akciğer kanserinde, hücre çoğalmasına malat1`in
advertisement
T. C. GAZİANTEP ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ AKCİĞER KANSERİNDE, HÜCRE ÇOĞALMASINA MALAT1’İN (UZUN KODLAMAYAN RNA) ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Hasan DAĞLI YÜKSEK LİSANS TEZİ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI DANIŞMAN Doç. Dr. Serdar ÖZTUZCU GAZİANTEP 2015 T.C. GAZİANTEP ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI AKCİĞER KANSERİNDE, HÜCRE ÇOĞALMASINA MALAT1’İN (UZUN KODLAMAYAN RNA) ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Hasan DAĞLI Tez Savunma Tarihi: 07.07.2015 Sağlık Bilimleri Enstitüsü Onayı Prof. Dr. Mehmet TARAKÇIOĞLU Sağlık Bilimleri Enstitüsü Müdürü Bu tez çalışmasının bir “Yüksek Lisans” derecesi için uygun ve yeterli bir çalışma olduğunu onaylıyorum. Prof. Dr. Ahmet ARSLAN Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Başkanı Bu tez tarafımca okunmuş, kapsamı ve niteliği açısından bir “Yüksek Lisans” tezi olarak kabul edilmiştir. Doç. Dr. Serdar ÖZTUZCU Tez Danışmanı Bu tez tarafımca okunmuş, kapsamı ve niteliği açısından bir “Yüksek Lisans” tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Jürisi İmzası Prof. Dr. Ahmet ARSLAN Doç. Dr. Serdar ÖZTUZCU Doç. Dr. Zafer ÇETİN BEYAN Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlamasından yazımına kadar bütün aşamalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün akademik bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmasıyla elde edilmeyen bütün ilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığını beyan ederim. 10.06.2015 Hasan DAĞLI TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi ve çalışmamın bütün aşamalarında bilgi, tecrübe, destek ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Doç. Dr. Serdar ÖZTUZCU’ya teşekkür ederim. Yüksek lisans dönemim boyunca bilgi ve önerileri ile bize yol gösteren Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Başkanı değerli hocamız Prof. Dr. Ahmet ARSLAN’a teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmam süresince katkı ve yardımlarını esirgemeyen hocalarımız Prof. Dr. Ecir Ali ÇAKMAK, Yrd. Doç. Dr. Mustafa ULAŞLI, Yrd. Doç. Dr. Yusuf Ziya İĞCİ, Yrd. Doç. Dr. Mehri İĞCİ, Yrd. Doç. Dr. Önder YUMRUTAŞ ve Doç Dr. Beyhan CENGİZ’e teşekkür ederim. Laboratuvarda beraber çalıştığımız, iyi ve kötü günlerimde her zaman yanımda olan değerli arkadaşlarım Öğr. Gör. Sercan ERGÜN, Arş. Gör. Sevil KIRKBEŞ, Arş. Gör. İbrahim BOZGEYİK, Arş. Gör. Recep BAYRAKTAR, Ebru TEMİZ, Kaifee Arman, Safdar Muhammad, Murat KORKMAZ, Seçil EROĞLU, Emine BAYRAKTAR, Esra BOZGEYİK, Yunus ŞAHİN, Seçil DEMİRAL, Zekiye ALTAN ve Gizem KARA’ya teşekkür ederim. Bugünlere gelmeme vesile olan, beni yetiştirip büyüten, maddi manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen değerli AİLEM’e teşekkür ederim. Bu tez, Gaziantep Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Komisyonu Başkanlığı tarafından TF.15.08 numaralı proje ile desteklenmiştir. i İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR ..................................................................................................................... i İÇİNDEKİLER .............................................................................................................. ii SİMGE VE KISALTMALAR ....................................................................................... v ŞEKİL LİSTESİ............................................................................................................. vi TABLO LİSTESİ ......................................................................................................... viii ÖZET ............................................................................................................................... 1 ABASTRACT .................................................................................................................. 2 1.GİRİŞ VE AMAÇ ........................................................................................................ 3 2.GENEL BİLGİLER..................................................................................................... 7 2.1. Akciğer Anatomisi ..................................................................................................... 7 2.2. Akciğer Fizyolojisi .................................................................................................... 9 2.3. Akciğer Kanseri ....................................................................................................... 10 2.3.1. Epidemiyoloji........................................................................................................ 10 2.3.2. Etiyolojisi .............................................................................................................. 11 2.3.3. Histolojisi .............................................................................................................. 12 2.3.3.1. Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri ........................................................ 13 2.3.3.2. Küçük Hücreli Akciğer Kanseri ........................................................................ 15 2.4. Hücre Döngüsü Ve Kanser Gelişimi ....................................................................... 16 2.4.1. Kanserli Hücrelerde G1/S Geçişi .......................................................................... 18 2.4.2. Kanserli Hücrelerde G2/M Geçişi ........................................................................ 19 2.5. Hücre Ölümü............................................................................................................ 19 2.5.1. Apoptozis .............................................................................................................. 19 2.5.2. Nekroz ................................................................................................................... 21 2.6. Akciğer Kanser Evreleri .......................................................................................... 22 2.7. Kanserde Kodlamayan RNA’lar .............................................................................. 25 ii 2.7.1. MikroRNA’lar (ncRNAs) ..................................................................................... 26 2.7.2. Uzun Kodlamayan RNA’lar (lncRNAs) ............................................................... 31 2.7.2.1. Uzun Kodlamayan RNA’ların Özelikleri .......................................................... 33 2.7.2.2. Kanserde Uzun Kodlamayan RNA’ların Etkisi ................................................. 35 2.8. MALAT1 ( Metastazla İlişkili Adenokarsinom Transkirip1).................................. 35 3. MATERYAL METOD ............................................................................................. 40 3.1. Hücre Kültürü Öncesi Sterilizasyon ........................................................................ 40 3.2. Hücre Soyları ve Kültür Aşaması ............................................................................ 40 3.3. Mimik RNA’ların Besi Ortamındaki Hücrelere Aktarılması .................................. 41 3.4. Hücre Soylarından Total RNA Eldesi ..................................................................... 42 3.5. RNA Örneklerinden Revers Transkriptaz PCR (RT-PCR) Yöntemi ile cDNA Eldesi ........................................................................................................................................ 43 3.5.1. mRNA’dan cDNA eldesi ...................................................................................... 43 3.5.2. Elde Edilen cDNA’lardan Kalite ve Miktar Tayini .............................................. 44 3.6. MALAT1 ve B-MYBL İfade Düzeyleri Ölçümü için Eş Zamanlı PCR (qRT-PCR) Yöntemi .......................................................................................................................... 45 3.6.1. Primer Seçimi ....................................................................................................... 45 3.6.2. PCR bileşenleri ..................................................................................................... 46 3.6.2.1. MALAT1 ve B-MYBL2 ifade düzeyi ölçümü için PCR bileşenleri ................. 46 3.6.3. İstatistiksel Analiz................................................................................................. 47 3.7. Akım (flow) sitometride apaptozis seviyelerine bakılması ..................................... 48 3.8. Akım (flow) sitometride hücre döngüsü analizi ...................................................... 49 4.BULGULAR ............................................................................................................... 50 4.1. A549 hücre Soyunda MALAT1’in gen İfade Sonuçları .......................................... 50 4.1.1. miR-503-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MALAT1’in katlı değişim ifade sonuçları................................................... 51 4.1.2. miR-150-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MALAT1’in katlı değişim ifade sonuçları................................................... 52 iii 4.1.3. miR-15a-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MALAT1’inkatlı değişim ifade sonuçları.................................................... 53 4.1.4. miR-503-5p, miR-150-5p ve miR-15a-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MALAT1’in katlı değişim ifade sonuçları .................. 54 4.2. A549 hücre Soyunda MYB geninin gen İfade Sonuçları ........................................ 55 4.2.1. miR-503-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MYB geninin katlı değişim ifade sonuçları ................................................. 56 4.2.2. miR-150-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MYB geninin katlı değişim ifade sonuçları ................................................. 57 4.2.3. miR-15a-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MYB geninin katlı değişim ifade sonuçları ................................................. 58 4.2.4. miR-503-5p, miR-150-5p ve miR-15a-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MYB geninin katlı değişim ifade sonuçları ................ 59 4.3. Akım (Flow) Sitometride Apaptozis ve Hüce Döngüsü Analiz Sonuçları .............. 60 4.3.1. A549 hücre soyuna negatif kontrol mimik (nc) verildiğinde elde edilen verilerin apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları .................................................................. 61 4.3.2. A549 Hücre hatına miR-503-5p mimik (miR-503) verildiğinde elde edilen verilerin Apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları................................................................. 62 4.3.3. A549 Hücre hatına miR-150-5p mimik (miR-150) verildiğinde elde edilen Apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları................................................................. 63 4.3.4. A549 Hücre hatına miR-15a-5P mimik (miR-15a) verildiğinde elde edilen Apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları................................................................. 64 5.TARTIŞMA ................................................................................................................ 65 6.KAYNAKÇA .............................................................................................................. 69 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................. 77 iv SİMGE VE KISALTMALAR AJCC American Joint Commitee on Cancer ATM Ataxia telegiectasia mutant CDI Siklin-bağımlı kinaz inhibitörleri CDK protein kinazlar cDNA Complementary DNA EGF Epidermal Büyüme Faktörü KHAK Küçük hücreli akciğer kanseri lncRNA Long non-coding RNA MALAT1 Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 miRNA MikroRNA mRNA Mesajcı RNA ncRNA Non-coding RNA NEAT2 Noncoding nuclear-enriched abundant transcript2 NSCLC Non small cell lung cancer p53 Tümör protein 53 PCR Polimeraz zincir reaksiyonu PRC1 Polycomb Repressive Complex qRT-PCR Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Rb Retinablastoma RISC RNA-induced silencing complex RT-PCR Reverse transkriptaz PCR siRNA Small interfering RNA SR Serin/Arjinin TGF Transforme Edici Büyüme Faktörü TNM Tümör-Nod-Metastaz TÜİK Türkiye İstatistik Kurumu UICC Union for International Cancer Control VALG Veterans Administration Lung Cancer Group WHO World Health Organization v ŞEKİL LİSTESİ Şekil 2.1. Akciğer yapısı .................................................................................................. 8 Şekil 2.2. Gaz alış verişi ve alveollerin yapısı ................................................................. 8 Şekil 2.3. Akciğer kanserinde risk faktörlerin etkisi ..................................................... 12 Şekil 2.4. Skuamoz hücreli karsinom ............................................................................ 14 Şekil 2.5. Büyük hücreli karsinom ................................................................................ 15 Şekil 2.6. Küçük hücreli akciğer karsinomu .................................................................. 16 Şekil 2.7. Hücre döngüsü ve kontrol noktaları .............................................................. 18 Şekil 2.8. Apaptotik sürecinde görev alan moleküller.................................................... 20 Şekil 2.9. miRNA ‘ların biyogenezi .............................................................................. 27 Şekil 2.10. miR-150-5p gösterimi .................................................................................. 28 Şekil 2.11. miR-503-5p’nin gösterimi ............................................................................ 39 Şekil 2.12. miR-15a-5p’nin gösterimi ............................................................................ 30 Şekil 2.13. lncRNA’ların çeşitli biyolojik süreçlere katılması ..................................... 33 Şekil 2.14. lncRNA ‘ların işlevsel özelikleri .................................................................. 34 Şekil 2.15. MALAT1’ in insan kanserlerindeki ifadesi ................................................. 36 Şekil 2.16. MALAT1 ‘in kanserdeki fonksiyonu ......................................................... 37 Şekil 3.1. 2-ΔΔCt formülü ................................................................................................. 47 Şekil 3.2. 2-ΔCt formülü ................................................................................................... 48 Şekil 4.1. miR-150-5p, miR-15a-5p, miR-503-5p ve GAPGH’e ait qRT-PCR analizi sonucu. Örnekler 16 ile 25 döngüleri arasında en yüksek eğim vermiştir. ..................... 50 Şekil 4.2. MALAT1’in ifadesel değeri A459 hücre soyunda miR-503-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. ................... 51 Şekil 4.3. MALAT1’in ifadesel değeri A459 hücre soyunda miR-150-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. ................... 52 Şekil 4.3. MALAT1’in ifadesel değeri A459 hücre soyunda miR-15a-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. ................... 53 vi Şekil 4.4. MALAT1’in ifadesel değeri A459 hücre soyunda, miR-503-5p, miR-150-5p ve miR-15a-5p’nin negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. ....................................................................................................... 54 Şekil 4.5. miR-150-5p, miR-15a-5p, miR-503-5p ve GAPGH’e ait qRT-PCR analizi sonucu. Örnekler 16 ile 25 döngüleri arasında en yüksek eğim vermiştir. ..................... 55 Şekil 4.6. MYB geninin gen ifadesi, A459 hücre soyunda miR-503-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. ................... 56 Şekil 4.7. MYB geninin gen ifadesi, A459 hücre soyunda miR-150-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. ................... 57 Şekil 4.8. MYB geninin gen ifadesi, A459 hücre soyunda miR-15a-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. ................... 58 Şekil 4.9. MYB geninin gen ifadesi, A459 hücre soyunda, miR-503-5p, miR-150-5pve miR-15a-5p’nin negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. ....................................................................................................... 59 Şekil 4.10. A549 hücre soyuna negatif kontrol (NC) mimik verildiğinde A). Apoptozise giden hücrelerin yüzde grafiksel gösterimi. B). Hücre döngüsü grafiksel gösterimi. .... 61 Şekil 4.11. A549 hücre soyuna miR-503-5p verildiğinde A). Apoptozise giden hücrelerin yüzde grafiksel gösterimi. B). Hücre döngüsü grafiksel gösterimi. ............................... 62 Şekil 4.12. A549 hücre soyuna miR-150-5p verildiğinde A). Apoptozise giden hücrelerin yüzde grafiksel gösterimi. B). Hücre döngüsü grafiksel gösterimi. ............................... 63 Şekil 4.13. A549 hücre soyuna miR-15a-5p verildiğinde; A). Apoptozise giden hücrelerin yüzde grafiksel gösterimi. B).Hücre döngüsü grafiksel gösterimi. ................................ 64 Şekil 5.1. Uzun kodlamayan RNA miRNA’lar baskılandığında apaptozis, hücre çoğalması ve hücre göçündeki değişim ......................................................................... 66 vii TABLO LİSTESİ Tablo 2.1. Türkiye’de sık görülen akciğer kanser türünde 100 bin kişide 1 yakalanma oranı ................................................................................................................................ 11 Tablo 2.2. Akciğer kanseri histolojik tipleri radyolojik klinik bulguları ....................... 12 Tablo 2.3. Apoptoz ve Nekrozun kıyaslanması ............................................................ 21 Tablo 2.4. TNM evreleme sistemi ................................................................................. 23 Tablo 2.5. Total evreleme sistemi ................................................................................. 24 Tablo 2.6. kodlamayan RNA‘lar .................................................................................... 26 Tablo 3.1. Kullanılan hücre soyunun özellikleri ............................................................ 40 Tablo 3.2. mRNA’dan cDNA elde etmek için uygulanan Revers Transkriptaz PCR reaksiyon karışımının içerikleri ...................................................................................... 43 Tablo 3.3. mRNA’dan cDNA eldesinde revers transkripsiyon için termal döngüleyici ayarları ............................................................................................................................ 44 Tablo 3.4. Örneklerden elde edilen mRNA cDNA’larının derişimleri .......................... 44 Tablo 3.5. MALAT1 ve B-MYB geninin ifade seviyelerinin belirlenmesi için kullanılan primer dizilimleri. ........................................................................................................... 45 Tablo 3.6. MALAT1 ve B-MYB ifade düzeyinin ölçüldüğü eş zamanlı PCR reaksiyon karışımının içerikleri ....................................................................................................... 46 Tablo 3.7. MALAT1 ve B-MYB ifade düzeyinin ölçüldüğü eş zamanlı PCR ayarları . 47 viii ÖZET AKCİĞER KANSERİNDE, HÜCRE ÇOĞALMASINA MALAT1’İN (UZUN KODLAMAYAN RNA) ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Hasan DAĞLI Yüksek Lisans Tezi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Tez danışmanı: Doç. Dr. Serdar ÖZTUZCU Haziran 2015, 77 sayfa Akciğer kanseri dünyada en sık görülen ikinci kanser türü olup, erkeklerde kanser ölümlerinin en önde gelen nedenlerinden biridir. Akciğer kanserine neden olan birçok çevresel faktörler olduğu gibi, kodlamayan RNA’larında (ncRNAs) etkisi tartışmasızdır. MALAT1 (metastazla ilişkili akciğer adenokarsinom transkirip1), akciğer kanserinde metastaz ve hücre çoğalmasına bir biyobelirteç ve uzun kodlamayan RNA’dır. Bir lncRNA ailesi olan MALAT1’in, gen ifadesinin araştırılması, hücre çoğalmasına etkisinin belirlenmesi, erken tanıda biyobelirteç olarak katkıda bulunacağından bu çalışmanın yapılmasına karar verildi. miRNA’larla MALAT1’i hedefleyerek yazılım sonrası B-MYB geninin, gen ifadesini yeniden düzenleyerek akciğer kanser hücrelerinin hücre çoğalmasını kontrol altına alınabileceğini düşünmekteyiz. Bu amaçla akciğer kanser hücre hattına (A549) hücre kültür ortamında MALAT1’i hedefleyen miRNA’lara maruz bırakıldı. Bu hücre soyunda total RNA elde edilip, cDNA’ya çevrildi. Real-Time PCR kullanarak MALAT1 ve B-MYB gen ifade düzeyine bakıldı. MiRNA’lara maruz bırakılan A549 hücre soyunun hücre döngüsü ve apoptosiz düzeyini belirlemek için flow sitometri cihazı kullanıldı. Yapılan çalışmada elde edilen bulgulara göre, MiR-503’e maruz bırakılmış hücre hattı, negatif kontrol miRNA, miR-150 ve miR-15a’ya maruz bırakılmış hücre hattına göre MALAT1 ve B-MYB gen ifadesi anlamlı bir şekilde düşük bulunmuştur. Hücre döngüsü ve apoptozis seviyesine bakıldığında miR-503’e maruz bırakılmış hücre soyu diğer miRNA maruz bırakılmış hücre soyuna göre apoptozise giden hücrelerin oranından yüksek, G2/M hücre döngüsüne giren hücrelerin sayısı ve oranından daha düşük bulunmuştur. Sonuç olarak; miR-503 ve miR-150, MALAT1’i hedefleyerek akciğer kanser hücrelerin hücre çoğalmasına baskılayacak ve apoptozise artıracak şekilde etkisi olduğunu MALAT1’in ifade seviyesi, hücre dögüsü ve apoptozis düzeyleri üzerinden yorum yapılabileceği söylenebilir. Anahtar kelimeler: Akciğer kanseri, Apoptozis, Hücre döngüsü, MALAT1, miR-503-5p 1 ABASTRACT INVESTIGATION OF CELL PROLIFERATION OF MALAT1 (LONG NON CODING RNA) IN LUNG CANCER Hasan DAĞLI Master of Science Thesis, Department of Medical Biology Supervisor: Assoc. Prof. Serdar ÖZTUZCU June 2014, 77 pages Lung cancer is the second most frequently observed cancer type and is mostly responsible for cancer deaths in males. Many environmental factors that can cause lung cancer such as non-coding RNAs (lncRNAs) whıch are undısputed ın lung cancers. Long noncoding RNAs have been studied in many cancers and have been found to be responsible for metastasis, cell proliferation and invasion in several cancer types. The long noncoding RNA MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1), is a highly conserved nuclear noncoding RNA (ncRNA) and a predictive marker for metastasis and cell proliferation development in lung cancer. Therefore a lncRNA, MALAT1 has been selected for their gene expression studies and for the investigation of MALAT1 as a possible biomarker in diagnosis. It is to be thought that after the downregulation of MALAT1 expression, the alternative splice variant factors of B-MYB control cell proliferation in lung cancer via rearrangement. Taking these in considerations we used Real-Time PCR in order to find out the expression level of MALAT1 and B-MYB in lung cancer cell line (A549). We used flow cytometry to determine the effect in cell proliferation and the level of apoptosis in G2/M. There was a significant decrease in gene expression of MALAT1 and B-MYB in cell line using miR-503 as compared to cell line with negatif kontrol miRNA, miR-150 and miR-15a. When we analysed cell proliferation and apoptosis, there was an increase in the number of cells undergoing apoptosis while there was decrease in the number of cells entering G2/M phase of cell cycle in cells with miR-503 as compared to cells with other miRNAs. As a result it can be concluded that miR-503 and miR-150 has a role in MALAT1 expression, cell proliferation and apoptosis by targeting MALAT1 and has been found to decrease cell proliferation and increase apoptosis of lung cancer cell line. Key words : Apoptosis, cell cycle, lung cancer, MALAT1, miR-503-5p 2 1. GİRİŞ VE AMAÇ Akciğer göğüs boşluğu içinde yer alan ve solunuma yarayan bir organımızdır. Göğüs boşluğunun sağ ve sol yanlarında bulunan iki ayrı parçadan meydana gelmiştir. Plevra denen bir zarla kaplıdır. İçerisi hava ile dolu olan ve ‘‘akciğer kesecikleri’’ denen boşluklardan oluşmuştur. Akciğer vücudumuzun oksijen ihtiyacını karşılayan önemli bir organımızdır. Her organ gibi akciğer organı da birçok hücreden oluşur (1). Akciğer kanseri, yapısal olarak normal akciğer dokusundan olan hücrelerin ihtiyaç ve kontrol dışı çoğalarak akciğer içinde bir kitle (tümör) oluşturmasıdır (1). Burada oluşan kitle öncelikle bulunduğu ortamda büyür, daha ileriki aşamalarda ise çevre dokulara veya dolaşım yoluyla uzak organlara yayılarak (karaciğer, kemik, beyin vb. gibi) hasara yol sebebiyet verirler. Genel anlamda bu tür yayılmaya metastaz adı verilir (2). Akciğer kanseri dünyada en sık görülen ikinci kanser türüdür. Akciğer kanseri oranları dünyanın birçok yerinde erkekler arasında doruğa çıkmış, ancak kadınlar arasında yükselmeye devam etmektedir. Akciğer kanseri erkeklerde kansere bağlı ölümlerinin en önde gelen nedenlerinden biridir. 2013’te Amerika’da yapılan bir araştırmaya göre, yaklaşık 159.480 kişinin akciğer kanseri bağlı ölümlerin sebeb olduğu raporlanmıştır (3). Akciğer kanseri histopatolojik özelliklerine dayalı olarak; küçük hücreli olmayan akciğer kanseri ve küçük hücreli akciğer kanseri olarak ayrılır. Akciğer kanseri mikroskop altında izlenen kanserli hücrenin görüntüsüne göre ayrılır (4). Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri, akciğer kanser türleri arasında en sık görülen türüdür ve yaklaşık %85’lik kısmını teşkil ettiği tahmin edilmektedir (5). Her bir tipin kanser hücrelerinin türü farklıdır. Her kanser hücresi değişik şekilde büyür ve değişik yollardan yayılır (6),(7). Küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin tipleri mikroskopla incelendiğinde kanser dokusundaki hücrelerin türüne ve hücrelerin görüntüsüne göre belirlenir: Skuamöz Hücreli (Epidermoid) Karsinom: Tüm akciğer kanserlerinin yaklaşık %25 ile %30 arasındaki bölümü, skuamöz hücreli karsinomlardır. Bu kanserler, akciğerlerde hava yollarının iç kısmını kaplayan yassı hücreler olarak tabir edilen skuamöz hücrelerinin erken dönemlerinde başlar (8). Adenokarsinom: Akciğer kanserlerinin yaklaşık %40’ı adenokarsinomlardır. Bu kanserler, normalde mukus benzeri maddeler salgılayan hücrelerin erken dönemlerinde 3 başlar. Akciğer kanserinin bu türü, çoğunlukla sigara içen (veya sigara içmiş olan) insanlarda ortaya çıkar, ancak sigara içmeyenlerde görülen akciğer kanserinin en sık görülen tipidir. Kadınlarda erkeklere oranla daha sık görülür ve akciğer kanserinin diğer türlerine oranla genç kişilerde ortaya çıkma olasılığı daha yüksektir. Adenokarsinom, genellikle akciğerin dış bölgesinde bulunur. Akciğer kanserinin diğer türlerinden daha yavaş büyüme eğilimi gösterir ve akciğer dışına yayılmadan önce bulunabilme olasılığı daha yüksektir (8). Büyük Hücreli (Farklılaşmamış) Karsinom: Bu tür kanserler, akciğer kanserlerinin yaklaşık %10 ile %15’i arasındaki bölümünü meydana getirir. Akciğerin herhangi bir bölümünde ortaya çıkabilir. Çok hızlı büyüme ve yayılma eğilimi gösterdiğinden, tedavi edilmesi zordur (8). Akciğer kanserlerinin histolojik tiplerinin zamanla değişiminde birçok faktör rol oynayabilir. Bunlar arasında toplumda sigara içenlerin azalması, tüketilen sigaraların yapısında ve içiminde değişiklik, çevresel karsinojenlere maruz kalma durumunda değişiklik ve akciğer kanseri tanısına yönelik teknolojik ilerlemelerle histopatolojik tanı ölçütlerinde değişiklikler gibi faktörleri sıralayabiliriz (9). Bu sebeble akciğer kanserlerinin histopatolojik tiplerinin dağılımı, yıllara göre değişimi, cinsiyet ve yaşa göre dağılımı ve bunları etkileyen faktörlerin incelenmesi ve izlenmesi akciğer kanserine karşı önlemlerin alınmasında ve geleceğe yönelik tedavi planlarının yapılmasında önemli bir etkendir (10). Akciğer kanseri ile igili yapılan son çalışmalar, akciğer kanserinin sigara kullanımı, çevresel karsinojenlere maruz kalma durumlarına karşın, son yıllarda keşfedilen uzun kodlamayan RNA’ların kanser gelişiminde, ilerlemesinde rol aldığı görülmektedir. Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA) hem kanser oluşumunda hem de normal biyolojik süreçlerde önemli moleküllerin fonksiyonlarını düzenlenmesinde görev alan, 200 nükleotitten büyük kodlamayan bir yazılım dizisidir (11). lncRNA‘lar: X-kromozomu etkinsizleştirlmesi (inaktivasyonu), genomik damgalama (imprinting), kromatin düzenlenmesi, gen yazılımı (transkripsiyonu) ve uç uca ekleme dahil çok sayıda biyolojik süreçlerde, önemli rollere sahiptir (12),(13). Kısaca lncRNA‘lar kanser durumunu denetlemek için bir dizi mekanizma ile hareket eder. lncRNA’ların fonksiyonları ve moleküler mekanizma hakkındaki bilgi artmasına rağmen, kanserlerde çoğu lncRNA’ların işlevi tam olarak bilinmemektedir. 4 LncRNA‘lar etki mekanizmaları ve faaliyet gösterdikleri düzenleyici yollar, hiyerarşiler ve ağların anlaşılması, büyük ölçüde kanser üzerindeki görevleri ve fonksiyonu modüle edilmesi, zamanla aydınlatılması ile yeni tedavi yollarının önünü açacaktır (14). Bu bağlamda bizim yaptığımız çalışma; akciğer kanserinde MALAT1’in doku büyümesi ve hücre çoğalmasına nasıl etki etiğini ve lncRNA’ların mekanizmaların nasıl çalıştığı hakkında daha iyi anlaşılmasına olanak sağlayacaktır. MALAT1 8000 nükleotit uzunluğunda, yazılım sonrası mRNA işleme sırasında rol alan bir lncRNA’dır. MALAT1‘in akciğer kanseri, hepatosellüler karsinom, rahim kanseri, meme kanseri, yumurtalık kanseri ve kolorektal kanserler gibi birçok kanserde ifade edildiği gözlenmiştir. MALAT1’in birçok kanserde tümörlerin gelişmesinde ve ilerlemesinde önemli rol almaktadır (15). MALAT1 hücre çekirdeğinde bol miktarda bulunur ve çekirdekte alternatif uç uca ekleme faktörleri olan serin arjiinin (SR) bileşenlerinin (komplekslerinin) hücre içindeki dağılımı ve aktivitesini modüle ederek öncül-mRNA’yi düzenler. Öncül-mRNA ekleme faktörleri, yapıştırma faktörlerinin mekansal dağılım rolü, MALAT1 ile özel ilişkisi analiz edilmiş ve elde edilen bulgulara göre; MALAT1, SR ekleme faktörleri ile etkileşim içinde olduğu tespit edilmiştir (16). Bu çekirdek nüveleri, onların dağıtımını modüle olduğunu gösterir (17). Ayrıca, MALAT1 in vitro olarak kolaylıkla retina endotelyal hücrelerde; hücre çoğalmasına, hücre göçünü ve tüp oluşumunu düzenler (18). MALAT1 lncRNA’sı birkaç katı tümör düzenlediği ve tümör hücresini çoğalttığı, apaptozun tetikleyen faktörleri baskılamasından (inhibe etmesinde) dolayı yayılıma katkıda bulunur. MALAT1‘le yapılan ilk çalışmalarda, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hastalarında, evre1 de ilerlemesinde önemli bir değişken olduğu ve onun ifadesi ile bu kanser türünde yüksek oranda metastaza neden oluğu gösterilmiştir (19). MALAT1, çeşitli insan karsinomlarında ifade edilmekte olup özellikle küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde aşırı ifade edildiğinden, akciğer kanserinde erken metastaz aşamasında biyobelirtec olarak kullanılabileceğini düşünmekteyiz (20,21). Tümör hücrelerinde MALAT1, durgun (in aktif) halinde iken, tümör oluşturan sebebler azalırken, MALAT1’in aşırı ifadesi ile hücre hatlarında ve farelerde tümör oluşumu ve hücre çoğalmasının artmasına neden olmaktadır (21). Ayrıca, MALAT1 yazılım faktörü E2F1 aktivitesini düzenleyerek hücre döngüsü ve tümörogenez ilerlemesine neden 5 olmaktadır. Tüm bu veriler bize MALAT1’in öncül hücre çoğalmasında işlevi olduğunu göstermektedir. Hücre döngüsünün belirli aşamalarında MALAT1 ayırıcı düzeyleri, hücre döngüsü ilerlemesinde rol oynayan genlerin ifadesini etkilemektedir (22). Dahası, normal insan diploid fibroblastlarında MALAT1, p53 ve hedef genlerin etkinleşmesiyle DNA hasarı yanıtını tetiklemektedir. MALAT1, insan hücrelerinde onkojenik yazılım etmeni BMYB gen ifadesini düzenler (23),(24). MALAT1, kanserli hücrelerde B-MYB gen ifadesini yeniden düzenleyerek hücre döngüsünün G2/M safhasında hücre çoğalmasını arttırdığı bilinmektedir. Bu bulgulara dayanarak MALAT1 hedefleyen miRNA’lar ile, hücre çoğalmasının önüne geçilebilir ve apoptozis tetikleyen faktörleri faal hale getirilebilir. Böylece ileriye dönük tedavi süreçlerinde akciğer kanserinde doku büyümesi ve hücre çoğalmasının önleyecek verileri literatüre girmesini sağlayabiliriz. 6 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Akciğer Anatomisi Akciğer; insandaki solunum sistemi işlevi gören önemli bir organdır. İnsandan başka diğer birçok omurgalı hayvanlar da akciğer solunumu yaparlar (25). Koni biçimdeki akciğerler göğüs boşluğunda yer alır ve göğüs kafesi içinde korunan akciğerler plevra denen koruyucu bir zarla sarılmışlardır. Sağda 3 solda 2 olmak üzere 5 loptan oluşur. Kalp sol tarafta olduğundan soldaki akciğerler küçüktür (Şekil 2.1) (26). Akciğer süngerimsi bir yapıda olup göğüs ve karın boşluğunu ayıran diyafram diye adlandırılan zarın üzerinde yer alır. Hacmi büyüyüp küçülebilir ve renk açık pembe görünümündedir. Soluk aldığında burun ve ağızdan giren hava, nefes borusu ve bronşlardan geçerek akciğere girer toplardamarlarla gelen karbondioksit burada temizlenir (Şekil 2.1) (26). Damar, sinir ve bronşların akciğere girdiği yere plevra zarı bulunmaz. Bu zarlar arasında sıvı bulunur (27). Bu iki zarın iç ve dış kısımları arasındaki boşluklarda az miktar sıvı bulunur. Bronşlar akciğerin içinde bronşçuklarla devam eder. Bronşçukların ucunda üzüm salkımına benzeyen alveol denilen hava kesecikleri bulunur. Alveoller kılcal kan damarınca çevrilidir. Oksijen ve karbondioksit değişimi alveollerde gerçekleşir. Alveollere giren havadaki oksijen kılcal kan damarlarına geçer. Yine kirli kandaki karbondioksit de alveollerde tutunarak dışarı verilir (27). Gaz değişimi kılcal damarlardaki kirli kanla, alveollerdeki hava arasında olur. Her akciğerde yaklaşık 300 milyon dolayında alveol bulunur. Solunum yüzeyini artıracak şekilde dizilmiş olan alveoller akciğerlerde yaklaşık 70-100 m2’ lik bir yüzey oluştururlar (Şekil 2.2) (4). 7 Şekil 2.1. Akciğer yapısı (29) Alveol epitel hücreleri, alveolün iç yüzünü ince bir tabaka şeklinde örten lipoproteinleri salgılar. Bu maddeler alveollerin yüzey gerilimini düşürmeye yarar (28). Şekil 2.2. Gaz alış verişi ve alveollerin yapısı (28). 8 2.2. Akciğer Fizyolojisi Akciğer vücudun göğüs boşluğunda yer alır ve göğüs boşluğunun sağ ve sol tarafında yerleşmiş vaziyettedir. Her akciğer lob olarak adlandırılan bölümlerden oluşmuştur ve yumuşak göğüs kafesinde korunmaktadır (6). Akciğerin temel işlevi vücuda oksijen getirmek ve vücutta birikmiş olan karbondioksiti dışarı atmaktır (6). Akciğerler aynı zamanda tahriş edici etkenlerden korumak için koku alma duyusu olan burun, ona göre dizayn edilmiştir. Burun; akciğere girecek olan kirleticilerin ve büyük parçacıkların önlenmesinde filtre görevi görür. Tahriş edici etmenler akciğere girip akciğerde tahrişe neden olursa, mukus dediğimiz ( yerel dilde balgam olarak bilinir) nefes tüplerinin üzerinde salgılanan sıvının solunum tüpleri tarafından ağıza doğru süpürüp ağızdan dışarıya doğru atılarak tepki verirler (30). Akciğerin bir başka koruyucu mekanizması da öksürüktür. Öksürük normal bir durum iken, aynı zamanda bronşların tahrip edilmesi sonucu ortaya çıkan bir olaydır. Normal bir öksürük, solunum organları tarafından akciğerlerden mukusu hızlı bir şekilde dışarıya doğru atmasını sağlar. Akciğer solunum yolları kas bantları ile çevrilidir. Akciğerler tahriş olduğunda bu kas bantları solunum yollarını daha sıkı hale gelmesini sağlar ve solunum zor hale gelir. Bu kasların sıkı hale gelmesine bronkosposm denir. Bronskospazm ( Bronchospams KOAH'lı ) olan kişilerin hava yolları daraldığından, nefes alması daha zordur. Bu genellikle astım hastası olanlar için büyük sorundur (31). Hava burun ve ağızdan girdikten sonra, trakea ya da ‘’nefes borusu’’ aşağı doğru hareket eder. Trakea: boyuna yakın olan tüpüdür ve bir sol bir nefes borusunu içine böler bunlara bronşlar denir. Akciğerin yarı içinden yarı dışarıdan olan bölmeleri, akciğer içerisinde ilerledikçe ince bronşçuklara ( bronchulus ) ayrılır. En son 1mm. çapında olan bronşçukların her biri italyanca ‘’üzüm salkımı’’ anlamına gelen alveolde sona erer (31). 9 2.3. Akciğer Kanseri 2.3.1. Epidemiyoloji Akciğer kanseri dünyada kansere bağlı olarak ölümlere neden olan en tehlikeli kanser türü haline gelmiştir. Erkeklerde kansere bağlı ölüm nedenleri arasında ilk sırada yer alır, kadınlarda bu kanser türüne bağlı ölümler ikinci sıradadır (32). Son yıllarda tedavi ilerlemelerine rağmen, akciğer kanseri tanısı konulan kişilerin neredeyse yarısı sırasında uzak bölgelere metastaz yaptığından, son 30 yılda önemli ölçüde ilerleme sağlanamamıştır (33). Bu kanser türünde, uzak bölgelere metastaz yaptıktan sonra, hastaların ortalama sadece % 5’i hayatta kalmayı başarabiliyor. Akciğer kanser hastalarının ortalama yaşam süresi 14 yıl kısalır (3). Dünya genelinde kansere bağlı ölümlerin başta gelen nedeni olmasına rağmen, akciğer kanser insidansı giderek azalmaktadır. Yine Amerika’da 2008 yıllında elde edilen verilere göre, 215.020 yeni vakanın bu kanser türüne ait olacağı ve 161.840 kişinin bu hastalıktan dolayı öleceği tahmin edilmektedir (34). Dünya verileri global olarak cinsiyet ayırımı yapmaksızın değerlendirildiğinde akciğer kanseri yılda % 0.5 oranında arttığı bilinmektedir (35). Türkiye’de de akciğer kanserine sık rastlanılmaktadır. Kanserli hastaların verilerinin düzenli olarak toplanmasındaki eksiklikler ve sıkıntılar nedeniyle, ne yazık ki ülkemizde gerçek istatistiksel rakamlara ulaşılamamaktadır. Sağlık bakanlığı kanser kontrol ve kanser istatistiği kurumu’nun verilerine göre, 1999 yılı akciğer kanseri insidansı sadece 14.2/100 000’dir (erkeklerde 7.8/100 000, kadınlarda 1.2/100 000). Bu verilere göre, akciğer kanseri erkeklerde en sık görülen kanser türüyken, kadınlarda 6. sırada yer almıştır. Diğer taraftan İzmir’de, 199394 yılı akciğer kanser insidansı 61.6/100 000 bulunmuştur ki, bu rakama göre Türkiye, dünyada akciğer kanseri insidansı en yüksek olduğu ülke konumu haline getirmiştir (36). Sağlık bakanlığı Türkiye’de kanser hastalığına bağlı vakaların son 10 yılda yaklaşık yüzde 80 oranında arttığını açıkladı. Ayrıca sağlık bakanlığı, ’’TÜİK verilerine göre:2002 yılında kansere bağlı ölüm % 12 iken, bu oranın 2012 yılında % 21’e ulaştığını açıkladı. Türkiye’de bölgelere göre; erkeklerde akciğer kanseri dağılımı şöyledir (Tablo 2. 1). 10 Tablo 2.1. Türkiye’de sık görülen akciğer kanserinin 100 bin kişide 1 yakalanma oranı Türkiye‘de dağılımı bölgelere göre kanser Erkeklerde akciğer kanser dağılımı Ege Bölgesi 42 Marmara 19 Karadeniz 31 İç Anadolu 24 Akdeniz 21 G. Doğu Anadolu 6 Doğu Anadolu 10 * 2012 yılında TÜİK’ in açıkladığı veriler, esas alınmıştır. 2.3.2. Etiyolojisi Sigara içimi akciğer gelişiminde önemli bir risk faktörüdür. Akciğer kanserinden ölümlerin % 80- %90 sigaranın neden olduğu tahmin edilmektedir. Sigara ile akciğer kanseri arasında önemli bir ilişki vardır (37). Bunlardan ilki tütün içindeki polisiklik, aromatik hidrokarbonlar, sigara dumanı içindeki mevcut kanseriyojenik bileşiklerin p53 geninde neden olduğu mutasyonlar. İkincisi, tütün dumanında bulunan N-nitrozo gibi büyük önemli grupladır. Bu bileşikler potansiyel kanserojenik kimyasallardır ve sigara içenlerin idrarında bulunur (38). Amerika çevre koruma ajansı, sigaradan sonra akciğer kanserinin ikinci önemli nedeni radon olarak belirlemiştir. Radon toprakta difüze olması nedeniyle yüksek risk taşımaktadır. Yine yeraltı madencileri yüksek radon derişimine maruz kaldığından akciğer kanseri riskinde sahip oldukları bulunmuştur. Solunan radon, alfa ışıması nedeniyle akciğerin epitel hücrelerinde birikmesi radyasyona neden olduğundan akciğerde kanserojen bir etkiye sahiptir (39). Buna ek olarak, tütün dumanı ile birlikte solunması, sinerjik bir etkiye sahiptir (şekil 2.3). Kansere neden olan diğer bir etken de asbesttir. Asbest doğal kayalarda mineral lifler halinde bulunur ve endüstride yaygın olarak kullanır. Kritozil, amosite, antofilit, ve krosidolit içeren karışık lifler gibi asbest liflerine maruz kalındığında, yüksek akciğer kanseri insidansı ile sonuçlandığı raporlanmıştır (40). Asbeste maruz kalan bireyler akciğer kanseri gelişiminde potansiyel risk taşımaktadır. Asbeste maruz kalanların 11 normalden 3 kat kadar daha yüksek risk altındadır (41). Akciğerde asbest kaynaklı etkiler doza bağlıdır. Aynı zamanda demirce zengin olan liflerin bileşimine ve ilgili girdilere (reaktiflere) bağlı olarak etki gösterir (41). Yine akciğer kanseri hastalarında asbeste maruz kalındığında; RASSF1A, CDKN2A (p16) ve tümör baskılayıcı genler, işlevini yapamaz hale gelir, tümör hücrelerin büyümesine, artmasına ve yayılmasına neden olurlar (42). Akciğer kanseri, sigara ve puro içilmesi, radona, asbestosa, arseniğe maruz kalmasının yanında sigara dumanına maruz kalınması, aile fertlerinde akciğer kanseri vakaların yaygın olması, meme ve göğüste radyasyon tedavisi ile tedavi görmüş olması, hava kirliliğin olduğu yerlerde yaşanılması, insanın bağışıklık sistemini tahrip eden (HIV) virüsü ile enfekte olmak, beta karoten kullanımı ve ağır sigara içilmesi gibi bir çok etken neden olabilir (şekil 2.3). Şekil 2.3. Akciğer kanserinde risk faktörlerin etkisi (43) 2.3.3. Histolojisi Dünya Sağlık Örgütü, (WHO) akciğer kanserinin histopatolojik sınıflandırmasını 2011 yıllında yeniden güncellemiştir. Tümörün büyüme hızı, yayılımı, metastazın zamanlaması, kemoterapi ve radyoterapiye yanıtına göre küçük hücreli olmayan akciğer kanseri ve küçük hücreli akciğer kanseri olmak üzere iki başlık altında toplamıştır. Küçük 12 hücreli olmayan akciğer kanseri de kendi aralarında; adenokarsinom, skumaz hücreli karsinom ve büyük hücreli karsinom olmak üzere alt gruplara ayrıldı (Toblo2.2) (44). Tablo 2.2. Akciğer kanseri histolojik tipleri radyolojik klinik bulguları 1. Küçük hücreli akciğer kanseri Sigara ile yakın ilişki, Sıklıkla santral yerleşimi, Mediastinal lenfadeneopati birlikteliği sıktır. En kötü prognozlu tür. 2. Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri Adenokarsinom En sık görülen tür, Genelikle sigara içmeyen kadın hastalarda görülür. Sıklıkla periferik yerleşimli, Radyolojik olarak hava bronkogramları şeklinde olabilir. Sküamoz Hücreli Kanser İkinci en sık raslanan tür, Sigara ile yakın ilişkili, Sıklıkla santral yerleşimli, Kaviteleşme gösterebilir. Büyük hücreli kanser En nadir görülen tür Sıklıkla periferik yerleşimli 2.3.3.1. Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri; tüm akciğer kanser vakaların % 80’i-%85’ini oluşturur ve hücrelerin yapılarına göre üç başlık altında incelenir. 1. Adenokarsinom, 2. Skuamoz hücreli karsinom, 3. Büyük hücreli karsinom. Adenokarsinom Küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin yaklaşık % 50’sini oluşturur. Diğer akciğer kanserlernin aksine sigara içimi arasında zayıf bir ilişki varolup ekseriyet sigara içmeyen kadınlarda yaygın görülür. Daha önceden varolan skar dokusundan gelişebilir ve bu nedenle ‘’skar karsinomu’’ olarak da bilinir (42). Periferik yerleşimli kitleler doğrudan plevra yayılımı yaparak plevra boyunca dairesel büyüme gösterirler (42). 13 Moleküler biyoloji ve teknolojinin gelişmesi ile yeni yöntemlerin çeşitlenmesi sonucu (Uluslararası akciğer kanseri çalışma grubu, Amerikan toraks derneği, Avrupa toraks cerahi birliği) tarafından özellikle adenokarsinom bir alt ünitesi sınıflandırmasına gidildi. Bu yeni sınıflandırma çoklu disipliner izleme dayalı olarak hastalığın seyrini ve ne kadar süre devam edeceğini tahmini belirlemede toplam boyuttan ziyade içerdiği bileşenle birlikte yayılım boyutu ön plana çıkmıştır (45). Skuamoz Hücreli Karsinom Skuamoz hücreli karsinom, akciğer kanserinin yaklaşık %25 ile %30 kısmını teşkil etmektedir. Bu kanser türü, akciğerde hava yollarının iç bronşlarını kaplayan yassı hücreler olan skuamoz hücrelerinin erken safhalarında başlar. Bu kanser türü, sigara ile yakın ilişkili olup, genellikle kadınlara göre erkeklerde daha yaygın görülür. Ayrıca epidermoid karsinom olarak da bilinir. Son yıllarda sigaralara filtreler eklenmesi sonucunda vb. skuamoz hücreli karsinomu giderek azalmaktadır. Akciğerlerin ortasında ve bronş yakınında bulunma eğilimi gösterirler (Şekil 2.4) (46) Şekil 2.4. Skuamoz hücreli karsinom (46) Büyük hücreli karsinom Büyük hücreli karsinom tüm akciğer kanserinin yaklaşık %10 ile %15’i arasındaki bölümünü oluşturur. Bu tür, akciğerin herhangi bir bölümünde ortaya çıkabilir. Çok hızlı büyüdüğünden ve yayılma eğilimi fazla gösterdiğinden dolayı tedavi edilmesi oldukça zordur. Büyük hücreli nöroendokrin karsinom olarak bilinen büyük hücreli karsinom alt türüdür, küçük hücreli akciğer kanserine çok benzer hızla büyür (47). 14 Büyük hücreli akciğer kanserinin en büyük nedeni sigaradır. Yine sigara dumanına maruz kalanlar büyük risk taşır. Ancak sigara içmeyen ve hiç sigara içmemiş kişilerde de bu tür kanser vakaları görülür. Hava kirliliği düzeyi yüksek olduğu yerlerde yaşanılması ve yine kanser neden olan kimyasal madde veya malzemeler (asbest gibi) yakın çalışanlar için büyük hücreli akciğer kanser riskini taşır (48). Şekil 2.5. Büyük hücreli karsinom (48) 2.3.3.2. Küçük hücreli akciğer kanseri Bu tipteki kansere bazen yulaf kanseri adı da verilir. Küçük olmayan akciğer kanserine göre daha az yaygındır, ancak daha hızlı gelişir ve vücudun diğer organlara yayılması daha fazladır (49). Küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK) nöroendokrin tümörlerden sayılır ve bütünsel akciğer kanserlerinin %15 ile %25’ini oluşturur. KHAK genellikle göğüs ortasına hava tüplerince (bronşlarlarda) başlar ve çok hızlı büyür. Erken dönemde uzak organlara metastaz yaptığı için sistematik bir hata kabul edilir. Ayrıca KHAK kemiğe, karaciğere ve karşı akciğere sıklıkla metastaz yapar. Bunun yanında % 40 bulan beyin metastazı görülmektedir (50). KHDAK hücreleri iyi tanımlanmamış hücre sınırları ve yetersiz stoplazmaya ve ince taneli çekirdek kromatine sahip olup küçük hücrelerden oluşan bir malign epiteyal tümördür. Hücreleri yuvarlak, oval veya iğ şeklindedir. Çekirdek kalıpları belirgin ve mitoz sayısı yüksektir (51). KHAK % 95’i akciğer kaynaklı karsinom olsada, ekrapulmoner bölgelerinden, nazofarenks (nasopharynx) alan, genitoürneral 15 (genitourinary) alan ve gastrointesnital (gastrointestinal) alanlarda da ortaya çıkabilir (51). KHAK, küçük hücreli olmayan karsinom hücrelere benzer klinik ve biyolojik davranışlara sahip metastaz potansiyeli yüksek karsinom hücrelerdir (Şekil 2.6) (51). Yapılan araştırmalar neticesinde akciğer kanseri için risk faktörlerinin, akciğer hücrelerinin DNA’sında bazı değişiklikler kaynaklandığı tespit edilmiştir. Bu değişiklikler zaman zaman anormal kanser hücrelerin büyümesine yol açmaktadır. Küçük hücreli akciğer kanseri vücutta hızla yayıldığı için tedavisi zordur. Genellikle tedavi kanseri öldüren ilaçlar (kemoterapi) alınır veya vücutta enjekte edilir. Bir diğer tedavi ise nadir de olsa cerrahi yöntem kullanılmasıdır. Genellikle yayılmamış tümör hücreleri sınırlı ise; hastaya cerrahi yöntemi uygulanır, kemoterapi veya radyasyon ameliyat sonrası gerekli görülür. Bu kanser türünde hızlı yayıldığından çok az sayıda hasta ameliyat için adaydır. Kemoterapi ve radyasyon tedavisi yoğun küçük hücreli akciğer kanseri olan kişilere verilir. Ancak, tedavi sadece belirtileri gidermek için yardımcı olur; bu hastalığı tedavi etmez (Şekil 2.6). Şekil 2.6. Küçük hücreli akciğer karsinomu (52) 2.4. Hücre Döngüsü ve Kanser Gelişimi Bir hücrenin canlılığının göstergesi birbirine tıpa tıp benzeyen iki yavru hücreye bölünmesidir. Hücre döngüsü, DNA sentezinin gerçekleştiği S evresi, mitoz bölünmenin izlendiği M evresi ve bu iki temel süreç arasında kalan geçici duraklama evreleri olan G1 16 ve G2 evreleri olmak üzere, başlıca 4 evrede gerçekleşir. Mutajenik etkilerin büyük bir kısmı hücrenin mutasyonlara karşı hassas olduğu hücre döngüsü esnasında gerçekleşir. Genel olarak, hücreler bir bölünme uyarıcı almadıkları sürece hücre döngüsü aktif (G1, G2, S ve M) fazlarına girmezler ve istirahat fazı denilen G0 fazında beklerler. Hücrenin bölünmesinde görev alan uyarıcılar (örneğin, büyüme faktörleri, sitokinler veya mitojenler) çok çeşitlidir (53,54). Hücreler mitoza girmeden önce bir hazırlık safhası geçirirler ve bu safhada hücreler hacim olarak büyürler. Hazırlık safhasında bölünme de rol alacak olan düzenleyici proteinler örneğin siklinler, büyük moleküller deoksiribonükleik asit’ler gibi büyük moleküller sentezlenir. Bu safhaya interfaz denir. İnterfaz evresi kendi içinde G1, S, ve G2 olmak üzere çeşitli alt bölümlerden (evrelerden) oluşur. İnterfaz, mitozla beraber hücre döngüsünü oluşturur. Yani hücre döngüsü G1, S, G2 ve M evrelerinden oluşur. G0 fazı ise normalde hücre döngüsü içinde yer almayan ve hücre döngüsü tamamladıkdan sonra döngüden çıkan hücrelerin bulunduğu evredir (şekil 2.7) (55). G1, S, G2 (Interfaz) evreleri hücre döngüsünün %90’nını kapsar ve 16-24 saatte tamamlanır. Mitoz bölünme ise 1-2 saat sürmektedir. Hücre büyümesi G1 fazında kısıtlayıcı nokta (R point) tarafından eş güdümlü ifade edilir. Kısıtlayıcı noktada hücre duracak veya hücre döngüsü tamamlayacaktır. G1 fazında hücreler kendi çevrelerini kontrol eder, uyarıları alır ve büyümeyi tetikler. Bu fazda DNA sentezi (replikasyonu) için hazırlık yapılır. RNA ve protein sentezi olur. S fazında ise DNA sentezlendikten sonra, G2 fazında hücre büyümeye devam eder aynı zamanda RNA sentezi, protein sentezi gerçekleşir ve hücre mitoza hazırlanır. Mitoz; profaz, metafaz, anafaz ve telofazdan oluşmaktadır. Telofazda sitoplazmik bölünme tamamlanır ve aynı genetik materyale sahip iki yeni hücre meydana gelir (53,54). Hücre döngüsü, bu döngüye özgü bir takım proteinler; siklinler, siklin-bağımlı serin/treonin protein kinazlar (CDK) ve siklin-bağımlı kinaz inhibitörleri (CDI) tarafından özgün olarak kontrol edilir. Siklinler, CDK ve CDI’lerinin düzeyleri hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında farklılık gösterir ve oldukça karmaşık bir düzen içinde döngünün ilerlemesini düzenlerler (56). Hücre döngüsünde bir faz tamamlanmadan sonraki faza geçilirse genetik materyal tam ve doğru kopyalanmadığı için hücrede hasar meydana gelebilir. Hücre döngüsünde G1-S geçişinde, G2-M geçişinde ve metafaz-anafaz geçişinde kontrol noktaları vardır. Bu 17 kontrol noktalarında hücrenin döngüye devam edip etmeyeceği kararı verilir. Eğer hasar varsa ve bu kontrol noktalarında rol alan proteinlerde mutasyon varsa veya bu hasarı tespit edilemiyorsa, hücre normal bir hücreymiş gibi bölünmeye ve çoğalmaya devam edecektir. Bunun sonucunda hücreler kanserleşmeye doğru gidecektir. Şekil 2.7. Hücre döngüsü ve kontrol noktaları (51) 2.4.1. Kanserli hücrelerde G1/S geçişi Gen mutasyonlarından dolayı G1-S geçişindeki değişimler kansere neden olabilir. Kanser hücrelerinin karakteristik özelliklerinden biri büyüme uyarımından bağımsız olarak G1 fazına tekrar girebilmeleridir. Retina blastoma fosforillenme/defosforillenme dengesizliği olduğunda, G1-S fazları arası geçişlerde olan değişiklikler hücrelerin çoğalmasını değiştirebilir. Rb gen mutasyonları insan kanserlerinden bazılarında (Glioblastoma ve Retinoblastoma vb) tanımlanmıştır. Tümör virüsleri histon deasetilaz HDAC ile Retinoblastoma Rb’nin bağlanmasını inhibe edebilir. Siklin D’nin fazla ifade olduğu bazı durumlarda ise E2F aktifleşmesinden sonra Rb inhibisyonunu sağlayan defosforillenme olmadığında S fazına hatalı ilerleme olabilir. Radyasyon vb. etkenlere maruz kalan hücrelerde hücre döngüsünde hatalara neden olur (57). Örneğin gama radyasyonuna maruz kalan hücrelerde fonksiyonel p53 geninin yetersiz olmasından dolayı bu hücreler G1’de tutulamaz ve S fazında hasarlı DNA’yı dublike ederek gen mutasyonuna veya hatalı kromozom dizilimine neden olur. Hücre çoğalmasını gen silinip çıkarılması (delesyonu), fazla gen ifadesi ve nokta mutasyonlar etkilemektedir. İnsan kanserlerinde en sık görülen mutant gen p53’tür. Normal bir hücrede DNA hasarı olduğunda, p53 düzeyi artar ve hücre döngüsünü G1 fazında baskılayarak DNA onarımı 18 için hücreye zaman kazandırır. Hasar tamir edilemiyorsa hücre apoptozise gider. p53 mutasyonlarında hücreler bölünmeye devam eder. Bu mutasyonlar sonucunda tümör baskılayıcı fonksiyonlarında kayıp olurken diğer yandan onkojenik fonksiyon ortaya çıkar (54). 2.4.2. Kanserli hücrelerde G2/M geçişi Kanser gelişiminde ve/veya hastalığın ilerlemesinde G2-M geçişinde değişimlerin rol oynadığı belirlenmiştir. İyonize edici radyasyon, protein kinazları, ataxia telegiectasia mutant (ATM) ve ATM ilişkili (ATR) genleri aktive eder (56). Chk1 ve Chk2 protein kinazlar, DNA hasarı sonucu aktive olan hücre döngüsünde kontrol noktalarında önemli rol oynamaktadır. Chk2 tümör baskılayıcı gen olmaya adaydır. DNA hasarının ardından, dengeleme (stabilizasyon) için p53 fosforilasyonunu uyarır. Mikrotübül inhibitörlerinin yaban (wild) tip p53’lü fare embriyo fibroblastlarına verilmesi ile G2-M geçiş bloğu aktive olur. Bunun yanısıra mutant p53‘lü hücrelerde hücre döngüsü durdurulamamıştır (57). Bu blok kromozomların ayrılması ve mitoz tamamlanmadan önce diğer S fazına geçişi önleyerek aneuploidiyi engellemektedir. Böylece mutant p53 uygun kromozom ayrılması olmaksızın tekrar tekrar döngüye neden olarak genomik dengesizliğe neden olur (57). 2.5. Hücre Ölümü 2.5.1. Apoptozis Apoptozis klasik hücre ölüm şekli olarak bilinen nekrozisden birçok özelliği açısından oldukça farklı olan bir hücre ölüm mekanizmasıdır. Apoptozis terimi, ilk defa 1972 yılında İskoçyalı araştırmacılar Kerr, Wyllie ve Currie tarafından kullanılmıştır. Bu bilim adamları, yapısal olarak özgün bir hücre ölüm tipi olarak tanımlamışlardır (58). Apoptozis aynı zamanda programlanmış hücre ölümü, fizyolojik hücre ölümü veya hücre intiharı olarak da bilinir. Her hücre doğar, belli bir süre yaşar ve sonra ölür. Apoptozisi programlanmış hücre ölümü olarak ifade etmek üzerinde tartışılan bir konu olmasına rağmen sıkça kullanılan bir yaklaşımdır (58). 19 Apoptoz hücrenin kendini yok etmek için bir takım metabolik ve fizyolojik işlemleri devreye soktuğu bir olaydır. Apoptozisin düzenlemesinde birçok molekül görev alır. Genel olarak apoptozun düzenlenmesinde kalsiyum, seramid, Bcl-2 ailesi gibi moleküller, p53, kaspazlar, sitokrom-c gibi proteinler ve mitokondriler rol alırlar. Apoptotik süreç boyunca hücre içine sürekli kalsiyum girişi olur. Kalsiyum iyonları; endonükleaz, proteaz ve trans glutaminaz aktivasyonunda, gen düzenlenmesinde ve hücre iskeleti organizasyonunda rol alır (şekil 2.8) (51). Apoptoz uyarısı alan hücre bulunduğu ortamdan uzaklaşır, komşu hücrelerle bağlantısını koparır ve büzüşür, kromatini yoğunlaşır piknotik bir görünüm alır. DNA’sı nukleozomlarından kesilir. Ancak hücre organelleri yapısal bütünlüklerini korur. Hücre zarı yapısında bulunan fosfotidil serin hücre zarının iç yüzünden dış yüzüne yer değiştirilmesi (transloke) olur. Çekirdek küçülür, parçalara ayrılır. Hücre zarla sarılı tomurcuklar halinde kopar, apoptotik cisimciklere ayrılır. Apoptotik cisimcikler makrofajlar tarafından tanınır ve fagosite edilir (59). Şekil 2.8. Apoptotik sürecinde görev alan moleküller 20 2.5.2. Nekroz Hücrenin iyon dengesi dışarıdan gelen fiziksel ve kimyasal uyarılar (yanma, ısı toksik madde v.b) sonucu bozulur. Bunu takiben DNA tamirinden sorumlu nuklear enzim PARP (Poli ADP-riboz polimeraz) NAD+ ’ı ikiye bölerek NAD kaybına neden olur. Bu durumda gerçekleşen ATP eksikliği, iyon pompası yetersiz kalmasına yol açar. Böylece hücre sıvı alır ve organeller şişer, dış membran bütünlüğü bozulur ve osmotik basınç nedeniyle hücre patlar. Hücre ölümünü takiben hücre içeriğinin hücreler arası boşluğa salınması yangı (enflamasyon, iltihaplanma) olayına sebep olur. Bu olayın karakteristik özelliği makrofaj ve nötrofillerin nekrotik dokuya göç etmesidir. Göç eden bu hücreler nekrotik dokuyu fagosite eder. Bu nedenle enflamasyon nekrozun önemli bir işaretidir (tablo 2.3) (51) Tablo 2.3. Apoptoz ve Nekrozun kıyaslanması (51) 21 2.6. Akciğer Kanser Evreleri Akciğer kanserinde evrelendirilmesinde primer tümörün büyüklüğü ve yayımına (T), bölgesel lenf bezi tutulumuna (N), uzak metastaz varlığına (M) dayanan TNM evrelendirmesi kullanılır. Küçük hücreli akciğer kanserinde TNM sınıflaması kullanılabilmekle beraber, bu hastalarda genellikle TNM sistemi yerine VALG (Veterans Administration Lung Cancer Group) tarafından önerilen evreleme sistemi kullanılmaktadır (60). Günümüzde hemen her yerde uluslararası kanser mücadele birliği UICC (Union for International Cancer Control) ve Amerikan kanser birliği AJCC’nin (American Joint Commitee on Cancer) biçimlendirdiği Tümör-Nod-Metastaz (TNM) sistemi kullanılmaktadır. Bu sistem 1942 yılında Pierre Denoix tarafından bulunmuştur ve hastalık prognozunu etkilediği düşünülen malign tümörlerin önemli morfolojik özelliklerine göre kanseri tanımlamak için bir altyapı sağlamıştır TNM sınıflaması, histolojik alt tiplerdeki prognoz farklılıkları olması yetersiz gelmesi sebebiyle, UICC ve AJCC tarafından 1996 yılında yeni bir evreleme sistemi geliştirilmiştir (60). TNM sisteminin yeniden geliştirilmesi ile skuamöz, büyük hücreli ve adenokarsinomlu (Küçük hücreli dışı, Non-small cell, NSCLC) hastalar yapılacak tedavi ve prognoz yönünden Evre IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB ve IV şeklinde sınıflandırılmaktadır. Küçük hücreli kanserli hastalarda TNM sistemi yerine VALG (Veterans Administration Lung Cancer Group) tarafından önerilen evreleme sistemi kullanılmaktadır. Buna göre hastalık bir hemitoraksta lokalize ise "sınırlı" ve hemitoraksın dışında daha yaygın ise "yaygın" olarak evrelendirilmektedir (61). 22 Tablo 2.4. TNM evreleme sistemi (61) Evre Tanım Primer tümör (T) TX Balgam ya da bronşlarda malign hücrelerin tespit edilip görüntüleme tetkikleri ya da bronkoskopi ile tümörün gösterilememesi TO Primer tümör belirtisi yok Tis Karsinoma in situ T1 En geniş çapı <3 cm, Akciğer ya da visseral plevra ile çevrili, bronkoskopide lop bronşundan daha proksimale invazyon göstermeyen, ana bronşun proksimaline uzanan bronşial duvara sınırlı yayılım gösteren herhangi bir büyüklükteki nadir yüzeysel tümör T2 Tümör aşağıdakilerden en az birine sahip olacak: En geniş çapı >3 cm Ana bronş yayılıma, ancak karinaya uzaklık > 2 cm Visseral plevra invazyonu Hiler bölgeye ulaşan ancak tüm akciğeri kapsamayan atelektazi ya da obstrüktif pnömoni T3 Tümörün herhangi bir büyüklükte olup göğüs duvarı diafragma, mediastinal plevra, parietal plevra ve perikard gibi yapılardan herhangi birine direkt yayılım göstermesi; veya karinaya 2 cm'den daha yakın ancak karinayı tutmayan ana bronştaki tümör; veya bütün bir akciğeri kapsayan atelektazi veya obstrüktif pnömoni ile birlikte olan tümör Tümörün herhangi bir büyüklükte olup mediasten, kalp, büyük damarlar, trakea, özfagus, vertebral kolon, karina gibi yapılardan herhangi birini invaze etmesi; veya malign plevral veya perikardial sıvı ile birlikte olan tümör; tümörle aynı lop içinde satellit tümör nodül ve nodülleri T4 Bölgesel lenf nodu (N) NX Bölgesel lenf nodlarının değerlendirilememesi N0 Bölgesel lenf nodu metastazı yok N1 Aynı taraf peribronşial ve/veya aynı taraf hiler lenf nodu metastaz ve primer tümörün direkt yayılması ile intrapulmoner bezlerin tutulması Aynı taraf mediastinal ve/veya subkarinal lenf bezlerine metastaz N2 N3 Karşı taraf mediastinal,hiler; aynı veya karşı taraf supraklavikular veya skalen lenf bezi metastazı Uzak metastaz (M) MX Uzak metastaz varlığının değerlendirilememesi M0 Uzak metastaz yok M1 Uzak metastaz var 23 Tablo 2.5. Total evreleme sistemi (61) Total Evre T kategorisi N kategorisi M kategorisi Gizli karsinom TX Tis T1 T2 T1 T2 T3 T1 T2 T3 T3 Herhangi T T4 Herhangi T N0 N0 NO N0 N0 N0 N0 N2 N2 N1 N2 N3 Herhangi N Herhangi N M0 MO M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 Evre 0 Evre IA Evre IB Evre IIA Evre IIB Evre IIIA Evre IIIB Evre IV Evre 1: Tümör, sadece akciğerin küçük bir bölümünde görülme halidir. Evre 2: Hastalık, en yakın lenf bezelerine atlamış durumdadır. Evre 3: Tümör, akciğer içinde akciğeri saran zara veya iki akciğer arasındaki mediasten denen boşluğa veya buradaki bezelere yayılmışsa bu durum 3. evredir. Evre 4: Karaciğer, kemik, böbrek üstü bezi gibi uzak organlara yayılmış durumudur. 24 2.7. Kanserde Kodlamayan RNA’lar Genomdaki istikrarsızlık ve mutasyon kanserin birer işaretidir. Kanserli hücrelerin en önemli karesteristik özellikleri hücre göçü, istila ve metastaz yapabilme yeteneğine sahip olmasıdır. Tümör ile ilişkili metastaz kanserde en önemli ölüm nedendir. Son yıllarda yapılan araştırmalarda genelikle protein kodlayan genler üzerinde durulsa da protein kodlamayan genler üzerinde yapılan çalışmalar, bilim insanlarının dikkatini bu noktaya çekmiştir (62). Transkriptlerin sadece küçük bir kısmı proteini kodlar. Ancak son büyük ölçekli tamamlayıcı DNA klonlama projeleri sonucunda, memeli genomunun büyük bir kısmı transkribe edildiği belirlendi. Bu transkriplerin çoğunun insan fizyolojisi ve hastalıklarındaki işlevi tam olarak belirlenememiştir (63). Genetik ve epigenetik değişiklikler protein kodlayan ve kodlamayan pek çok genlerin anormal ifadesi ile sonuçlanır (64). Genomda ‘‘karanlık madde’’ olduğu düşünülen kodlamayan RNA’lar ( ncRNA ) memeli transiptomunda ayrılmaz bir parçası olarak ortaya çıkmıştır. Bu anlaşılmaz moleküller protein kodlamayan dizi olarak tanımlanır, ancak bu diziler hem yapısal hem de işlevsel rol oynayabilirler. Kodlamayan RNA’ların (ncRNA) işlevleri arasında yazılım ve yazılım sonrası gen susturulması ve kromozomların yeniden modellenmesi yer alır. Tanımlanan ve fonksiyonu aydınlatılan ncRNA’ların sayısı her geçen gün artmaktadır (65). ncRNA’lar iyi karakterize edildiğinde, uzun kodlamayan RNA’lar ( lncRNAs ) kanserler üzerine önemli etkileri bulunur (16). Kodlamayan RNA’lar yaygın olarak uzunluklarına göre sınıflandırılır. ncRNA’lar tanımlanırken nükleotit sayısı baz alınır. ncRNA’ların büyük bir kısmı kısa düzenleyici RNA’lardan oluşmaktadır. Bu RNA’lar, RNA enterferans (RNA interference-RNAi) mekanizması ile gen susturumunu sağlayan moleküllerdir. Bu mekanizma, milyarlarca yıl önce, hücrelere saldıran virüslere karşı geliştirilmiş bir savunma mekanizmasıdır (65). Günümüzde artık, RNAi mekanizmasının gelişim, farklılaşma, hücre çoğalması ve apoptoz gibi önemli süreçlerin düzenlenmesinde rol aldığı bilinmektedir. Kısa düzenleyici RNA’ların uzunlukları 15-40 baz çifti arasında değişmektedir. Bunlara örnek olarak siRNA (small interfering RNA), mikro RNA (miRNA) ve PIWI (P-element induced wimpy testis) proteini ile etkileşimi olan RNA (piRNA) verilebilir (Tablo 2.10) (66). 25 Uzun kodlamayan RNA (lncRNA) ise; 200 nüktleotitten büyük ve hücre döngüsünde, apoptoz, hücre çoğalması gibi birçok biyolojik süreçte rol alan dizilerdir. Şu ana kadar çalışılmış çoğu lncRNA, birçok biyolojik süreçlerde görev aldığı ve gen ifadesini düzenlediği raporlanmıştır (Tablo 2.10) (67). Tablo 2.10. Kodlamayan RNA‘lar 2.7.1. MikroRNA’lar (ncRNA’lar) İlk defa C.elegans’ın gelişimini çalışan Lee ve arkadaşları tarafından 1993 yılında tanımlanan mikro RNA (miRNA)’lar, 18-22 nukleotid uzunluğunda, protein kodlayıcı olmayan, hücreler tarafından doğal olarak üretilen RNA’lar olarak tanımlanır (68). miRNA’lar hedef mRNA’nın translasyonel etkinliği ya da kararlılığını düzenleyerek gen susturulmasına (inhibe edilmesine) neden olurlar (68). miRNA’nın uygun dizi hedeflemesi, hedef dizi üzerindeki miRNA ve mesajcı RNA (mRNA) arasındaki baz eşleşmesine bağlıdır. Eğer dizilerde eşleşme %100 olarak gerçekleşmiyorsa, miRNA mRNA’nın okunmasını baskılar. Tam baz eşleşmesinin olduğu durumlarda ise miRNA mRNA’yı yıkıma götürür. miRNA genelde baz eşleşmesini mRNA’nın translasyona uğramayan bölgesinde (3’ UTR) gerçekleştirir (68). 26 Hücre çekirdeği içinde RNA Polimeraz II (RNA Pol II) veya RNA polimeraz III (RNA Pol III) ile pri-miRNA'lar oluşturulur. RNaz III endonükleaz "Drosha" enzimi ve çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein "Pasha kompleksi” tarafından işlenerek öncülmiRNA'ya (Pre-miRNA) dönüştürülür (69). Pre-miRNA'lar çekirdek zar proteini "exportin-5" aracılığıyla sitozole aktarılır. Sitozole aktarılan pre-miRNA’lar doğrudan RNaz III endonükleaz "Dicer"a bağlanır (69). Dicer, pre-miRNA sap-ilmiğini kestikten sonra, iki tamamlayıcı kısa RNA molekülü meydana gelir. Dicer aynı zamanda RNAindüklenmiş susturma kompleksi (RNA-induced silencing complex) RISC’nin oluşumunu başlatır. Bu iki kısa RNA’dan sadece biri RISC’e dahil olur (Şekil 2.9) (70) Şekil 2.9. miRNA ‘ların biyogenezi (70) Tanımlanan miRNA’ların sayısı her geçen gün hızla artmaktadır. Bugüne kadar tanımlanmış miRNA’ların sayısı 2000’i aşmıştır ve Bu miRNA’ların çoğu çeşitli çalışmalar sonucu dokular arasında, gelişim süreçlerinde ve kanser gibi patolojilerde farklı profillere sahip olmuştur (71). 27 miRNA‘lar haberci RNA’ları hedefleyerek baskılar ya da işlevsel özelliklerini bakılayarak gen ifadesini düzenler, mRNA çevirisini bloke ederek hücre çoğalması, hücre farklılaşması apaptoz gibi önemli olaylarda kritik rol oynarlar. Literatür, miRNA ve miRNA-lncRNA data veri tabanını araştırıldığında MALAT1’i hedefleyen veya hedefleyebilecek bu potensiyele sahip miRNA’lar seçildi. miR-150-5p miR-150, başta insanlar dahil olmak üzere memelilerde bulunan mikroRNA’nın ön ailesidir. 22 nükleotid uzunluğunda olan olgun miRNA dizisi Dicer enzimi tarafından öncü saç tokası yapısını alır. Daha sonra bu dizi RISC ile beraber RNA interference etkiler. Şekil 2.10. miR-150-5p gösterimi (95) 28 MiR-150 dizisinin ifadesi hematopoetik kök hücre soyu farklılaşması sırasında değişir. miR-150 birçok kanserde ilişkili olduğu bulunmuştur. Mide kanserinde hücre çoğalmasını teşvik eder. Aynı zamanda birçok kanserde aşırı ifade olduğu tespit edilmiştir. miR-150 malignant lenfoma da sağlıklı hücrelere göre tümör hücrelerini baskılar (72). miR-503-5p miR-503 küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde glioblastoma ve hepaselüler karsinomada tümör baskılayıcı olarak işlev görür. Kolon kanserinde onkomiR olarak çalışır. Çeşitli kanserlerde tümör baskılayıcı olarak rol almasına rağmen meme kanserinde ki işlevi açıklanamamıştır (73). Şekil 2.11. miR-503-5p’nin gösterimi 29 miR-15a-5p MiR-15 mikroRNA’nın ön ailesi olup gen ifadesini düzenleyen küçük kodlamayan RNA genlerinden oluşur. miR-15a ve 15b miR-dizileri yüksek oranda korunmuş bu diziler üç ayrı kromozom üzerinde kümelenmiştir. İnsanlarda miR-15a ve miR-16 kromozom 13q14 pozisyonunda kümelenmiş. Bu bölge belirli kanser türlerinde sıklıkla değişime uğrayan bölgedir (74). Şekil 2.12. miR-15a-5p’nin gösterimi (97) 30 2.7.2. Uzun kodlamayan RNA’lar (lncRNA’lar) Hücre çekirdeğinde, DNA eşlenmesi, yazılım, RNA işlenmesi ve RNA’nın çekirdekten stoplazmaya geçişi dahil olmak üzere bir çok önemli olaylar gerçekleşmektedir. Yine hücre bölünmesi çekirdek alt yapının organizasyonu ve çekirdekteki yaşanan süreçlerin uzaysal zamansal koordinasyonu, etkin hücre fonksiyonu ve metabolizmasını sağlanması gibi olayların sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir (75). Çekirdek proteinlerin katalitik ve yapısal fonksiyonları düzenleyen onlarca araştırma merkezleri olsa da, lncRNA’ların protein karmaşımlarının (komplekslerinin) fonksiyonların icra etmesinde görev aldıklarını kanıtlayan araştırmaların sayısı giderek artmaktadır. LncRNA’lar büyük ölçüde biyoinformatik vasıtasıyla belirlendiği gibi, herhangi belirgin protein kodlama potansiyeli içermeyen, uzunluğu 200 nükletidden büyük RNA molekülü olarak tanımlanır (75). Ayrıca lncRNA, makroRNA ve uzun intergenik kodlamayan RNA (lincRNA) gibi isimlerle de ifade edilir. LncRNA’lar sık sık örtüşen protein kodlayan ve kodlamayan transkriptler arasına serpiştirilmiştir. Başlangıçta lncRNA’lar tam uzunlukları, farenin cDNA kütüphanesinin büyük ölçekli dizilemesi ile keşfedilmiştir. Yıllardır lncRNA‘nın farklı kanser türleri üzerinde etkisi araştırılmış fakat güçlü deliller ortaya konulamamıştı. Ancak daha sonra lncRNA dizilerinin belirlenmesi ve fonksiyonlarının bilinirliğinin zamanla artması, farklı kanserler üzerindeki etkilerinin daha da netleşmesine neden olmuştur (75). Bu lncRNA’lar birçok belirli dokularda farklı zamanlarda, ifade seviyeleri farklıdır. Örneğin kanserin gelişim süreçlerinde, nörodejaneratif alzaimer hastalıklarında farklı zamanda farklı seviyede ifade edilir (76). Özellikle insanlardaki ilginç karmaşık hastalıklarda tüm değişkenlerin %95’ i protein kodlayan düzenleyici RNA dizilerinde aranırdı ancak lncRNA araştırması henüz emekleme aşamasında olduğundan ve bilim adamları sadece bu molekülerin yeni dizilerin belirlenmesi ile fonksiyonlarını çözmeye başlayabiliyor. Ancak gelişmekte olan herhangi bir alanda olduğu gibi, bu yeni model sistemde moleküller derinlemesine bir bakış açısı sağlanması için ilk olarak gelişmesi gerekmektedir (76). İlk öneri yaklaşık 20 yıl önce DNA’daki bilgileri mRNA’ya aktaran, mRNA’yi baskılayan H19 geninin bulunması, özellikle mesane kanserinde emriyonik ve tümör büyümesini düzenlemesini azalttığı (down regüle) saptanması ile uzun kodlamayan RNA’ların varlığı keşfedilmiştir. Kısa zaman sonra X kromozomun durgun (in aktif) hale 31 getiren özel inaktif transkirip ( XIST’in) tanımlanması ile ncRNA için düzenleyici ve yapısal fonksiyonlar önerilmiştir. Protein kodlamayan gen bölgelerindeki tümör baskılayıcı ve durdurmasında özgü 5 (GAS5), küçük nükleolar RNA (snoRNA) birkaç transkriptin keyfedilmesi sağlandı. Prostat kanser antijen 3 lncRNA PCA3 DD3 malignant prostat kanserinde aşırı ifade edilmesi ile lncRNA’ların kansere özgü ifade sergileyebilir algısını güçlendirmiştir (77). İnsan genomunun ayrıntılı açıklanması ile kodlayan bölgelerde birçok transkriptin sessiz olması bu transkriptin gerçek bir lncRNA olduğunu işater eder. Son 4 yıllık süreçte tespit edilen lncRNA’ların %15 nin fonksiyonlarının açıklanması beklenmektedir. Çünkü bu süre zarfında 6000 lncRNA’dan 14000 lncRNA’ ya yeni transkriptlerin bulunacağı tahmin edilmektedir. Henüz keyşfedilmeyi bekleyen binlerce belki milyonlarca lncRNA dizileri bulunuyor (9). Hala protein kodlayan bölgeleri ile örtüşen lncRNA’ların analiz edilmesi gerekir (77). lncRNA’ların işlevi tam olarak bilinmemekle birlikte, artan lncRNA sayıları ve birçok biyolojik süreçlere katılımı için biriken kanıtlar, normal ve malign hücrede önemli fonksiyonlara sahip oldukları görülüyor (77). Örneğin hastalığın karıştığı mutasyona uğramış lncRNA’lar son örnekleri kromatin ve transkripsiyonu değiştirmek için kromatin-remodeling kompleksleri PRC1 ve PRC2 bağlanan ANRIL ve HOTAİR bulunur. GAS5 lncRNA GR transkripsiyon faktörü için bir yem olarak hareket eder ve DNA ve transkripsiyonel aktivasyon bağlanmasını GR engeller. BACE-1AS RNA BACE-1 çevirisinin düzenlenmesini sağlayan tamamlayıcı BACE-1 mRNA bağlanan ise MALAT1 RNA, mRNA, alternatif yapıştırma düzenleyen SR proteinlerine bağlanır (Şekil 2.13). 32 Şekil 2.13. lncRNA’ların çeşitli biyolojik süreçlere katılması (78) 2.7.2.1. Uzun kodlamayan RNA’ların özellikleri GENCODE açıklama projesi sayesinde bugüne kadar insan lncRNA’ların büyük kataloğu kurulmuş, yapısal organizasyonu ve genom işleme gibi birçok ortak özellikleri ile ilgili kapsamlı bilgiler artık belirlenmiştir. LncRNA’lar potansiyel protein kodlayan transkripsiyon birimlerinden bağımsızlardır ve protein kodlayan transkript ile komşu değil, sadece tanınmayan uzantıları vardır. İfade edilmiş lncRNA genleri, aktif transkiripsiyonu tipik bir histon değişiklikleri ile ilişkilidir, ancak protein kodlayan genler ile karşılaştırıldığında, genel olarak birçok belirli dokuda daha düşük ifade gösterir. LncRNA ve protein kodlayan genlerin uzunluğu, işleme ve ekleme (splicing) sinyali benzerdir. LncRNA İşlevsel Özellikleri LncRNA dizisi, DNA ya da RNA özgül dizilerine bağlanarak veya proteinlere bağlanarak işlev görürler. Bazı lncRNA’lar aslında mikroRNA veya Piwi RNA'lar gibi küçük düzenleyici RNA öncüleridir. MikroRNA aksine, lncRNA’lar ortak bir hareket modu ile tanımlanmamıştır. Bu diziler gen ifadesinin yanı sıra protein sentezini de düzenler. Bazı lncRNA’lar kromatin düzenlemesi ve yapısını yanında doğrudan yazılımı düzenleme işlevleri deneysel olarak tanımlanmıştır. LncRNA’lar yazılım sonrası yapıştırma, 33 düzenleme, lokalizasyon, çeviri ya da yıkma gibi RNA işlenmesinde önemli olayları düzenler (79). Son zamanlarda lncRNA’ların işlevleri çeşitli moleküler mekanizmaya göre katagorize edilmiştir. LncRNA’lar aşağıdaki gibi dört model üzerinde toplansa da daha fazla tarif edilebilir. İleti (Sinyal) modeli: : molekül sinyal ya da yazılım aktivitesinin bir göstergesi olarak işlev görür. Yem (decoy) modeli: uzaktaki diğer düzenleyici RNA’ları ya da proteinleri titre ederek bağlanır. Rehber (Guide ) modeli: Belirli hedeflere ribonükleoprotein karmaşımlarını (kompleksleri) lokalizasyonunu yönlendirir. İskele (Scaffold) modeli: : ilgili moleküler bileşenler (proteinler ve veya RNA) monte edilebileceği bir platform gibi yapısal bir role sahiptir (Şekil 2.24). Şekil 2.14 lncRNA ‘ların işlevsel özellikleri (80) 34 2.7.2.2. Kanserde uzun kodlamayan RNA’ların etkisi LncRNA’ ların fonksiyonları analiz edildiğinde canlı hücrenin genetik bilgi işleme sırasında her adımda çok yönlü düzenleyici işlev gösterdiği görülmüştür. Birçok kanserde lncRNA hücre çoğalması, hücre farklılaşması ve apoptozun kontrol edilmesi gibi önemli olaylarda rol oynamaktadır. 2.8. MALAT1 ( Metastasis Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1) ncRNA’ lar bir RNA dizisidir fakat protein kodlama yetenekleri yoktur. MikroRNA’lar (18-22 nt uzunluğunda) akciğer kanserinde sık sık haberci RNA (mRNA) hedefler ve ifadesini düzenler. miR-196a and miR-200b gibi yeni miRNA akciğer kanserinde yüksek oranda ifade olur. İşlevleri az bilinen, uzun olmasına rağmen kodlamayan RNA’lar (lncRNA) protein düzenleyici, yapısal düzenleyici ve özellikle bunlara ek olarak gen ifadesini düzenleyici olarak fonksiyon görürler (82). Şu anda iki lncRNA MALAT1 ve HOTAİR ( Hox transkript antisens intergenik RNA)’in akciğer kanserinde etkili olduğu tespit edilmiştir. MALAT1 yüksek oranda korunmuş ve 8000 nt uzunluğunda olup küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde (NSCLC) (adenokarsinom, skuamöz hücreli kanser ve büyük hücreli karsinom dahil olmak üzere ) yüksek oranda ifade edilir (82). Bu olgun transkript kolonikal poly(A) kuyruğu olmamasına rağmen 3’lü sarmal yapısı ile kararlı (stabilize) edilir. Bu transkript ribonükleoprotein karmaşımlarının moleküler yapısını oluşturmak için çekirdekte tutulduğu tahmin ediliyor. MALAT1 hücre hareketi, yayılım (invasion) ve metastaz nadiren olsa da yazılım sonrası genlerin ifadesini düzenlenmesinde rol alır. HOTAİR akciğer kanserinde yüksek oranda ifade edilen bir RNA olup (en azında memelilerde) yüksek oranda korunduğu bilinmektedir. Bu lncRNA, PRC2 ve histon düzenleme karmaşımları ile etkileşir ve HOXD ifadesini düzenler (82). LncRNA’ların ifadesi birçok hastalıkla ve kanserle ilişkilendirilmiştir. MALAT1, HCN olarak ta bilinir. Kodlamayan nükleer zenginleştirilmiş transkirpt2 (noncoding nuclearenriched abundant transcript 2) [NEAT2]); PRO2853; linc00047; ncRNA0iq0047 olarak bilinen lncRNA’lar; küçük hücreli akciğer kanserinde, metastazın belirlenmesinde biyobelirteç olarak kulanılır. Bu lncRNA meme, pankreatik, akciğer, kolon ve karaciğer gibi birçok kanserde yüksek oranda ifade edilir (Şekil 2.13) (83). 35 Şekil 2.15. MALAT1’ in insan kanserlerindeki ifadesi (84) MALAT1’in ifadesi, mesane üroteryal karsinom ile normal mesane epiteli ile karşılaştığında, mesane üroteryal karsinomunda daha yüksek oranda ifade edildiği belirlnmiştir. İfadesi susturulmuş MALAT1 bu kanser türünde hücre büyümesi, apoptozis ve hücre hücre hareketini (motalitesi) azaltmıştır (83). MALAT1 lncRNA’sının birçok fonksiyonlarının analizi yapılmıştır. Bunlardan Serin /Arjinin proteinlerin aktif seviyelerini modüle ederek (alternatif splicing) uç uca eklemeyi düzenler (Şekil 2.14) (17). Öncül haberci RNA’nın splicing faktörleri ile trankripsiyon bölgesi düzenlenmesinde ve yazılım sonrası gen ifadesinin kontrolünde rol alır (Şekil 2.14) (85). MALAT1 hemen hemen birçok insan dokusunda ifade edilir ve yüksek oranda insan kanserinde düzenlemesini artırır (upregüle olur). Bu lncRNA akciğer kanseri metastazında etkindir. siRNA veya miRNA ile susturulduğunda akciğer kanser hücrelerinde hücre göçünü engeller ve bu sayede yazılım sonrası gen ifadesindeki değişiklikleri düzenler. Yine kısa saç tokası RNA (Short hairpin RNA) susturulduğunda boyun kanseri hücre hatlarında hücre çoğalması ve yayılımı azaltır (83). 36 Şekil 2.16. MALAT1 ‘in kanserdeki fonksiyonu (86) MALAT1 farklı kanserlerde farklı ifadesi; başta akciğer kanseri olmak üzere, gelecekte klinikpatalojik olarak birçok kanserdeki önemin belirlenmesi lncRNA’ların önemini daha da iyi anlaşılmasına olanak sağlayacaktır. MALAT1’in potansiyel rolünün araştırılması klinikte akciğer kanserinde tedaviye yönelik etkisinin hedeflemesi için daha çok çalışılmaya ihtiyaç vardır (85). MALAT1 memelilerde yüksek oranda korunmuştur. Birçok kanserde işlevsel etkisi tartışmasızdır. Birkaç farklı mekanizmada önemli rol oynar. Stoplazmada üretilen mascRNA (yeni tRNA- ncRNA gibi) MALAT1’ in 3 ucu) RNase P ve RNase Z tarafından ayrılabilir, sonra serin /arjinin proteinlerin aktif seviyelerini modüle ederek (alternatif splicing) uç uca eklemeyi düzenleyebilir. Dahası MALAT1 CBX4’a (Chromobox homolog 4) bağlanabilir. Hem Pc2 (Polycomb 2), sevk edilir hemde Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) ile birleşir (87). Tüm bu etkileşim kontrolleri, interkromatin granüllerin yeniden yerleşmesi ve gen ifadesinin susması ve aktivitenin 37 artması ile ilgilidir. Böylece MALAT1 bilinen belirli genleri, birkaç hücre döngü kontrol genleri (p21, p27 ve B-MYB) ve metastazla ilişkili genleri (MIA2, ROBO1,CTHRC1 ve CCT4) düzenleyerek kanser hücre hatlarında, hücre göçüne, hücre yayılımına ve hücre çoğalmasına etki eder (87). MALAT1 çeşitli katı tömürlerde yüksek oranda ifade edildiği gözlenmiş ve birçok kanserde metastaz ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Çekirdekte bol miktarda ve nükleer benekler (nuclear speckles) halinde bulunurlar. Bu öncül çekirdek beneklerin, RNA polimeraz II transkripsiyonunu koordine etmesi, pre-mRNA ekleme ve mRNA’nın çekirdekten dışarıya geçişinde rol aldığı düşünülüyor. Bu lncRNA SR splicing factorlerin aktivitesini ve hücresel dağılımını modüle ederek öncül mRNA’nın uc uca eklenmesinde rol oynar. Bu tür bir mekanizma hücre döngüsünün belirli aşamalarında ya da belirli hücre dışı sinyalleri ile belirli yapıştırma faktörlerinin üzerindeki etkisi, hücrelerdeki bölgesel konsantrasyonunu değiştirir (22). Daha önceki çalışmalarda MALAT1’in, tümörügesiz ve hücre döngüsü ilerleyişini ve E2F1 transkripsiyon faktör aktivitesini düzenleyen mekanizmalar önerilmiştir. Tüm yaklaşımlar MALAT1‘in açıklanamayan mekanizmalarının varolduğu ve öncül proliferatif işlevinin olduğunu gösterir. Önceki araştırmalarda MALAT1’in hücre döngüsü sırasında ki rolü ve insan hücrelerinde MALAT1’in seviyeleri, hücre bölünmesi sırasında düzenlendiği açıklanmıştır (11). MALAT1-depleted (tükenmiş) hücrelerde hücre döngüsünde keşfedilen hasarlarda p53 seviyesine duyarlı olması MALAT1’ in önemli bir efektör olduğunu gösterir. Sonuç olarak MALAT1, öncül mRNA işlenmesi veya ifadesini, onkojenik transkripsiyon faktörleri ve hücre döngüsü işleyişini özellikle mitotik ilerlemeleri düzenlemelerinde rol oynar (22). MALAT1’ in hücresel seviyeleri G1/S ve M esnasında esnasında yüksektir. Hücre döngüsünde DNA eşlenmesi fazına girmesi ve/veya hücre bölünmesi geçirmesi (M) gibi iki önemli evre vardır. Baskılanmış MALAT1 ifadesi, hücre döngüsü ilerleyişi ile (G1/S ve mitotik ilerlemede) ilişkilidir. Hücre döngüsü kontrol fonksiyonu olarak bilinen BMYB transkıripsiyon faktörüdür. B-MYB farklı belirli kanser tiplerin de yüksek oranda ifade edilir. Transkripsiyon faktörlerinden biri olan MYB ailesi hücre döngüsünde rol oynayan nükleer bir proteindir. Bu kodlanan protein, S fazında hücre döngüsü ve ilerlemesini esnasında siklinA / siklin-bağımlı kinaz 2 ile fosforile ederek hem aktivator hem de represör aktivitesini artırır. B-MYB kendi transkıpsiyonel özelliklerine ek olarak çok fonksiyonlu bir proteindir. Hücre döngüsünde diğer düzenleyicilerle doğrudan etkileşim 38 içindedir (88). Yapılan son çalışmalarda S fazında B-MYB, MuvB (complex) ile ilişkili çoklu proteindir ve mitosiz sırasında ifade edilir (88). Sonuç olarak MALAT1 ‘in ifade edilmediği hücrelerde B-MYB çoğu mitotik genlerin ifadesini göstermektedir. MALAT1 ‘in ifade edilmediği hücrelerde B-MYB anormal genlerin ifadesinden sorumludur. Yakın zamanda chip-seq veri tabanına göre B-MYB, MALAT1’in promotor bölgesine bağlanmaktadır ve MALAT1 ‘in ifadesini düzenlemektedir. Bu da B-MYB ve MALAT1 olumlu düzenleyici döngünün bir parçası olabileceğini göstermektedir (22). MALAT1 ile yapılan çalışmalar gösteriyor ki, insan hücrelerinde B-MYB onkojenik yazılım faktörünü pozitif olarak düzenler. Ayrıca farklı kanser türlerinde MALAT1‘in anormal ifadesinin dikkat çekici derecede arttığı tespit edilmiştir. Her ne sebepten olursa olsun MALAT1‘in ifadesi karsinogenezdeki etkisinin araştırılması gerekmektedir. Tüm bu araştırmalara dayanarak hücre döngüsü ilerlemesinde veya hücre ölümünde rol alan genlerin, belirli hücrelerdeki veya dokulardaki anormal ifadesi, anormal alternatif eklemeler, tümörün ilerlemesinde önemli katkı yapmaktadır (89). 39 3. MATERYAL METOD 3.1. Hücre Kültürü Öncesi Sterilizasyon Hücre kültüründe kullanılan tüm plastik malzemeler ve hazır olarak bulunan steril medyumlar ticari firmalardan sağlandı. Cam malzemeler 160ºC’de 60-90 dakika sterilize edildi (otoklavlandı). 0,22 μm delik büyüklüğündeki mikrobiyolojik filtreler kullanılarak tüm sıvı maddeler süzüldü ve steril edildi. 20 dakika ultraviyole ışık açılarak ve bunu takiben 15 dakika havalandırılarak Steril kabin (SafeMate 1.2, BioAir, LAF Technologies Pty Ltd, Victoria, Avusturalya) steril edildi. Sterilize edilen kabine alınacak malzemeler ise %70 alkolle silinerek içeri alındı. 3.2. Hücre Soyları ve Kültür Aşaması Tezde kullanılacak olan akciğer kanseri hücre soyu (A549), ATCC (LGC Standards GmbH, Wesel, Almanya) firmasından satın alınmıştır. Bu hücre soyunun ATCC adları, kanser durumları, morfolojisi ve histopatolojileri Tablo 3.1’ de gösterilmiştir. Tablo 3.1. Kullanılan hücre soyunun özellikleri Hücre soyu ATCC adı Kanser Morfolojisi Histopatoloji A549 (ATCC® CCL185™) Karsinom Epiteyal Küçük hücreli olmayan karsinom Bu hücre hattı 25 cm²’lik flaskta, 100 ml besiyeri içinde, 10 ml Fetal Sığır Serum (FCS) (Sigma, Deisenhofen, Almanya), 1 ml Penisilin/streptomisin solüsyonu (Sigma, Deisenhofen, Almanya) destekli 5 ml 10x DMEM solüsyonu (Sigma, Deisenhofen, Almanya) olacak şekilde % 5 karbondioksitli ortamda yetiştirildi. Hücre soyu ilk geldikleri gün, 37ºC karbondioksitli etüvde 24 saatliğine dinlendirmeye bırakıldı.48 saat sonra flasktaki tüm besiyeri steril pipet yardımıyla çekildi. Besiyeri çekilmiş flasklara 37ºC su banyosunda ısıtılan 1X’lik Tripsin’den 1-2 ml eklendi. Flasklar 5-7 dakika 37ºC CO2 etüvde bekletildi. Daha sonra flasklara Tripsin’in aktivitesini durdurmak için 5 ml FCS’li DMEM eklendi. Kalkan hücreler, 50 ml’lik flakonlara alındı. Flakonlara alınan 5 40 ml FCS’li DMEM ortamındaki hücreler 75 cm²’lik flaska pipet yardımıyla aktarıldı ve 10 ml FCS’li DMEM eklenerek % 5 karbondioksitli 37ºC ortamda yetiştirildi. Hücre soyu karbondioksitli etüvde 24 saatliğine dinlendirmeye bırakıldı. 24 saat sonra flasktaki tüm besiyeri steril pipet yardımıyla çekildi. Besiyeri çekilmiş flasklara 37ºC su banyosunda ısıtılan 1X’lik Tripsin’den 1-2 ml eklendi. Flasklar 5-7 dakika 37ºC CO2 etüvde bekletildi. Flask tabanına tutunmuş hücrelerin birbirlerinden ayrılmaları inverted mikroskop ile kontrol edildi. Daha sonra flasklara Tripsin’in aktivitesini durdurmak için 5 ml FCS’li DMEM eklendi. Kalkan hücreler, 50 ml’lik flakonlara alındı ve oda ısısında 3000 devir ile 4 dakika boyunca santrifüj edildi. Üstte kalan süpernatan atıldı. Dipte kalan hücreler hafifçe çözdürüldü ve yaklaşık 0,5 ml sıvı içerisindeki hücreler steril pipet yardımıyla alınarak, önceden içlerine 4 ml besi yeri konmuş flakona aktarıldı. 3.3. Mimik RNA’ların Besi Ortamındaki Hücrelere Aktarılması 1.1 nmol mimik miRNA (QIAGEN) (miR-503-5p, miR-150-5p, miR-15a-5p) 50 µl RNase saf su (RNase free water) ile çözdürüldü. 2. Hücre sayımı yapıldıktan sonra 12’lik well plateki her kuyucuğa 1ml FCS’li DMEM ortamında 80.000-300.000 hücre olacak şekilde complete medium ekildi. 3. 0,5 lik ependorf tüplere 200 µl DMEM konuldu. Üzerine RNase saf su ile çözdürülmüş 0,3 µl mimik RNA ve 6 µl transfection reagent konulup kısaca vortekslendi. 4. 5-10 dakika inkübe edildi. 5. Hazılanan karışım damla damla hücrelerin üzerine damlatıldı ve karışımında emin olmak için well plate hafifçe çalkalandı. 6. Hücreler 37ºC karbondioksitli etüvde 48 saatliğine dinlendirmeye bırakıldı. 41 3.4. Hücre Soylarından Total RNA Eldesi Hücre soylarından total RNA izole etmek için miRNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Almanya) kullanılmıştır. Kitin iş akış şeması bâz alınarak RNA elde edilmiştir. Prosedör aşağıdaki gibidir: 1. Öncelikle %100’e yakın olduğu tespit edilen hücre soyu kaldırıldı, santrifüj yardımıyla çöktürüldü, süpernatant atıldı ve üzerine 700 μl QIAzol Lysis Reagent eklendi. 2. Elde edilen homejenat oda sıcaklığında (15–25°C) 5 dakika boyunca muhafaza edildi. Üzerine 140 μl kloroform eklendi ve15 sn boyunca çalkalandı. 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında tutuldu. 3. 15 dakika boyunca 4°C’de 12.000 g’de santrifüj yapıldı ve üst faz yeni bir tüpe alındı. 4. Tüpteki miktarın 1,5 katı (yaklaşık 600 μl) 100% etanol eklendi ve pipet ile iyice karıştırıldı. 5. En fazla 700 μl örnek 2 ml toplama tüpü içerisindeki RNeasy® Mini kolona yüklendi ve oda sıcaklığında 20 sn boyunca 8000 g’de santifuje tabi tutuldu. Toplama tüpünde biriken kalıntı atıldı. Kalan örnek olduğunda işlem tekrarlandı. 6. Temiz bir toplama tüpüne alınan RNeasy Mini kolona 700 μl Buffer RWT çözeltisi eklendi ve oda sıcaklığında 20 sn boyunca 8000 g’de santifuj yapıldı. Toplama tüpünde biriken kalıntı atıldı. 7. Temiz bir toplama tüpüne alınan RNeasy Mini kolona bu sefer 500 μl Buffer RPE çözeltisi eklendi ve yine oda sıcaklığında 15 sn boyunca 8000 g’de santifuj uygulandı. (Not: Kullanmadan önce Buffer RWT ve RPE çözeltilerine %96-100 etanol eklendi.) Toplama tüpünde biriken kalıntı atıldı. 8. Temiz bir toplama tüpüne alınan RNeasy Mini kolona tekrar 500 μl Buffer RPE çözeltisi eklendi ve bu sefer oda sıcaklığında 2 dk boyunca 8000 g’de santifuj yapıldı. Toplama tüpünde biriken kalıntı atıldı. 9. 1,5 ml’lik toplama tüpüne alınan RNeasy Mini kolona 30–50 μl RNase içermeyen su eklendi ve oda sıcaklığında 1 dk bekletildi. Daha sonra 1 dk boyunca 8000g’de santifuj yapıldı. Toplama tüpündeki birikinti total RNA’yı içermekteydi. 42 3.5. RNA Örneklerinden Revers Transkriptaz PCR (RT-PCR) Yöntemi ile cDNA Eldesi 3.5.1. mRNA’dan cDNA eldesi Elde edilen total RNA içindeki mRNA’yı cDNA’ya çevirmek için Ipsogen RT Kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Almanya) kullanıldı. Test edilecek (10 μl) her bir RNA örneğinin 1 μg'ı 65°C'de 5 dakika süreyle inkübe edildi. Hemen 5 dakika buzda bekleterek soğutuldu. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için kısa süreli santrifüj edildi. Revers Transkriptaz ön karışımı buzda hazırlandı ve buzda tutuldu. Tablo 3.2. mRNA’dan cDNA elde etmek için uygulanan Revers Transkriptaz PCR reaksiyon karışımının içerikleri Bileşenler Örnek başına hacim (μl) 5x Revers Transkriptaz tamponu 5 dNTP 2 Random primer (100 μM) 5,25 RNaz İnhibitörü (40 U/μl) 0,5 Ters transkriptaz (200 U/μl) 1 DTT 1,25 RNaz içermeyen su 0,5 Örnek başına RT ön karışım hacmi 15,5 Ön karışım dikkatlice karıştırıldı, kısa süreli santrifüj edildi ve her bir RNA örneğinin üzerine ön karışımdan 15 μl eklendi. Her bir tüp dikkatlice karıştırıldı ve kısa süreli santrifüj edildi. Veriti™ Dx 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) cihazındaki kayıtlı revers transkripsiyon programı çalıştırıldı (Tablo 3.3 ). Tüpün altındaki cDNA'yı toplamak için kısa süreli santrifüj edildi ve qPCR gerçekleştirene kadar -20°C'de saklandı. 43 Tablo 3.3. mRNA’dan cDNA eldesinde revers transkripsiyon için termal döngüleyici ayarları Süre (dakika) Sıcaklık (°C) 10 25 60 50 5 85 ∞ 4 Tepkime tamamlandıktan sonra elde edilen tek sarmal cDNA örneklerinin dondurulup çözülerek oluşan kaybı önlemek için 0.2 ml’lik PCR tüplerine 2 μl eşit miktarlarda dağıtıldı. Eşit miktarlarda bölme işlemi yapıldıktan sonra cDNA’ların kullanım ömrünü uzatmak için -80oC’de muhafaza edildi. 3.5.2. Elde edilen cDNA’lardan kalite ve miktar tayini İfade analizi deneyleri öncesi elde edilen cDNA örneklerinin miktarlarını ve kalitesini belirlenmek amacıyla ve tüm örnekleri aynı yoğunlukta reaksiyona tabi tutmak amacıyla spektrofotometrik yöntem kullanıldı. Kalite ve miktar tayini Epoch Micro-Volume Spectrophotometer System (BioTek, Winooski, United States) kullanılarak yapıldı. İfade analizi deneyleri öncesi örneklerden elde edilen cDNA miktarları mRNA cDNA’sı için 50 ng/μl’e çekildi. Tablo 3.4. Örneklerden elde edilen mRNA cDNA’larının derişimleri Örnekler Derişim (ng/μL) 260/280 Absorbans Değerleri S-F (sadece DMEM) 1817,2 1,80 N-C (Mimik negatif kontrol) 1862,9 1,78 MiR-503-5p( A559 hücresinde) 1818,4 1,79 MiR-150-5p ( A559 hücresinde) 1828,0 1,80 MiR-15a-5p ( A559 hücresinde) 1963,7 1,79 44 3.6. MALAT1 ve B-MYB İfade Düzeyleri Ölçümü için Eş Zamanlı PCR (qRT-PCR) Yöntemi Eş zamanlı PCR reaksiyonu DNA bağlayan boyaların kullanımı ile amplifikasyonun eş zamanlı olarak takibine olanak sağlar. SYBR Green bu amaçla sıklıkla kullanılan boyalardan biridir. Çift iplikli DNA molekülüne bağlanarak floresan ışıma verir. Primerin bağlanmasını takiben gerçekleştirilen uzama aşamasında, hedef DNA’nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA’ya bağlanan SYBR Green miktarı artmakta ve buna bağlı olarak yayılan floresans miktarında artış gözlenmektedir. SYBR Green boyasından alınan ışımanın sınır değeri aştığı noktaya Ct yada Cp değeri adı verilmektedir. Bu noktada DNA amplifiye olmuş ve DNA’ya bağlanan boyanın verdiği ışıma sınır değeri aşmıştır. Işımanın sınır değeri aştığı anda amplifikasyondan emin olunur ancak doğru amplikonun takibinin yapıldığının belirlenebilmesi için erime eğrisinin incelenmesi gerekmektedir. Çünkü SYBR Green belirli bir DNA molekülüne bağlanan özgül bir boya değil, tüm çift iplikli DNA moleküllerine bağlanan bir boyadır. 3.6.1. Primer Seçimi MALAT1 ve B-MYB primerleri, NCBI veritabanında yer alan “Gene” arayüzü (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/) kullanılarak tasarlandı. Kullanılan primerlerin ileri ve geri primer dizilimleri Tablo 3.5’da gösterilmiştir. Hamarat bir(housekeeping) gen olan GAPDH kullanıldı. Tablo 3.5. MALAT1 ve B-MYBL2 geninin ifade seviyelerinin belirlenmesi için kullanılan primer dizilimleri. Primer Adı İleri Dizi (F) Geri Dizi (R) MALAT1 GAGTGTACCGCTGTGCTGTT GCTGCACTGTGCTGTACTTT B-MYBL2 ACTTGATCGAGTCGGACCCT GCTGCACTAGGCTGTTGTTG 45 3.6.2. PCR bileşenleri Eş zamanlı PCR reaksiyonu Rotor Gene 6000 Real-Time PCR Machine (Qiagen GmbH, Hilden, Almanya) cihazı kullanılmıştır. MALAT1 ve B-MYBL2 ifade analizi için hazılanan ön karışımda RT² SYBR Green ROX FAST Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden, Almanya) kullanılmıştır. 3.6.2.1. MALAT1 ve B-MYB ifade düzeyi ölçümü için PCR bileşenleri Tablo 3.6’ye göre eş zamanlı PCR ön karışımı buzda hazırlandı. Karıştırıldı ve buza koyuldu. Eş zamanlı PCR ön karışımı cDNA haricinde ifade analizi reaksiyonu için gerekli olan her bileşeni içermekteydi. Tablo 3.6. MALAT1 ve B-MYBL2 ifade düzeyinin ölçüldüğü eş zamanlı PCR reaksiyon karışımının içerikleri Bileşenler Hacim (μl) RT² SYBR Green ROX FAST Mastermix 6,25 F Primer (10 μM) 0,25 R Primer (10 μM) 0,25 Rnaz/Dnaz içermeyen su 5,25 cDNA (50 ng) 0,5 Total 12,5 Her örneğe ait cDNA, eş zamanlı PCR ön karışımı içeren her tüpe eklendi. Yavaşça karıştırıldı, kısa bir şekilde santrifüj edildi ve buza tekrar konuldu. Rotor Gene 6000 Real-Time PCR Machine (Qiagen GmbH, Hilden, Almanya) cihazındaki kayıtlı programı çalıştırıldı (Tablo 3.7). 46 Tablo 3.7. MALAT1 ve B-BMBL2 ifade düzeyinin ölçüldüğü eş zamanlı PCR ayarları Sıcaklık (oC) Süre(sn) Enzim aktivasyonu 95 10 dakika Denaturasyon 95 15 Primer bağlanması/uzama 60 60 Erime eğrisi 65 1 95 devamlı 40 döngü 3.6.3. İstatistiksel Analiz A549 hücre soyundan MALAT1 ve B-MYB ifade düzeylerinin kıyaslanmasında sonuçlar istatistiksel olarak ikili karşılaştırmalar için microsoft office excel programı kullanılmıştır. Kısmi miktarlara dayalı yöntemde A549 hücre soyu için ölçümü yapılan MALAT1 ve BB-MYBL2 geninin ölçüm değerleri GAPDH geni ölçüm değerleri normalize edilmiştir. Referans olarak alınan GAPDH geni belirli şartlar altında ifade düzeyi değişmeyen, her doku ya da hücrede bazal düzeyde ve hücreler arası varyasyon göstermeden ifade edilen hamarat genlerdir. qRT-PCR yönteminde Cp (Crossing points) değerleri elde edilmiştir. qRT-PCR sonuçlarında, hücre soyları arası istatistiksel analiz yapılırken 2-ΔΔCt formülü kullanılmıştır (Şekil 3.1). Bu değer bize ilgili genin bir hücre hattındaki ifade düzeyinin, kontrol baz alınarak diğer hücre hattındakine göre kıyaslanmasını sağlar; yani, katsayı bilgisi edinilir Şekil 3.1. 2-ΔΔCt formülü qRT-PCR sonuçlarında ilgili genin referans gene göre kıyaslaması için 2 -ΔCt formulü kullanılmıştır (Şekil 3.2). Bu değer bize o genin referans gene göre hangi oranda ifade düzeyinin değiştiğini gösterir; yani, göreceli ifade bilgisi edinilir. 47 Şekil 3.2. 2-ΔCt formülü 3.7. Akım (flow) sitometride apoptoz seviyelerine bakılması Hücre apoptozu Annexin V ve 7AAD içeren kit kullanılarak üretici firmanın (Becton Dickinson, Pharmingen, UK) tavsiyeleri doğrultusunda çalışıldı. Apoptotik hücrelerle nekrotik hücreleri ayırmak için, hücreler Annexin V (yeşil floresan) ve 7AAD (kırmızı floresan) ile aynı anda boyatıldı. Well platelere total hücre 1.000.000 olacak şekilde ekildi. Kitin çalışma prasedürü şöyledir: 1. 12’lik well plate ekilmiş olan hücreler 300 ml tripsin, 1ml DMEM ile kaldırıldı. 2. kaldırılan hücreler 1500 rpm de 5 dakika santrifüj edildi, üst faz atıldı. 3. Hücre süspansiyonlarının üzerine 1ml PBS eklendi, kısaca vortekslendi, 1500 rpm de 5 dakika sanrifüj edildi, üst faz döküldü. Böylece hücreler PBS ile yıkanmış oldu. 4. Hücre süspansiyonlarının üzerine binding buffer eklendi. ( 1ml binding buffer + 9 ml distile su ile seyreltildi) 1500 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Üst faz atıldı. 5. Hücre süspansiyonların üzerine 500 µl binding buffer eklendi. Kısaca vortekslendi ve yeni tüplere 100 µl aktarıldı. 6. Aktarılan yeni tüplere 5 µl Annexin, 5 µl 7AAD eklendi ve 15 dakika boyunca inkübe edildi. (Karanlık ortamda) 7. Hücreler 1500 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Üst faz döküldü. 8. Hücre süspansiyonlarının üzerine 500 µl binding buffer eklendi. Hücre süspansiyonları daha sonra Becton coulter NAVIOUS tipi akım (flow) sitometre ile değerlendirildi. Kaluza analysis programı kullanılarak her numune için hücreler sayılıp analiz edildi. 48 3.8. Akım (flow) sitometride hücre döngüsü analizi Hücre döngüsü için BD Cycletest™ Plus DNA Reagent kiti ( biosciences, Almanya) kullanıldı. Kitin çalışma prosedörü şöyledir: Hücreler 1X 106 olacak şekilde sayıldı. Hücre döngüsü için çalışma prasedürü şöyledir. 1. 12’lik well plate ekilmiş olan hücreler 300 ml tripsin, 1ml DMEM ile kaldırıldı. 2. Kaldırılan hücreler 1500 rpm de 5 dakika santrifüj edildi, üst faz atıldı. 3. Hücre süspansiyonlarının üzerine buffer solution eklendi. ( 1ml buffer solution + 9 ml destile su ile seyreltildi) 1500 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Üst faz atıldı. 4. 3. Adım tekrar edildi. 5. Hücre süspansiyonunun üzerine 250 µl solution A eklendi. Tüplerin dibine hafifçe vurularak karışması sağlandı. Hassas olduğundan vorteks yapılmadı. 10 dakika karanlık ortamda inkübe edildi. 6. Hücre süspansiyonun üzerine 200 µl solution B eklendi. Yine tüplerin dibine hafifçe vurularak karıştırılması sağlandı. 10 dakika karanlık ortamda inkübe edildi. 7. Hücre süspansiyonunun üzerine 200 µl solution C eklendi ve yine tüplerin dibine hafifçe vurularak karıştırılması sağlandı. 10 dakika karanlık ortamda inkübe edildi. Hücre süspansiyonları daha sonra Becton coulter NAVIOUS tipi akım (flow) sitometre ile değerlendirildi. Kaluza analysis programı kullanılarak her numune için hücreler sayılıp analiz edildi. 49 4. BULGULAR Akciğer kanserinde rol oynayan birçok molekül, gen ve yazılım faktörlerinin doku ve organ büyümesine etkileri tam olarak bilinemediğinden, tedavi amaçlı kullanılan ilaçlara direnç gösterebilir. Özellikle lncRNA’ların kanser üzerindeki etkisi ve yazılım faktörleri ile etkileşimleri gizemini korumaktadır. Bu amaçla tedaviye yönelik yeni yaklaşımları geliştirmesi için küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücre hattında (A549) miR-503, miR-150 ve miR-15a’nın MALAT1’e (uzun kodlamayan RNA) etkisinin gen ifadesinin analizleri yapılmış, apoptozis ve hücre döngüsü seviyelerine bakılmıştır. 4.1. A549 hücre Soyunda MALAT1’in gen İfade Sonuçları A549 akciğer kanseri hücre soyuna mimik miRNA‘lar aktarılıp 48 saat sonra hücreler kaldırılıp total RNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen RNA’lardan cDNA’ya çevrilmiş, kalite ve miktar tayini yapılmıştır. Daha sonra bu yoğunluklar ifade analizi öncesi 50 ng/μl’ye çekilmiştir. Bu hücre soyunun miR-150-5p, miR-15a-5p ve miR-503-5p ifade sonuçları gerçek zamanlı PCR yöntemiyle ölçülmüştür. miR-150-5p, miR-15a-5p ve miR-503-5p ifadelerinin normalizasyonu yapılırken hamarat gen olarak GAPDH kullanılmıştır (Şekil 4.1). Şekil 4.1. miR-150-5p, miR-15a-5p, miR-503-5p ve GAPGH’e ait qRT-PCR analizi sonucu. Örnekler 16 ile 25 döngüleri arasında en yüksek eğim vermiştir. 50 4.1.1. miR-503-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MALAT1’in katlı değişim ifade sonuçları Şekil 4.2’de MALAT1 lncRNA’sının ifade düzeyi A549 hücre soyunda negatif kontrol baz alınarak birbirine göre kıyaslanması gösterilmiştir. Grafikte 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanan katlı değişim miktarları şöyledir: NC ( Negatif kontrol) için 0,21, miR-503 (miR-503-5p’nin) için 0,11 olarak bulunmuştur. Şekil 4.2. MALAT1’in ifadesel değeri A459 hücre soyunda miR-503-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. 51 4.1.2. miR-150-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MALAT1’in katlı değişim ifade sonuçları Şekil 4.3’te MALAT1 lncRNA’sının ifade düzeyi A549 hücre soyunda negatif kontrol baz alınarak birbirine göre kıyaslanması gösterilmiştir. Grafikte 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanan katlı değişim miktarları şöyledir: NC ( Negatif kontrol) için 0,21, miR-150 (miR-150-5p’nin) için 0,15 olarak bulunmuştur. Şekil 4.3. MALAT1’in ifadesel değeri A459 hücre soyunda miR-150-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. 52 4.1.3. miR-15a-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MALAT1’inkatlı değişim ifade sonuçları Şekil 4.3’te MALAT1 lncRNA’sının ifade düzeyi A549 hücre soyunda negatif kontrol baz alınarak birbirine göre kıyaslanması gösterilmiştir. Grafikte 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanan katlı değişim miktarları şöyledir: NC ( Negatif kontrol) için 0,21, miR-15a (miR-15a-5p’nin) için 0,01 olarak bulunmuştur. Şekil 4.3. MALAT1’in ifadesel değeri A459 hücre soyunda miR-15a-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. 53 4.1.4. miR-503-5p, miR-150-5p ve miR-15a-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MALAT1’in katlı değişim ifade sonuçları Şekil 4.4’de MALAT1 lncRNA’sının ifade düzeyi A549 hücre soyunda negatif kontrol baz alınarak birbirine göre kıyaslanması gösterilmiştir. Grafikte 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanan katlı değişim oranları şöyledir: NC ( Negatif kontrol) için 0,21, miR-503 (miR-503-5p’nin) için 0,11, miR-150 (miR-150-5p’nin) için 0,149684838 miR-15a (miR-15a-5p’nin) için 0,01 olarak bulunmuştur. Şekil 4.4. MALAT1’in ifadesel değeri A459 hücre soyunda, miR-503-5p, miR-150-5p ve miR-15a-5p’nin negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. 54 4.2. A549 hücre Soyunda MYB geninin gen İfade Sonuçları A549 akciğer kanseri hücre soyuna mimik miRNA ‘lar aktarılıp 48 saat sonra hücreler kaldırılıp total RNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edillen RNA’lardan cDNA’ya çevrilmiş, kalite ve miktar tayini yapılmıştır. Daha sonra bu yoğunluklar ifade analizi öncesi 50 ng/μl’ye çekilmiştir. Bu hücre soyunun miR-150-5p, miR-15a-5p ve miR-503-5p MYB genine etkisinin ifade sonuçları eş zamanlı PCR yöntemiyle ölçülmüştür. miR-150-5p, miR-15a-5p ve miR503-5p ifadelerinin normalizasyonu yapılırken hamarat gen olarak GAPDH kullanılmıştır (Şekil 4.5). Şekil 4.5. miR-150-5p, miR-15a-5p, miR-503-5p ve GAPDH’e ait qRT-PCR analizi sonucu. Örnekler 16 ile 25 döngüleri arasında en yüksek eğim vermiştir. 55 4.2.1. miR-503-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MYB geninin katlı değişim ifade sonuçları Şekil 4.6’da MYB geninin gen ifadesi, A549 hücre soyunda negatif kontrol baz alınarak birbirine göre kıyaslanması gösterilmiştir. Grafikte 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanan katlı değişim miktarları şöyledir: NC ( Negatif kontrol) için 0,012, miR-503(miR-503-5p’nin) için 0,006 olarak bulunmuştur. Şekil 4.6. MYB geninin gen ifadesi, A459 hücre soyunda miR-503-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. 56 4.2.2. miR-150-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MYB geninin katlı değişim ifade sonuçları Şekil 4.7’de MYB geninin gen ifadesi, A549 hücre soyunda negatif kontrol baz alınarak birbirine göre kıyaslanması gösterilmiştir. Grafikte 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanan katlı değişim miktarları şöyledir: NC ( Negatif kontrol) için 0,012, miR-150 (miR-150-5p’nin) için 0,008 olarak bulunmuştur. Şekil 4.7. MYB geninin gen ifadesi, A459 hücre soyunda miR-150-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. 57 4.2.3. miR-15a-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MYB geninin katlı değişim ifade sonuçları Şekil 4.8’de MYB geninin gen ifadesi, A549 hücre soyunda negatif kontrol baz alınarak birbirine göre kıyaslanması gösterilmiştir. Grafikte 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanan katlı değişim miktarları şöyledir: NC ( Negatif kontrol) için 0,012, miR-15a (miR-15a-5p’nin) için 0,014 olarak bulunmuştur. Şekil 4.8. MYB geninin gen ifadesi, A459 hücre soyunda miR-15a-5p, negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. 58 4.2.4. miR-503-5p, miR-150-5p ve miR-15a-5p’nin A549 hücre soyunda miRNA negatif kontrol baz alınarak hesaplanan MYB geninin katlı değişim ifade sonuçları Şekil 4.8’de MYB geninin gen ifadesi, A549 hücre soyunda negatif kontrol baz alınarak birbirine göre kıyaslanması gösterilmiştir. Grafikte 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanan katlı değişim miktarları şöyledir: NC ( Negatif kontrol) için 0,012, miR-503(miR-503-5p’nin) için 0,006, miR-150 (miR-150-5p’nin) için 0,00875911, miR-15a (miR-15a-5p’nin) için 0,014 bulunmuştur. Şekil 4.9. MYB geninin gen ifadesi, A459 hücre soyunda, miR-503-5p, miR-150-5p ve miR-15a-5p’nin negatif kontrol baz alınarak hesaplanan katlı oran değişim grafiksel olarak gösterilmiştir. 59 4.3. Akım (Flow) Sitometride Apaptozis ve Hüce Döngüsü Analiz Sonuçları A549 akciğer kanseri hücre soyuna mimik miRNA ‘lar aktarılıp 48 saat sonra hücreler kaldırıldı. Hücre apoptozisi Annexin V ve 7AAD içeren kit kullanılarak üretici firmanın (Becton Dickinson, Pharmingen, UK) tavsiyeleri doğrultusunda çalışıldı. Apoptotik hücrelerle nekrotik hücreleri ayırmak için, hücreler Annexin V (yeşil floresan) ve 7AAD (kırmızı floresan) ile aynı anda boyandı. Hücre döngüsü için BD Cycletest™ Plus DNA Reagent kiti ( biosciences, Almanya) kullanıldı. Kitin çalışma prosedörü baz alınarak hücreler flow sitometri de okutmak için hazır hale getirildi. Hücre süspansiyonları karanlıkta buz üstünde 15 dk inkübe edilecek, daha sonra BectonCoulter tipi akım (flow) sitometre ile değerlendirildi. Hücreler Navious Software programı ile okutuldu, kaluza (analysis) analiz programı ile değerlendirildi. 60 4.3.1. A549 hücre soyuna negatif kontrol mimik (nc) verildiğinde elde edilen verilerin apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları Şekil 4.10’da A549 hücre soyuna negatif kontrol mimik (NC) verildiğinde elde edilen apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları grafiksel olarak gösterilmiştir. Kaluza analiz programına göre elde edilen verilerin değişim oranları şöyledir: apoptozise giden hücreler %34,33 hücre döngüsü G2/M döngüsüne giren hücrelerin sayısı 2828, yüzde değişimleri 15,46 olarak bulunmuştur. Şekil 4.10. A549 hücre soyuna negatif kontrol (NC) mimik verildiğinde A). Apoptozise giden hücrelerin yüzde grafiksel gösterimi. B). Hücre döngüsü grafiksel gösterimi. 61 4.3.2. A549 Hücre hatına miR-503-5p mimik (miR-503) verildiğinde elde edilen verilerin Apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları Şekil 4.11’ da A549 hücre soyuna miR-503-5p mimik (miR-503) verildiğinde elde edilen apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları grafiksel olarak gösterilmiştir. Kaluza analiz programına göre elde edilen verilerin değişim oranları şöyledir: apoptozise giden hücreler %46,44, hücre döngüsü G2/M döngüsüne giren hücrelerin sayısı 2229, yüzde değişimleri 10,89 olarak bulunmuştur. Şekil 4.11. A549 hücre soyuna miR-503-5p verildiğinde A). Apoptozise giden hücrelerin yüzde grafiksel gösterimi. B). Hücre döngüsü grafiksel gösterimi. 62 4.3.3. A549 Hücre hatına miR-150-5p mimik (miR-150) verildiğinde elde edilen Apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları Şekil 4.12’ da A549 hücre soyuna miR-150-5p mimik (miR-150) verildiğinde elde edilen apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları grafiksel olarak gösterilmiştir. Kaluza analiz programına göre elde edilen verilerin değişim oranları şöyledir: apoptozise giden hücreler %43,61 hücre döngüsü G2/M döngüsüne giren hücrelerin sayısı 2504, yüzde değişimleri 11,37 olarak bulunmuştur. Şekil 4.12. A549 hücre soyuna miR-150-5p verildiğinde A). Apoptozise giden hücrelerin yüzde grafiksel gösterimi. B). Hücre döngüsü grafiksel gösterimi. 63 4.3.4. A549 Hücre hatına miR-15a-5P mimik (miR-15a) verildiğinde elde edilen Apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları Şekil 4.13’ da A549 hücre soyuna miR-15a-5p mimik (miR-15a) verildiğinde elde edilen apoptozis ve hücre döngüsü analiz sonuçları grafiksel olarak gösterilmiştir. Kaluza analiz programına göre elde edilen verilerin değişim oranları şöyledir: apoptozise giden hücreler %26,78, hücre döngüsü G2/M döngüsüne giren hücrelerin sayısı 2720, yüzde değişimleri 13,29 olarak bulunmuştur. Şekil 4.13. A549 hücre soyuna miR-15a-5p verildiğinde; A). Apoptozise giden hücrelerin yüzde grafiksel gösterimi. B).Hücre döngüsü grafiksel gösterimi. 64 5.TARTIŞMA Uzun kodlamayan RNA’lar ( lncRNAs) 200 nt büyük ve büyük bir bölümü okuma çerçevesinden yoksun olan, birçok hastalıklarda erken dönemlerde tanı, tahmin ve tedavi yönelik çalışmalarda biyobelirteç olarak kullanılan kodlamayan dizilerdir (90). Zenginleştirilmiş çekirdek yazılımı nuclear-enriched abundant transcript 2 (NEAT2) olarakta bilinen MALAT1 her yerde bulunan ve yüksek miktarda ifade edilen 8000 nt uzunluğunda lncRNA’dır. LncMALAT1 Akciğer kanseri gibi farklı insan kanserinde tümör dokusunun ve kılinik parametrelerin ilerleyişinde aşırı ifade olur (90). MALAT1 akciğer kanserinde metastazik ve birçok tümörün düzenlemesinde prognostik biyobelirteç olarak keşfedilmiştir. Ancak tümörlerde transkripsiyonel düzenleme mekanizması hala açıklığa kavuşturulamamıştır(91). B-MYB ile birlikte ele alındığında A549 akciğer kanser hücrelerinde de düzenlenmiş ifadesi, transkripsiyon faktörüne aracılık ettiği ve tedaviye yönelik bir hedef olabiliceğini ortaya koymaktadır (91). Önceki çalışmalarda MALAT1’in iki farklı moleküler mekanizması üzerinde durulmuştur. Alternatif uç uca eklemeleri düzenleme ve gen ifadesini düzenlemelerdir (91). Bizim çalışmamızda verileri incelendiğinde A549 hücrelerinde fonksiyonel sistemleri kaybolduğu ve buna bağlı olarak B-MYB geni ilişkili olarak hücre çoğalmasına etkisinde değişiklikler gözlemlenmiştir (Şekil 5.1). Kanser tedavisi için kullanılan doğal mikroRNA’lar, birkaç geni hedefleyerek fonksiyonlarına bağlı birkaç fenotipik değişimine neden olur (93). MiRNA’lar, özgül genleri, protein kodlayan genleri ve uzun kodlamayan genleri hedefleylebilir. Sonulan çalışmada, uzun kodlamayan RNA’ları hedefleyen (MALAT1) miRNA’ları seçildi. MiR-150, miR-15a ve miR-503’larla MALAT1’i hedefleyerek akciğer kanserinde hücre çoğalmasına potansiyel etkisini inceledik. Literatür ve miRNA-lncRNA data veri tabanı incelediğinde miR-150, miR-15a ve miR-503’larla MALAT1 hedeflendiğinde akciğer kanser hücre hatlarında MALAT1 gen ifadesi azalmaktadır (Şekil 5.1). literatürü incelendiğinde, MALAT1’in ifadesi baskılandığında akciğer kanserinde G2/M de hücre döngüsünde hücre çoğalmasını azalttığı, apoptozise giden hücrelerin arttığı görülmektedir (Şekil 5.1). 65 Şekil 5.1. Uzun kodlamayan RNA miRNA’lar baskılandığında apaptozis, hücre çoğalması ve hücre göçündeki değişim (94) Genler, yazılım faktörleri gibi pek çok biyomoleküller akciğer kanserinde doku ve organ büyümesine rol alan önemli birer faktördür. Fakat son yıllarda yeni olan lncRNA’ların kanserde etkisi hala gizemini korumaktadır. Çalışmamızda bu moleküllerin fonksiyonlarını analiz ederek, mekanizmalarını anlamaya çalıştık. Bunun için uzun kodlamaya RNA ailesi olan MALAT1’i seçtik. MALAT1 akciğer kanserinde aşırı ifade olur. Özellikle küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde hücre çoğalmasını arttırdığı bilinmektedir. MALAT1, yazılımdan sonra B-MYB genin alternatif uç uca ekleme faktörlerini düzenleyerek kanserli hücrelerde hücre çoğalmasını (proliferasyonu) düzenleyerek normal hücrelere göre, kanserli hücrelerin daha fazla artmasına neden olur. Eğer MALAT1 susturulursa veya ifadesi baskılanırsa hücre çoğalmasına etkileri olabileceğini düşündük, bu hipoteze dayanarak MALAT1 inhibe edecek mikroRNA’lar seçildi. Bu amaçla tedaviye yönelik yeni yaklaşımları geliştirmesi amacıyla küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücre hattında (A549) miR-503, miR-150 ve miR-15a’nın MALAT1’e etkisinin gen ifade analizleri yapılmış, apoptozis ve hücre döngüsü seviyelerine bakılmıştır. Yaptığımız çalışmada elde ettiğimiz verilerde gösterdi ki MALAT1’in ifadesi baskılandığında akciğer kanserinde, kanserli hücrelerin apoptozise giden hücrelerin sayısının artma, buna mukabil G2/M hücre döngüsünde hücrelerin sayısında ve yüzdelerinde azalmalar olduğu saptanmıştır (Şekil 4.2 ve 4.3). Bu verileri şöyle de yorumlayabiliriz; MALAT1’i hedefleyecek mikroRNA’lar, ne kadar oranda gen ifadesini 66 inhibe etmede başarılı olmuşsa, o kadar oranda apoptozise giren hücrelerin sayısında artma, hücre döngüsünde de azalamalar olur. Ayrıca gen ifade analizlerindeki grafikler incelendiğinde, MALAT1’in gen ifadesindeki değişim ile doğru orantılı olarak B-MYB gen ifadesindeki değişim benzer şekilde değiştiği görülmüştür (Şekil 4.2, 4.3 ve 4.4). Çalışmadaki veriler incelediğinde; A549 hücre soyuna miR-503 mimik RNA verildiğinde, MALAT1’in ve B-MYB geninin gen ifadesi aynı şartlarla negatif kontrol mimik RNA verilmiş aynı hücre soyuna göre, anlamlı bir şekilde düşük bulunmuştur (şekil 4.2 ve 4.6). Bu hücre hattında aynı koşullarda apoptozis ve hücre döngüsü incelendiğinde miR-503’ün verilmiş hücrede apoptozis yüksek bulunmuş, hücre döngüsü düşük bulunmuştur (Şekil 4.11). Bu sonuçlara göre; miR-503, MALAT1’i susturmuş veya ifadesi baskılanmış bu lncRNA, B-MYB hücre döngüsü kontrol genini yazılım sonrası yeniden düzenlemiştir. Hücreleri apoptozise götüren faktorler tetiklenerek hücreler apoptoza götürülmüştür, buna bağlı olarak G2/M döngüsüne giren hücrelerin sayısında azalmalar gözlenmiştir. Bu veriler ışığında, akciğer kanserinde MALAT1’in ifadesini düzenlenerek hücre çoğalmasının kontrol altına alabileceğini gösterilmiş oldu. Çalışmadaki ikinci bir mikroRNA ise, miR-150. A549 hücre soyuna miR-150 mimik verildiğinde; MALAT1 ve B-MYB ifade düzeylerine bakıldığında MALAT1 ve B-MYB ifade düzeyinde azalma gözlenmiştir (Şekil 4.3 ve 4.7). Bu bulgulara göre MALAT1’ in gen ifadesi inhibe edilmiştir. Gen ifadesi baskılanmış bu biyomolekül flow sitometride apoptoz ve hücre döngüsüne bakıldığında, apoptoza giden hücrelerin sayısında artış, G2/M hücre döngüsüne giren hücrelerin sayısında azalma tespit edilmiştir (şekil 4.12). Bulduğumuz bu verilere göre, MALAT1 hedefleyerek B-MYB geninin gen ifadesinde de azalmalar olur. MALAT1 ifadesi, hücre çoğalması ile doğru orantılı bulunmuştur (Şekil 4.12). Eğer MALAT1 düşük ifade edilirse, B-MYB geninde ifadesi düşer ve bunun sonucunda küçük hücreli olmayan akciğer kanser hücrelerinde, hücre çoğalması azalır. Çoğalamayan hücreler, ön-apoptotik faktörler uyarılarak hücreler apoptoza götürülür. Çalışmamızda kullandığımız son mikroRNA ise miR-15a’dır. Bu miRNA mimiği A549 hücre soyuna verildiğinde MALAT1’in ve B-MYB’nin gen ifadesi normal negatif kontrol verilmiş A549 hücre soyuna göre yüksek bulunmuştur (Şekil 4.4 ve 4.9). MALAT1’in gen ifadesi, negatif kontrol verilmiş hücreye göre, yüksek olduğundan apoptozise giren hücrelerin sayısında azalma, G2/M döngüsüne giren hücrelerin sayısında ve yüzdesinde 67 artma beklenmektedir (Şekil 4.13). Şekildeki veriler incelendiğinde apoptozise giren hücrelerin sayısında atma görülmüş, fakat G2/M döngüsüne giren hücrelerin sayısında da negatif kontrole göre azalma görülmüştür. Bu sonuçlara göre hücre döngüsünde veriler anlamsız bulunmuştur (Şekil 4.13). Beklenmediğimiz diğer sonuçta miR-15a hücreye verildiğinde MALAT1’in gen ifadesi yüksek bulunması. MiR-15a, MALAT1’i baskılayamadığı gibi MALAT1’i inhibe eden diğer faktörleri baskılamış olabilir. Sunulan araştırmada elde edilen sonuçlara göre, MALAT1 akciğer kanserinde hücre çoğalmasına pozitif etki eder. Kanserli hücrelerde MALAT1 susturulursa apoptoza giren hücrelerin sayısı artar, G2/M döngüsüne giren hücre sayısı azalır. MALAT1 gen ifadesindeki değişim ile B-MYB gen ifadesindeki değişim aynı doğrultudadır. Yine akciğer kanserinde lncRNA ifadesini baskılamak için verilmiş miRNA’lar mukayese edildiğinde, miR-503 gen ifadesini en fazla baskılayan miRNA’dır. MiR-503’ten sonra MALAT1 ifadesini baskılayan ikinci miRNA ise miR-150’dir. MiR-15a, MALAT1’in gen ifadesini baskılamadığı gibi gen ifadesini artırmıştır. Tüm bu veriler karşılaştığında MALAT1’i susturmak için miR-503 ve miR-150 mikroRNA’lar kullanılabilir. Sonuç olarak; lncRNA olarak tanımlanan kodlanmayan diziler kanser hücrelerinde pek çok kanser hücrelerinde birden fazla rolleri vardır. Küçük hücreli olmayan akciğer kanser hücrelerinde MALAT1 ne kadar çok ifade olursa, kanserli hücrelerde o kadar çoğalır. MALAT1, siRNA, miRNA gibi küçük kodlamayan RNA’larla ifadesi düzenlenebilir. Kanserli hücrelerde MALAT1’in ifadesinin azalması, doku ve organ büyümesini negatif yönde etkisi olur. Elde ettiğimiz bulguların doğrulanması ve daha ileri çalışmalar için deneysel tümör modeli oluşturulmuş hayvan modellerinde miR-503 ve miR-150 kullanarak tümör gelişimi araştırılabilir. 68 6. KAYNAKÇA 1. Tian, Y., Chu, Q., and Chen, Y. (2014) [Progress of platelet derived grow factor family in non-small cell lung cancer]. Zhongguo fei ai za zh Chinese journal of lung cancer 17, 42-48 2. http://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/type/lung-cancer/ (11.01.2015) 3. Laskin, J. J., and Sandler, A. B. (2005) First-line treatment for advanced non-smallcell lung cancer. Oncology (Williston Park, NY) 19, 1671-1676; discussion 16781680 4. Dong, Y., Liang, G., Yuan, B., Yang, C., Gao, R., and Zhou, X. (2014) MALAT1 promotes the proliferation and metastasis of osteosarcoma cells by activating the PI3K/Akt pathway. Tumor Biology, 1-10 5. Badisa, R. B., Mina, D. A., Latinwo, L. M., and Soliman, K. F. (2014) Selective Anticancer Activity of Neurotoxin 1-Methyl-4-Phenylpyridinium on Non-small Cell Lung Adenocarcinoma A549 Cells. Anticancer research 34, 5447-5452 6. Kanteti, R., El-Hashani, E., Dhanasingh, I., Tretiakova, M., Husain, A. N., Sharma, S., Sharma, J., Vokes, E. E., and Salgia, R. (2014) Role of PAX8 in the regulation of MET and RON receptor tyrosine kinases in non-small cell lung cancer. BMC cancer 14, 185 7. Pikor, L. A., Ramnarine, V. R., Lam, S., and Lam, W. L. (2013) Genetic alterations defining NSCLC subtypes and their therapeutic implications. Lung cancer 82, 179189 8. http://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/type/lung-cancer/non-small cell lung cancer/ (17.03.2015) 9. Pirastu, R., Comba, P., Iavarone, I., Zona, A., Conti, S., Minelli, G., Manno, V., Mincuzzi, A., Minerba, S., and Forastiere, F. (2013) Environment and health in contaminated sites: the case of Taranto, Italy. Journal of environmental and public health 2013 10. Andreas, S., Rittmeyer, A., Hinterthaner, M., and Huber, R. M. (2013) Smoking Cessation in Lung Cancer—Achievable and Effective. Deutsches Ärzteblatt International 110, 719 11. Kornienko, A. E., Guenzl, P. M., Barlow, D. P., and Pauler, F. M. (2013) Gene regulation by the act of long non-coding RNA transcription. BMC biology 11, 59 69 12. Spizzo, R., Almeida, M. I., Colombatti, A., and Calin, G. A. (2012) Long non-coding RNAs and cancer: a new frontier of translational research&quest. Oncogene 31, 45774587 13. Liu, J., Yao, J., Li, X., Song, Y., Wang, X., Li, Y., Yan, B., and Jiang, Q. (2014) Pathogenic role of lncRNA-MALAT1 in endothelial cell dysfunction in diabetes mellitus. Cell death & disease 5, e1506 14. Cheetham, S., Gruhl, F., Mattick, J., and Dinger, M. (2013) Long noncoding RNAs and the genetics of cancer. British journal of cancer 108, 2419-2425 15. Hou, Z., Zhao, W., Zhou, J., Shen, L., Zhan, P., Xu, C., Chang, C., Bi, H., Zou, J., and Yao, X. (2014) A long noncoding RNA Sox2ot regulates lung cancer cell proliferation and is a prognostic indicator of poor survival. The international journal of biochemistry & cell biology 53, 380-388 16. Gutschner, T., Hämmerle, M., Eißmann, M., Hsu, J., Kim, Y., Hung, G., Revenko, A., Arun, G., Stentrup, M., and Groß, M. (2013) The noncoding RNA MALAT1 is a critical regulator of the metastasis phenotype of lung cancer cells. Cancer research 73, 1180-1189 17. Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., and Bubulya, P. A. (2010) The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Molecular cell 39, 925-93 18. Eißmann, M., Gutschner, T., Hämmerle, M., Günther, S., Caudron-Herger, M., Groß, M., Schirmacher, P., Rippe, K., Braun, T., and Diederichs, S. (2012) Loss of the abundant nuclear non-coding RNA MALAT1 is compatible with life and development. RNA biology 9, 1076-1087 19. Tee, A. E., Ling, D., Nelson, C., Atmadibrata, B., Dinger, M. E., Xu, N., Mizukami, T., Liu, P. Y., Liu, B., and Cheung, B. (2014) The histone demethylase JMJD1A induces cell migration and invasion by up-regulating the expression of the long noncoding RNA MALAT1. Oncotarget 5, 1793 20. Sobin, L. H., Gospodarowicz, M. K., and Wittekind, C. (2011) TNM classification of malignant tumours, John Wiley & Sons 21. Li, L., Feng, T., Lian, Y., Zhang, G., Garen, A., and Song, X. (2009) Role of human noncoding RNAs in the control of tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 12956-12961 70 22. Tripathi, V., Shen, Z., Chakraborty, A., Giri, S., Freier, S. M., Wu, X., Zhang, Y., Gorospe, M., Prasanth, S. G., and Lal, A. (2013) Long noncoding RNA MALAT1 controls cell cycle progression by regulating the expression of oncogenic transcription factor B-MYB. PLoS genetics 9, e1003368 23. JiP, D., and Wang, W. (2003) MALAT1, anovelnoncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survivalin early stage non small cell lung cancer. Oncogene 22, 8031 24. Lin, R., Maeda, S., Liu, C. a., Karin, M., and Edgington, T. (2007) A large noncoding RNA is a marker for murine hepatocellular carcinomas and a spectrum of human carcinomas. Oncogene 26, 851-858 25. Rolf A. Stahel, Robert Ginsberg, Klaus Havemann, Fred R. Hirsch, Daniel C. Ihde, Jacek Jassem, Karl Karrer, L. Herbert Maurer, Kell Osterlind, Paul Van Houtte. Staging and prognostic factors in small cell lung cancer: a consensus report. Lung Cancer, 5 (1989) 119-126 26. Kummerow, K., Phillips, S., Griffin, M., Holzman, M. D., Nealon, W., Pinson, C. W., Poulose, B. K., Cobert, M. L., Peltz, M., and West, L. M. (2012) That’s Why It’sa 5Year Program: Resident Acquisition of Anorectal Disease Management Competence. Seth Miller, Vance Sohn, Marlin Wayne Causey, Matthew Martin, Tommy Brown, and Scott Steele 187 An Urban-Rural Blight Choledocholithiasis Presentation and Treatment. Julia Shelton. Journal of Surgical Research 173 27. http://www.on5yirmi5.com/haber/yasam/dunya-hali/109735/akcigerin-yapisi-vegorevleri.html. (5.6.2015) 28. http://www.bilgicik.com/yazi/insanda-solunum-sistemi/ (5.6.2015) 29. http://www.welldonew.com/wp-content/uploads/2012/06/1de1d.gif. How to keep the lungs healthy (5.6.2015) 30. Cotes, J. E., Chinn, D. J., and Miller, M. R. Lung function: physiology, measurement and application in medicine, John Wiley & Sons 31. Fredberg, J. J., Inouye, D. S., Mijailovich, S. M., and Butler, J. P. (1999) Perturbed equilibrium of myosin binding in airway smooth muscle and its implications in bronchospasm. American journal of respiratory and critical care medicine 159, 959967 32. Horeweg, N., van Klaveren, R., Groen, H., Lammers, J.-W., Weenink, C., Nackaerts, K., Mali, W., Oudkerk, M., and de Koning, H. (2012) Blinded and uniform cause of death verification in a lung cancer CT screening trial. Lung cancer 77, 522-525 71 33. Richards, T. B., White, M. C., and Caraballo, R. S. (2014) Lung Cancer Screening with Low-Dose Computed Tomography for Primary Care Providers. Primary Care: Clinics in Office Practice 41, 307-330 34. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Murray, T., and Thun, M. J. (2008) Cancer statistics, 2008. CA: a cancer journal for clinicians 58, 71-96 35. Goksel, T., and Akkoclu, A. (2001) Pattern of lung cancer in Turkey, 1994-1998. Respiration; international review of thoracic diseases 69, 207-210 36. Köktürk, N., Yeğin, D., Çiftçi, T. U., Mullaoğlu, S. B., and Öztürk, C. (2004) Akciğer kanserlerinde epidemiyolojik özellikler yıllar içinde değişim gösteriyor mu?. Toraks Dergisi 5, 137-142 37. Pfeifer, G. P., Denissenko, M. F., Olivier, M., Tretyakova, N., Hecht, S. S., and Hainaut, P. (2002) Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p 53 mutations in smoking-associated cancers. Oncogene 21, 7435-7451 38. McErlean, A., and Ginsberg, M. S. Epidemiology of lung cancer. in Seminars in roentgenology, WB Saunders 2011,10.1053/j 39. Barros-Dios, J. M., Barreiro, M. A., Ruano-Ravina, A., and Figueiras, A. (2002) Exposure to residential radon and lung cancer in Spain: a population-based casecontrol study. American Journal of Epidemiology 156, 548-555 40. Carbone, M., Kratzke, R. A., and Testa, J. R. (2002) The pathogenesis of mesothelioma. in Seminars in oncology, Elsevier 2002 Feb;29(1):2-17. 41. Hubaux, R., Becker-Santos, D. D., Enfield, K., Lam, S., Lam, W. L., and Martinez, V. D. (2012) Arsenic, asbestos and radon: emerging players in lung tumorigenesis. Environ Health 11, 89 42. Sanchez Cespedes, M., Ahrendt, S. A., Piantadosi, S., Rosell, R., Monzo, M., Wu, L., Westra, W. H., Yang, S. C., Jen, J., and Sidransky, D. (2001) Chromosomal alterations in lung adenocarcinoma from smokers and nonsmokers. Cancer Research 61, 1309-1313 43. Sozzi, G., Sard, L., De Gregorio, L., Marchetti, A., Musso, K., Buttitta, F., Tornielli, S., Pellegrini, S., Veronese, M. L., and Manenti, G. (1997) Association between cigarette smoking and FHIT gene alterations in lung cancer. Cancer research 57, 2121-2123 44. Ergelen, R., and Cagatay Çimşit, N. (2013) AKCİĞER TÜMÖRLERİ. Bulletin of Thoracic Surgery/Toraks Cerrahisi Bülteni 4 72 45. Ettinger, D. S., Akerley, W., Bepler, G., Blum, M. G., Chang, A., Cheney, R. T., Chirieac, L. R., D'Amico, T. A., Demmy, T. L., and Ganti, A. K. P. (2010) Non–small cell lung cancer. Journal of the national comprehensive cancer network 8, 740-801 46. http://lungcancer.ucla.edu/adm_lung_cancer_nonsm.html. (17.03.2015) 47. Mehra, R., Moore, B. A., Crothers, K., Tetrault, J., and Fiellin, D. A. (2006) The association between marijuana smoking and lung cancer: a systematic review. Archives of internal medicine 166, 1359-1367 48. http://lungcancer.ucla.edu/adm_lung_cancer_nonsm.html. Diseases of the Lung: Lung cancer - non-small cell; NSCLC: Diseases of the Lung: Lung cancer - non-small cell; NSCLC (17.03.2015) 49. Souhami, R., and Law, K. (1990) Longevity in small cell lung cancer. A report to the Lung Cancer Subcommittee of the United Kingdom Coordinating Committee for Cancer Research. British journal of cancer 61, 584 50. ALTINBAŞ, M., DİKİLİTAŞ, M., ÖZKAN, M., DOĞU, G. G., and ER, Ö. (2007) Küçük hücreli akciğer kanserine yaklaşım. Türk Onkoloji Dergisi 22, 44-53 51. Kalemkerian, G. P., Akerley, W., Bogner, P., Borghaei, H., Chow, L. Q., Downey, R. J., Gandhi, L., Ganti, A. K. P., Govindan, R., and Grecula, J. C. (2013) Small cell lung cancer. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 11, 78-98 52. http://image.slidesharecdn.com/10-140227054919-phpapp02/95/10-akcier-kanser-i20-638.jpg?cb=1393480189 (8.4.2015) 53. Engin, K., and Özyardımcı, N. (2001) Akciğer Kanserleri Tanı ve Tedavide Temel İlkeler ve Uygulamalar. Avrupa Tıp Kitapçılık, İstanbul 54. Aktuğ, H. Apoptozis ve hücre döngüsü. Ege journal of medicine. 2014, Cilt 53, Sayı 1, Sayfa(lar) 060-064 55. Casimiro, M. C., Crosariol, M., Loro, E., Li, Z., and Pestell, R. G. (2012) Cyclins and cell cycle control in cancer and disease. Genes & cancer 3, 649-657 56. Abraham, R. T. (2001) Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes & development 15, 2177-2196 57. Lowitz, B. B., and Casciato, D. A. (2013) Medical oncology & principles of cancer biology. 58. Guicciardi, M. E., Malhi, H., Mott, J. L., and Gores, G. J. Apoptosis and necrosis in the liver. Comprehensive Physiology, 2013 977-1010 59. Cabadak, H. (2008) Hücre Siklusu Ve Kanser. ADÜ Tıp Fakültesi Dergisi 2008; 9(3) : 51 - 61 73 60. Singletary, S. E., and Connolly, J. L. (2006) Breast cancer staging: working with the sixth edition of the AJCC Cancer Staging Manual. CA: a cancer journal for clinicians 56, 37-47 61. http://tr.wikipedia.org/wiki/Akci%C4%9Fer_kanserinde_evrelendirme ( 2. 4.2015) 62. Schmidt, L. H., Spieker, T., Koschmieder, S., Humberg, J., Jungen, D., Bulk, E., Hascher, A., Wittmer, D., Marra, A., and Hillejan, L. (2011) The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology 6, 1984-1992 63. Braconi, C., Kogure, T., Valeri, N., Huang, N., Nuovo, G., Costinean, S., Negrini, M., Miotto, E., Croce, C., and Patel, T. (2011) microRNA-29 can regulate expression of the long non-coding RNA gene MEG3 in hepatocellular cancer. Oncogene 30, 47504756 64. Costa, F. F. (2010) Non‐coding RNAs: Meet thy masters. Bioessays 32, 599-608 65. Akkaya, Z. Y., and Dinçer, P. Tedavi yaklaşımlarında yeni bir dönem: Kodlamayan RNA’lar ve hastalıklar.Marmara Medical Journal (2013) 26:5-10 DOI:10.5472/MMJ.2012.02596 66. Voinnet, O. (2009) Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell 2009 136, 669-687 67. Tsai, M.-C., Manor, O., Wan, Y., Mosammaparast, N., Wang, J. K., Lan, F., Shi, Y., Segal, E., and Chang, H. Y. (2010) Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science 329, 689-693 68. Pillai, R. S., Bhattacharyya, S. N., and Filipowicz, W. (2007) Repression of protein synthesis by miRNAs: how many mechanisms? Trends in cell biology 17, 118-126 69. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., and Kim, V. N. (2002) MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal 21, 4663-4670 70. miRNA (microRNA) Introduction. http://www.sigmaaldrich.com/life- science/functional-genomics-and-rnai/mirna/learning-center/mirnaintroduction.html. (04. 06. 2015) 71. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., and Chen, C. (2007) Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC genomics 8, 166 72. Wang, W.-H., Chen, J., Zhao, F., Zhang, B.-R., Yu, H.-S., Jin, H.-Y., and Dai, J.-H. (2014) MiR-150-5p suppresses colorectal cancer cell migration and invasion through targeting MUC4. Asian Pacific journal of cancer prevention :APJCP 15, 6269-6273 74 73. Polioudakis D., Abell, N. S., and Iyer, V. R. (2015) miR-503 represses human cell proliferation and directly targets the oncogene DDHD2 by non-canonical target pairing. BMC genomics 16, 40 74. Druz, A., Chen, Y.-C., Guha, R., Betenbaugh, M., Martin, S. E., and Shiloach, J. (2013) Large-scale screening identifies a novel microRNA, miR-15a-3p, which induces apoptosis in human cancer cell lines. RNA biology 10, 287-300 75. Bergmann, J. H., and Spector, D. L. (2014) Long non-coding RNAs: modulators of nuclear structure and function. Current opinion in cell biology 26, 10-18 76. Haemmerle, M., and Gutschner, T. (2015) Long Non-Coding RNAs in Cancer and Development: Where Do We Go from Here? International journal of molecular sciences 16, 1395-1405 77. Martens-Uzunova, E. S., Böttcher, R., Croce, C. M., Jenster, G., Visakorpi, T., and Calin, G. A. (2014) Long noncoding RNA in prostate, bladder, and kidney cancer. European urology 65, 1140-1151 78. LncRNAs participate in a wide variety of biological processes. http://www.biocat.com/cgibin/page/sub1.pl?main_group=genomics&sub1=long_non-coding_rna_(lncrna) (06.04.2015) 79. Han D, Wang M, Ma N, Xu Y, Jiang Y, Gao X. Long noncoding RNAs: novel players in colorectal cancer. Cancer Lett. 2015 May 28;361(1):13-21. 80. http://www.biocat.com/cgibin/page/sub1.pl?main_group=genomics&sub1=longnoncoding_rna_(lncrna) (06.04.2015) 81. Sana, J., Faltejskova, P., Svoboda, M., and Slaby, O. (2012) Novel classes of noncoding RNAs and cancer. J Transl Med 10, 103 82. Bowman, R. V., Yang, I. A., Semmler, A. B., and Fong, K. M. (2006) Epigenetics of lung cancer. Respirology 11, 355-365 83. Han, Y., Liu, Y., Nie, L., Gui, Y., and Cai, Z. (2013) Inducing cell proliferation inhibition, apoptosis, and motility reduction by silencing long noncoding ribonucleic acid metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 in urothelial carcinoma of the bladder. Urology 81, 209. e201-209. e207 84. Human body atlas http://lncrnadb.com/Malat1/ (14.04.2015) 85. Bernard, D., Prasanth, K. V., Tripathi, V., Colasse, S., Nakamura, T., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Sedel, F., Jourdren, L., and Coulpier, F. (2010). A long nuclear‐retained 75 non‐coding RNA regulates synaptogenesis by modulating gene expression. The EMBO Journal 29, 3082-3093 86. MALAT1- a paradigm for long noncodind faction in cancer http://www.lncrnablog.com/tag/malat1/page/2/ (05. 05. 2015) 87. Wang, X., Li, M., Wang, Z., Han, S., Tang, X., Ge, Y., Zhou, L., Zhou, C., Yuan, Q., and Yang, M. (2014) Silencing of long noncoding RNA MALAT1 by miR-101 and miR-217inhibits proliferation, migration and invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells. Journal of Biological Chemistry, jbc. M114. 596866 88. Barletta, C., Druck, T., LaForgia, S., Calabretta, B., Drabkin, H., Patterson, D., Croce, C. M., and Huebner, K. (1991) Chromosome locations of the MYB related genes, AMYB and BMYB. Cancer research 51, 3821-3824 89. Helin, K. (1998) Regulation of cell proliferation by the E2F transcription factors. Current opinion in genetics & development 8, 28-35 90. Ma KX, Wang HJ, Li XR, Li T, Su G, Yang P, Wu JW. (2015) Long noncoding RNA MALAT1 associates with the malignant status and poor prognosis in glioma. Tumour Biol. 2015. 3355-9. 91. Li S1, Wang Q, Qiang Q, Shan H, Shi M, Chen B, Zhao S, Yuan L. (2015) Sp1mediated transcriptonal regulation of MALAT1 plays a critical role in tumor. J Cancer Res Clin Oncol. 25773124. 92. Gutschner T, Hämmerle M, Eissmann M, Hsu J, Kim Y, Hung G, Revenko A, Arun G, Stentrup M, Gross M, Zörnig M, MacLeod AR, Spector DL, Diederichs S. (2013) The noncoding RNA MALAT1 is a critical regulator of the metastasis phenotype of lung cancer cells. Cancer Res. 1180-9. 93. Fu X, Liu Y, Zhuang C, Liu L, Cai Z, Huang W. (2015) Synthetic artificial microRNAs targeting UCA1-MALAT1 or c-Myc inhibit malignant phenotypes of bladder cancer cells T 24 and 5637. Mol Biosyst. 1285-9. 94. Han X, Yang F, Cao H, Liang Z. (2015) MALAT1 regulates serum response factor through miR-133 as a compeing edogenus RNA in myogenesis. FASEB J. 14-259952 76 ÖZ GEÇMİŞ 1987 yılında Şanlıurfa’nn Haliliye ilçesinde doğdu. İlköğretimi Şanlıurfa merkezde tamamladı. Orta öğretime burada devam etti. Lise öğrenimi merkezde bulunan Şanlıurfa lisesi’nde bitirdi. 2007 yılında Dicle Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi kimya bölümü’nde lisans eğitimine başladı. 2012 yılında buradan mezun oldu. 2013 Güz döneminde Gaziantep Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı’nda yüksek lisans eğitimine başladı. 77
