Endemik Verbascum alyssifolium`da ISSR

Endemik Verbascum alyssifolium’da ISSR-PCR Optimizasyonu
Muhip Hilooğlu1, Emel Sözen1, Ali Kandemir2
Anadolu Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 26470, Eskişehir
Erzincan Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 24100, Erzincan
e-mail: [email protected]
1
2
Giriş
Verbascum alyssifolium Boiss (Scrophulariaceae), Erzincan yöresinde dar yayılış alanına sahip endemik bitki
türlerindendir. Bilinen 3 farklı lokalitesi bulunmaktadır. Tür, Türkiye Bitkileri Kırmızı Kitabında Veri Yetersiz
(DD) olarak kaydedilmiştir. Bu türe dair morfolojik ve anatomik özelliklerin belirlenmesi dışında bugüne kadar
yapılmış herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Popülasyonların değişen çevre şartlarında varlıklarını
sürdürebilmeleri tamamen sahip oldukları genetik çeşitliliğe bağlıdır. Nadir ve tehlike altındaki türler için koruma
stratejilerinin geliştirilmesinde türlerin genetik çeşitlilik değerlerinin saptanması bu nedenle oldukça önemlidir.
Bu çalışma kapsamında Verbascum alyssifolium’a ait DNA örnekleri ile ISSR-PCR optimizasyonu yapılarak türün
genetik çeşitlilik seviyelerini belirlemek için kullanılacak olası ISSR primerlerinin saptanması amaçlanmıştır.
Gereçler ve Yöntem
Bitki örneklerine ait DNA’nın izolasyonu için 2XCTAB yöntemi kullanıldı. Bitki örneklerinden elde edilen
DNA’ların miktar ve saflık dereceleri Nanodrop Spektrofotometre cihazında 260/280 nm dalga boylarında
okunarak tespit edildi. Ayrıca DNA örneklerinin kalitesi ve genomik DNA bantı oluşum durumları %0,8’lik agaroz
jelde yürütülerek de belirlendi. PCR için her populasyonu temsilen 1 birey seçilmiş ve bu bireyler ile PCR
kurulmuştur. PCR optimizasyonu sırasında sıcaklık, MgCl2, primer ve kalıp DNA'nın farklı miktarları denenmiş
ve en uygun koşullar bulunmaya çalışılmıştır. MgCl2 için 1-3 µl, kalıp DNA için ve 1-5 µl (2-10 ng), dNTP için
1-4 µl ve 2,5mM’lık ISSR primerleri için de 1-4 µl arasında değerler denenmiştir. PCR prosedürü; 94 °C’de 4 dk.
1 döngü ön denatürasyon, 45 döngü 94 °C’de 45 sn. denatürasyon, 40-64 °C’de 45 sn. primer bağlanma, 72 °C’de
90 sn. uzama, 72 °C’de 7 dk. 1 döngü son uzama ve 4 °C’de bekleme basamaklarından oluşmaktadır. PCR ürünleri
yatay jel elektroforezi (Thermo, Midicell Promo) ile %1.4'lik agaroz jel üzerinde 90V'ta 80dk yürütülmüştür ve
dijital olarak görüntülenmiştir. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacıyla 100 bp plus'lık DNA ladder
(Fermentas) kullanılmıştır.
Bulgular
DNA izolasyonu sonucu türün 3 populasyonunu temsilen seçilen bireylerden elde edilen DNA miktarları sırasıyla
μl’de 112-134-76 ng’dır. Çalışmada toplam 44 ISSR primeri denenmiş, kalıp DNA, MgCl2 ve dNTP
optimizasyonu sonrasında her iki türde de polimorfik ve tekrarlanabilir bantlar oluşturan 20 primer saptanmıştır.
Bunlar; GAG(CAA)5, (CAG)5, VHV(GT)7G, (GA)8YC, (AG)8G, (GA)8T, (AC)8YT, (AG)8T, (AG)8C ,(AC)8C
,(AC)8G, DD(CGA)5 ,(AG)8YT, (GA)8C, (GGGTG)3, (TC)8C, (TC)8G, (CA)8RC, (AGT)6, (CCG)6 primerleridir.
Bu primerler için optimize edilen kalıp, MgCl2 ve dNTP konsantrasyonları sırasıyla 10ng, 2mM ve 2,5 µM olarak
bulunmuştur.
Sonuç ve Tartışma
Yapılan deneyler sonucunda Verbascum alyssifolium türü için denenen 44 adet ISSR primerinden 20 tanesinin
kaliteli ve tekrarlanabilir bant verdiği, diğer primerlerin ise iyi çalışmadığı, polimorfik bantlar üretmediği ve
genetik çeşitlilik seviyelerinin belirlenmesinde kullanılmayacağı gözlemlenmiştir. Bu çalışma sonucunda elde
edilen PCR optimizasyon sonuçları ve belirlenen primerler, Verbascum alyssifolium’un genetik çeşitlilik
seviyesinin belirlenmesine yönelik çalışmalarda yol gösterici olacaktır.
Anahtar Kelimeler: Verbascum alyssifolium, Endemik, Genetik çeşitlilik, ISSR-PCR optimizasyonu
Teşekkür
Bu çalışma Anadolu Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Başkanlığı tarafından (Proje No:
1409F389) desteklenmiştir.