Biyolojik nanoporlar: gramicidin A, alfa hemolyzn iyon

Nano gözenekler
(Nano-pores)
KÜBRA KICIR
12/05/2011
Nanopore
A nanopore is a small hole in an electrically insulating membrane, that
can be used as a single-molecule detector.
•
1 – 100 nm
• amino asit, şeker ve nükleotitler 1nm
• DNA çift sarmal yapısı 2nm
• kan plazması 2-6nm
• ribozomlar 20nm
• virüsler 10 – 50nm
Nanoporlar genel olarak 2 gruba ayrılır;
Biyolojik nanoporlar: gramicidin A, alfa hemolyzn iyon kanalları (potasyım
kanalları ve asetilkolin reseptörü) , mitakondri ve bakteri proteinleri
•
Belli bir transmembran hücresel protein nanopor olarak hareket edebilir.
Sentetik nanoporlar ( katı-faz nanoporlar): filtrasyonda kullanılan
nükleoporlar (50nm – 200nm), mika içerisine kazınmış nükleer parçalar,
silikon nitrür içerisine açılmış porlar
•
Nanoporlar bir silikon parçasının (silikon nitrür ) içinde aşındırma
yöntemi ile daha büyük delikler halinde de yapılabilir ve daha sonra aşamalı
olarak iyon demeti litografisiyle de istenilen şekilde doldurma yapılarak çapı
daha küçük boyutlara indirilebilir.
Alfa Hemolisyn
Alfa hemoliysn, çapı 5nm den daha küçük
gözenekler gerektiğinde en yaygın olarak
kullanılan pordur. Bu por, aslında bir bakteri
toksinidir.
Alfa hemolisyn hücre zarında delik açma
özelliğine sahip organik bir enstrümandır. Bu
bakteri doğal ortamında çevresindeki yabancı
hücrelerin zarında delik açmak, bu delik
yoluyla karşı hücredeki küçük organeller,
iyonlar, çeşitli mineraller ve ATP gibi
molekülleri kendisine geçirmek için kullanır.
Ucuz ve etkin olması avantajlarıdır.
alpha-hemolysin pore (made up of 7
identical subunits in 7 colors) and 12mer single-stranded DNA (in white) on
the same scale to illustrate DNA effects
on conductance when moving through a
nanopore.
Gramicidin A
•
Gramisidin, 6 antibiyotikten oluşan bir
antibiyotik karışımıdır.
•
Toprakta bulunan Bacillus brevis
bakterisinden elde edilir.
•
•
•
2-4nm iç çapına sahiptir.
Iyonofor olarak kullanılabilir.
Her biri 15 aminoasitten oluşan 2 gramisidin
molekülü uç uca gelerek içi hidrofilik dışı
hidrofobik olan sarmal bir yapı oluşturur. Iyonlar
bu kanal içinden rahatlıkla geçebilirler.
A picture of the simplest ion
channel known - antibacterial
gramicidin A. It conducts
monovalent cations at near
diffusion rates, causing collapse
of the membrane potential and
killing hapless bacteria. Here
Gramicidin A (helical dimer in red)
is embedded in lipid bilayer (only
the phosphate head groups in
green are shown) and solvated
with a KCl solution (K blue, Cl red
and water is in the
background). Because of its
simplicity, gramicidin offers an
ideal channel structure for testing
new methods and ideas.
Katı Faz Nanopor Fabrikasyonu ve Nanopor Dizilemesi
Düzgün nanoporlar üretmek ve SiN membranlarda nanopor dizilemesi
yapabilmek için TEM de yüksek şiddetli elektron demeti kullanılır. Bu nanoporlar
tek iplikçikli DNA moleküllerinin analizi için kullanılır.
Nanopore arrays are fabricated using a Scanning TEM,
with a typical size distribution smaller than 0.5 nm
High resolution TEM images of nanopores
fabricated in 20 nm thick SiN membranes.
Grafen
Grafen, ince ve esnek olması, elektriksel ve
mekanik özelliklerinden dolayı nanopor olarak
kullanılabilen bir maddedir.
Kimyasal buhar çöktürme (CVD) yöntemiyle
geniş bir alanda grafen yetiştirilebilir ve bir
silikon membran üzerine asılabilir. Daha sonra bu
grafen TEM içerisinde odaklanmış bir elektron
demetiyle delinir ve nano boşluklar açılabilir. Bir
elektrolit çözeltisi içerisine yerleştirilmiş
düzenekten DNA molekülünün geçişi sağlanarak
dizileme işlemi gerçekleştirilir.
Molekül translokasyonu sırasında, iyon akışı
bloklanır ve ölçülen akımda bu sinyallerin
dedektasyonu yapılabilir.
Nanopor DNA Dizileme
Nanopor dizileme, DNA iplikçiği üzerindeki nükleotidlerin nasıl sıralandığını
belirleyen ve 1995 yılından beri gelişmekte olan bir yöntemdir.
Özellikle kalıtsal hastalıkların meydana gelme ve tedavi süreçleriyle ilgili
mekanizmaların anlaşılması için, araştırma yapılan konuya etki eden gen
bölgelerinin belirlenmesi gerekir. Bu bakımdan DNA analizlerinin yapılması, tedavi
sürecinin başlangıcı ve devamında izlenecek yolu belirleyen en önemli faktördür.
DNA dizi analizi ile birçok organizmanın genlerinin yapısı ve organizasyonu
hakkında önemli bilgiler elde edilebilir. Birçok canlı türünün tüm gen haritaları bu
şekilde tanımlanabilir.
DNA molekülü öncelikle belirli işlemler sonucu tek iplikli hale getirilir. Daha
sonra bu tek iplikli DNA molekülünün yapıtaşları olan nükleik asit dizilerinin
belirlenmesi gerekir. Bunun için molekülün yapıtaşlarına, belirlenen koşullar
altında ayrılmasını sağlamak amacıyla, belli düzlemler hazırlanır ve aynı anda bu
düzlemlerde meydana gelen biyolojik/kimyasal ve fiziksel reaksiyonların bilgisayar
ortamına geçişi sağlanır.
Tespit edilmesi gereken gen bölgelerini tanıma, DNA molelüküne bağlanma ve
floresan ışık yayma yeteneği olan yapay diziler (prob) hazırlanır ve ortama eklenir.
Çünkü bilgisayar ortamına aktarılması gereken nükleik asit bilgisinin,cihazlar
tarafından algılanması için, belli bir dalga boyunda ışığın bu dizilerden cihazlara
ulaşması gerekir. Cihazlar gelen ışık demetlerini kaydeder ve bilgisayar
programında veriler değerlendirilir.
Varolan birçok DNA dizileme teknolojisi, DNA içeriğindeki bazları
tanımlayabilmek için, floresan boya işaretlemesinin kullanımına ve optik bilgisayar
donanımlarına ihtiyaç duyar.
Çoğu dizileme metodunda, dizileme yapmadan önce DNA’nın
büyütülmesi/genişletilmesi gerekir. Bu süreç zaman ve maliyeti artırır ve hatalı
DNA dizilimlerinin oluşmasına yol açabilir.
Nanoporlar elektriksel alanda oluşturulan ve DNA molekülüne verilen direkt
elektrik sinyalleri aracılığıyla büyütme ve işaretleme gerekliliğini ortadan kaldırır.
Nanopor dizileme daha hızlı, pahalı olmayan, kesin bir yöntemdir. 100 milyon
bazın dizilemesi bu teknolojiyle yaklaşık bir günde yapılabilmektedir.
•
Bir lipid membran üzerinde hemolizyn kanal bulunmaktadır. Buraya 120
milivoltluk bir voltaj uygulandığında, por içerisinden 120 piko amperlik bir
akım geçer. Bu şekilde 1M lık KCl çözeltisi içerisinde bulunan bu porlardan
potasyum ve klor iyonlarının taşınımı sağlanır.
•
DNA sarmalı nanopora yaklaştığı zaman, buradaki iyonik akımı kısmen
engeller.
•
Bir kaç milisaniye sonra DNA sarmalı kendiliğinden açılarak hemolizynin
açıklığından içeri çekilir. Bu sırada akımda %10luk bir geçici düşüş meydana
gelir.
Herhangi bir zamanda nanopordan
geçebilecek akım miktarı porun A, G, C
ve T ile engellenmiş olup olmamasına
baglı olarak değişir.
DNA nın pordan geçişi sırasında
pordaki akım değişimi, DNA
sekansının direk okunmasıyla
gösterilir.
Nanopor, içinden düzgün sırayla geçen
DNA daki bazları tek tek tanımlamak için
de kullanılabilir.
Nanoporlar bir çözeltideki analiti
tanımlamak için kullanılabilir.
Oxford Üniversitesinde yapılan bir
araştırmada, protein nanoporlar
kullanarak küçük moleküllerin
enantiyomerleri arasındaki farklılıklar
(ibuprofen ve thalidomide gibi) iyon
kanalları ve spesifik biyobelirteçlerle
tanımlanabilmiştir.
Bu da kliniktıp ve ilaç gelişiminde geniş
bir uygulama alanı oluşturabilir.
Kanser Teşhisinde Nanoporlar
Biyolojik membranları taklit eden nano gözenekler, kanser gibi bazı
hastalıkların erken evrede teşhisinde kullanılabilir. Hücre zarında bulunan delikler
ve gözenekler hücrenin içi ile dışı arasındaki bağlantıyı sağlarlar. Bu boşlukları
taklit edebilen nano gözenekler geliştirilmiştir. Buradaki amaç, bu porlar ultra
hassas biyosensör olarak kullanılarak, hastalığa neden olan proteinleri tespit
etmektir.
Bu sensörler, proteinlerin varlığında membrandan geçen akımdaki değişimi
tespit ederek hastalığın tanısını koyar. Proteinler porların uçlarına bağlanarak
içerden geçen akımı bloke ederler. Burada kullanılan nano gözenekler diğerlerinin
aksine silindirik değil koni şeklindedir. Bu da algılama için çok daha uygundur.
Çünkü iyon akım nedeniyle gerilim düşümü nanopor ucunda odaklanmıştır.
Hastalıkların Tedavisinde Nanoporlar
Akıllı cihazlar ile hastalıktan etkilenen bölgeye kontrollü ilaç salınımı lokalize
edilebiliyor. Nano – membranların içlerine biyofarmostatik ilaçlar depo ediliyor ve
belli bir zamanda ilacın gözeneklerden difüzyonu sağlanıyor.
İmmün sistemden gelebilecek saldırılara karsı teröpatik maddeleri korumak için
6nm civarında porlara sahip membranlar ilaç taşıyıcı sistemleri olarak kullanılır.
Silikon tabakalara yapay olarak inşa edilmiş nanoporlar oksijen, glikoz
ve insülin gibi küçük moleküllerin geçmesine izin verirken, immünoglobinler
gibi büyük immün sistem moleküllerinin geçişini engeller.
Bu yolla yapılan bir deneyde, fare pankreas hücreleri mikro
kapsüllenmiştir. Bunların çevre hücrelerden tamamen izole olarak,
nanoporlar yardımıyla besinleri ve serbest insülini içlerine aldıkları
gözlenmiştir. Böylelikle nano porların, işlevini yapamayan pankreas
hücrelerini, özellikle insülin üretiminden sorumlu hücreleri değiştirmek ve
vücut fonksiyonlarını düzeltmek için kullanılabileceği görülmüştür.