rec-DNA-t9.91 MB

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ
Rekombinant-DNA teknolojisinin
gelişimindeki önemli atlama taşları:
1860-1865
Gregor Mendel
Bezelye çaprazlamaları ile
döllere “gen” geçişini ilk kez
ortaya çıkardı




1953 Watson ve Crick : DNA' nın çift iplikli
sarmal yapısı keşfedildi.
1957 Kornberg : DNA polimeraz izole edildi.
1966 Nırenberg ve ark: Genetik kod çözümlendi.
1967 Gellert
: DNA ligaz izole edildi.
1970 Hamilton Smith
Restriksiyon enzimlerini (DNA
makasları) keşfetti
DNA yı belli noktalardan
kesebilen enzimler

1972-73 Jackson ve ark : İlk r-DNA molekülü
oluşturuldu.
Boyer ve ark : Gen klonlama
tekniğinde plazmidler keşfedildi

1975
Southern : hibridizasyon tekniği
geliştirildi. " Southern Blot " tekniği.
Kan ve ark : ilk prenatal teşhis
1977
Walter Gilbert ve Allan
Maxam , ayrıca Fred
Sanger ayrı ayrı
laboratuvarlarda DNA
nın şifresini çözecek
DNA baz dizisini ortaya
çıkaran “DNA dizileme”
metodunu geliştirdiler
1978 Yuet Wai Kan ve Andree-Marie Dozy
“restriction-fragment-length polymorphism”
(RFLP) yöntemini geliştirdiler

1979 Goeddel ve ark: ilk rekombinant – insülin

1982 Palmiter ve Brinster : Transgenik fareler
Spradling ve Rubin : Transgenik meyve
sinekleri üretildi.
1985-1990
Kary Mullis arkadaşları polimeraz
zincir reaksiyonu (PCR) adı verilen , hızlı
DNA klonlaması ve dizi tepitinde önemli bir
teknik geliştirdiler
1986; İlk hastalık geni pozisyonel
klonlama ile tayin edildi ;immun bir
hastalık olan kronik granulomatos
hastalığı.
1987; Rekombinant hepatit B aşısı
üretildi.
1989; ABD de İnsan Genomu Araştırma
Ulusal Merkezi kuruldu
1994; İlk transgenik domates satış izni
aldı

1993 Stilman ve Hall : İnsan embriyosunun
klonlanması çalışmaları
.



1997 Wilmut : Koyun klonlanması (Erişkin
memeli hücrelerinden)
1998 İnsan Genom Projesi (İGP) başlatıldı
2000 li yıllar: İGP tamamlandı (2003)
DNA çipleri
Farmakogenetikte atılımlar
Kök Hücre - tedavi
Rekombinant DNA teknolojisinde
kullanılan yöntemler

Özel kesici enzimler kullanarak DNA
molekülünün kesilmesi
DNA nın Klonlanması
 DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir
şekilde saptanması
 Nukleik asit hibridizasyonu
 Genetik Mühendisliği

Rekombinant DNA teknolojisinde
kullanılan yöntemler - 1

Özel kesici enzimler kullanarak DNA
molekülünün kesilmesi
HpA I
5' G-T-T * A-A-C 3'
3' C-A-A * T-T-G 5'
Eco RI
5' G *A-A-T-T-C 3'
3' C-T-T-A-A * G 5'
Hind III
5' A *A-G-C-C-T 3'
3' T-T-C-G-G * A 5'
Pst I
5' C-T-G-C-A * G 3'
3' G * A-C -G-T-C 5'
Restriksiyon enzimleri (DNA makasları)
Restriksiyon enzimleri
Enzim
Elde edildiği kaynak
Tanıma bölgesi
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens H
GGATCC
EcoRI
Escherichia coli RY13
GAATTC
HaeIII
Haemophilus aegyptius
GGCC
HindIII
Haemophilus influenzae Rd
AAGCTT
HpaI
Haemophilus parainfluenzae
GTTAAC
HpaII
Haemophilus parainfluenzae
CCGG
MboI
Moraxella bovis
GATC
NotI
Nocardia otitidis-caviarum
GCGGCCGC
SfiI
Streptomyces fimbriatus
GGCCNNNNNGGCC
TaqI
Thermus aquaticus
TCGA
Restriksiyon enzimi (DNA makası) olan EcoRI çembersel
DNA molekülünü keserek yapışkan uçlara sahip doğrusal
şekle getirir
RFLP (Parça uzunluk polimorfizmi)
Rekombinant DNA teknolojisinde
kullanılan yöntemler - 2

DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde
saptanması
Enzimatik Yöntem (Sanger Yöntemi)
Kimyasal yöntem (Maxam-Gilbert Yöntemi)
DNA dizileme
yöntemi
dideoksinukleotid,
2 , 3 dideoksi CTP.
DNA dizileme yöntemi
Rekombinant DNA teknolojisinde
kullanılan yöntemler- 3

Nukleik asit hibridizasyonu:
Southern transferi : DNA hibridizasyonu
Nouthern transferi : RNA hibridizasyonu
Nukleik asit hibridizasyonu
“Southern Transferi”
Rekombinant dna teknolojisinde
kullanılan yöntemler - 4

DNA Klonlaması

Vektör kullanarak canlı hücrede
DNA çoğaltımı ;
*Plazmid
*Virus genetik materyeli
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile
çoğaltım işlemi (tüpte)

genetik haritası.
İki tane antibiyotik dirençlilik geni taşır
Plasmid PBR322 nin
Kimerik DNA (veya Rekombinant- DNA) oluşturma:
Plazmid DNA sının yabancı DNA molekülü ile birleştirilmesi
Bakteri kullanarak
DNA veya Gen Klonlanması
Bakteri (E. coli) tarafından rekombinant memeli Proinsulin sentezi
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR veya PCR)
 Kalıp DNA
 DNA polimeraz (Yüksek ısıya dayanıklı)
 Primerler
 dNTP ler ( CTP-ATP-GTP-TTP)
Rekombinant DNA teknolojisinde
kullanılan yöntemler - 5
Genetik Mühendisliği
Transgenik hayvan ve bitkiler üretmek

Transgen: Yabancı gen (veya DNA)
Transgenik: Yabancı geni taşıyan organizma
Transgenik model oluşturmak:
 Hücrelere yeni gen nakli ( bir gen üzerinde
değişiklik yaptıktan sonra -mutant gen- normal
genin yerine sokulması) ile farklı özellikler taşıyan
organizmaların üretilmesi.

Transgenik hayvan oluşturma yöntemleri;
1- Döllenmiş yumurtaya gen transferi ile
transgenik hayvan (fare) üretimi
2- Embriyonik kök hücrelerine (EKH) gen
transferi ile transgenik hayvan (fare)
üretimi
Transgenik fare: Döllenmiş yumurta hücresine büyüme hormonu
geni eklenen transgenik fare dev boyutlarda.
Rec- DNA
Teknolojisinin
Kullanıldığı Alanlar
Rekombinant DNA teknolojisinin
biyomedikal önemi





Birçok hastalığın moleküler temelini anlamak
(ailesel hiperkolesterolemi, orak hücre
anemisi, talessemi, kistik fibroz, müsküler
distrofi)
Rec-DNA teknolojisi kullanılarak tedavi
etmek (örn: insülin, büyüme hormonu,
plazminojen aktivatörü)
Aşılar üretmek (hepatit B)
Tanı (AIDS testi)
Tedavi (gen tedavisi)
Prenatal tanıda



Beta thalessemia,
Duchenne
müsküler distrofi,
Frajil-X sendromu
Kanser teşhisinde



retroviruslar
Onkogenler
Mutant genler
Aşı üretiminde
Yenebilir aşıların
üretimi
Muz patates gibi
ürünlere hepatit B,
Kolera aşılarının
klonlanması

“Çocuklar ölmesin
Şekerde yiyebilsinler”
Biyoteknolojik çalışmalarda

Çevre mühendisliğinde biyolojik savaş
süper bakteriler
oktan, ksilen, naftalin ve karışık
hidrokarbonlar gibi petrol artıklarını
kullanabilen bakteri türlerinden , tüm bu
özellikleri bir arada taşıyan
mikroorganizma.
Hastalıkların moleküler seviyedeki
patolojik tanıları



Diyabet
ateroskleroz ve koroner arter hastalıkları
Alzheimer , şizofreni, parkinson
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 1

proteinleri kodlayan genlerde meydana gelen mutasyonlar
sonucu hasarlı veya eksik protein üretimine dayanır.
Bu patolojilere göre genetik hastalıklar


Bir proteinin alt gruplarını oluşturan
proteinlerde mutasyon
Thalessemia’ ler (Otosomal resesif)
Enzim hasarları
Aminoasidopatiler;Fenilketonuri, (Otosomal resesif)
Lizozomal depo hastalıkları; Tay-Sacs hastalığı
(Otosomal resesif) .
İnklüzyon –hücre hastalığı (protein trafiğindeki hata)
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 2

Reseptör proteinlerindeki hatalar ve eksiklikler
Ailesel Hiperkolesterolomi

(Otosomal dominant)
Transport proteinlerindeki hatalar
Kistik fibrozis (Otosomal resesif)

Yapısal proteinlere bağlı hastalıklar
Ducshenne Müsküler distrofi ( Kasta Distrophin
protein eksikliği ) (X’e bağlı)
Osteogenesis imperfecta ve Ehlers Danlos
( kollogen sentez hataları )
(Otosomal dominant)
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 3

Nörodejenaratif hastalıklar
Alzheimer Hastalığı (Otosomal dominant veya
çok nedenli)

Büyüme veya farklılaşma proteinlerinde
hasarlar
Kalıtsal meme ve ovaryum kanserleri :
( BRCA1- BRCA2 mutasyonlarına bağlı ) (otosomal
dominant)
Viral ve bakteriyal enfeksiyonlarda
patojenin tespitinde




Tüberküloz bakterisinin tespiti m . tuberculosis
(PCR ile ) ayrıca alt tiplerinin tayini
Hepatit virusu
Herpes simplex
onko-virusların tayini
DNA çipleri
Biyoteknolojik çalışmalarda
İlaç sanayisinde;
“Antitripsin
Kistik fibrozda”

Adli Tıpta
şüpheli suçlunun tayini
veya
babalık tayini
Gen Tedavisi
AMAÇ: Mutant fenotipi düzeltmek
Gen tedavisi için kullanılan
vektörler:


Viral Vektörler:
* Retroviruslar
* Adenoviruslar
Viral Olmayan Vektörler :
* Çıplak DNA (plazmid içine sokulmuş hedef DNA)
* Lipozomlar içine sokulmuş DNA paketleri
* Protein-DNA bileşenleri (hücre yüzey
reseptörlerine bağlanan protein ve DNA bileşeni)
* Yapay kromozomlar
Retroviruslar:
 viral genom, konak hücre DNA’sına katılır.
Adenoviruslar:
 viral genom, konak hücre DNA’sına katılmaz

kromozom dışında sitoplazmada genetik
materyal olarak bulunur.

insersiyonal mutasyona neden olmaz.
Gen transferinde çeşitli yöntemler vardır:
 Rekombinant- DNA'nın lipid vezikülleri
(lipozomlar) ile hücreye sokulması.
 Virus genomu içine ilgili DNA parçasının
sokularak tranfeksiyon
 Nukleus içine mikroenjeksiyon ile rekombinantDNA'nın sokulması.
Gen tedavisi
Vektörler iki yoldan organizmaya verilir
 Ex vivo: Organizma dışına alınan mutant
hücrenin düzeltilerek yeniden organizmaya
verilmesi
 In vivo: Dışarıda hazırlanan normal geni taşıyan
vektörün organizmaya verilmesi
Gen tedavisi örnekleri
Ex vivo

SCID: Ciddi kombine immun yetmezlik hastalığı
Adenozin deaminaz (ADA ) mutasyonu
Kemik iliğinden kan kök hücreleri çıkarılır.
Sağlam gen bir vektör yardımı ile kök hücreye
nakledilir.
Kök hücre organizmaya geri sokulur.
DMD : Duchen müsküler distrofi :
Distrofin proteini mutant.
Gen tedavisi örnekleri 1

Ailesel Hiperkolesterolemi ;LDLR:
Düşük dansiteli lipoprotein reseptör geninde mutasyon.
(LDLR: Karaciğerde sentezlenir )
Kalp ve damar hastalıklarına yatkınlık nedeni



LDLR- / LDLR- hastaların karaciğer hücreleri alınır,
normal gen retroviruslar ile hepatositlere sokulur,
düzeltilmiş hücreler portal ven ile vücuda verilir.
Gen tedavisi örnekleri 2
İn vivo

Kistik fibroz:
Klor kanal proteini mutant.
Adenoviruslara normal gen sokulup sprey yolu
ile burun mukozasına verilir.
Homolog rekombinasyon ile gen inaktivasyonu
Klonlama
klonlanmış plazmid DNA sının mikroenjeksiyon
ile döllenmiş fare yumurta hücresindeki erkek pronukleusu içine
aktarılışı
DNA mikroenjeksiyonu;

Dolly
1996 da Keith
Campbell and Ian
Wilmut tarfından
Roslin enstitüsünde,
(Edinburgh, İskoçya)
da klonlandı
Mikroenjeksiyon
İnsan Genom Projesi
1990 da ABD de İnsan Genom
Projesi başlatıldı (US Department
of Energy and the National
Institutes of Health)
15 yıllık plan içinde bitirilmesi
planlandı
Teknolojideki hızlı gelişmeler ile
4 yıl önce bitirildi
http://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/home.html
İGP ile ilk başta
3 milyon DNA baz çiftinin % 97.7 sinin
dizilenmesi amaçlandı
ilerleyen yıllarda
2000 yazında % 90 nının çözülmesi
amaçlandı ancak 1 Mayıs 2000 de;
2,540,358,000 bazlık dizi (% 79.1) tespit
edildi
Sonuç olarak
2003’te %100 lük dizi tespiti amaçlandı
%18.6 (598,586,000 baz) tespit adildi
1 Aralık 1999 da,
İlk insan kromozunun tümü
dizilendi: kromozom 22
İnsan Genom Projesi ile;
Gen bilgi bankaları
Kalıtsal hastalıklara çareler
Genetik danışma
Genomik
cografya.
İnsan genomu
çeşitli yollarla
haritalanabilir
Fiziksel harita
genetik bağlantı
haritası