Agrobacterium aracılığıyla gen transferi
advertisement
Agrobacterium aracılığıyla gen transferi iki çenekli bitkilerde a. tumefaciens kök boğazı uruna sebep olur. Ø Agrobacteria-mediated transformation-developed since 1987, first established in tobacco Gen aktarımında başarı için gerekli 3 adım: • Gen aktarımında kullanılan Agrobacterium vektörlerinin elde edilmesi. • Yeni bir bitki oluşturma yeteneğindeki bitki hücrelerine gen aktarım yöntemlerinin. • Seçiçi işaret genlerinin geliştirilmesi. Ti PLASMİD tümör–inducing plasmid 200-800 kb 1. 2. T-DNA: Transferred DNA; 10~30 kb “cis-factor” Virulence proteins “trans-factor” • Oksin ve sitokinin grubu bitki hormonları bitki hücrelerinin in vitro şartlarda çoğalarak kallus oluşturabilmeleri için mutlaka gereklidir. • Enfeksiyon sonucu oluşan dokunun normal bitkide bulunmayan bazı a. asitler ve opinler’ler olarak bilinen şeker türevlerini sentezlediği görülmüştür. Bu bileşikler bitkide azot ve karbon kaynağı olarak kullanılmaktadır. • Tümörlü dokunun sentezlediği opin türleri enfekte eden bakteri hatları tarafından belirlenir.. • Böylece Agrobacterium hatları oktopin ve napolin olmak üzere iki grupta toplanır. Agrobacterium chromosomal DNA pscA chvA chvB T-DNA-inserts into plant genome for transfer to the plant vir genes pTi tra bacterial conjugation opine catabolism oriV Ti Plasmid Ti Plasmid Agrobacterium can be used to transfer DNA into plants Agrobacterium tumefaciens bakterisi TDNA aktarımı için gerekli 3 öğeyi taşımaktadır. 1. T-DNA bölgesi. 2. Virülens bölge (vir). 3. chromosomal genes: chvA, chvB, pscA attR genleridir. T-DNA: Ti veya Ri plazmidi üzerinde bulunan ve bakteriden bitki hücresine aktarılatrak bitkinin genomuyla birleşen küçük DNA parçasıdır. Oktopin tipi plazmidler bitkinin genomuyla bağımsız birleşebilen TL, TC ve TR olarak simgelenmiş T-DNA bölgelerine sahiptir. Öte yandan nopalin tipi plazmidler de ise tek bir TDNA bulunmaktadır. Ayrıca T-DNA da bitkilerde oksin sitokinin üretimini katalize eden enzimleri kodlayan iaaM, iaaH ve ipt gibi genlerinde bulunduğu tespit edilmiştir. Virülens genler • Vir bölgesi T-DNA aktarımında gerekli olan ürünlerin önemli bir kısmını sağlamaktadır. • Vir A, Vir B, Vir C, Vir D, Vir E ve Vir G mutlaka gerekli olan 6 ana operon ve gerekli olmayan diğer 2 operon Vir F ve Vir H dan meydana gelmektedir. • Vir A ve Vir G operonları vir genlerinin aktivitelerini yönlendiren pozitif bir düzenleyici sistemini kodlamaktadırlar. Kromozomal genler • A g r o b a c t e r i u m b a k t e r i s i n i n k e n d i kromozomu üzerinde bulunan dört adet lokus chvA, chvB, pscA ve attR bakterinin bitki hücrelerine tutunmasını, yaralanmış bitki dokularından bakterinin çoğalması ve Ti plazmidi üzerinde bulunan vir genlerinin düzenlenmesinde rol oynamaktadır. T-DNA Aktarımının Moleküler Mekanizması • Agrobacterium’un bitki hücrelerine tutunması ve koloni olşturması • Virülens genlerinin uyarılması • T-DNA transferi • T-DNA nın bitki genomuna entegrasyonudur. Agrobacterium Infection Süreci T-DNA nın moleküler mekanızması Left Border T-DNA Right Border T-DNA nın alt sarmalı 24 bp sağ ve soloverdrive sınır bölgesinin 3. ve 4 . Nükleotidleri arasında vir D2 proteini tarafından kesilir. 5’ Vir D2 proteini alt sarmalı sağvirD/virC sınır bölgesinden kestikten sonra tek sarmalın 5 ucunda bağlı kalarak T iplikciğinin serbest kalmasını sağlar. Left border T-DNA Right border gap filled in virE virD/virC T-strand D 1. T iplikciği Vir E proteini tarafından sarılarak nükleaz enzimlerinden korunur. T- iplikciğinin bitki hücresine taşınmasında Vir D2 proteini pilot görevi yapar . Left border T-DNA Right border D T-strand coated with virE virD nicks at Left Border sequence 1. Transfer to plant cell. 2. Second strand synthesis 3. Integration into plant chromosome Ko- entegratif (cis) vektörler: 1. Bitkilere aktarılmak istenen genlerin kolayca klonlanabileceği klonlama bölgesi. 2. E. coli ve Agrobacterium da aktif olan seçici bakteriyel işaret geni 3. Bitkide işlev yapabilen seçici işaret gen 4. E coli içerisinde fonksiyonel olan fakat agrobacteriumda etkili olmayan bir replikasyon orjini Ikili (BİNARİ/TRANS) vektörler: 1. T-DNA içerisinde bulunan be bitkilere aktarılmak istenen genlerin kolayca klonlanabileceği klonlama bölgesi. 2. E. coli ve Agrobacterium da aktif olan seçici bakteriyel işaret geni 3. Bitkide işlev yapabilen seçici işaret geni 4. E coli ve agrobacteriumda fonksiyonel olan bir replikasyon orjini MiniTi T-DNA based vector for plants Disarmed vectors: do not produce tumors; can be used to regenerate normal plants containing the foreign gene. 1. Binary vector: the vir genes required for mobilization and transfer to the plant reside on a modified pTi. 2. consists of the right and left border sequences, a selectable marker (kanomycin resistance) and a polylinker miniTi for insertion of a foreign gene. MiniTi T-DNA based vector for plants a binary vector system T-DNA deleted kanr polylinker LB 1 RB ori bom modified Ti plasmid vir miniTi bom = basis of mobilization oriV 2 Agrobacterium aracılığıyla yüksek oranda bir gen aktarımı için gerekli olan koşullar • Gen aktarımı için uygun gelişme safhasındaki eksplant devamlı olarak sağlanmalıdır. • Tür içerisindeki farklı çeşitlerde başarılı olmalıdır. geliştirilen gen aktarım tekniği, kültürü yapılan yüksek verimli çeşitlerde başarılı olmadıkça hiç bir önemi yoktur. • Çok sayıda bireysel transgenik bitki elde edebilmek için yöntem etkili ekonomik ve tekrarlanabilir olmalıdır. • Gen aktarımı yapılan hücrelerden transgenik bitki elde edilebilmesi için etkili bir seleksiyon sistemi geliştirilmelidir. • Maliyet ve somaklonal varyasyonu en düşük seviyede tutmak için doku kültüründe geçen süre mümkün olduğu kadar kısa tutulmalıdır. • Gerek tohumla gerekse vejetatif çoğaltım için stabil ve üniform transgenik bitkiler elde edilmelidir. • Sadece istenilen özellikleri kodlayan enler bitkiler aktarılmalı istenmeyen DNA dizilerinin geçişi engellenmelidir. • Fazla kopya sayısından kaynaklanan aktarılan genin inaktivasyonunu ve entegrasyon bölgelerinde oluşabilecek gen zararlarını engellemek için genler düşük kopya sayısından aktarılmalıdır. • Aktarılan genler istenilen fizyolojik devrede ve arzu edilen seviyede aktivite göstermelidir. • Bitki genotipi, asetosiringon gibi vir genlerini uyarıcı bileşikler, şekerler, pH, sıcaklık, ışık, hücre konsantrasyonu inokulasyon ve ko-kültivasyon süresi, eksplant tipi, hormon uygulaması ve yaralanma gibi faktörler de Agrobacterium ile gen aktarımını önemli ölçüde etkilemektedir. • Agrobacterium ile gen aktarımında çeşitli bitki kısımları , protoplastlar, hücre süspansiyonları ve kallus dokuları eksplant olarak kullanılabilmektedirler. • Gen aktarımı için önce bitkilere aktarılmak istenen genlerin klonlandığı vektörü taşıyan Agrobacterium sıvı bakteri büyütme ortamında (NB) büyütülür. Hazırlanan bitki eksplantları sıvı bitki rejenerasyon ortamında seyreltilmiş olan bu bakteri kültürüyle belirli bir süre inokule edilir. • Inokule edilen eksplantlar daha sonra gen aktarım işleminin gerçekleşmesi için bitki büyüme düzenleyicileri içeren katı bir bitki rejenerasyon ortamına aktarılarak 48-72 saat süreyle ko-kultivasyona tabi tutulurlar. • Ko-kültivasyon süresi sonunda eksplantlar bakteri büyümesini engelleyen bir antibiyotik ve sadece gen aktarımı yapılan hücrelerin gelişmesine izin veren seçici bir bileşik içeren aynı rejenerasyon ortamına aktarılır. • Seçici bileşiğin tipini kullanılan işaret geni belirlemektedir. • Örneğin bitki hücrelerine nptII işaret geni aktarılmış ise kanamisin, hpt geni aktarıldığı durumlarda ise higromisin antibiyotiği kullanılır. bar geninin aktarıldığı durumlarda ise uygun bir herbisit (fosfinotrisin) kullanılmalıdır. • Seçici besin ortamına aktarılan eksplant üzerinde bulunan transgenik hücrelerden birkaç hafta sonra ya doğrudan sürgünler, somatik embriyolar veya rejenerasyon yeteneğine sahip kallus oluşumu gözlenir. • Gelişen sürgünler yine antibiyotik ve seçici bileşik içeren köklendirme ortamına aktarılarak köklendirilir. • Köklendirme ortamına seçici bileşiğin ilave edilmesiyle gene aktarımı yapılamayan kaçak sürgünlerin köklenmesi büyük oranda engellenmiş olur. Köklenen sürgünler son olarak saksılara aktarılarak tohum elde edilir. • aktarılan genin elde edilen bitkilerde kesin olarak bulunup bulunmadığını Southern blot veya PCR gibi moleküler tekniklerle teyit edilebilmektedir. Agrobacteriumun büyütülmesi ve muhafazası • Sıvı bakteri kültürlerinin çoğalmasına agarlı besin ortamında büyütülmüş olan bireysel kolonilerden başlanılabilir. tek bakteri kolonisisteril bir lup ile alınarak 50 ml lik steril Falcon tüpü içerisine konan ve gerekli antibiyotikleri içeren sıvı NB bakteri büyütme ortamına konur. Daha sonra bakteri kültürleri çalkalayıcı inkübatörde 160-200 devir ve 28 C de bir gece yada istenilen çoğaltım elde edilinceye kadar büyütülür. • Bu bakteri kültürü seyreltilerek bitki eksplantların inokulasyonunda kullanılabilir. • Yeniden bireysel koloniler elde etmek için ise çok az bir miktar bakteri kültürü gerekli antibiyotikleri içeren katı (NA) NUTRİENT AGAR besin ortamı üzerine steril bir lup ile yayılır. • Bu bakteri kültürlerini içeren petri kutuları ters çevrilerek Agrobakteriumun büyümesi için 28 C de iki gün inkübe edilir. • Iki gün içerisinde büyütülen bakteri kültürleri ters çevrilerek 4 C de 6 hafta canlılıklarını koruyabilmektedirler. • Daha uzun süreli muhafaza işlemi için eşit miktarda bakteri kültürü ve %40 gliserol içeren NB 2 ml lik cyrogenic tüplerde karıştırıldıktan sonra sıvı nitrojende dondurulup -80 C de muhafaza edilmektedir. Bu şekilde bakteri kültürlerinin 10 yıl canlılıklarını muhafaza etmek mümkün olmaktadır. • ayrıca bu şekilde bu bakteri plazmidide güvence altına alınmış olur.
