1928
Martin Chalfie
1/3 of the prize
USA
Columbia University
New York, NY, USA
b. 1947
Roger Y. Tsien
1/3 of the prize
USA
University of California
San Diego, CA, USA
b. 1952
Bitki nukleus genomunun özellikleri
• Genom büyüklüğü:
– C-değerleri, C-değeri paradoksu
– Kromozom sayısı
– Gen, gen aileleri sayısı, tüm gen kompleksliklerini
anlama
– Retrotranspozonlar ve diğer tekrarlanan diziler
– Arada dağılmış pattern’lar
• Sentromer, Telomer, Matriks bağlanma
bölgeleri (MARs)
Model genom nedir?
• Biyolojinin hangi konusu ile çalıştığınıza bağlıdır.
• Kısa generasyon süresi, küçük genom, kendi
ve karşı döllemesi kolay, küçük boyutlu bitki,
ekonomik olarak önemli diğer bitki türleri ile
ilşkisi, kolay transformasyon, genetik ve
fiziksel haritalarının varlığı, genom dizisi
varlığı.
• Arabidopsis, pirinç ve son günlerde mısır genom
projeleri tamamlanmıştır. Medicago, kavak ve
domates de tamamlanmak üzeredir.
Fenotip ve Genotip ilişkilerini araştırmak
• İleri ve Geri genetik çalışmalar
– İleri: fenotip > harita > gen klonla > işlevi çalış
Klasik yöntem
– Geri: klonlanmış gen > hangi fenotip
etkileniyor olası işlev
– Not: Dizileme otomatize edilmiştir fakat
fenotipik değerlendirmede böyle bir olasılık
bulunmamaktadır.
Genleri tanımlamak ve izole etmek
– Bir metabolik olayı düzenlemek o olayı etkileyen
gen biliniyorsa daha kolay olur.
– Hangi genler fenotipi kontrol eder, hangi fenotipik
değişimler allel değişimleri (mutasyon) ile oluşur.
– DNA/RNA/protein ve bitki formu, işlevi ve
evolüsyonu arasındaki ilişkiyi anlamak
Bitki genomunun özellikleri
• Kloroplast genomu:
– Halkasal ve çok korunmuş (gen sırası ve dizisi)
– Büyüklük: 100-300 kb (ort. = 140 kb, 110 gen)
• Mitokondri genomu:
– Halkasal ve az korunmuş, yüksek düzeyde rekombinasyon
gösterir
– Büyüklük: 200-2500 kb (Arabidopsis = 367 kb, 58 gen)
• Nukleus genomu
– Linear, çok sayıda kromozom
– Büyüklüğü değişir (türiçi ve türler arası)
– Kromozom sayısı değişir (türler arasında)
14
Nukleus kromozom sayıları
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
15
Bitki bilinmiyor 2n=2 (200,000 hala sayılmadı)
Mirmisia pilosa
2n=2 (ilkel Australya karıncası)
Bazı bitkiler
2n=4 (Asteraceae ve Poaceae)
Arabidopsis 2n=10
Sorghum
2n=10
Arpa
2n=14 (n=7)
Mısır
2n=20
Pirinç
2n=24
Domates
2n=24
Buğday
2n=42 (n=7)
Poa literosa
2n=266
Voaniolana gerardii 2n=600
Bitkilerde C-değeri
• C-değeri:
– Haploid hücrelerde (gametlerde) pikogram olarak DNA miktarı, 1
pg = 965 mega [million] baz çifti(Mb)
– ~3,000 türde (~1% angiosperm)biliniyor
– 38 Mb (bir crucifer, Cardamine amara) ile > 123,000 Mb (bir
zambak, Fritillaria assyriaca) arasında
– Bitki ailelerinin % 70inde @ C-değeri bilinmiyor
• C-değeri bitki gelişiminin hücresel bazı değerleri ile
ilişkilidir:
– Min. mitotik hücre siklusu, mayoz süresi
– CO2 yanıtsızlığı, kışın ısınma, biomass üretimi
– Küçük genomlular <6 haftada gelişim dönemlerini tamamlarlar
(Bennett, 1972)
16
C-değeri ve bitki biyolojisi
(Bennett, 1998)
C-değeri paradoksu
• Genom büyüklüğü gen sayısı ve kompleksliği ile ilişkili değildir.
Tür
C-value
Fiziksel büyüklük Genetik büyüklük
Arabidopsis
Rice
Sorghum
Tomato
Maize
Barley
•
•
•
•
•
125 Mb
430 Mb
760 Mb
950 Mb
2,500 Mb
5,300 Mb
1200 cM
1800 cM
1500 cM
1400 cM
1500 cM
1760 cM
Fiziksel/Genetik Gen Sayısı
104 kb/cM
238 kb/cM
500 kb/cM
680 kb/cM
1,660 kb/cM
3,000 kb/cM
Genom fiziksel büyüklüğü farklılıklar gösterir.
Genetik büyüklükler oldukça yakındır
Büyük genomlar büyük fiziksel:genetik uzaklık oranları gösterirler
Gen sayısı değişiklikler gösterir
Gen sayısı ve gen ailesi sayısı arasındaki ilişki bilinmiyor
25,498
~50,000
~50,000
??
~50-100,000
~50,000
Genom obezitesi
• Büyük genomlar ile küçük genomlar arasındaki fark nedir?
– Büyük genomlarda çok miktarda tekrarlanan diziler bulunur.
– Tekrarlanan dizilerin çoğunda retrotraspozonlar bulunur.
– Retrotransposonlar bir RNA ara molekülü taşırlar
– Büyük genomlarda genler nasıl organize olurlar?
– Çok değişken araya girişler bulunur
– Mısırda genler kromozomların ucuna doğru adacıklar oluştururlar
– Mısırda gen adaları retrotranspozon denizi ile çevrilidir
• Büyük ve küçük genomlar arasında çalışma yönünden ne fark vardır?
– Dizileme zor ve pahalı
– Gen izolasyonu zor
Rekombinasyon
• Genom boyunca varyasyonlar gösterir.
– Domates: I2 loci = 43 kb/cm karşın Tm2 locus = 3.3 Mb/cM
• Ortalama fizisel:genetik oran istatistik olarak gerekli olmayabilir
–
–
–
–
–
Gence zengin alanlarda yüksek
Metillenmiş ve tekrarlanan bölgelerde az
Gen gence zengin yoksa fakir alanlarda mı yerleşmiş sorusu önemli
Marker bulma zengin alanlarda kolaylaşır
Rekombinasyon frekansını değiştirebilme çalışmaları büyük önem taşıyor
• Rekombinasyonu nasıl izleriz?
– Polimorfizm
– Her türlü varyasyon
• RFLP, AFLP, SSR, dizi, morfolojik, biyokimyasal
Gen tahminleri
• Computasyonal gen tahmin programları
• Dizilenmiş genomlarla annotasyon
• Gen model konfirmasyonu
• Alternative kırpılma
21
Sentromer ve telomer
• TELOMER
– Çok korunmuş, tandem tekrarlar (T/A)n G1-8
– Boyu değişken
– 2 - 40 kb
• SENTROMER
– Diziler korunmamış (S. cerivisiae veS. pombe).
Bitkilerde henüz klonlanmadı
– Dizilemesi zor (Arabidopsis,pirinç, insan vb)
– Sentromerle ilgili işlev bilinmiyor, fakat kinetokor
oluşumu ve iğ bağlanma yeri, hücre bölünmesinde
kardeş kromatidlerin ayrılmasını sağlar
22
Sentromer
• Arabidopsis ve pirinçte
– 180 bp core tekrarı Arabidopsis (pAL), 155 bp core tekrarı pirinç
(CentO), 156 bp core tekrarı mısır (CentC)
– core tekrarı retrotranspozon tekrarları ile çevrili (Athila LTR
Arabidopsis; CRR, bir Ty3/Gypsy retrotranspozon pirinç)
– Perisentrik bölgeler çeşitli tipte transpozonlarla çevrili ve sıklıkla
metillenmiş
– Rekombinasyon oranı diğer bölgelere göre 10-20 kez az
• 880-1260 kb/cM’a 104-220 kb/cM in Arabidopsis
• Rekombinasyon nasıl bastırılır?
• Sentromerik bölgede eşleşme geç olur
• Tekrarlar rekombinasyonu azaltır.