Slayt 1
advertisement
PULMONER PATOLOJİDE İMMÜNOHİSTOKİMYA VE İMMÜNOPATOLOJİ UYGULAMALARI Dr. Kemal BAKIR Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji AD TTD 10. Yı Yıllı llık Kongresi 2525-29 Nisan ANTALYA SUNU AKIŞI Tarihçe Amaç Yöntemler Pulmoner Patolojide İHK İHK’de Tuzaklar Son söz 2 TARİHÇE: Coons ve arkadaşlarının 1940’lardaki infekte dokuda floresseine bağlı antikorlarla bakteriyel antijenleri tanımlamaları ile tanısal immünokimya gündeme gelmiştir Yaklaşık olarak son 30 yıldır kullanılmaya başlanan immünohistokimyanın(İHK) gelişmesi 1980’lerin sonları ve 1990’ların başına rastlamaktadır. İlk kullanılmaya başlandığında dar bir panel ile başlanmış olmakla birlikte, bugün için rutin uygulamalarda binlerce antikor bulunmaktadır 3 İmmünopatoloji : immünohistokimya, İmmünofloresan, in situ hibridizasyon. 4 İmmünopatoloji •Doku kesitleri, •Aspirasyon materyalleri, •Bronkoalveoler lavaj gibi sıvılara uygulanabilmektedir 5 ENZİM 6 Doku antijeni Tavşan immünoglobulin G Koyun anti-tavşan IgG Belirteç (flurossein, ferritin, enzim) 7 DİREKT YÖNTEM 8 İKİ BASAMAKLI İNDİREKT YÖNTEM 9 ÜÇ BASAMAKLI İNDİREKT YÖNTEM 10 Çözünebilir immün kompleks teknikleri (Çözünebilir enzim - anti enzim immün kompleksleri) 11 12 13 14 15 İn situ hibridizasyonda(İSH) işaretlenmiş riboprob, hedef hücre veya organizmalarda belli bir (araştırılmak veya gösterilmek istenen protein dizinini) nükleik asid dizininin tamamlanması işlemine dayalı bir sistemdir. İn situ hibridizasyonda kullanılan problar digoksigenin ile işaretlenmiş olabilir. Bu prob, enzim taşıyan anti-digoksigenin antikoru ile saptanabilir. Bu yöntem ile antikorun lokalizasyon yanı sıra kantitatif değerlendirme de olanaklıdır. 16 Tarihçe Amaç Yöntemler Pulmoner Patolojide İHK İHK’de Tuzaklar Son söz 17 İHK hangi amaçla kullanılmaktadır : • HE ile konulan tanının desteklenmesi • Etiopatogeneze katkı sunmak için • İnflamatuvar hastalıklarda hücre çeşitliliğinin ve birikme yerlerinin saptanması • Tedavinin şekillendirilmesi ve yeni tedavi yöntemlerinin araştırılması • Prognostik parametrelerin araştırılması • Transplantasyonda rejeksiyon ve zedelenme mekanizmaları ile ilgili bilgilerin sağlanması 18 Tarihçe Amaç Yöntemler Pulmoner Patolojide İHK İHK’de Tuzaklar Son söz 19 İHK’nın inceleme (MUTFAK) aşamasına gelinceye kadar; ¾ Rutin Takip İşlemleri ¾ İHK uygulamasına ait işlemler ¾ İHK değerlendirilmesine ait işlemler 20 Rutin takip işlemleri; •Dokunun fiksasyonu (fiksasyonun tipi ve zamanı) •Dokunun takip işlemleri ( doku takip cihazı, parafine gömme, kesme ve arşivleme) •Deparafinizasyon işlemleri 21 İHK uygulamasına ait işlemler; •Antijen retrival (doğru yöntemin seçilmesi) •Boyanma yöntemi ve protokolü •Boyanmada kullanılan solüsyonların geçerlilik süreleri •Kontroller ( önerilen pozitif ve negatif kontrol materyallerinin doğru kullanımı) 22 İHK değerlendirilmesine ait işlemler •Teknisyen ve patologun bir arada çalışması ve uyumu •Antikor panel seçimi •Seçilen antikor panelinin duyarlılığı •Seçilen antikor klonu •Sonuçların doğru okunması , skorlanması ve pozitiflik oranının değerlendirilmesi 23 24 25 26 Saptama Sistemleri: PAP APAAP (Strept)Avidin-Biotin Polimer Bazlı Teknoloji Eşzamanlı Birden Çok Doku Belirtecinin Boyanması 27 İHK, genel olarak avidin-biotin tabanlı saptama sistemleri ile birlikte kullanılmaktadır. Böbrek ve karaciğer başta olmak üzere hücrelerdeki biotin ile bağlanması nedeniyle hatalı sonuçlara neden olduğu için polimer tabanlı saptama(“detection”) sistemleri kullanılmaya başlanmıştır. 28 Gelecekte de tiramin-bazlı amplifikasyon sistemlerinin ön planda olacağı düşünülmektedir 29 İmmünohistokimyasal reaktivite hücrelerde veya stromada karşımıza çıkar. Hücrelerdeki reaktivite ise, membranöz, sitoplazmik ve/veya nükleer olabilir. Boyanmanın genişliğine, yoğunluğuna ve/veya genişlik ve yoğunluğun kombinasyonuna göre reaktivite var ve yok arasında geniş bir aralıkta değerlendirilir (zayıf, orta, güçlü ; +, ++, +++ gibi…). 30 membranöz 31 Nükleer ve sitoplazmik 32 Tarihçe Amaç Yöntemler Pulmoner Patolojide İHK İHK’de Tuzaklar Son söz 33 İmmünopatoloji uygulamalarından İHK pulmoner patoloji özeline indirgendiğinde ise; • Akciğerdeki diffüz parenkimal akciğer hastalıklarında, • Astma ve KOAH gibi hastalıklarda, • İnflamatuvar hücre çeşitleri ve sayılarının saptanmasında, • İnfektif hastalıklarda, • Akciğerin benign ve malign neoplazmlarında, • Mezotelyal lezyonlarda, • Patogenez ve tedaviye yönelik deneysel çalışmalarda kullanılmakta ve yararlı sonuçlar elde edilmektedir 34 Astmatiklerde yapılan çalışmalarda; Bronş duvarındaki kronik T hücre aracılı immünolojik reaksiyonun özellikleri İHK ile gösterilmeye çalışılmaktadır. T hücreleri (CD2, CD5, CD7 ve CD8 monoklonal antikorları), B hücreleri ( CD19, CD20 monoklonal antikorları), Monosit ve makrofajlar (CD 68), Eozinofiller (EG1), Aktif eozinofiller (EG2) gösterilmeye ve kantitatif olarak değerlendirilmeye çalışılmıştır 35 Ayrıca T hücre alt tiplerinin değerlendirilmesi için de CD4: CD8 oranı çift boyama immünopatoloji yöntemi ile saptanmaya çalışılmıştır 36 Proksimal hava yollarından alınan biyopsi ile distal hava yollarından yapılan bronkioloalveoler lavajda (BAL) T hücre, eozinofil ve makrofaj sayı ve oranları saptanabilmektedir. Astmadan ani ölümlerde distal inflamasyonu göstermek üzere BAL T hücre lenfositozisinde bir artış saptanmıştır. Astma hastalarında ise bu artışın olmadığı ve rölatif olarak normal kaldığı gözlenmiştir. CD 8 + T hücrelerindeki artış ile birlikte CD4:CD8 oranında bir tersine dönüş gözlenmiştir 37 Ayrıca birbirine benzer iki ayrı hastalık tablosu eozinofilik bronşit ile astma arasında ki ayırıcı tanıda balgam, lavaj ve BAL’da eozinofili ve İHK olarak nitrik oksid bakılarak ayırıcı tanı yapılmaya çalışılmaktadır 38 Kronik obstrüktif akciğer hastalığında (KOAH) sigara içenlerle içmeyenler arasında CD8 + T hücreleri araştırılarak, sigara içicilerinde CD8 artışı saptanmıştır. Böylece CD8 hücrelerinin KOAH patogenezindeki rolü gösterilmiştir 39 Diffüz parenkimal akciğer hastalıklarında tanı ve sürecin işleyişinin değerlendirilmesi amacıyla da İHK ve genel olarak immünopatoloji yer bulmaktadır 40 Deneysel olarak yapılan çalışmalarda da İHK kullanılarak insanlardaki pulmoner patolojilerin etiopatogenezi araştırılmakta ve tedavileri için çözümler üretilmeye çalışılmaktadır. Bunlardan birisi de akciğer hipersensitivitesinde biriken hücrelerin tipinin saptanması ve toplanma lokalizasyonudur. •Dendritik hücreler bronşioller çevresinde birikmekte •Makrofajlar arterler etrafında toplanmakta •CD4 + T hücreleri de bronşioller çevresinde birikmektedir. 41 Akciğer kanseri tüm dünyada kanserden ölümler sırlamasında birinci sırada yer almaktadır. Ayrıca akciğer karsinomlarından küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK), tüm akciğer kanserlerinin % 80’ini oluşturmaktadır. Bu nedenle bu tümörlerin ayırıcı tanısının yapılması ve prognozunun belirlenmesi de önemlidir. 42 β -katenin adenokarsinomların ayırıcı tanısında kullanılmakta, c-kit’in adenokarsinomlardaki pozitif boyanmaları hem ayırıcı tanıda işe yaramakta, hem de prognoz ile ilişkilendirilmektedir 43 Β-katenin 44 KHDAK’da çok sayıdaki prognostik faktörleri saptamak amacıyla İHK kullanılmaktadır. Bu moleküler prognostik faktörler 4 başlık altında toplanmaktadır : 1. Büyüme faktörleri ve reseptörleri, onkogenler 2. Programlı hücre ölümü 3. Hücre sikulusunun regülasyonu 4. Angiogenez ve tümör progresyonu 45 Sıklığı(%) Prognostik değeri ErbB-1 (EGFR) 50-80 Var ErbB-2 (HER2-neu) 4-84 Tartışmalı K-ras 7-32 Tartışmalı TGF-beta 46-51 Yok Fas 36-54 Var Kaspaz 3 30-73 Var P53 aşırı ekspresyon 30-77 Yok P53 mutasyon 21-53 Var Survivin 52-86 Var Bcl-2 16-67 Tartışmalı ONKOGENLER/BÜYÜME FAKTÖRLERİ PRO-APOPTOTİK FAKTÖRLER ANTİ-APOPTOTİK FAKTÖRLER 46 HÜCRE SİKLUSU Ki-67 33-66 Tartışmalı Rb 15-30 Tartışmalı Siklin D1 25-51 Yok p16 inaktivasyonu 27-51 Var p21 43-73 Var Siklin E 16-53 Var Siklin B1 22 Var hTERT/Telomeraz 33-85 Var VEGF 47-71 Var HGF 72 Var Angiostatin 24 Var MMP2 ve 9 60-80 Var CD44 20-63 Yok DAPK 44 Var RASSF1A 32 Var ANGİOGENEZ / İNVAZYON EPİGENETİK MODİFİKASYONLAR 47 RNP 48 İHK’nın diğer bir kullanım alanı da mezotelyomaların adenokarsinomdan ayırıcı tanısıdır. Bu amaçla; kalretinin, sitokeratin 5/6, podoplanin, WT1 ile birlikte MOC-31, Ber-EP4, B72.3, CEA, BG-8 ve TTF-1 kullanılabilir 49 Peritoneal mezotelyoma ile seröz karsinom arasındaki ayırıcı tanıda MOC-31, Ber-EP4, östrojen reseptörü ve kalretinin yararlı belirteçler olarak tanımlanmaktadır. 50 Epiteloid mezotelyoma ile skuamöz karsinom arasındaki ayırıcı tanıda ise MOC-31, Ber-EP4, CEA, BG-8 ve p63 kullanılabilir ve bunların tamamı skuamöz hücreli karsinomda eksprese olur . 51 Yakın zamanda kullanılmaya başlanılan ve mezotel belirteçleri olan D2-40 ve podoplanin, epitelyal mezotelyomaların % 90’ınında pozitif boyanma göstermektedirler 52 D2-40 Akc-Adeno D2-40 Mezotelyoma 53 İmmünositokimya (İSK), effüzyon sitoloji örneklerine uygulanan bir yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır: •Smearlere, •Sitospin, •Thinprep örneklerine uygulanabilmektedir. Sitolojik örneklerde İSK uygulamalarında teknik olarak ve yorumlamalarda zorluklarla karşılaşıldığı için bu materyallerden elde edilen hücre bloklarına İSK uygulanmaktadır 54 55 İSK için en uygun örnek hücre bloklarından elde edilmektedir . Pulmoner patoloji uygulamalarımızda da özellikle -balgam, -bronş lavajlarının tamamında -plevra sıvılarının bir kısmında hücre blokları hazırlanmaktadır. Hem hücrelerin bir arada olduğu kesitler elde edilmekte hem de İSK uygulamaları için uygun örnekler elde edilmektedir. 56 Tarihçe Amaç Histolojik Tekniklerde Problemler Yöntemler Pulmoner Patolojide İHK İHK’de Tuzaklar Son söz 57 Teknik tuzaklar •Fiksasyon •Doku takibi •Antijenitenin ortaya çıkarılması veya belirginleştirilmesi •Saptama (“detection”) sistemleri Mesleki tuzaklar •Panel seçimi •Panelin duyarlılığı •Antikor tipinin seçimi •Antikor klonunun seçimi •Sonuçların yorumlanması •Tüm literatürün yorumlanması 58 Doku Fiksasyonu : Hızlı fiksasyon (doku kuruması veya fiksatifsiz solüsyon) Fiksasyon tipi (formalin, B-5, Bouin, glikol tabanlı fiksatif) Fiksasyon süresi (küçük doku için birkaç saat) 59 Doku Takibi : Paraffin ısısı Kesit kalınlığı 60 Saptama Sistemleri: Avidin-biotin Dekstran-polimer 61 Antijenitenin ortaya çıkarılması veya belirginleştirilmesi: Enzim Isı Tampon 62 Panel Seçimi: Tanı Karsinoma Lenfoma Melanoma Sarkoma Kullanılan panel Pansitokeratin CD45 S-100 Vimentin Yeğlenen panel Pansitokeratin CD45 + CD43 S-100 ve Melan A Kollajen tip IV ve Vimentin Panel seçiminde algoritm önemlidir 63 Antikor klonunun seçimi: Her klon aynı duyarlılıkta değildir. Farklı klonlarla yapılan çalışmalarda, İHK boyanmasının ciddi değişiklikler gösterdiği saptanmıştır 64 Yorumlama Farklılıkları : Teknik veriler ve literatür birarada değerlendirilmelidir Kontrol ile birlikte değerlendirilmelidir 65 Tarihçe Amaç Yöntemler Pulmoner Patolojide İHK İHK’de Tuzaklar Son söz 66 Doku örnekleri için HE, Sitopatoloji için Papanikolau, giemsa ve HE boyalarının ışık mikroskopisi ile incelenmesi hala güncelliğini ve altın standart oluşunu korumaktadır. İHK ve İSK gibi gelişmiş yöntemler, 9tanıyı desteklemek, 9etiopatogeneze katkıda bulunmak 9tedavi yöntemlerinin belirlenmesi ve sonuçlarının izlenmesi amacıyla kullanılmasının yararı açıktır. 67 KHDAK Hastaları Çeşitli subtipler Patolog Adenokarsinom “Düşük risk” Adenokarsinom dışı “Orta risk” “Yüksek risk” “Düşük risk” “Orta risk” “Yüksek risk” 68 Bu yöntemlerin kullanımı sırasında; Teknisyenle işbirliği yanı sıra, Doğru fiksatiflerin kullanımı, Doğru İHK saptama yöntemleri Doğru antikor panellerinin kullanılması zorunludur. 69 70 HE tanısı yaklaşımı için kullanılan temel prensiplerin tamamı İHK pratiğine de uygulanmalıdır. Bu da tanıda daha az yanılgıya neden olacaktır KLİNİSYENLE İŞBİRLİĞİ VE ORTAK ÇALIŞMALARIN PLANLANMASI İHK’nın KATKISINI ARTTIRACAKTIR 71 TEŞEKKÜRLER 72 TEŞEKKÜRLER
