FARKLI MATERYALLERDE OLUŞAN BAKTERIYEL

FARKLI MATERYALLERDE OLUŞAN BAKTERIYEL BIYOFILM TABAKASINDAN
İZOLE EDILEN AEROBIK HETEROTROFIK BAKTERI DÜZEYLERI
Gülşen ALTUĞ1, Mine ÇARDAK1, Pelin S. ÇİFTÇİ1, Sevan GÜRÜN2
1-İSTANBUL ÜNIVERSITESI, SU ÜRÜNLERI FAKÜLTESI, DENIZ BIYOLOJISI ANABILIM DALI
2-İSTANBUL ÜNIVERSITESI, FEN-EDEBIYAT FAKÜLTESI, BIYOLOJI BÖLÜMÜ
[email protected]
ÖZET
Deniz ortamında farklı amaçlarla kullanılan materyaller arasından seçilen ahşap,
galvaniz, saç, paslanmaz çelik, pamuk halat, cam ve alüminyum materyalleri üzerinde
oluşan bakteriyel biyofilm tabakasında bulunan mezofilik aerobik heterotrofik bakteri
düzeylerini araştırmak amacı ile bakteriyolojik analizler yapılmıştır. Laboratuar
ortamında kurulan cam düzenek deniz suyu ile doldurulmuş, invertöre bağlı olarak
havalandırması kontrol edilmiş, ve içine eşit ebatlarda farklı materyaller yerleştirilmiştir.
Membran filtrasyon metodu kullanılarak deniz suyunda başlangıçtaki bakteri düzeyi
tespit edilmiş ve ölçümler 48 saat arayla test süresince sürdürülmüştür. 12 gün
sonunda biyofilm tabakası gözlenmiş, materyaller üzerinden aseptik koşullarda 1
cm2’lik alandan alınan kazıntı örnekleri homojenize edilerek Marine ve Nutrient Agar’a
ekilerek mesofilik heterotrofik aerobik bakteri düzeyleri belirlenmiştir. Denemeler 48
saatte bir 29 gün boyunca tekrarlanarak bakteri düzeylerinin materyale bağlı olarak
tutunma oranları karşılaştırılmıştır. En yüksek bakteri düzeyi pamuk halat materyalinde
gözlenirken bunu ahşap, alüminyum, saç, cam, paslanmaz çelik ve galvaniz takip
etmiştir. Materyallerde tespit edilen bakteri düzeyinin deniz suyu ortamından yüksek
bulunmuştur. İzole edilen bakteriler antibiyotiklere ve ağır metallere dirençliliklerinin
tespiti gibi ileri tetkiklerde kullanılmak üzere stoklanmıştır.
Anahtar Kelimeler: Bakteriyel biyofilm, mezofilik aerobik heterotrofik bakteri, pamuk halat,
ahşap, galvaniz, saç, paslanmaz çelik, cam, alüminyum
LEVELS OF HETEROTROPHIC AEROBIC BACTERIA ISOLATED FROM BACTERIAL
BIYOFILM LAYER ON VARIOUS MATERIALS
ABSTRACT
Bacteriologic analyses were carried out with an aim to investigate the level of
heterotrophic aerobic bacteria on several materials such as wooden, galvanizes, sheet
iron, stainless steel, cotton rope, glass and aluminum. Chosen materials were put in
the mechanism which was filled with natural sea water and attached to invertors for
controlling to aeration, formed in the laboratory. Firstly the level of mesophilic
heterotrophic aerobic bacteria was tested using by membrane filtration method in the
sea water during the 29 days. 1 cm 2 scraped biofilm materials, which were taken
aseptically from observed biofilm layer on materials after 12 days, homogenized and
inoculated on Nutrient agar and Marine agar in order to examined level of mesophilic
heterotrophic aerobic bacteria. Bacteriological measurements were done each 48
hours and attachment rate of bacteria depending on different materials were compared
during 29 days.
The maximum bacteria levels were found as 7.9 CFU/ 100 ml in the sea water in the
seventh days and recorded as 5.9 CFU/100 ml at the end of the tests. Level of
bacteria in the ambient water were found lower than the materials due to fact that
heavily propensity of bacteria to the particular substrates. Maximum bacteria levels
were calculated from cotton rope, aluminum, sheet iron, glass, stainless steel,
561
galvanizes respectively. The isolated bacteria were stocked with an aim to use further
studies for understand their resistance capability against to some antibiotics or heavy
metals.
Keywords: Bacterial biofilm, Mesophilic heterotrophic aerobic bacteria, Wooden, Galvanizes,
Sheet iron, Stainless steel, Cotton rope, Glass, Aluminum
GİRİŞ
Mikroorganizmalar gelişimleri için uygun organik ve inorganik maddelerin biriktiği dış
yüzeylerde, özellikle gözle görülemeyen çizikler ve aşınmış bölgeler içine yuvalanarak
yerleşmekte, birbirlerine ve yüzeylere bağlanarak biyofilm oluşturabilmektedir.
Biyofilme tutunmuş bakteriler bu yapının içinde antimikrobiyal ajanlara ve olumsuz
çevre koşullarına dirençli hale gelebilmektedirler (Kumar ve ark., 1998, Poulsen, 1999,
Arnold ve Silvers, 2000, Türetgen 2004).
Islak yüzeylerde oluşan mukuslu yapı gösteren bakterilerin fenotipik olarak planktonik
yapılarından farklılıklar gösterdiği tespit edilmiş ve bu mukoid yapılara biyofilm (canlı
tabaka) denilmiştir. Bakteriler kıyısal alanlarda, organik madde girdisinin açık
denizlerden daha yüksek olması veya partiküle bağlı olarak gelişebilecekleri, biyofilm
oluşturabilecekleri ortamları bulabilmeleri nedeni ile daha fazla çoğalabilmektedirler.
Biyofilm oluşumu dinamik çok aşamalı bir yapılanmadır.
Mikroorganizmalar tarafından oluşturulan, çoğunlukla doğal materyallerde gelişen ve
"biyofouling" olarak tanımlanan bu mekanizmanın başlangıcını, basit gram negatif
bakterilerin ortama tutunması oluşturmakta, diatom ve protozoalar daha sonra
katılmaktadır (Austin 1988). Bakterilerin deniz çevrelerinde herhangi bir yüzeye
tutunma istekleri organik maddeleri değerlendirmek içindir. "Attachment bacteria"
olarak isimlendirilen partiküle tutunmuş bakteriler yüzey suyunda serbest yaşayan
bakterilerden daha yoğun olarak tespit edilmişlerdir (Grossart ve ark. 2003).
Kültür edilemeyen formlar adsorbsiyon mekanizması anlaşıldıktan sonra katı cisimlere
bakterilerin tutunması sağlanarak ilk kez tatlı su ortamlarından izole edilebilmişlerdir
(Austin 1988). Deniz bakterilerinin yüzeylere tutunma eğilimlerine yönelik ilk çalışma
Zobell (1943) tarafından yapılmıştır. Böylece bazı bakterilerin bir yüzeye yaklaşarak
ekzopolisakkkaritler üretmesi, yapışması ve mikrokoloniler oluşturarak biyofilm
oluşumuna yol açması tanımlanmıştır.
Bu çalışmada deniz ortamında farklı amaçlarla kullanılan materyallerin, bakterilerin
gelişmesi için uygun ortamlar hazırlayarak istenmeyen bakteriyel biyofilm oluşumuna
yol açmasının, kültür edilebilir heterotrofik aerobik mezofilik düzeyi yönü ile materyale
bağlı olarak karşılaştırmasını yapabilmek amaçlanmıştır.
MATERYAL ve YÖNTEM
Ahşap, galvaniz, saç, paslanmaz çelik, pamuk halat, cam ve alüminyum olarak seçilen
materyaller Palanichamy ‘e (2002) göre analize hazırlanmışlardır.
Şekil 1. de görülen düzenek içine sırası ile eşit ebatta her materyal 6 adet kupon tutucu
üzerine yerleştirilmiştir. Düzenek çalışma modu orta ayar olarak seçilen invertöre (HiRUN/N100) bağlanmış ve deniz suyu ile doldurulmuştur. Pamuk halat düzenek içine
serbest yerleştirilmiştir.
Deniz suyunda başlangıç mesofilik heterotrofik aerobik bakteri düzeyleri membran
filtrasyon (Millipore) tekniği ile belirlenmiştir. Materyaller yerleştirildikten sonra 48 saat
562
ara ile su örnekleri ile birlikte analiz edilmiş, 12 gün sonunda gözlenen biyofilm
tabakalarından, aseptik koşullarda 1 cm2’lik alandan alınan kazıntı örnekleri
homojenize edilerek Marine ve Nutrient Agar’a ekilmiş 37o C’ de 18 saat inkübasyon
sonucunda mesofilik heterotrofik aerobik bakteri düzeyleri belirlenmiştir (FDA 1998).
Denemeler 48 saatte bir olmak üzere 29 gün boyunca tekrarlanmıştır.
Şekil 1 Laboratuarda kullanılan düzenek, kupon tutucu ve farklı bakteriyel biyofilm materyalleri
Figure 1 The laboratory test system, coupon holder and various bacterial biofilm materials
BULGULAR
Düzenekte kullanılan deniz suyunda yapılan bakteriyolojik analizler sonucunda bulunan
Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeyleri Çizelge 1 de özetlenmiştir.
Çizelge 1 Denemelerde Kullanılan Deniz Suyunda Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri
Düzeyleri (log10- CFU/100 mL)
Table 1 Level of Mesophilic Heterotrophic Aerobic Bacteria in the sea water were used in the
tests.
Zaman /Gün
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeyleri
Marine Agar
Nutrient Agar
Ortalama
4,7
5
5,9
7,3
7
6,4
6,6
7
6,7
6,6
6,7
6,4
6,4
5,9
5,9
6,6
6,8
6,9
7,4
7,4
6,6
6,6
6,9
6,4
6,4
6,4
6,1
6,1
5,9
5,9
563
5.65
5.90
6.40
7.35
7.20
6.5
6.6
6.95
6.55
6.50
6.55
6.25
6.25
5.90
5.90
Deniz suyunda başlangıç bakteri düzeyi Marine Agar’da 6x104 CFU/100 mL, Nutrient
Agar’da 5x106 CFU/100 mL olarak tespit edilmiştir.
Şekil 2 Düzenekte Kullanılan Deniz Suyunda Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeylerinin
(CFU/100 ml) dağılımları
Figure 2 Distribution of Mesophilic Heterotrophic Aerobic Bacteria (CFU/100 ml) in the Sea
Water were used in the laboratory Test System
Çizelge 2 Denemelerde Kullanılan Farklı Materyallerde Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri
Düzeyleri (log10- CFU/cm2)
Table 2 Levels of Heterotrophic Aerobic Bacteria were Isolated from Various Materials in the
tests (log10- CFU/cm2).
Günler
M
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
1
6,5
5,8
7,8
7,8
5,6
6,0
5,3
5,6 5,9
6,1
6,5
6,6
6,9
7,0
7,0
2
6,8
5,1
7,9
7,9
7,0
6,5
6,1
5,6 5,9
6,1
6,1
6,4
6,6
6,6
6,6
3
5,9
5,4
7,6
7,6
6,0
6,4
6,1
5,6 5,9
6,2
6,2
6,3
6,5
6,5
6,5
4
6,2
6,1
7,6
7,6
5,6
6,1
6,7
5,6 5,7
6,1
6,4
6,4
6,5
6,5
6,5
5
6,1
5,8
7,8
7,8
6,0
5,9
5,8
5,6 5,5
6,1
6,1
6,2
6,2
6,4
6,4
6
6,3
5,8
7,4
7,4
6,3
6,2
5,7
5,5 6,1
6,5
6,5
6,6
7,0
7,4
7,4
7
7,0
6,3
7,9
7,9
7,1
6,6
6,5
5,7 6,2
6,6
6,6
6,9
7,1
7,9
7,9
M: Materyal, 1: Saç, 2: Alüminyum, 3: Paslanmaz çelik, 4: Cam, 5: Galvaniz, 6: Ahşap,
7: Pamuk Halat
Denemeler süresince en yüksek bakteri düzeyi pamuk halat materyalinde tespit
edilmiştir.
564
Şekil 3 Denemeler süresince Farklı Materyallerde Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri
Düzeylerinin Dağılımı (log10- CFU/cm2)
Figure 3 Distribution of Mesophilic Heterotrophic Aerobic Bacteria were Isolated from Various
Materials in the tests (log10- CFU/cm2).
Şekil 4 Denemeler Sonunda Farklı Materyallerde Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri
Düzeylerinin Ortalama Dağılımı (log10- CFU/cm2)
Figure 4 The Average Distribution of Mesophilic Heterotrophic Aerobic Bacteria (log10CFU/cm2) were Isolated from Various Materials at the End of the Tests
TARTIŞMA VE SONUÇ
Bakterilerin ortamdaki besin elementleri değerlendirmek amacı ile herhangi bir yüzeye
tutunarak yaşama eğilimleri serbest yaşama eğilimlerinden fazladır. Bu eğilimleri deniz
ortamında farklı yüzeyler üzerinde yerleşerek istenmeyen bakteri topluluklarının bir
araya gelmesine zemin hazırlar. Diğer mikroorganizmaların yerleşmesi başlangıç
bakterilerinin yoğunluğu ile ilişkili bir süreçtir (Stoodley ve ark. 1999).
Materyallere bağlı olarak bakterilerin tutunma oranlarını değerlendiren çalışmalar
vardır. Bu konuda yapılan çalışmalar farklı ortam karakterlerinde tutunmanın da
farklılıklar göstereceği yönündedir (Donlan 2002, Davey 2000 ).
Deniz ekosisteminde bakteriyel gelişmeyi etkileyen bir çok çevresel faktör olduğunu
biliyoruz ancak ortamda bakteriyel kullanıma uygun besin elementlerinin özellikleri,
partiküler madde miktarı aynı trofik düzeye sahip farklı akuatik alanlarda bakterilerin
farklı davranışlar sergilemelerine neden olabilmektedir. Bu farklılıklar bakteri
düzeylerinde de değişik sonuçlar almamıza neden olabilmektedir.
565
Bu çalışmada laboratuar ortamında bakterilerin farklı materyaller üzerinde tutunma
düzeyleri incelenirken kullanılan doğal deniz suyunun başlangıç bakteri düzeyi
mesotrofik ortam karakterinde bulunmuştur. Dolayısı ile incelenen materyaller
mesotrofik bir ortamda bulunan materyallere bakterilerin yaklaşma düzeyi olarak
değerlendirilmiştir.
Bu durumda en yüksek bakteri düzeyi pamuk halat materyalinde gözlenirken bunu
sırasıyla ahşap, alüminyum, saç, cam, paslanmaz çelik ve galvaniz takip etmiştir.
Marine Agar ve Nutrient Agar kullanılarak yapılan analizlerde bakterilerin besiyerini
zaman zaman farklı değerlendirdikleri görülmüştür. Bu durumu bakterinin gelişme eğrisi
dahilinde geçirdiği dönemin besiyerine yansıması olarak değerlendiriyoruz. İçerdikleri
besin elementleri bakımından birbirine yakın olan bu iki besiyerinin ortalama (log10)
değerleri Şekil 3 de görülmektedir.
Biyofilm tabakası içerisinde yaşayan bakterilerin hayatta kalma şansları daha fazladır.
Biyofilmin dış tabakaları hasarı absorbe ederken, iç tabakalarda stres yanıtının
başlaması için zaman kazanılmış olur (Costerton 1999). Besin yetersizliğine bağlı
değişen mikro çevreye daha çabuk adapte olabilen türler, saldırı sonunda hayatta
kalarak yeniden çoğalma işlemine hızla başlayabilirler. Denemelerde deniz suyunda
bulunan bakteri miktarı 7. günde 7.9 cfu/ 100 ml olarak en yüksek düzeye ulaşmış,
denemenin son günü 5.9 cfu/100 ml olarak kaydedilmiştir. Ortamdaki bakteri düzeyi bu
iken materyalde tespit edilen bakteri düzeyi deneme sonunda 6,4-7,9 CFU/cm2
aralığında değişmiştir. Materyallerde tespit edilen bakteri düzeyinin yüksek olması
bakterilerin yüzeylere tutunma eğilimi ve biyofilm içinde yaşama oranının yüksekliği
tezini desteklerken , materyallerden izole edilen bakteriler antibiyotiklere ve ağır
metallere dirençliliklerinin tespiti de dahil olmak üzere ileri tetkiklerde kullanılmak üzere
stoklanmıştır.
KAYNAKLAR
Arnold, J. W., Silvers, S., 2000, Comparison of poultry processing equipment surfaces for susceptibility to
bacterial attachment and biofilm formation, Poultry Science, 79: 1215-1221.
Austin, B., 1983. Bacterial microflora associated with a coastal, marine fish-rearing unit. Journal of the
Marine Biological Association UK, 63: 585-592.
Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP., 1999. Bacterial biofilms: a common cause of persistent
infections., Science. 284 (5418):1318-22
Davey, ME., O'toole, G.A., 2000. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol
Rev. 64 (4):847-848
Donlan, R.M., 2002. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8(9):881-890.
FDA 1998. Bacterial Analytical Manual 8..ed., Revision A. AOAC International WASHİNGTON, D.C.
Grossart, H.-P., T. Kiørboe, K. Tang, and H. Ploug. 2003. Bacterial colonization of particles: growth and
interactions. Appl. Environ. Microbial. 69:3500-3509.
Kumar, C. G., Anand, S. K., 1998. Significance of microbial biofilms in food industry : a review,
International Journal of Food Microbiology, 42: 9-27.
Palanichamy, S., Maruthamuthu S, Macickam, S. T., Rajendran, A., 2002. Microfouling of manganeseoxidizing bacteria in Tuticorin harbour waters, Current Science 82 7: 865-869.
Poulsen, L. V., 1999. Microbial biofilm in food processing : review, Lebensm.-Wiss. u.-Technol., 32: 321326.
Stoodley, P., Z. Lewandowski, J.D. Boyle and H.M. Lappin-Scott. 1999. The formation of migratory ripples
in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. J. Environ. Microbiol. 1(5): 447-455.
Türetgen, İ. 2004. Comparison of free residual chlorine and monochloramine for efficacy against biofilms in
model and full scale cooling towers” Biofouling 20:81-85.
Zobell, C. E.,1943. Journal of Bacteriology., 46: 39–56.
566