Bitki Biyoteknolojisi ve Açılımları YIBO--2009 YIBO Doç. Dr. Tijen Talas-Oğraş TÜBĐTAK - Marmara Araştırma Merkezi Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü BĐYOTEKNOLOJĐ Biyoteknoloji; ürün oluşumu için biyolojik sistemlerin kullanıldığı teknolojik uygulamalar. • Ekmek, bira, yoğurt, peynir yapımı ve geliştirilmesi Modern biyoteknoloji: rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak üretim sürecinin hızlı ve güvenli olarak uygulanması. • Aşı üretimi Alanları: hücre ve doku kültürü, moleküler biyoloji, mikrobiyoloji, genetik, fizyoloji, biyokimya, bilgisayar mühendisliği Bitki Teknolojisinin Tarihsel Gelişimi 2.000 MÖ 19.yy erken 20.yy Orta 20.yy 1930 1940 1950 1970 1980 1980 1990 2000 2010 Kültüre alma Melezleme Mutasyon ve seleksiyon Hücre kültürü Somaklonal varyasyon Embriyo kurtarılması Poliembriyogenez Anter kültürü Rekombinant DNA Markır ile seçim Genomik Proteomik Metabolomik Sistem Biyoloji 3 Biyoteknoloji Tarihi 1800-1900 : Temel çalışmalar 1900-1953 : Genetik 1953- 1976: DNA araştırmaları, bilimsel patlama 1977- 2008: Modern biyoteknoloji 1865 - Gregor Mendel (1822 - 1884) “Faktörler nesilden nesile aktarılır”. Biyoteknolojideki gelişim 1943-1953 Đlk biyoteknolojik üretimi; kortizon laboratuvarda hayvan hücreleri üretildi 1953 DNA’nın keşfi; James Watson, Francis Crick moleküler biyoloji ve genetik araştırmalarda patlama 1966 Genetik kodun şifresi çözüldü (M.Nirenberg, H. Mathaei, S. Ochoa) 1972 ilk rekombinant DNA molekülünün oluşturulması (Paul Berg), restriksiyon enzimleri, ligaz enziminin kullanımı 1972 rekombinant DNA çalışmaları için kılavuz hazırlandı (NIH: Amerika Ulusal Sağlık Enstitüsü) 1978: rekombinant DNA teknolojisi ile insan insülin geni bakteriye aktarıldı, üretimi başarıldı (Genentech) (tanı ve tedavi edici moleküllerin üretiminde DNA dizileme ve klonlama teknikleri ile hızlandı). 1977: ilk insan proteini bakteride üretildi Genentech, somatostatin, insan büyüme hormonu 1985 böcek, virüs ve bakteriye dirençli GD bitkilerin ilk alan denemeleri yapıldı. Đnsanlarda gen terapisi denemeleri ile ilgili rehber onaylandı (NIH) 1986: ilk rekombinant aşı onaylandı (hepatit) (FDA) Đlk transgenik tütün bitkisinin ekimi onaylandı (EPA) 1994 transgenik gıda ürünü, “Flavr Savr” domates onaylandı (FDA) Bitkilerin önemi: • Yeryüzündeki birincil üreticilerdir, birincil besin kaynağıdır • Havadaki oksijen dengesini sağlarlar • Çevre dengelerini düzenlerler • Erozyonu önlerler • Sessiz fabrikalardır; tıp, kağıt, boya, kozmetik vb. sanayi uygulamalarında ve enerji alanında kullanılırlar. Bitki biyoteknolojisinin alanları: •Bitki doku kültürü •Bitkilere gen aktarımı •DNA parmak izi çalışmaları Genetik mühendisliği: Genler ile taşınan DNA bilgisinin farklı bir hücreye/organizmaya aktarım işlemidir. Neden gen aktarımı yapılır? • Bir kimyasal üretiminde • Organizmanın özelliklerinin değiştirilmesi Genetik Yapısı Değiştirilmiş Organizma (GDO, GMO): Doğal süreçler ile elde edilmesi mümkün olmayan yeni özellikler kazandırılmış organizma GDO’ların Tarımsal Alandaki Avantajları: • Tarımsal ilaç kullanımında azalma • Verimde artış •Uygun olmayan iklim ve toprak koşullarında bile ürün alınabilme Genetik Modifikasyonların Hedefleri • Tarımsal ilaç kullanımında azalma • Herbisit ve böceklere karşı dayanıklılık sağlanması • Azot fiksasyonu ve ürün miktarının geliştirilmesi • Geç olgunlaşma, raf ömrünün uzatılması • Besinsel özelliklerin geliştirilmesi • Kısır bitki üretimi • Verimde artış •Çevresel koşullara tolerans (kuraklık, tuzluluk) Uygun olmayan iklim ve toprak koşullarında bile ürün alınabilme Genetiği değiştirilmiş ürünlerin avantajları: Hayvansal üretimde: - Daha kaliteli et, süt, yumurta verimi - Hayvan sağlığı ve tanı ile ilgili yöntemlerin geliştirilmesi Çevre için: - Tarım ilacı kullanımının azaltılması - Toprak, su ve enerjinin korunması - Doğal atıkların değerlendirilmesi - Orman ürünlerinin daha etkin işlenmesi Böceklere/ yabancı ot ilaçlarına toleranslı transgenik bitkilerin avantajları: •Böceklere toleranslı bitkiler insektisit kullanımını azaltabilir. • Đşçilikten tasarruf sağlanabilir • Đşçi sağlığı korunabilir •Etkili bir yabancı ot mücadelesi yapılabilir •Mısırda Fusarium kaynaklı mikotoksinler azalmaktadır (Munkvoldve ark. 1999). DNA (deoksiribonükleik asit) DNA kromozom içinde sıkıca paketlenmiştir: DNA’nın agaroz jelde görüntülenmesi: DNA parmakizi profilleri DNA parmakizi: Anne Çocuk Erkek Hayvanlara gen aktarımı • Çıplak DNA ‘nın aktarımı Mikro enjeksiyon, elektroporasyon •Virüs ile yönlendirilen gen aktarımı DNA mikroenjeksiyonu ile transgenik fare eldesi Gen aktarımı için vektör hazırlığı Bitkilerde genetik mühendisliği Bakteri Bitki hücresi Bakteri DNA’sı Gen Transformasyon • Agrobacterium • Biyolistik • Elektroporasyon Transgenik bitki Hücre bölünmesi 24 Agrobacterium Toprakta yaşayan gram negatif bir bakteri, Doğal genetik mühendisi, A. rhizogenes- saçak kök hastalığı A. tumefaciens- dikotillerde taç tümörü hastalığı Biyolistik ile bitkilere gen aktarımı: Elektroporasyon ile gen aktarımı: DNA ‘nın elektrik akımı ile hücre zarından içeri alınması 27 Gen aktarımında kullanılan çeşitli bitkisel formlar: Bitki doku kültürü Aseptik şartlarda yapay bir besin ortamında hücre, doku veya organ gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin üretilmesidir. Besin ortamı bileşenleri •Makro elementler (azot, fosfor,sodyum, magnezyum, kükürt, vb.) •Mikro elementler (demir, manganez, çinko, bakır, vb.) •Vitaminler (tiamin, nikotinik asit, vb.) •Şekerler (sakkaroz, glikoz, vb.) •Jel yapıcı maddeler (agar, fitajel, jelatin, vb.) •Amino asitler (glisin, arginin, vb.) •Bitki büyüme düzenleyicileri Bitki doku kültürünün bitki ıslahındaki uygulama alanları Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik çeşitlilik oluşturmak, türler arası melezlemeler • Kaybolmakta olan türlerin korunması • Çoğaltılması zor olan türlerin üretimi (mikroçoğaltım) • Gen aktarımı Sekonder metabolit üretimi Sentetik tohum üretimi Bitki Doku kültürü Paulownia elongata internod eksplantlarından direkt somatik embriyo gelişimi Pamuk embriyolarının doku kültüründe gelişimi Doku Kültüründe Kavak Doku kültüründe geliştirilen kavak bitkisi: Yeni nesil transgenik bitkiler (20052015): • Bitkilerde aşı üretimi • Đşlevsel gıdalar ve bitkisel ilaçlar • Aroma ve tadın değiştirilmesi • Alerjik etkilerin ortadan kaldırılması • Fitoremediasyon uygulamaları • Bitkilerde plastik ve polimer üretimi Bitki Biyoteknolojisinin Gelişim Evreleri Değer Agronomik özellikler Kalite özellikleri Bitkisel fabrikalar Yenilenebilir kaynaklar Biyodizel uygulamaları Modern Biyoloji, Moleküler Genetik Fenotip Đyileştirilmiş ürünler Genotip/genler/DNA (kalıtım bilgisi) Genomik (tüm gen bilgisi) Genomikten geliştirilmiş tahıllara 1. Faz Genomik platform Gen RNA Genotip Proteinler Metabolitler (Ters genetik) Organizma Fenotip DNA harita Transkriptom Proteom Metabolom Profil 2. Faz: Geliştirilmiş tahıllar Moleküler ıslah, transgenik tahıllar (yeni özellikler) Genetiği Değiştirilmiş Organizmaların Tanı Yöntemleri: • DNA’ya dayalı yöntemler - Klasik, gerçek zamanlı PCR - Mikroarray (DNA “chip”) • Proteine dayalı yöntemler - ELISA - Şerit testler - Western blot • Herbisit uygulaması • Yeni teknolojiler: transkriptomik, proteomik ve metabolomik analizleri Tanı analizinde gereksinimler; • Hedef moleküller; DNA veya protein • Yardımcı moleküller DNA için primer ve prob Protein için antikor • Referans materyal Pozitif ve negatif kontrol Miktar tayini için kalibre edici materyal GDO veya GDO içeren ürünlerin analizi: • Analiz için örnek alınması • Örneğin homojenize edilmesi • DNA, RNA veya protein izolasyon - DNA’ya dayalı yöntemler (PCR) - RNA’ya dayalı yöntemler (RT- PCR) - Proteine dayalı yöntemler - Yeni teknolojiler • Molekülün belirlenmesi (boyut, renk, hibritleme...) • GMO’nun miktarının belirlenmesi • Sonuçların yorumlanması Örnek DNA izolasyonu Baz çifti (bp) 500 400 300 200 100 Sonuç DNA çoğaltımı 180 bp Elektroforez Proteine dayalı GDO tanı teknikleri: - ELISA - Şerit test - Western blot Kağıt şeritlerde immünokromatografik GDO analizi: - 10 dakika içinde yanıt oluşur Đmmünokromatografik GDO analizi: Böceklere dayanıklı ürünler Raf ömrü uzatılmış domates Gray ve ark.1992 Süs bitkilerinde yapılan genetik değişimler Transgenik Tohum Oluşturma Aşamaları: • Genin belirlenmesi, klonlama 1-3 yıl • Vektör hazırlama 1 yıl • Gen aktarımı 1-2 yıl • F1 eldesi 1 yıl • F1’lerin test edilmesi 1 yıl • Genetik melezleme 1 yıl • Lab. ve tarla denemeleri, risk analizleri 3-6 yıl • Ticarete sunum 1 yıl Toplam 10- 16 yıl Đnsan tedavisinde kullanılan ilaçların transgenik bitkilerde üretimine yönelik çalışmalar: •Kistik fibrosis ve karaciğer hastalıklarında kullanılan ά-1antitripsin proteininin çeltik bitkisinde, Gaucher hastalığında kullanılan ve insan plasentasından elde edilen glukoserebrosidazis tütün bitkisinde üretilmiştir. • “Yakın bir gelecekte yüksek fiyatlarla satılan ilaçlar, düşük maliyetlerle bitkilerde üretilebilecektir. “ Bitki hücrelerinde rekombinant protein üretimi GDO’ya tepkiler/ olası riskler: • Gıda güvenliği ve etik ile ilgili kaygılar • Çevresel etkiler (genetik erozyon, gen kaybı) • Küreselleşme (tekelleşme) • Şeffaflık ve bilgi eksikliği • Politik güven eksikliği • Ekonomik, ticari kaygılar • Sosyo-ekonomik yapı Halkın bunu nasıl karşılayacağı nı merak ediyorum? Genetiği değiştirilmiş tarım ürünleri veya bunların türevlerini içeren gıda ürünleri zararlı mı? Kişisel genomik test (399$) -2008’in en iyi 50 keşfi 600,000 genetik markırın tanımlanması ve tanısı 90 özellik ile ilgili yatkınlık. Çeşitli kanserlere yakalanma yüzdesi… Evrensel tohum saklama kasası, Kuzey Avrupa Norveç 4.5 milyon tohum örneği, - 18 oC Verimli bir çalıştay dilerim… [email protected]