DHPLC (Denaturating High-Performance Liquid Chromatography

DHPLC (Denaturating High-Performance Liquid Chromatography)
DHPLC, tanımlanmamış mutasyonların genetik tanısında, DNA Separation Teknolojisi ile
birlikte kullanılan Transgenomik WAWE DNA Fragment Analiz Sistemidir. Analizlerde dört
software paketi kullanılır; ‘‘WAWE maker 3.4, 4, 4.1’’ ve ‘‘Navigator’’. DHPLC aynı
zamanda, TMHA (Temperature-Modulated Heteroduplex Analysis) olarak da bilinir. Hızlı ve
otomize scanning metodudur. Mutasyonlar, oluşturulan hetero ve homoduplexler karışımına
göre karakterize peaklar yoluyla gözlemlenir.
Bir mutasyon için heterozigot olan bireyler, wild type mutant DNA’dan 1:1 oranında
bulundururlar. Mutasyon bulunan PCR ürünü 95 0C’ye ısıtılıp, yavaşça soğutulduğunda,
hetero ve homoduplex karışımı oluşur. Homozigot mutant alel taşıyan bireylerden alınan
DNA, wild type DNA fragment ile karıştırılmalı ve hibridize edilmelidir. Bu örnek, hetero ve
homoduplex karışımını içerir.
WAWE nükleik asit analiz platformu ‘‘ion-pair reserved-phase high performance liquid
chromatography’’ (IP-RP-HPLC) üzerine kuruludur ve 3 modda çalıştırılabilir: ‘‘nondenaturating’’, ‘‘partially denaturating’’ve ‘‘fully denaturating’’.
İşlemin iki fazı vardır: -alkile edilmiş nonporöz polistiren-divinil benzil C18 ile paketlenen
bir DNA separation kolonundan oluşan bir ‘‘durağan faz’’ ve asetonitril (ACN)-organik kosolvent- ve DNA’nın durağan fazla etkileşmesini garantileyen ion-pairing ajanı
trietilamonyum asetat (TEAA) içeren bir ‘‘mobil faz’’. Non-denaturating koşullar altında
(<50 0C) dsDNA, boyutuna bağlı olarak WAWE buffer sistemle elute olacaktır. Aslında,
DNA, büyüklük esasına göre TEAA’nın amonyum iyonu ile elektrostatik olarak etkileşir.
DNA ne kadar büyük olursa, TEAA ile o kadar fazla etkileşim gerçekleşir. TEAA ile bir kez
birleştiğinde, etkili olarak hidrofobik DNA Sep kolonu ile etkileşime izin veren hidrofobik bir
dış çevreye sahip olur. Oluşan bağların sayısı DNA fragment boyutuna göre determine edilir.
TEAA köprü molekülü olarak hareket eder ve TEAA’nin alkil zincirleri DNA Sep matrix’inin
hidrofobik yüzüyle etkileşir. DNA Sep matrix’ten DNA’nın elusyonu, hidrofobik eluant
ACN’nin kullanılmasıyla gerçekleşir. ACN, köprü moleküllerinin alkil zincirleri ve durağan
faz arasındaki hidrofobik etkileşimi indirger. Artan konsantrasyonlarda ACN, kolona konulur,
artan boyutta DNA fragmentleri elute edilir. Non-denaturating koşullar altında (50 0C), bu
ayrım boyut bağımlıdır fakat sekans bağımlı değildir.
Fully denaturating sıcaklıklarında, tek zincirli moleküller (RNA veya DNA) separate
edilebilir. Bu mod, oligonükleotit kalite kontrol ve purifikasyonu için kullanılabilir. Oligolar,
bir fragment toplayıcı kullanarak hata peaklerinden etkili olarak separate edilebilir.
Partially denaturating ile, bir nükleotit kadar küçük bir farklılığı olan iki ürünü içeren bir
örneği denature ve hibridize etme, iki homo ve heteroduplex oluşumuyla sonuçlanır. Bunlar 4
farklı peak olarak gözlenir. Fakat, homozigot wild-type kontrol ile karşılaştırıldığında peak
profilindeki herhangi bir farklılık, bir mutasyonun belirtecidir.
Melting algorithm WAWEmaker software’in kullanımıyla determine edilen bir kolon
sıcaklığında (Transgenomik Ltd., Crewe, UK), DHPLC, öncelikle heteroduplexler olarak,
DNA moleküllerini separate eder. Bu, dsDNA duplexte kabarcık oluşumunun bir sonucudur.
Kabarcık, DNA bazları ve kolon durağan fazının ion-pairing tabakası arasındaki elektrostatik
etkileşimler için kullanılabilir yükleri indirger. DNA molekülünün yük yoğunluğu tek iplikli
bölge içerisinde indirgenir.
DHPLC mutasyon tespitine ilişkin önemli prosedürler: PCR primer dizaynı; oil-free PCR;
heteroduplex oluşumu; fragmentin melting profil determinasyonu; separasyon gradientinin
kurulumunu kapsayan metot hazırlanması; örnek hazırlanması; yüklenmesi; örnek analizini
içerir. Optimize edilmiş DHPLC, %94-100 duyarlılıkla heterozigot sekans varyantlarını tespit
edebildiğinde, full-sekans analiziyle karşılaştırır. DHPLC’nin bir PCR ürünündeki alellerin az
bir kısmını içeren mozaik mutasyonları tespit ettiği gösterilmiştir; ki bu mutasyonlar direk
sekans analizleriyle tespit edilememektedir. Sistem jel-freedir ve örnekler direk olarak PCR
cycler’dan WAWE platformuna transfer edildiğinden çoğu kez otomize edilebilir.
Materyaller
1. PCR Amplifikasyonu:
• DNA Template ~50 ng
• OptimazTM Polimeraz (Transgenomik Ltd., Crewe, UK) Amplitaq GoldTM (PerkinElmer, Foster City, CA)
• GeneAmp 10X PCR buffer 11 (Perkin-Elmer) Günlük kullanım için +4 0C’de ve uzun
süre saklamak için -20 0C’de saklanır.
• 25 mM MgCl2 solüsyonu (Perkin-Elmer). -20 0C’de uzun süre, +4 0C’de kısa süre
saklanır.
• -20 0C’de 100 mM dATP, TTP, dCTP, dGTP stokları. Günlük kullanım için 2mM
seyreltilip +4 0C’de saklanır.
• -20 0C’de 100 µM primer stokları. Çalışma stokları 10µM +4 0C’de (Thermohybaid,
İnteractiva Division).
• Oil-free çalışabilen ve 96 kuyu plakalı thermal cycler 9600 (Perkin-Elmer) veya PTC
225 Tetrad (GRI, Essex, UK).
• Microtiter plakaları veya tüp stripleri.
2. DHPLC ve Data Analizleri:
• WAWE DNA fragment analiz sistemi (Transgenomik Inc., Omaha, NE)
• DNA Sep kartuşları (Transgenomik Ltd)
• In-line filtreler (Transgenomik Ltd)
3. Su ve Bufferlar:
WAWE için gerekli Buffer solüsyonları analitik kimya standartlarına göre, cam kaplar içinde
hazırlanmalı. Sağlık ve güvenlik nedenleriyle, her zaman nitril eldivenleri giyilmeli ve çeker
ocak kullanılmalı. Transisyon iyonlarının kolonun ömrünü kısaltması nedeniyle, yüksek kalite
su kullanılmalıdır. Minimum standart HPLCgrade suyudur (Sigma Aldrich Co Ltd., Poole,
UK).
•
•
•
•
Buffer A: Ion-pairing için 0,1 Mtriethyl ammonium acetate (TEAA) (Transgenomik
Ltd.). 2 M 4 0C’de sakla.
Buffer B: Gradient yaratmak için 0,1 M TEAA ve %25 asetonitril (ACN) (Sigma
Aldrich Co Ltd.).
Buffer C: Kolonu temizlemek için %75 ACN (Sigma Aldrich Co Ltd.)
Buffer D: Şırıngayı yıkamak için %8 ACN.
4. Kalite Kontrol:
•
•
pUC18 digest (Transgenomik Ltd.). –20 0C’de sakla.
Mutasyon tespit kontrolü, DYS271. Bu, bir G>A transversiyonunun 209-bp
heterozigot lokusudur (Transgenomik Ltd.). -20 0C’de sakla.
Metotlar
1. PCR Amplifikasyonu (Tablo 1)
Total 25µl hacimde PCR reaksiyonlarını tamamlayınız. İki injeksiyondan fazla işlem varsa,
50 µl kullanınız.
Tablo 1: Bir PCR Reaksiyonu İçin Gerekli Reajan Hacimleri
X1 reaction
Gene Amp 10X buffer 11 veya Optimase reaction buffer 10X 1
2 mM deoxynucleotide 52 triphosphate (dNTP) mix 1
25 mM MgCl2 1
10 ∝M Primer—Forward 1
10 ∝M Primer—Reverse 1
AmpliTaq Gold™ or Optimaz 1
Sterile distilled water
50 ng DNA 1
2.5
2.5
2.5
1.0
1.0
0.1
10.4
5.0
Belirtilen hacimlere göre bir master mix hazırlayınız. Uygun koşullarda örnekleri amplifiye
ediniz. İnisiyel denaturasyon basamağını 95 0C’de 15 dakika, denaturasyon basamağını 35
siklus, annealing, extension ve 72 0C’de 10 dakika final extension basamaklarını
gerçekleştiriniz. Primerleri uygun olarak yerleştiriniz ve mix’i multikanal pipet kullanarak
dağıtınız. Hasta DNA’sı, kuyu başına 50 ng DNA olacak şekilde eklenir. Normal, mutasyonpozitif ve DNA’sız kontrolleri kurulum dizaynına ekleyiniz.
2. Heteroduplex Oluşumu:
Analizlerden önce, direk olarak PCR ürünlerini ısıtınız ve sonra heteroduplex oluşturmak
için yavaşça soğutunuz: 95 0C’de 5 dakika ısıtınız, sonra sıcaklığı 45 siklus boyunca her
siklusta 1,5 0C azaltınız. Homozigot mutant DNAları ve erkek bireylerde X-bağımlı
mutasyonları tespit etmek için, hastanın örneğiyle uygun wild-type PCR ürününü, öncelikli
olarak heteroduplex basamağına, yaklaşık 1:1 oranında karıştırınız. PCR ürünlerini jel
üzerinde her hangi bir hataya karşı kontrol ediniz.
Plaklar, running esnasında buharlaşma ile kayıp verebilir. Bu, autosamplerin soğutma
bloğunun ayarlanmasıyla minimize edilebilir. Alternatif olarak, easy-pierce adhesif yaprağı,
plakları kaplamak için kullanılabilir (ABgene, Surrey, UK).
3. Separasyon Gradient Determinasyonu:
Gradient optimizasyonu için, 60-500 bp uzunluğunda wild-type PCR ürününden yaklaşık
50 µl al. Mutant örnekleri için bu optimizasyon gerekli değildir.
4. Boyut ve Saflık Determinasyonu:
Nondenaturating koşullar altında PCR ürünlerinin fragment boyutu ve saflığını determine
ediniz. Beklenen boyutun tek keskin bir elusyonunu vermelidir. Eğer birden fazla peak
bulunuyorsa, ya da banketli bir peak varsa, öyleyse örnekte bir DNA fragmentinden daha
fazla vardır, ve PCR protokolünü optimize etmeye ihtiyaç duyulabilir.
5. Mutasyon Tespiti İçin Gradient Seçimi:
Mutasyon tespiti için önerilen gradient, dakika başına Buffer B’de %2’lik bir artış
eğilimidir. Tablo 2’de gösterilen yaygın gradient, analiz hızı için optimize edilmemesine
rağmen, bilinmeyen sekanslar için veya tekniğe uygun olan boyut içerisinde her hangi örnek
için kullanılabilir. Akış zamanları, Buffer B’nin daha az bir oranda çıkmaya başlamasıyla
indirgenebilir. Bu optimizasyon WAWE sistem kuruluşu yazılımıyla yapılır. Gradienti, 50
0
C’de nondenaturating koşullarda inisiyel olarak koşun.
6. Separasyon Sıcaklığı:
Tipik olarak, Tm’de (fragmentlerin ortalama %75 sarmal olduğu sıcaklık), mutasyonlar,
evrensel gradienti kullanarak (%1,5-2 daha az buffer B’ye denk), nondenaturating koşullar
altında (50 0C) fragmentin elusyonundan 0,75-1 dakika daha erken bir retensiyon zamanında
tespit edilir.
7. DHPLC ve Data Analizleri:
WAWEmaker yazılımında 3 ana kısım vardır:
1. D-7000 Admin: Bu, datanın depolandığı uygulama klasörlerini içeren dosyalama
sistemidir. Her ay yeni bir uygulama klasörü yapınız ve diğer klasörlerden metotları
kopyalayınız. Birden fazla dosya açıksa, program başlamayacaktır.
2. D-7000 HSM: Bu, ikon yönlendirmeli olan ana programdır. Stepwise biçiminde
kolayca takip edilebilir.
3. WAWEmaker: Bu, D-7000 HSM’e yeni metot getirmeden, metotlar dizayn etmek için
kullanılır.
Tablo 2: WAVE Sisteminde Mutasyon Tespiti İçin Evrensel Gradient
Time (min)
10.0
10.1
16.1
16.2
16.7
16.8
18.0
%A
65 1
60
28
10
10
85
85
%B
35
140
172
100
100
15
115
Flow (mL/min)
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
7.1. WAWEmaker 4.0’da Yeni Bir Proje Yapma:
1. Yeni bir sekans getirmek: Sekansınızı bir text dosyası olarak getiriniz, ki
WAWEmaker onu bir DNA dosyasına çevirir. Sekans dizinindeki DNA dosyasını
kaydediniz. Şimdi projede kullanılmaya hazırdır. Diskteki sekansını şuraya giderek
getirin: File→ Open DNA sequence→Select your sequence from your disk.
WAWEmaker ‘‘your sequence. DNA.’’ şeklinde dosyanın yeniden adlandırılacağını
söyleyecektir. OK’e basınız. Sekansınız şimdi, proje içindeki ‘‘sequence file’’ kutusu
altındaki drop down list’de görünecek. Şimdi sekansınızı, sekans dizininde bir DNA
dosyası olarak kaydediniz.
File →Save DNA→Name your sequence and change→Save in your sequence as the “Save as type” box to
sequence Sequence file (*.DNA) folder
Şimdi sekansınız, sekans dizininde bir DNA dosyası olarak kaydedildi.
2. Önce kaydedilmiş bir sekansı kullanma: DNA dosyası olarak önceden kaydedilen bir
sekans bir projede kullanılmaya hazırdır. Yeni projede sekans açmak için:
File→Open DNA sequence→Select your sequence from your sequence folder
7.2 Erime Profili:
1. Bir erime profili yapma: Sekans file kutusu altında drop down list’de bir kez sekansını
yaptığında, onu ‘‘sequence file’’ kutusunda görünür yapmak için sekans ismine tıklayınız.
Sekansın doğru olduğunu kontrol etmek ve fragmentinin Tm’ini hesaplamak için, ekranın
solundaki ‘‘sequence’’ butonuna tıklayınız. Şimdi sekansınızı text kutusunda
görüntülenmiş olduğunu göreceksiniz. Fragmentinizin Tm’i text kutusunun sağında
görülebilir. Fragmentinizin bir erime profilini görmek için, ekranın solundaki ‘‘melting’’
butonuna tıklayınız ve sonra üst kutunun sağındaki ‘‘calculate’’e tıklayınız. Bu size
‘‘helical fraction vs temp.’’ı gösterecektir. Verilen bir sıcaklıkta fragmentinizin bir erime
profilini görmek için, alt kutunun sağındaki ‘‘calculate’’e tıklayınız. Profilin sıcaklık
dizisi ‘‘calculate’’ butonunun üstündeki kutularda değiştirilebilir.
2. Bir melting profili yazdırmak: File→Print report
Daha sonra raporunuzun bir önizlemesini göreceksiniz. ‘‘Print’’e basınız.
7.3 Metot:
1. Yeni bir metot yapmak: ‘‘Sequence file’’ kutusu altındaki drop down listesinden
sekansınızı açınız. Sekansınızın ismi şimdi kutunun içinde görünecektir. ‘‘Application type’’
kutusu altındaki drop down listesindeki ‘‘mutation’’a tıklayarak uygulama tipini giriniz.
Sonra, fragmentiniz için hesaplanan değerler kutuların içinde gösterilecektir. Gradient
bilgisini görüntülemek için ekranın solundaki ‘‘gradient’’ butonuna tıklayınız. Önceki ayarları
değiştiriniz. Her örnek için run time’ı 6.8 dakikadan 5.6 dakikaya düşürünüz.
Project→Project options→Click on the ‘‘gradient’’ tab
Metodunuz için tüm data doğru ise, ayarlarınızı metot dizinine kaydediniz.
File→Save method as→name your method→Save in your method folder
Şekil 1:Tm’i 55 0C olarak belirlenen tek bir erime domain’i gösteren 480bp’lik bir DNA fragmenti
için erime eğrisi raporu
Şekil 2: GC’ce zengin bir domaine uysun diye, Tm’i 55 ve 58 0C olarak belirlenen iki erime
domaini gösteren 492bp’lik bir DNA fragmenti için erime eğrisi raporu. Bu fragmentte
55 0C Tm’de, 123. baz pozisyonunda bir T/G transversiyonu tespit edilmiştir.
Tablo 3: Mutasyon Tespiti İçin Gradient Hazırlanması
İkaz Seviyesi
Yükleme İçin Düşüş
Yükleme Süresi
Gradient Süresi
Temizleme Süresi
Dengeleme Süresi
Hızlandırıcılı
Normal
5% B
0.1 dk
4.0 dk
0.1 dk
0.9 dk
Hızlandırıcısız
Normal
5% B
0.1 dk
4.0 dk
0.5 dk
2.0 dk
Metotlar genellikle ‘‘Your fragment@temp’’ ve ‘‘Exon 6@57’’ olarak adlandırılır. Metot adınız ‘‘Metot name’’
kutusunda görüntülenir ve metodunuz da metot dizininizde kaydedilir.
2. Önceden kaydedilmiş bir metodu açma:
File → Open method → Select your method from your method folder
Metodunuz ‘‘Method name’’ kutusu altındaki drop down list’de görünür.
7.4. Proje
1. Yeni bir proje yapmak: Önceden kaydetmiş olduğunuz sekansı ve metodu açabilirsiniz:
File → Open DNA sequence/method → Select your sequence/method from the appropriate folder
Fragmentinizin datası kutularda görüntülenir. ‘‘Sample table’’ tabına tıklayınız.
Metodunuzun datası sample table’ın en üst çizgisinde gösterilir. Hatta, metodunuzun datası
seçtiğiniz tüm hatlarda gösterilecektir. Eğer bir plağın başından başlamıyorsanız, örneklerin
şişe sayısının değiştirilmesine ihtiyaç duyulabilir. Örneklerinizin adlarını ‘‘Sample box’’a
yazarak isimlendiriniz.
Her örneğinizin datasının, metodunuz için doğruluğunu kontrol ediniz. Aynı işlemi,
koşulacak herhangi bir ek metot için tekrarlayınız. Şayet bir hızlandırıcı kullanmıyorsanız,
low flow kurulumunu takiben, her running serisinin sonunda, 45 dakika bir 0,9 ml/dk Buffer
C ile kolon yıkama işlemi gerçekleştiriniz (A ve B 50:50, 0,5 ml/dk)
Şekil 3: Şekil 2’deki 492bp’lik fragmentteki 55 0C Tm’de bulunan bir T/G transversiyonun WAWE izi.
Normal bir male kontrol (tek homoduplex peak) karşılaştırma için eklenmiştir. İzin başında ve
sonundaki peakler, injeksiyon peak’ini ve hızlandırıcı peak’ini ayrı ayrı göstermektedir.
Mutasyon, bir ABI 377 kullanarak floresan sekanslamayla karakterize edilmiştir.
Örnek tablonuz tamamlandığında, ekranın ucunda görünen, önceki ‘‘application folder’’ ve
‘‘column name’’in doğru olduğunu kontrol ediniz.
File →Save project as →Name your project →Save in your project folder
Projeler genellikle ‘‘Gene fragment@temp date’’ olarak adlandırılır.
2. Önceden kaydedilmiş bir projeyi açmak:
File→Open project→Select your Project from Project folder
7.5 Örnekleri Koşmak
1. Başlama: Başlamadan önce bufferların ve yıkama solüsyonlarının en azından yarı dolu olup
olmadığını kontrol ediniz. İnjeksiyon kapağını, şırınga iğnesini ve tasfiye sıvı yollarını
imalatçının yönergelerine göre her zaman yıkayınız. Projeniz açıldığında, örnek tablosunun
ucuna gidiniz ve yeni örnek koşmasını başlatmak için ‘‘Run samples’’a tıklayınız. Tahmini
koşma süresi ekranın uç sağ kısmında görünecektir. Koşu başladığında, ekran örnek
tablosundan monitör görüntüsüne değişecektir. Burada, örnekleriniz koşarken sonuçları
göreceksiniz.
2. Bir koşuyu başlıyorken değiştirmek: Koşu yapılırken metodunuzu değiştirme olasılığınız
vardır. Bunu yapmak için, örnek tablosuna gidiniz ve değiştirmek istediğiniz örneğe
tıklayınız. Yeni datayı doldurunuz, ve koşunuz müteakiben değiştirilecektir. Bir örnek koşu
işlemindeyken, onun kaydı örnek tablosunda griye döner ve değişiklikler yapılamaz.
3. Bir koşu başladığında onu durdurmak: Eğer koşunuzu durdurmak veya duraklatmak
isterseniz, örnek tablosu görüntüsüne gidiniz ve ‘‘Pause table’’a tıklayınız. Bunu yaparak,
tamamlanmamış koşudaki örneğinizin sonucunu kaybedersiniz. Şu anda koşunuz ya ‘‘Resume
table’’a tıklayarak tekrar başlatılabilir veya ‘‘Abort’’a tıklayarak durdurulabilir.
7.6 Sonuçlar
1. WAWEmaker koşarken sonuçları görüntülemek: Koşu yapılırken sonuçlara göz atabilir ve
çıktı alabilirsiniz. Bunun için ‘‘results’’a tıklayınız. Görüntülemek istediğiniz örneğin
sonuçlarını listeden örneğinizi seçip üzerine çift tıklayarak açınız. Sonuçlarınız ekranda
görünecektir.
2. Ekran ayarlarını değiştirmek: Pencere için ekran ayarlarını değiştirmek isterseniz, kürsörü
pencerenin üzerine sürükleyiniz ve sağ fare tuşuna tıklayınız. Görünen menüde ‘‘Chart’’a
tıklayınız. Şimdi ayarların herhangi birini değiştirebilirsiniz. Bunu yaptıktan sonra, ‘‘Apply’’a
tıklayınız ve değişikliklerin önizlemesi gelecektir. Sonra ‘‘OK’’e tıklayınız.
3. Birden fazla sonuç görüntülemek: Aynı pencerede birden fazla sonuç görüntülemek
mümkündür. Bunun için, üstteki sonuç penceresinin hemen üzerindeki ‘‘Show all’’ kutusunu
kontrol edilmelidir. Bunu yapınca, örnekler listesine gidiniz ve görüntülemek istediğiniz
örneğin üzerine çift tıklayınız. Görüntülene her sonuç arasındaki boşluk, kürsörü sonuç
penceresinin üzerine sürükleyerek değiştirilebilir. Bireysel sonuçlar arası boşluğu daha geniş
veya daha küçük yapmak için ‘‘Trace axes offset’’ ayarını değiştirmelisiniz.
4. Sonuçların çıktısını almak için: Sonuçlarınız çıktı almaya hazır olduğunda şunu yapınız.
File→print report
Bu size bir önizleme gösterecektir. Raporu printlemek için ‘‘Print’’ butonuna basınız.
Ayrıca, örnek tablonuz ve gradient bilginiz de printlenebilir. Bunun için, soldaki uygun
kutuyu kontrol ediniz ve önceki gibi printleyiniz.
7.7 WAWE sistem raporu
WAWE sistem raporu printlemek, WAWE, pompa için basınç sıcaklık kurgusu yaparken
bir problemle karşılaşıldığı durumlarda kullanışlı olmaktadır. D-7000 HSM’e gidiniz. Ekranın
solundaki ‘‘blue filing cabinet’’ ikonuna tıklayınız ve uygun uygulama dizinini seçiniz.
‘‘Chromatogram’’ ikonuna tıklayınız. Bu, size uygulama dosyasında koştuğunuz örneklerin
listesini verir. Raporunu printlemek istediğiniz örneğin üzerine tıklayınız. Aynı örnek ismiyle
bir başka pencere görmelisiniz. ‘‘modify report’’ butonunu takiben, ekranın ucundaki
‘‘recalculate’’ butonuna tıklayınız. Bu, size WAWE sistem raporunuzun bir print
önizlemesini göstermelidir.
Notlar
1. Bu mod, duplikasyon/delesyon tespiti için, peak yüksekliği ve alan oranlarını karşılaştıran
kantitatif çalışmalar için uygundur.
2. Yüksek pürifikasyon çalışması için bir dizi kolon ve buffer mevcuttur ve ulaşılabilir
(Transgenomik Ltd.).
3. Pratikte, birçok mutasyonla ilişkili homo ve heteroduplex elusyon profilleri üst üste
bindiğinde, 4 peak pattern’i nadiren görülür. Bununla birlikte, analizler için fragment spesifik
Tm’i seçildiğinde (yaklaşık %75 helikal yapı bulunan sıcaklık) ve yaklaşık %70-%90
melting’e uygun sıcaklıklarda, farklı bir mutant patern’i genelde kullanışlı olur.
4. Çoğu operator, jel SSCP/heteroduplex analizleri için orijinal olarak dizayn edilen primer
setlerini kullanmayı seçecektir. Bununla birlikte, bu kanı, tahmin edilen fragment melting
profillerine verilmelidir. Tanımlanmayan mutasyonların tespiti için, 150-450bp’lik
fragmentleri seçmek en iyi tercihtir. Eğer sekans biliniyorsa, uygun yazılımı kullanarak
melting profili kurunuz. Bu profildeki yüksek noktaların kenarındaki primerleri kurunuz,
böylece GC-rich bölgeler, fragmentin ortasında olmasındansa uçlarında bulunur. Aynı
fragmentte 15 0C’den daha fazla farklılık gösteren bölgelerin inklüzyonunu önleyiniz. Eğer
engellenemezse, belki dGTP’yi N7-dGTP ile değiştirmek gerekebilir, ki böylece GC-rich
bölgelerin melting sıcaklığı düşürülebilir, ya da harici olarak, 3 veya 4 bazın kısa bir GC
kenetlenmesi dahil edilebilir. Primerlerin yaklaşık lokasyonları determine edildiğinde, daha
detaylı primer dizaynı başlayabilir.
Evrensel sekans primerleri veya T7 promotorları gibi non-template uçlu primerlerin
kullanımı önlenmelidir. Tavsiye edilen primer melting sıcaklığı 56 0C’dir. Primer 1 ve 2
arasındaki Tm farkı 1 0C’den az olmalıdır. Primer ve template arasındaki Tm farkı yaklaşık 25
0
C olmalıdır. Primerler hatasız sekanslı olmalıdır. Degradasyonu önlemek için, primerleri pür
suda bekletmektense Tris-HCL içinde (pH 8.0) saklamanız önerilir.
5. Elusyon profilleri spesifik bir mutasyon için tutarlı olmasına rağmen, farklı mutasyonlar
ayırt edilemez profiller paylaşabilirler. Sekanslama, varyantların karakterizasyonu için tavsiye
edilir.
6. Yüksek template konsantrasyonları WAWE izini etkileyebilir.
7. Buffer sistemleri deterjan gibi reajanlar içeriyorsa, DHPLC kolon üreticileriyle görüşmeniz
önem arz etmektedir. Aksi taktirde kolon ömrü ciddi şekilde kısalabilir. Fakat, DMSO ve 7deaza-2-dGTP probleme neden olmamıştır.
Tablo 4: Pfu ile ve Optimaz veya TaqGold ile PCR amplifikasyonu protokolü
8. Entegre sistem, otosampler, pompa, kolon fırını, DNASep kolonu, in-line degasser, UV
detektörü, WAWE utility yazılımı 3.4, 4.0, 4.1 veya Navigator bilgisayar sistemi, monitör ve
renkli printer’dan oluşur. Opsiyonel ekstralar, daha ileri analizler veya sekanslamalar için
bireysel peakleri izole etmede fragment toplayıcıyı, baştan sona sample’ın koşu zamanını
indirgemek de bir hızlandırıcıyı kapsar.
9. Enzimler, multivalent iyonlar (Mg+2 gibi ) ve geniş DNA fragmentleri, tüm PCR
örneklerinde vardır. Hep beraber, WAWE DNA Fragment Analiz Sistemi’ndeki PCR ürünü
ile birlikte injekte edilmiştir. %100 Buffer B ile birlikte yıkama basamağı sırasında, genelde,
DNASep kartuşundan elute edilirler.
10. In-line filtrelerini her 1500 injeksiyonda yenileyiniz ve kaydediniz.
11. Genelde en çok yapılan hata bufferların hazırlanmasındadır. Dikkatlice ve HPLC suyunda
durulanmış volumetrix flasklar kullanarak hazırlayınız. Buffer A, B ve D haftada bir, C ise 3
haftada bir değiştirilmelidir.
12. Best Practice Guidelines’a göre, mutasyon standartları haftalık olarak ve iyi kalite kontrol
için her sistem değişiminden sonra koşulmalıdır. Eğer QC testi hata verirse, 80 0C sıcak kolon
yıkamayı deneyiniz. Eğer bu hata verirse, Buffer C ile 80 0C reverse sıcak yıkama yapınız.
80 0C kolon yıkama için, fırını 80 0C’ye kurunuz ve %100 buffer C’yi 30 dk boyunca, 0.9
ml/min hızda koşunuz. Fırını tekrar 50 0C’ye kurunuz, soğumaya bırakınız, sonra Buffer A ve
B’yi koşunuz 50:50 0.9 ml/min hızda, en azından 3 saat dengelenene kadar. Düşük akışa
dönünüz ve iki kör örnek koşunuz, sonra da mutasyon standardı pUC18 digest plus ekleyiniz.
Eğer ilerleme yoksa, reverse sıcak yıkamayı deneyiniz. İlk olarak pompayı kapatınız ve
kolonun yönlendirmesini ters çeviriniz. Sonra daha önce tanımlandığı gibi 80 0C’de fırında
yıkayınız.
13. TEAA ve ACN kısmen tehlikeli kimyasallardır ve güvenlik prosedürleri imalatçı firmanın
talimatlarında belirtildikleri gibi uygulanmalıdır.
14. Metal tıkaçlardan veya şırınga iğnesi üzerindeki yapışkanlıktan dolayı olan tıkanıklıklar
probleme neden olurlar. Bu yüzden şırıngayı en azından her 1000 injeksiyonda bir çıkarıp
temizlemek önerilir.
15. En üstteki grafikte üretilen bir melting profili: helikal fraksiyon vs temperature. 4-6
derecenin üzerinde S şekilli melting eğimi vardır ve bir önemli melting domaini veya birbirine
çok yakın çoklu domainleri vardır (Şekil 1). Daha geniş bir dağılımın üstündeki melting veya
farklı biçimdeki bir profil, çoklu farklı melting domainlerinin varlığını önermektedir (Şekil 2).
16. Uçtaki grafik (şekil 1, 2), bp’ye karşı kurgulanan, her bireyin sekanstaki baz çiftinin
hesaplanan Tm’ini göstermektedir. Ayrıca bu, bp pozisyonunun Y eksenine karşı ve sıcaklığın
X eksenine karşı kurgulanmasıyla, önemli domainlerin melting sıcaklıklarını kontrol etmek
için, gözlenebilir. Eğer sadece bir domain varsa, Tm analizleri genellikle uygun olacaktır.
Eğer bir domainden fazlası olursa; ki bunlar 3 0C’den daha fazla ayrılamazlar, Tm’e çok yakın
bir sıcaklık yeterli olacaktır. 3 0C’den daha ayrı domainler, bilinmeyen mutasyonları
görüntülerken, birden fazla sıcaklık analizi gerektirebilir. Bu sıcaklıklar grafikten türetilebilir.
Geniş fragmentler (>500bp) muhtemelen bir melting domainden daha fazlasına sahiptirler.
Primerleri yeniden dizayn etmek ya da fragmenti bir restriksiyon enzimiyle kesmek en iyi
yoldur.
Primerlerin yakınındaki mutasyonlar, ilk büyük domainin içinde olacaklarından dolayı,
genellikle kolayca görülürler. Bir fragmentin küçük bir kısmı, geri kalanından fark edilir
derecede daha yüksek melting sıcaklığına sahipse, o domain için düşünülen sıcaklıktan 1 0C
daha düşük bir sıcaklık seçmeniz önerilir.
Hazırlayan : Hızlan Hıncal Ağuş
Kaynaklar
1. Oefner, P. J. and Underhill, P. A. (1998) DNA mutation detection using denaturing high-performance liquid
chromotography (DHPLC), in Current Protocols in Human Genetics (Dracopoli, N. C., Haines, J. L., Korf, B.
R., Moir, D. T., Morton, C. C., Seidman, D. E., et al., eds.), 19,Wiley, New York, pp. 7.10.1–7.10.12.
2. Haynes, S., Eccles, D., and Harvey, J. (2000) DHPLC analysis of HNPCC: a rapid sensitive exon screen of
hMLH1 and hMSH2. J. Med. Genet. 37 (Suppl. 1), S42.
3. Wagner, T., Stoppa-Lyonnet, D., Fleischmann, E., Muhr, D. I., Pages, S., Sandberg, T., et al. (1999)
Denaturing high-performance liquid chromotography detects reliably BRCA1 and BRCA2 mutations. Genomics
62, 369–376.
4. Gross, E., Arnold, N., Goette, J., Schwartz-Boeger, U., and Kiechle, M. (1999) A comparison of BRCA1
mutation analysis by direct sequencing. Hum. Genet. 105, 72–78.
5. Giordano, M., Oefner, P. J., Underhill, P. A., Cavilli-Sforza, L. L., Tosi, R., and Richiardi, P. M. (1999)
Identification by denaturing high-performance liquid chromatography of numerous polymorphisms in a
candidate region for multiple sclerosis susceptibility. Genomics 56, 247–253.
6. Liu,W. L., Oefner, P. J., Qian, C., Odom, R. S., and Francke, U. (1998) Denaturing HPLC-identified novel
FBN1 mutations, polymorphisms, and sequence variants in Marfan syndrome and related connective tissue
disorders. Genet. Test. 1, 237–242.
7. Jones, A. C., Sampson, J. R., Hoogendoorn, B., Cohen, D., and Cheadle, J. P. (2000) Application and
evaluation of denaturing HPLC for molecular genetic analysis in tuberous sclerosis. Hum. Genet. 106, 663–668.
8. Klein, B., Weirich, G., and Brauch, H. (2001) DHPLC-based germline mutation screening in the analysis of
the VHL tumor suppressor gene: usefulness and limitations. Hum. Genet. 108, 376–384.
9. Holinksi-Feder, E., Mller-Koch,Y., Friedl,W., Moeslain, G., Keller, G., Plaschke, J., et al. (2001) DHPLC
mutation analysis of the hereditary nonpolyposis colon cancer (HNPCC) genes hMLH1 and hMSH2. J. Biochem.
Biophys. Methods 47, 21–32.
10. Jones, A. C., Sampson, J. R., and Cheadle, J. P. (2001) Low level mosaicism detectable by DHPLC but not
by direct sequencing. Hum. Mutat. 17, 233–234.