hızlan hıncal ağuş

DHPLC
HIZLAN HINCAL AĞUŞ
Denaturating High-Performance
Liquid Chromatography
¾ DHPLC, tanımlanmamış mutasyonların genetik
tanısında, DNA Separation Teknolojisi ile birlikte
kullanılan Transgenomik WAWE DNA Fragment
Analiz Sistemidir.
¾ DHPLC aynı zamanda, TMHA (Temperature-
Modulated Heteroduplex Analysis) olarak da bilinir.
¾ Hızlı ve otomize scanning metodudur.
¾ Mutasyonlar, oluşturulan hetero ve homoduplexler
karışımına göre karakterize peaklar yoluyla
gözlemlenir.
¾ Analizlerde dört software paketi kullanılır; ‘‘WAWE
maker 3.4, 4, 4.1’’ ve ‘‘Navigator’’.
15.11.2007
2
Bir mutasyon için
heterozigot olan bireyler,
wild type ve mutant
DNA’dan 1:1 oranında
bulundururlar.
Mutasyon bulunan
PCR ürünü 95 0C’ye
ısıtılıp, yavaşça
soğutulduğunda, hetero
ve homoduplex
karışımı oluşur.
15.11.2007
Homozigot mutant alel taşıyan
bireylerden alınan DNA, wild
type DNA fragment ile
karıştırılmalı ve hibridize
edilmelidir. Bu örnek, hetero ve
homoduplex karışımını içerir.
3
WAWE nükleik asit analiz platformu ‘‘ion-pair
reserved-phase high performance liquid
chromatography’’ (IP-RP-HPLC) üzerine kuruludur ve
3 modda çalıştırılabilir:
¾Non-denaturating
¾Partially denaturating
¾Fully denaturating
15.11.2007
4
İşlemin iki fazı vardır:
À divinil benzil C18 (alkile edilmiş nonporöz
polistiren) ile paketlenen bir DNA separation
kolonundan oluşan bir ‘‘durağan faz’’ ve
À Asetonitril (organik ko-solvent ) (ACN) ve
DNA’nın durağan fazla etkileşmesini garantileyen
ion-pairing ajanı trietilamonyum asetat (TEAA)
içeren bir ‘‘mobil faz’’
15.11.2007
5
Non-denaturating koşullar altında (<50 0C)
dsDNA, boyutuna bağlı olarak WAWE
buffer sistemle elute olacaktır.
15.11.2007
DNA, büyüklük esasına göre TEAA’nın
amonyum iyonu ile elektrostatik olarak
etkileşir. DNA ne kadar büyük olursa,
TEAA ile o kadar fazla etkileşim
gerçekleşir. TEAA ile bir kez birleştiğinde,
etkili olarak hidrofobik DNA Sep kolonu
ile etkileşime izin veren hidrofobik bir dış
çevreye sahip olur. Oluşan bağların sayısı
DNA fragment boyutuna göre determine
edilir.
6
TEAA köprü molekülü olarak hareket eder ve
TEAA’nin alkil zincirleri DNA Sep matrix’inin
hidrofobik yüzüyle etkileşir.
DNA Sep matrix’ten DNA’nın elusyonu,
hidrofobik eluant ACN’nin kullanılmasıyla
gerçekleşir.
15.11.2007
ACN, köprü moleküllerinin alkil zincirleri ve
durağan faz arasındaki hidrofobik etkileşimi
indirger. Artan konsantrasyonlarda ACN, kolona
konulur, artan boyutta DNA fragmentleri elute
edilir. Non-denaturating koşullar altında (50 0C),
bu ayrım boyut bağımlıdır fakat sekans bağımlı
değildir.
7
15.11.2007
8
Fully denaturating
À Fully denaturating sıcaklıklarında, tek
zincirli moleküller (RNA veya DNA)
separate edilebilir.
À Bu mod, oligonükleotit kalite kontrol ve
purifikasyonu için kullanılabilir.
À Oligolar, bir fragment toplayıcı kullanarak
hata peaklerinden etkili olarak separate
edilebilir.
15.11.2007
9
Partially denaturating
À Partially denaturating ile, bir nükleotit kadar
küçük bir farklılığı olan iki ürünü içeren bir örneği
denature ve hibridize etme, iki homo ve
heteroduplex oluşumuyla sonuçlanır.
À Bunlar 4 farklı peak olarak gözlenir. Fakat,
homozigot wild-type kontrol ile
karşılaştırıldığında peak profilindeki herhangi bir
farklılık, bir mutasyonun belirtecidir.
15.11.2007
10
DHPLC, öncelikle heteroduplexler
olarak, DNA moleküllerini separate
eder. Bu, dsDNA duplexte kabarcık
oluşumunun bir sonucudur. Kabarcık,
DNA bazları ve kolon durağan
fazının ion-pairing tabakası
arasındaki elektrostatik etkileşimler
için kullanılabilir yükleri indirger.
DNA molekülünün yük yoğunluğu
tek iplikli bölge içerisinde indirgenir.
15.11.2007
11
Optimize edilmiş DHPLC, %94-100
duyarlılıkla heterozigot sekans varyantlarını
tespit edebildiğinde, full-sekans analiziyle
karşılaştırır. DHPLC’nin bir PCR ürünündeki
alellerin az bir kısmını içeren mozaik
mutasyonları tespit ettiği gösterilmiştir; ki bu
mutasyonlar direk sekans analizleriyle tespit
edilememektedir. Sistem jel-freedir ve örnekler
direk olarak PCR cycler’dan WAVE
platformuna transfer edilir.
15.11.2007
12
DHPLC mutasyon tespitine
ilişkin önemli prosedürler:
À PCR primer dizaynı
À oil-free PCR
À heteroduplex oluşumu
À fragmentin melting profil determinasyonu
À separasyon gradientinin kurulumunu
kapsayan metot hazırlanması
À örnek hazırlanması; yüklenmesi; örnek
analizi
15.11.2007
13
PCR Primer Dizaynı
Geniş-aralıklı primer dizaynı :
À Bilinmeyen mutasyonların
tespiti, tüm mutasyonların
tespiti için maximum bir
olasılık gerektirir.
À En yüksek doğruluğa ulaşmak
için, burda tanımlanan tekniği
kullanarak tek baz mutasyonları
1.5 kb’lık fragmentlerde tespit
edilmiş olmasına rağmen,
exonu 150-450 bp’lik kısımlara
parçalamak daha iyidir.
À Eğer sekans biliniyorsa, uygun
software’i kullanarak melting
profilini inşa edin.
15.11.2007
14
PCR
Primer
Dizaynı
Geniş-aralıklı
primer
dizaynı :
À Aynı fragmentte 15˚C’den fazla farklılık
gösteren bölgeler yaratmaktan sakının. Eğer bu
mümkün değilse, G-C zengin bölgelerin erime
ısısını düşürmek için dGTP’nin N7-dGTP ile
(7deaza-2’-deoxiguanozin 5’trifosfat)
değiştirilmesi veya 3 veya 4 bazlık kısa bir GC
kıskacı eklemek gerekebilir. Fakat GC
kısakacına ihtiyaç oldukça seyrektir.
À Primerlerin yaklaşık yerleşimlerine karar
N7-dGTP
verdikten sonra daha detaylı primer dizaynı
başlayabilir.
15.11.2007
15
PCR Primer Dizaynı
Lokal Primer Dizaynı :
À Tavsiye edilen primer erime ısısı (Tm) 56˚C’dir.
Primer 1 ve 2 arasında Tm farkı 1˚C’den az olmalıdır.
À Primer ile kalıp arasındaki Tm farkı 25˚C civarında
olmalıdır.
À Herhangi kendiliğinden-birleşmiş primer loopları
12˚C’den düşük Tm’e sahip olmalıdır.
À Primerler hatalı sekanslar olmadan yüksek saflıkta
olmalıdır. Degradasyonu önlemek için, primerleri saf
su yerine Tris-HCl (pH 8.0) tamponunda saklamak
tercih edilebilir.
15.11.2007
16
15.11.2007
17
PCR Protokolü
15.11.2007
18
Heteroduplex Oluşumu
À DNA polimerazı EDTA , 60 mM NaCL, 10
mM TrisHCl (ph 8.0) ile inaktive edin.
À 4 dakika 95 ºC’ye ısıtın, daha sonra 45
dakikadan fazla 25 ºC’ye soğutun.
À Homozigot mutant DNA wildtype ile
hibridizasyondan önce, 1:1 oranında
birleştirilmelidir.
15.11.2007
19
Fragment Boyutu ve Saflık
À Non-denatüre edici koşullar altında PCR ürününün
fragment boyutunu ve saflığını belirleyin. Bu
beklenen boyutta, keskin tek bir DNA piki
vermelidir.
À Eğer birden fazla pik mevcutsa, veya omuz dirsek
yapmış bir pik varsa, o zaman örnekte birden fazla
DNA fragmenti vardır ve PCR protokolü optimize
edilmeye gerek duyar.
15.11.2007
20
Separasyon Sıcaklığı
Tipik olarak, Tm’de (fragmentlerin ortalama
%75 sarmal olduğu sıcaklık), mutasyonlar,
evrensel gradienti kullanarak (%1,5-2 daha
az buffer B’ye denk), nondenaturating
koşullar altında (50 0C) fragmentin
elusyonundan 0,75-1 dakika daha erken bir
retensiyon zamanında tespit edilir.
15.11.2007
21
Separasyon Gradient
Determinasyonu
Gradient
optimizasyonu için,
60-500 bp
uzunluğunda wildtype PCR ürününden
yaklaşık 50 µl al.
Mutant örnekleri için
bu optimizasyon
gerekli değildir.
15.11.2007
22
İşlem Basamakları
PCR örnekleri standart 96-well’li plaklara yüklenir. Bir
otomatik-örnekleyici, DNA fragmentlerinin yüksekçözünürlükte bir micropeliküler matrixle hızlıca
ayrıştırıldığı, DNA Sep kartuşuna 1µL kadar küçük
hacimler enjekte eder.
Analizler örnek başına sadece 5 ila 7 dakikada tamamlanır,
bu 96 örneğin geleneksel jel-tabanlı tekniklerin
gerektirdiği zaman diliminde işlenmesine olanak sağlar.
WAVE sistemi analiz sırasında DNA fragmentinin
miktarını ölçen bir ultraviyole (UV) dedektörü vardır.
Ayrıştırılan fragmentler pik şeklinde izlenir veya bilinen
jel-benzeri bantlar veya her ikisi halinde gözlenir.
Fragmentlerin toplanması (opsiyonel) tamamiyle
otomatiktir.
15.11.2007
23
UV Ölçümü
15.11.2007
24
Avantajları
Eğer gende bir mutasyon oluşursa, bir DNA heteroduplexi
(tam komplementer olmayan ipliklerin eşleşmesi) oluşur
ve bağlanma daha gevşektir. DNA double helixini denatüre
etmek (eritmek) için yüksek sıcaklıklar kullanılabilir. Eğer
bir mutasyon oluşursa, heteroduplexin erime ısısı,
homoduplexinkinden daha düşük olacaktır. Kısmen erimiş
DNA, mutasyon içermeyen erimemiş DNA
homoduplexinden (tam komplementer ipliklerin eşleşmesi)
kolayca ayırt edilebilir.
À Bu DNA double heliksinin denatüre edilme metodu, DNA
sekans analiziyle karşılaştırıldığında hassas, hızlı, doğru ve
ucuzdur.
15.11.2007
25
Avantajları
Eğer WAVE Sistem görüntülemesi bir varyasyonu
tespit ederse, araştırıcılar mutasyonu daha ayrıntılı
anlayabilmek için genellikle geleneksel DNA
sekans analizini kullanırlar. DNA
görüntülemesinde WAVE Sistemi’nin
kullanılması, mutasyon içermeyen DNA’nın
gereksiz, ayrıntılı analizini elimine etmeye
yardımcı olarak zaman ve para tasarrufu yaptırır.
15.11.2007
26
Avantajları
À Hızlı analiz : Tam örnek analizi 5 ila 7 dakikadadır. Fazladan basamaklar
À
À
À
À
gerekmez, ve sonuçlar miktar belirlemesi, analiz, rapor ve arşivleme için
hemen hazır olur.
Kolay örnek kurulumu : Örnekler direkt standart 96-well’li PCR platlerinden
enjekte edilir. Sadece PCR platinizi auto-sampler’a (otomatik-örnekleyiciye)
yerleştirin, bir metodu yükleyin ve analizi başlatmak için mouse’a tıklayın.
Kolay ve doğru metod kurulumu : Kullanımı kolay, menü-işletimli software
sizi adım adım metod kurulumuna sevk eder, analiziniz için doğru koşulları
sağlar.
Güçlü kimya, güvenilir sonuçlar : Yüksek performanslı DNA Sep kimyası,
bir çok örnek ve bir çok çalıştırmadan sonra bile single-stranded
konformasyon polimorfizminden daha üstün tespit doğruluğunda, kuvvetli,
yeniden oluşturulabilen analizler sağlar.
Çok yönlülük : Bir araya getirilmiş yüksek performanslı kabiliyetleri doublestranded DNA, single-stranded DNA ve oligonükleotidlerin yüksek
çözünürlükte ayrıştırılması kadar, mutasyon tespitini de içerir.
15.11.2007
27
Avantajları
À Otomatikleştirilmiş fragment toplanması geri eldeyi
maksimuma çıkartır : Verimlilik ve geri eldedeki artış
opsiyonel otomatikleştirilmiş fragment toplamasıyla en
verimli hale getirilmiştir. Toplanan fragmentler, hiç bir
çözücü uzaklaştırması gerektirmeden müteakip PCR
amplifikasyonu veya cycle sequencing için hemen hazırdır.
À Tam deneysel rapor : Pik izleri ve alıkonma-süre tabloları
raporlarınıza otomatik olarak yerleştirilir. Ve jel-tabanlı
tekniklerin aksine, veriler analiz için veya arşiv ve kendinize
göre analiz etmek için hemen hazır olur.
À Bunların hepsi jelsizdir. Jel hazırlamak ve ekstra postanalizlere gerek yoktur.
15.11.2007
28
Uygulamaları
À Tek-Nükleotid Polimorfizmleri (Single-Nucleotide
Polimorfisms –SNPs) : SNPler WAVE’in ısı-ayarlanmış
heteroduplex analizi (Temperature modulated heteroduplex
analysis-TMHA) metoduyla tespit edilir. Tek baz mutasyonlu
DNA ve wild-type DNA ısıtılır ve bir hetero- ve homoduplex
karışımı oluşturması için yavaş yavaş soğutulur. DNA Sep
kartuşu, baz-çifti uyuşmamaları nedeniyle yapısal olarak
değişmiş heteroduplexi hızlıca ve kolayca ayrıştırır.
À Kısa Sıralı Tekrar Polimorfizmleri (Short Tandem RepeatSTR- Polimorphisms) : Otomatikleştirilmiş gen tiplemesi için
4 ila 12 baz çiftinde farklılık gösteren alleller WAVE Sistemiyle
tespit edilebilir ve ayrıştırılabilir ve daha sonra sekans analiziyle
incelenebilir.
À Oligonükleotid saflaştırması ve sentezin kalite kontrolü :
WAVE’in oligonükleotid sentezindeki hataları kontrol etme ve
oligonükleotidleri saflaştırma yeteneği, yüksek-kalitede sekans
primerleri, PCR primerleri ve hibridizasyon problarının
üretilmesini sağlar. Ek uygulamalar, çeşitli moleküllerle
etkileşen sekans-seçimli DNA çalışmalarında kullanılan
15.11.2007
29
polinükleotidlerin analizini içermektedir.
Uygulamaları
À DNA polimerazların doğruluğu : PCR sesinin
azaltılması, mutasyonel spektrum analizinin hassasiyetinin
artmasına yol açar. En uygun hale getirilmiş PCR
protokollerine ve DNA polimerazın doğruluğunun
değerlendirilmesine WAVE Sisteminin kullanılmasıyla
ulaşılmıştır.
À Transgen insersiyonu veya gen knockout’u için
genotipleme : WAVE’in yüksek-geri eldeli
otomatikleştirilmiş örnek işleme tarzı, memeli ve bitki
fonksiyonel genomiklerindeki yabanıl ve transgenik
türlerin PCR fragment patternlerindeki farklılıkların
analizini en verimli hale getirmiştir.
À Spesifik nükleik asitlerin miktar ölçümü : Spesifik viral
nükleik asitlerin veya hücrelerde ve dokulardaki mRNA
moleküllerinin ölçülmesi rekabete dayalı Reverse
Transkripsiyon PCR (RT-PCR) ve Temperature-modulated
Heteroduplex Analizi ile başarılır.
15.11.2007
30