Hücre ve dokularda biyoteknoloji II

HÜCRE VE DOKULARDA BİYOTEKNOLOJİ II

Biyoteknoloji biyolojik sistem ve süreçleri kullanarak sorunlara çözüm bulunması
ve yararlı ürünler üretilmesidir.

Bir yönüyle yatırımcıya para kazandırırken; diğer yönüyle tıpta, ziraatte,
hayvancılıkta, ilaç ve gıda endüstrisinde bir çok sorunlara çözümler bulunmaktadır.
Üretim
Klonlanmış genlerden proteinlerin sentez ettirilmesi ve saflaştırılması.
Üretim için bakteri hücreleri kullanılır ve ökaryotik konaklar test edilir.
Optimizasyon 2 aşamada yapılır:
-Sistemin biyolojisi
-Üretim süreci
Maya anlatım sistemleri
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Pichia pastoris
Hansela polymorpha
Kluyveromyces lactis
Yarrowia lipolytica
Bakteriyel özellikler gösterirler,
Üretimleri kolay, ucuz besiyeri, çok sayıda farklı mutant
Irk elde edilebilir. Proteinler post-trans mod. ları geçirir.
Örnek

Heterolog protein üretimi yaklaşık 12gL-1
(P. pastoris)
1
Karbon kaynağı olarak metanolde ürer. Üremesi aktivitesi düşük olan alkol oksidaz enzimi
ile düzenlenir (total proteinin %30u). Heterelog genler Aox1 promotörünün önüne
klonlanarak yüksek anlatım düzeyleri elde edilir.
Bakülovirus anlatım sistemi
Anlatımı yapılan protein özel filtrasyon sağlayan sistemlerde saflaştırılır
Bakülovirus anlatım sistemi
Bu virüsler böcekleri enfekte eder ancak memelileri etmez.
Genomu halkasal çift zincirli, 88-200kbdir.
Bir plazmid kullanılarak viral genomla rekombinasyon sağlanır ve istenilen gen aktarılır.
Protein mühendisliği
Gen dizisini değiştirerek proteinlerin yapısının değiştirilmesidir.
Bölgeye spesifik mutagenesis yapılır.
Enzim üretimleri
-Biracılık, gıda, tekstil, deri, deterjan, tıbbi maddeler, temel araştırmalar
Örnek: Kimozin (peynir yapımında) sütteki kazeini yıkan bir proteazdır.
BST: bovine somatotropin bir büyüme faktörüdür. İnekte süt üretimini artırır (bakteride
üretilmiştir).
Terapötik üretimi: bir hastalığın iyileştirilmesi:
2
Protein ürünler: hastalarda üretilmeyen, yada kusurlu üretilen proteinlerin yenilerinin
üretilmesi
Spesifik proteinler: hastalığı iyileştiren protein ürünleri
Rekombinant aşılar
Aşı
Saccharomyces cerevisiae hepatit B virüsünün yüzey antijeni olan HBsAg’yi üretmede
kullanıldı (AdH promotörü kontrolünde)
Domates ve muz kullanılmıştır.
Genetik Mühendisliği&Biyoteknoloji
Protein üretimi
Bakteri
Maya
Böcek
Memeli
hücreleri
Terapötikler
Yer değiştirme
Aşıla
r
Özel hast
tedavisi
BS
T
Hayvancılık
&sağlık
riskleri
Enzimler
Kimozin
Proteazlar
Lipazlar
Mol Biy
ürünleri
TIP VE ADLİ TIPTA GENETİK MÜHENDİSLİĞİ
3
Uygulamalar
•Teşhis ve tedavi
•Adli tıpta DNA profili
Genetik hastalıklar
•Doğum esnasında olan bir hastalık “konjenital” hastalık olarak isimlendirilir ve yeni doğan
bebeklerde %5 oranında bulunur.
Enfeksiyonların teşhisi
•Bakteriyel enfeksiyonlar: “mikrobiyolojik kültür” yapılarak antibiyotik tedavisi verilir
rDNA teknolojisinin kullanıldığı diğer hastalıklar:
Tüberküloz (Mycobacterium tuberculosis)
Human papilloma virus (HPV)
Lyme hastalığı (Borrelia burgdorferi)
enfeksiyonlar: Herpes gibi virüslerin teşhisi zordur (farklı tipleri vardır). HIV’de
standart olarak immünolojik belirleme yapılır.
•Viral
Testler
ELİSA
Western blot
Antijen testi (p24)
Nükleik asitlere dayalı yöntemler
ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)
ELISA hem kalitatif hemde kantitatif olarak antijen-antikor bağlanmasını ölçen bir
testdir. Testi kullanabileceğimiz moleküller hormonlar, enzimler, mikrobiyal
antijenler, ilaçlar yada HIV’de olduğu gibi antikorlardır.
1.
2.
3.
4.
Antijen içeren solüsyon kaba alınarak
60’ çökmesi beklenir.
Serum örneği katılarak antikorların
antijene bağlanması sağlanır.
Bağlanmayan antikor yıkama ile
uzaklaştırılır.
Antikorum Fc bölgesine bağlanan anti
IG antikoru eklenir ve bağlanması
sağlanır. Bu bir antikoenzim
kompleksidir.
“kromojenik” substrat eklenerek renk
oluşumu sağlanır.
•P24 antijen testi: Burada HIV’nin p24 proteinine özgül olan monoklonal antikorlar kullanılır.
Bu antikorlar hastanın kanı ile karıştırıldığında bağlanma olursa enzime bağlı renk reaksiyonu
ile tespit edilir.
Nükleik asitlere dayalı testler
PCR HIV’nin oldukça korunmuş olan gag geninin 142 bazlık hedef bölgesinin çoğaltımına
dayanmaktadır. 2001 yılından beri ABD de kullanılan bu test ile teşhis 12 güne inmiştir. Test
pahalıdır ve önce kan örneğinden 10-20 denemelik havuz PCR lar yapılır. Eğer bunlar pozitif
olursa detaylı teste geçilir.
4
testinde, viral RNA hastanın serumundan saflaştırılır, ve revers transkriptaz ile
DNA ya dönüştürülür. PCR ile viral genomda çoğaltım yapılır. Serumdaki virus miktarı
kantitatif olarak ölçülebilir.
RT-PCR
bDNA yada dallanmış DNA testinde, virüsü konsantre edebilmek için plazma
santrifüj edilir, ve RNA serbest kalır. RNA ya bağlanan özel oligonükleotitler eklenir, aynı
zamanda başka özel oligonükleotitler eklenerek RNA tüpe sabitlenir. RNA nın diğer
kısımlarına bağlanan çeşitli oligonükleotirler eklenir, en son aşamada enzime bağlı oligo
DNA’lar eklenerek renklenme sağlanır. Enzim aktivitesi ile oluşan renk reaksiyonu viral
RNAnın miktarını gösterir. Örneğin antiretroviral tedavi sonucu viral RNA düzeyinde düşme
olursa bu şekilde ölçüm yapılabilir. Testin hassasiyeti ml. de 25.000 kopyadan fazladır.
Gen mutasyonlarının teşhisi
•Bir çok genetik hastalık kromozal olmasına rağmen bir kısmıda tek gen bozukluğu sonucu
oluşmaktadır.
Quantiplex
Kalıtım şekli/Hastalık
Görülme sıklığı
Hastalığın özellikleri
Otozomal resesif
Sistik fibrosis
Tay-sachs hastalığı
Orak hücreli anemi
Fenilketonuri
a-Antitripsin eksikliği
1:2000-1/2500 (Batı)
Iyon transportu kusurlu,
akciğer enfeksiyonu,
pankreas yetmezliği
1:3000 (Askenazi yahudileri) Nörolojik dejenerasyon,
körlük, felç
1:50-1:100 (Afrika)
Kan hücreleri orak şeklinde
olur, anemi, heterozigor
genotip malaria dirençli olur.
1/2000-1/5000
Fenilalanin birikimi sonucu
zeka geriliği,
1/5000-1/10000
Akciğer dokusunda zarar,
karaciğer yetmezliği
Otozomal dominant
Hungtinton hast
Ailesel hiperkolelesterol
Meme kanseri
genleri(BRCA1/2)
Ailesel retinoblastoma
X-bağlı
Duchene müsküler distrofi
Hemofili A/B
Mitokondriyal
Motor fonksiyonların geç
algılanması
1:500
Erken gelişimde kalp
hastalığına yatkınlık
1:800 (Askenazi yahudileri) Meme ve ovaryum kanserine
yatkınlık
1:14000
Retina tümörleri
1:5000-1:10000
1:3000-1:4000
1:10000
Leber kalıtımsal optik nöropati (LHON)
Kas erimesi
Kan pıhtılaşmasında kusur
Optik sinirlerde hata, körlük,
karmaşık kalıtım
Sistik fibroz (CF)
•Taşıyıcı olma frekansı 1/25 kişidir.
•Solunum yolunda yapışkan mukus oluşması en belirgin semptomdur.
•Tedavi ile yaşam ancak 30 yıl sağlanabilir.
•Zardaki Cl iyon transportundna sorumlu bir proteinde bozulma oluşur.
•CF’den sorumlu protein: “Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator” (CFTR)’dir.
5
•Bu
hastalık tek genli kalıtımda bozuk genlerin “pozisyonel klonlama” ile nasıl bulunduğuna
dair iyi bir örnektir.
CFTR’nin yapısı: 5 domenden yapılmıştır, klorid kanalını yapan 2 domen, 2
nükleotit bağlama domeni (ATP’yi bağlar ve hidroliz eder) ve 1 düzenleyici
domen.
•Pozisyonel klonlama: Fenotiple genotip arasındaki bağlantıyı çözer.
•1985’de CF geninin 7. kromozomun uzun kolunda bulunduğunu gösteren, met adı verilen bir
bağlantı markırı bulundu. Bu markır yakın bağlantılı olduğundan rekombinasyona girmedi ve
başlangıç noktası olarak kullanıldı.
•Bu markırın çevresindeki yaklaşık 280kbç DNA potansiyel CF genleri açısından tarandı
(kromozom walking ile)
Sonuçta 4 aday CF geni bulundu.
Gen 250kbç.dir ve 27 ekzon bölgesi vardır. 1480 AAlik bir protein yapar.Bu protein ABC
transport proteinleri ailesine benzer.CF genlerinin %70inde görülen hata ekzon 10’da görülen
delesyondur.Bu mutasyon F508 olarak adlandırılır.
6
Kromozom yürütme ve atlama tekniğinin işleyişi
Mutant aleli olan bireyler normal CFTR oluşturamaz ve hastalık gelişir.
F508 mutasyonları
•CFTR geninde bugüne kadar yaklaşık 1000 mutasyon belirlenmiştir. Bunlar promotör,
çerçeve kayması, AA yer değiştirmeleri, kırpılmada hatalar veya delesyonlar şeklindedir.
F508 CF alelinin teşhisi
PGD (Pre-implantation genetic diagnosis)
•Kendisinde veya ailesinde genetik hastalık olan bir kişiye sağlıklı bir çocuk sahibi olabilme
fırsatını verir.
7
•PGD, prenatal tanı yöntemlerinden farklı bir yaklaşımdır. Prenatal tanı gelişen fetüsde
genetik bir hastalığın veya durumun olup olmadığını test etmekdir. (Amniyosentez, koriyonik
villus örneklemesi (CVS), kas veya karaciğer biyopsisi gibi testler başlıca prenatal tanı
yöntemleridir.)
•Bu uygulamalar gebeliğin 9.-20 haftaları arasında yapılabilir. PGD ise hatalı insan
embriyolarını laboratuar şartlarında genetik olarak taramak amacıyla geliştirilmiştir. Diğer bir
deyimle, embriyoda genetik hata var ise hamileliğe giden süreç baştan durdurulabilir.
PGD (Pre-implantation genetic diagnosis)
•İlk PGD araştırmaları 1980’lerin sonunda İngiltere’de başlamıştır. PGD analizi yapılan ilk
bebek 1989 yılında doğmuştur. 1997’de doğan bebek sayısı 30’un üzerindeydi. 2000 yılında
1500’den fazla çift PGD uygulamaları için başvuruda bulunmuş, 1000’den fazla PGD/IVF
denemesi yapılmıştır.
PGD aşamaları
•Öncelikle anne ve baba taşıdıkları genetik hastalık açısından taranır ve/veya taşıyıcı
belirlenir.
•Anne adayına super-ovülasyon yapabilmesi için özel ilaçlar verilir. Bir çok yumurta ürettirilir
ve bu yumurtalar toplanır.
•Standart IVF (In vitro fertilization/ tüp bebek) prosedürü uygulanır- yumurtalar bir petride
laboratuvar ortamında verici spermleriyle döllenir.
•IVF den 3 gün sonra, başarılı embriyolar 8 hücre bölünmesi yaparlar. Bu embriyolardan
alınan 1-2 hücre moleküler analizlere tabi tutulur.
•İzole edilen DNA’da PCR ile test edilen gene bakılır. Eğer genetik bir hata bulunursa
embriyo yok edilir. Genetik hastalıklara ek olarak embriyoda meme kanseri gelişiminden
sorumlu gende kontrol edilebilir.
•
8
PGD ile test edilebilen bazı genetik hastalıklar:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Orak hücreli anemi,
Spinal musküler atrofi,
Tay-sach hastalığı,
Fenilketonuri,
Retinitis pigmentosa ,
Retinoblastoma,
Huntington hastalığı,
Musküler distrofi (Duchenne ve
becker),
Miyotonik distrofi,
Nörofibromatosis tip I,
Retinitis pigmentosa,
Charcot-Marie-Diş hastalığı,
Barth sendromu,
Turner sendromu,
Down sendromu,
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
OTC yetersizliği,
p53 kanserleri,
Achondroplazi,
adenosine deaminaz eksikliği,
alpha-1-antitrypsin eksikliği,
Alzheimer (AAP geni),
Beta thalasemi,
Sistik fibroz,
Epidermolysis bullosa,
Fanconi anemisi,
Gaucher hastalığı,
Hemofili A ve B,
Fragile X syndrome,
Lesch-Nyhan sendromu –
Rett sendromu
DNA profillemesi
•İnsanların genomları (tek-yumurta ikizleri hariç) birbirinden farklıdır. Bu durum genomların
“belirleyici” olarak kullanımı sağlamaktadır.
DNA parmakizi
•Bu yöntemlerin genel ismi “DNA parmakizi” çalışmalarıdır. Burada şüpheliye ait bir DNA
örneği referans örneklerle eşleştirilir.
•İlk kez Alec Jeffreys tarafından 1985’de düşünüldü (miyoglobin genleri ile çalışmaktaydı).
Çok yüksek seviyede tekrarlı kısımlardır, 100 milyon baza kadar çıkabilir.
Kromozomların sentromer ve telomere yakın olan heterokromatin bölgelerinde yer alır.
Özellikle Y kromozomunda boldurlar.
•Satelitler:
daha orta seviyede tekrarlı olan tandem dizilerdir (9- 100 bç, genellikle 15
bç), genellikle ortalama 0.5- 30 kb’lik arraylerde bulunurlar. Omurgalıların, mantarların ve
bitkilerin genomunda ökromatin bölgelerinde bulunurlar.
•Minisatellitler
orta seviyede tekrarlıdır, kısa tekrarlardır (2-6 bç) . Omurgalı, böcek ve
bitki genomunda vardır. İnsan genomunda ökromatin bölgelerde en az 30.000 mikrosatelit
lokusu olduğu tahmin ediliyor. Kopya sayıları populasyonlar arasında farklılık gösterir,
ortalama 10-100’dür.
•Mikrosatellitler
Bu lokusların genomdaki tekrar sayıları baz alınarak RE ile kesimler ve prob ile hibridize
edilerek yapılan analizler kişilere özel parmakizi çıkaracağından yöntem adli tıpta son derece
güvenilir olarak kullanılmaktadır.
Parmakizi test yöntemleri :
1. Tek lokus DNA parmakizi
9
Çeşitlilik spesifik bir prob veya PCR primerleri kullanılarak tek bir lokusda
belirlenir.Özellikle DNA kırık veya hasarlı elde edilmişse bu yöntem avantajlıdır.
2. Multilokus DNA parmakizi Birden fazla lokusdaki çeşitlilik aynı anda belirlenir. Burada
tek lokusa özgü problar, birden fazla benzer dizi çeşitliliklerini belirleyebilir. Burada hiç
bilinmeyen DNA dizileri üzerinden bir fenotip oluşturulmaktadır. Tek lokusa göre daha bilgi
vericidir.
•VNTR lokuslarında heterozigotluk
•Restriksiyon fragmenti uzunluk polimorfizmi (RFLP): Örneğin:
Alellerde BamH1 kesim noktalarındaki farklılaşma sonucu prob 2 fragmente bağlanır, 2
parça çıkar
Multilokus tiplendirme ile suçlunun teşhisi
•ABD’de
yılda yaklaşık savunma tarafından 200-300.000 örnek; tanıklar tarafından (şüpheli
olmayan) 540.000 örnek DNA analizi için toplanmaktadır.
STR-tiplendirmesi aşamaları
•Biyolojik örneklerden DNA’nın saflaştırılması.
•DNA’nın miktarının ölçülmesi
•STR lokuslarının PCR ile çoğaltılması
•Kapiler elektroforez ile örneklerin ayrıştırılması
Kullanılan
bir prosedürde, insan 17. kromozom üzerindeki primatlara özgül alfa satelit
bölgesine spesifik bir prob ile DNA miktarsal olarak tayin edilmektedir.
Bölge: D17Z1
Burada slot-blot sisteminde
DNA sulandırım yapılarak
kuyulara yüklenir ve prob ile
hibridize edilerek kimyasal
olarak görüntülenir
Günümüzde bu metod yerine
real-time PCR kullanılarak insan
Alu dizileri miktarsal olarak tayin
edilmektedir.
10
(CAG)5 probu bir çok
lokusu tanımaktadır,
Hangisi çocuğun
babasıdır?
Tek lokus tiplendirme
Çocuk ile anne-baba arasındaki akrabalığın
tek problar kullanılarak belirlenmesi
Multilokus tiplendirme
11
Multilokus tiplendirme ile suçlunun teşhisi
DNA testlerinin avantajları:
1. Kan grubu gibi serolojik testlere göre
DNA testleri daha hızlı ve kesindir. Kan
örneğine ihtiyaç olmaz.
2. Kesinlik milyonda 1 gibi bir orandadır.
3. DNA proteinlere göre stabildir, uzun
süre saklanabilir.
Tek lokus prob ile ana-baba tayini. 1 Nolu örnekteki band (DF) annenin aynı
babanın farklı olduğunu gösteriyor.
STR-tiplendirmesi aşamaları
1.
2.
3.
4.
Biyolojik örneklerden DNA’nın saflaştırılması.
DNA’nın miktarının ölçülmesi
STR lokuslarının PCR ile çoğaltılması
Kapiler elektroforez ile örneklerin ayrıştırılması
12
 Kullanılan bir prosedürde, insan 17. kromozom üzerindeki primatlara
özgül alfa satelit bölgesine spesifik bir prob ile DNA miktarsal olarak
tayin edilmektedir.
Bölge: D17Z1
Burada slot-blot sisteminde
DNA sulandırım yapılarak
kuyulara yüklenir ve prob ile
hibridize edilerek kimyasal
olarak görüntülenir
 Günümüzde bu metod yerine
real-time PCR kullanılarak insan
Alu dizileri miktarsal olarak tayin
edilmektedir.
13
Parmakizindeki DNA Bandı Sayısı
Yanlış Band Oluşma Olasılığı
4
1/ 250
6
1/ 4000
8
1/ 65.000
10
1/ 1 milyon
12
1/ 17 milyon
14
1/ 268 milyon
16
1/ 4300 milyon
18
1/ 68000 milyon
20
1/ 1 milyar
Genetik mühendisliğinin Adli tıpta ve
medikal teşhis/tedavide uygulama alanları
• Teşhis
Enfeksiyon (mikrobiyal yada viral DNA)
Genetik hastalıklar
• Gen terapisi
In vivo
Ex vivo
• Adli tıp
Tek-lokus problar
Minisatelit DNA
Multilokus problar
Mikrosatelit DNA
STR amplifikasyonu
14