PowerPoint Sunusu - Erzurum Teknik Üniversitesi

BÖLÜM 8
GEN EKSPRESYONU ANALİZ
ARAÇLARI
1
1. GİRİŞ :
Yeni bir genin klonlanmasından sonraki adım; genin yapısını, ekspresyonu
nasıl düzenlendiğini ve kodlanan gen ürününün biyolojik foksiyonlarını
belirlemektir. Gen ekspresyonu; genlerde kodlanan genetik bilgiden
foksiyonel bir protein yada bir RNA üretimidir.
Gen ifadesi ; en yaygın anlamıyla hem transkripsiyonu hem de translasyonu
kapsayan bir terimdir. Fakat sıklıkla transkripsiyon terimi için kullanılır.
DNA replikasyonu, RNA transkripsiyonu, protein translasyonu ve gen
regülasyonunun temel moleküler mekanızmaları ilk olarak lambda
bakteriyofajında ve E. Coli bakterisinde incelenmiştir. Daha sonra çalışılan her
bir model organizma organizmlardaki komplex yönleri araştırmak için kullanılır.
2
2. Geçici ve Kararlı Transfeksiyon Analizleri
Moleküler klonlama ve gen ifadesinin analizi için önemli tekniklerden biri DNA
‘nın hücre içine girişidir.
Transfeksiyon denen süreç çıplak DNA ‘ nın hücreler tarafından içeri alınmasını
gerekli kılar. Çıplak DNA yı alma metodları:
1- Kimyasal transfeksiyon
2-Lipofeksiyon
3-Elektroporasyon
4-Doğrudan enjeksiyon
5- Mikrobalistik tir.
Diğer transfer tekniği ise viral kapsitlerde paketlenen DNA‘ nın hücre içine
alınımını içerir.
Çoğu deneyde DNA ‘nın hücrede kararlı bir şekilde korunması gerekmez. Bu
durumda geçici transfeksiyon ( DNA ‘ nın hücre içerisine kısa süreliğine girişi )
yeterlidir.
3
Daha uzun süreli analizlerin gerekli olduğu protein overekspresyonu gibi teknikler için
kararlı transfeksiyon gereklidir.
3. Raportör gen
Raportör gen, gen ifadesi analizlerinde sıkça kullanılır. Bir rapörtör gen; RNA
yada protein seviyeleri bilinen kolaylıkla ve doğru olarak ölçülebilen bir gendir.
Bu yüzden bir rapörtör genler gen ifadesi değişiklerini takip etmek için basit bir
araçtır. Bu genler sıklıkla protein ürünlerinin miktarı kolayca ölçülemeyen başka
kodlayıcı bölgelerin yerine konulmak için kullanılır.
Raportör genlerin birkaç önemli avantajı vardır. Araştırmacılar; çalışılacak her bir
regülatör bölge için ayrı bir deneye gerek duymazlar örneğin Raportör genler farklı
dokular veya gelişim safhasındaki diğer bir genin regülatör bölgesinin aktivetisini,
gen aktarma sistemlerinin etkinliğini, protein-protein etkileşimlerini ya da DNA –
protein etkileşimlerini ayrıca moleküler klonlama teşebbüslerinin başarısını analiz
etmek için kullanılır.
4
Roportör genler; genel olarak ökaryot hücrelerin çoğunda bulunmayan enzimatik
aktiviteli ve floresans özelikli proteinleri kodlar. Kullanımı yaygınlaşmış raportör
genlerin kodladığı proteinler arasında β–Gal, lusiferaz, kloroamfenikol asetilaz
(CAT), Yeşil floresan proteini (GFP) ve GUS (β GLUKORONİDAZ ) proteinleri vardır.
Raportör genlein seçimi; kullanılacak hücre sistemi ve istenilen hassasiyet gibi
çeşitli faktörlere bağlıdır.
GUS : glukoronidleri hidrolizler
Beta galaktosidaz: β – Galaktozidlerin hidrolizini sağlar.
Lusiferaz : lusiferini okside eden bir enzimidir.
CAT : Asetil coA dan gelen asetil gruplarıyla kloramfenikolün asetilasyonunu
katalizler .
GFP: doğal bir floresans proteinidir. Işık üretimi için ne substra ne de kofektöre
ihtiyaç duyar.
5
Gen regülasyonunun analizi:
Bir rapörtör genin en yaygın kullanımlarından biri bir gen ifadesinin nasıl regüle
edildiğinin yani düzenlendiğinin analizini yapmaktadır. özel bir regülatör bölgeye
raportör genin eklenmesiyle rekombinant bir DNA elde edilir. Oluşturulan bu yapı
bir hücreye transfekte edilir yada bir organizma içerisine aktarılır. Doğal genin
ifadesini etkileyen her şey raportör genin ifadesini de etkileyecektir. DNA
bağlanma proteinini kodlayan bir cDNA, kültür hücresine alındıktan sonra vektöre
klonlanır. Bu tip bir deneyde hem bir ifade plazmiti hemde bir raportör plazmid
tarnsfekte edilir. Raportör analizi aşırı üretilen proteinin, kontrol bölgesinin
aktivitesi üzerindeki etkisini izlemek için gerçekleştirilir.
Saflaştırma ve belirleme etiketleri ( füzyon proteinler ): Raportör genler, sadece
protein üretiminin sağlanması veya raportör proteinin başka bir protein ile füzyonu
oluşturması için; başka dizilere eklenirler.
Sıklıkla bütün bir raportör proteinin tamamı yerine afinite etiketi veya epitop
etiketi olarak iş gören kısa bir peptit dizisi işaretlemede kullanılır.
6
Bir epitop etiketi, spesifik antikorla tanınan bir antijenik belirteçtir. Protein ifade
vektörleri, genellikle protein yada peptid etiketini kodlayan bir nükleotit dizisi
içerir. İlgili gen, etiket ile alakalı olarak çerçeve içine klonlanır. ilgili protein;
raportör protein veya etiketli peptid ile füzyon bir protein olarak sentezlenir.
Yaygın olarak kullanılan protein yada peptid etiketler: 6- histidin, glutatyon s transferaz (
GST), transkripsiyon faktörü c-Myc FLAG ( Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys a.asiti ) ve
influze A virüsü hemoglutinini ( HA ) içerir.
Bu diziler sentezlenen proteinin N terminal veya C terminal uçlarını bağlanır
bu durmda antikorun saptanması çok daha kolaylaşmaktadır. Etiketler; antikor
afinite reçinlerine bağlanır böylece bir protein kraışımından füzyon proteinin
ayrışması kolaylıkla saflaştırılır.
Füzyon proteinler; DNA–Protein etkileşiminde, protein–protein etkileşimlerinde
, protein lokalizasyonu çalışmalarında kullanılır.
7
Histidin etiketi (His –Tag) : Bu etiket faktörü altı ardışık histidini kodlar. Füzyon
proteini içeren bakteri lizatları ; nikel-nitrilotriasetik asit ( Ni NTA ) ile reçine
içeren kolondan geçirilerek fraksiyone edilebilir. Histidin etiketli proteinler
reçinedeki metalle komplex oluşturur. Histidin etiketli proteinler, imidazol içeren
bir tampon yardımıyla kolondan alınır. İmidozal metallerle komplex yapma üzere
histidinle yarışır. Ve His Tag ile Ni NTA ile etkileşimi bozar protein reçineden
ayrılır.
GST etiketi : GST ifade vektörü 26 kD luk bir protein olan glutatyonu Stranferazı kodlar. Füzyon proteini içeren bakteriyel lizatlar; glutatyon agaroz
kolunundan geçirilir GST kısmı matrikse tutulur. Aşırı miktarda glutatyon ilave
edilerek saflaştırılır. GST etiketinden proteini ayırmak için proteazla kesim yapılır
protein saflaştırılır.
İmmuno etiketler: spesifik antikorlar kovalent olarak protein A seferoza ( yada
agaroz ) bağlanır. Bağlı proteinler epitopa karşılık gelen fazla peptit ile veya
uygun yüksek tuz konsantrasyonu ile ayrıştırılır.
8
Floresans protein etiketler; GFP; hücrelerin lokalizasyonu için yaygın olarak
kullanılan raportör gendir. GFP kendi içerisinde florofor peptid içerir.flororor
protein içerisine yerleştirildiğinde yeşil ışık saçar.
4. INVITRO MUTAGENEZ :
DNA molekülü klonlandığı zaman; invitro mutagenez teknikler, dizi değişimlerini
oluşturmak için kullanılabilir. Bu spesifik mutasyonlar regülator elemetlerini ya da
kritik amino asit kodonlarını saptamak amacıyla, mutant ve yaban tip klonların
fonksiyonel olarak karşılaştırılmasına imkan sağlar.
invitro mutagenezin başlıca 3 tipi vardır. Bunlar delesyon, tarama, site directed
mutagenezdir. Moleküler biyologlar PCR temelli metotlar kullanılır.
PCR İle delesyon mutagenezi ;
Delesyon mutagenezi; bir klondan DNA segmentlerini uzaklaştırır. Bu tip
mutagenez, bir gen promotoru gibi DNA daki regülatör dizilerin analizi için
kullanışlıdır. Delesyonlar ayrıca bir regülatör proteinin DNA bağlanma domaini
yada aktivasyon domaini gibi fonksiyonel domainlerinin yerinin belirlenmesi için
kullanışlıdır. PCR bu delesyonları oluşturmak için uygun bir metottur.
9
Linker – scanning mutagenez : linker tarama mutagenezi , fonksiyonunu
saptanması için, klon genin her bir parçasının sistematik olarak yer
değiştirmesidir. DNA dizileri küçük bloklar şeklinde kesilir ve sonra klon gen
boyunca her pozisyonda oligonükleotit linkerleri ile yer değiştirilir.
Site – directed ( bölgeye özgü ) Mutagenez :Klonlanmış bir DNA molekülünün
belirlenmiş bölgelerinde küçük insersiyonların ya da spesifik baz değişimlerinin
yapılması olarak ifade edilir. Proteinlerde çokça kullanılan bir site directed
mutagenez varyasyonu alanin substitüsyonudur. X ışını kristalografi ile birlikte
kullanıldığında site directed mutagenez, protein yapısını ve fonksiyonundaki kritik
amino asitlerin önemini doğrulamak için uygulanır.
5.RNA EKSPRESYONU VE LOKALİZASYON ( GEN transkripsiyon
seviyesinde analiz )
Genelde hücrenin mRNA seviyelerinde ki değişiklikler, bu mRNA ların karşılığı
olan protein seviyelerindeki değişikliklerle orantılıdır ama bu kuralın istisnalarıda
vardır. Genellikle genler sürekli , geçici , mekana bağlı olarak ifade edilirler.
Sürekli ( konsititütif ) eksprasyon : genlerin her zaman ifade edildiğini gösterir.
10
Mekana bağlı ( spatial ) ekspresyon: Bu genlerin mRNA sı, yalnızca bir organizmanın
spesifik dokularında bulunur.
Geçici ( temporal ) ekspresyon : gelişimin spesifik evresinde ekspres ediliyorsa bu genin
geçici olduğunu gösterir.
mRNA
seviyesinin izlenmesi Northern blotting , in situ hibridizasyon,
rinonükleaz dan koruma ve revers transkripsiyon –PCR gibi birkaç teknik
kullanılarak başarılabilir.Yakın zmanda gerçek zamanlı kantitatif PCR ( Q PCR )
gelişmesiyle mRNA seviyelerinin çok hassas ölçülmesini mümkün kılmıştır.
Northern blotting :
RNA moleküllerini problamak için kullanılır. mRNA‘lar nispeten kısa
olduklarından agaroz jel elektroforeziyle ayrılmaları için hiçbir enzimle önceden
kesilmesi gerekmez. Elektroforez sonrası RNA , EtBr ile boyanarak görünür hale
getirilebilir.Daha sonra RNA Nitroselüloz yada naylon mebrana aktarılır. RNA
probuyla işaretlenir. Otoradyografide görüntülenir. Bir bantın yoğunluğu mevcut
mRNA nın miktarıyla orantılıdır.
Bu teknik transkribe olmuş spesifik RNA ların boyutlarını belirlemek ve miktarını
ölçmek için kullanılır. Bu yüzden bu metot spesifik genlerin ifadesini araştırmada
kullanışlıdır. Northern blot genin kilobaz boyutu seviyesinde iyi tahmin
yapılmasını sağlar. Bununla birlikte çok hassas bir teknik değildir ve bu teknikle
11
düşük miktardaki mRNA ların belirlenmesi zor olabilir.
12
In situ hibridizazyon :
Bir hücrede RNA nın kesin konumunu görebilme imkanını sağlar. Probla
hibridizasyon izole edilmiş RNA yerine , örnek dokuda gerçekleştirilir. Radyoaktif
işaretleme için genelikle tridyum kullanılır. tridyum işaretli probla
inkübasyonundan sonra lam fotografik emilsiyona daldırılır. Ve mRNA nın
konumunu gösterir. Radyoaktif olmayan belirleme metodlarında ise antijen
etiketli prob ve floresans etiketli prop kullanılır. Floresan etikiteli probun
kulanıldığı teknik FISH ( floresan in situ hibridizasyon ) olarak adlandırılır.
RNAaz dan koruma deneyi ( RPA ) :
RPA , total RNA veya mRNA karışım komplexindeki spesifik bir mRNA transkriptini
belirlemek ve miktarını ölçmek için kullanılan hassas bir metottur. ilgili RNA dizisine
komplementer etiketli bir RNA probu, bir invitro transkripsiyon ile sentezlenir. daha
sonra, total RNA veya mRNA karışımına hibiridize edilir. Çift zincirli RNA yı kesmeyen
fakat tek zincirli RNA ‘ ları kesen RNAaz ile muamele edilir. Kesilmeyen herhangi bir
RNA probla komplementer haldedir. Bu nedenle ilgili gen transkibe edilir. Numune
jel elektroforezi ve otordayogarfi ile analiz edilir. Bu yöntem trankripsiyon başlangıç
noktasının belirlenmesi ve mRNA nın iç ve dış sınırının haritalanması için uygundur.
13
Revers transkripsiyon PCR :
mRNA belirlenmesinde kullanılan hassas bir tekniktir. mRNA seviyesiniin analizi için kullanılan
RPA ve Nothern tekniklerine göre daha küçük örneklerden mRNA belirlenmesinde kullanılır.
ilk adımda cDNA kopyaları revers transkriptaz enzimi kullanılarak sentezlenir. ikinci adımda
ilgili spesifik cDNA, gen spesifik primer kullanılarak PCR ile çoğaltılır. PCR ürünleri jel
elektforeziyle analiz edilir.
Bu teknik rutin olarak kabakulak, kızamık , AIDS gibi hastalıklara neden olan RNA virüslerinin
varlığının tanı testinde kullanılır. Tek bir hücrede belirli bir RNA nın var olup olmadığını
belirleyecek kadar hassastır. Bununla birlikte bu metot mRNA nın miktarını doğru olarak
ölçülmesi için kullanılmaz.
Q-PCR ( kantitatif real time )
PCR karışımınına floresan boyaların bağlanmasıyla PCR ürününün real time
ölçümü yapılabilir. mRNA miktarının oldukça hassas ve doğru olarak ölçülmesini
sağlar. revers transkripsiyonla cDNA sentezlenmesinden sonra SYBR Green boyası
varlığında gen spesifik primerlerle çoğaltılır. boya yalnızca çift zincirli DNA ya
bağlandığında floresans ışık saçar. Uzama safhası süresince SYBR Green in PCR
ürünlerine bağlanan miktarı arttığından, yayılan floresan ışığının miktarıda gittikçe
artar. Sonuç olarak müteakip her PCR döngüsünde artan floresan sinyali real time
PCR la belirlenecektir.
14
6. PROTEİN EKPRESYONU VE LOKALİZASYONU (TRANSLASYON SEVİYESİNDE )
Protein ekspresyonu , protein je elektroforezi ve Western Blot, in situ analiz, ELISA
gibi immunolojik araçlarla etiketli füzyon proteinleri oluşturularak birkaç biçimde
analiz edilebilir.
Western blot :
Proteinleri problamak için kullanılır. ilgili protein etiketli bir antikorla
belirlendiğinden Western blot daha tanımlayıcı olan immünoblotting olarakda
adlandırılır. Bu teknik genelde diğer proteinlerle karışık halde ve genelde çok
düşük konsantrasyonlardaki spesifik bir proteini belirlemek için kullanılır. İlk
adım bir SDS poliakrilamid jelle bir protein karışımını ayırmaktır. Poliakrilamid
jelde protein örneklerinin ayırımından sonra proteinler, jelde görülen ayırımın
bir kopyasını elde etmek için elektroforetik transferle bir membrana aktarılarak
blotlanır. Blotlamadan sonra hedef proteini tanımlamak için prob olarak işaretli
antikor kullanılır. Antikor sadece bu proteini içeren banta bağlanırsa bir antikor
tabakası oluşur. Blotlamadan sonra membran ilgili proteine karşı spesifik
monoklonal yada poliklonal antikor solusyonunda inkübe edilir. Sonraki adımda
membran alkalin fosfataz gibi bir enzimin kovalent bağlı olduğu ikinci bir
antikorla inkübe edilir. ikinci antikor birinci antikora spesifik olarak bağlanır. bir
kromojenik substrat ilave edildiğinde enzim bu substratla reaksiyona girer mor
bir çökelti oluşturur. Böylece bant işaretlenmiş olur. Alternatif olarak ışık
üretimine yol açan bir kemilüminesans substratda ilave edilebilir. Bu durumda
membran bir X ışını filmine yatırılır.
15
16
17
In situ analiz :
Floresan protein etiketli füzyon proteinlerinin ekspresyonu ve lokalizasyonu canlı
hücre içerisinde doğrudan analiz edilebilir. Ayrıca in situ yürütülen immünoanalizler
araştırmacıların floresan olarak etiketlenmeyen proteinlerin doğru lokalizasyonuna
bakabilmelerini sağlar. Bu durumda hücreler immünoboyamadan önce fikse
edilerek genelde olduğu gibi mikroskop lamı üzerine yerleştirilir. bu yöntem
genelde Western Blot sonuçlarının doğrulamak için kullanılır. floresans olarak
etiketlenen primer antikorlar belirleme için kullanıldığında teknik doğrudan
immünofloresans analiz olarak adlandırılır. Belirleme için hedef proteine bağlanan
primer (birinci) antikora floresan olarak etiketli sekonder antikor bağlandığı tekniğe
dolaylı indirect immünofloresans analiz adı verilir. Enzim bağlı sekonder antikor
kullanıldığında örneğin tipine bağlı iki terimde kullanılır. olarak organ kesitleri yada
embriyonun tamamına antikor tutturulduğunda teknik immünohistokimya olarak
adlandırılır.
18
Enzim bağlı imminosorbant analiz ( ELISA ):
İmminoanalizler , antijen- antikor reaksiyonlarının miktarını belirler. En yaygın
olarak kullanılan immünoanalizlerden biri ELISA dır.
Bu mettodda iki ana varsyasyon vardır. ELISA ; antikorların tanıdığı antijenlerin
varlığını belirlemek için yada bir antijeni tanıyan antikorları test etmek için
kullanılabilir. ELISA nın en yaygın tiplerinden biri sandviç ELISA dır. Bu teknikte
ilk olarak CAT ( Kloramfenikol asetitransferaz ) tanıyan antikorlar ,96 kuyucuklu
plastik mikroplağın kuyucuklarının yüzeyine sabitlenir. ikinci olarak CAT raportör
geni analizinden elde edilen hücre ekstarları kuyucuklara doldurulur. Ekstratda
bulunan herhangi bir CAT ın kuyucuklara sabitlenmiş CAT antikorlarıyla
etkileşime girmesi sağlanır. Daha sonra CAT ı tanıyan dioksigen etiketli antikor
ilave edilir ve bunların mikroplaka yüzeyine bağlı her CAT proteinine bağlanması
sağlanır. Daha sonra peroksidaz bağlı dioksigeninini tanıyan antikor
digoksijenine bağlanması için ilave edilir. son olarak peroksidaz substratı ilave
edilir ve renkli ürün oluşması sağlanır. ELISA mikroplaka ile absorbansı okunur.
nispeten daha ucuz ve yüksek hassasiyetlidir. Ayrıca düzenli bir biçimde bir
klinik tanı aracı olarak kullanılır.
Hepatit, HIV 1 gibi viral enfeksiyonların belirlenmesinde sıklıkla kullanılır.
19
20
7. ANTISENS TEKNOLOJİSİ
21