Nükleik asitler

18.11.2008
Nükleik
asitler
Sıcaklıkla öldürülmüş S suşları
Canlı R suşlarını canlı S suşuna dönüştürür
a)
b)
c)
d)
• Deoksiribonükleik asit
• Ribonükleik asit
R suşunu virulan yapan faktör DNA’dır.Oswald Avery-1944
Isıyla öldürülmüş S suşundaki hücre ekstrelerinde bulunan DNA
bozulursa ve bu ekstre R suşuyla karıştırılırsa canlı nonvirulan R suşları
fareyi öldürmez
Farelere virulan S suşu enjekte
edildiğinde ölür
R suşu enjekte edildiğinde yaşar
Isıyla öldürülmüş S suşu enjekte
edildiğinde yaşar
Isıyla öldürülmüş S suşu ve canlı R
suşu enjekte edildiğinde ölür
Frederick Griffith-1928 Streptococcus pneumonia
S suşundaki bir faktör R suşunu transforme ederek S haline dönüştürdü
1
2
3
4
DNA’nın YAPISI ve ÖZELLİKLERİ
*DNA saf olarak elde edilmiş ve X ışınları kırınımı yöntemiyle molekül
yapısı araştırılmıştır.
*İngiliz bilim adamı olan MAURİCE H.F. WİLKİNS ve ROSALİND FRANKLİN
tarafından X ışınları kırınımı yöntemiyle yapılan araştırmalar sonucunda,
DNA’nın daha net ve ayrıntılı bantları elde edilmiştir.
*Daha sonra Amerikalı genetikçi JAMES D.WATSON ve bir İngiliz
biyofizikçisi olan FRANCİS H.C. CRİCK tarafından bu bulgular
değerlendirilerek, DNA’nın sarmal yapılı, yangın merdiveni şeklindeki
molekül modeli ileri sürülmüştür.
*Watson ve Crick’in 1953’te yayınladıkları DNA molekül modeline göre,
DNA molekülü sarmal şeklinde birbiri üzerine kıvrılmış iki iplikten
oluşmuştur
5
6
1
18.11.2008
Nükleotidlerdeki bazlar
Nükleotidler
7
8
eker-P omurgası ve 3D
yapısı
Antiparalel zincirler mavi
ile gösterilmiştir bazlar
arası H bağları A-T
arasında 2 G-C arasında 3
bağ bulunur.
3.34nm
Helixin bir dönüşü
Bazlar arası mesafe 0.334nm (3.34Angstrom)
9
10
eker ve bazdan oluşan birim nükleozid
olarak adlandırılır.
Fosfodiester bağı iki komşu deoksiriboz
arasındadır.
11
Büyük ve küçük oluklar DNA’ya proteinlerin bağlanmasını
kolaylaştırırlar.
DNA sağa dönümlü heliks yapıdadır. Solüsyondaki form B
formudur
12
2
18.11.2008
Hücre çekirdeğindeki DNA molekülleri, hücrenin
bölünme evresinde, kompleks katlanmalarla kromozom
denen yapılar haline gelirler
DNA
Canlı hücrelerde genetik bilginin saklandığı kromozomal
komponent
DNA’da saklı olan genetik bilgi, replikasyon suretiyle
kalıtılabilmekte
transkripsiyon olayı ile RNA’ya aktarıldıktan sonra
translasyon olayı ile protein haline çevrilebilmektedir
13
DNA’nın denatürasyonu ve
renatürasyonu
14
RNA (ribonükleik asit)
DNA’daki genetik bilgiyi bir fonksiyonel proteine
dönüştürmekte aracı rol oynayan nükleik asittir
RNA molekülü çift sarmallı değil tek zincir şeklindedir;
bazen firkete modeli gibi çeşitli modeller oluşturabilir
15
16
haberci RNA (messenger RNA,
mRNA)
RNA çeşitleri
• haberci RNA (messenger RNA, mRNA)
• taşıyıcı RNA (transfer RNA, tRNA)
• ribozomal RNA (rRNA)
protein sentezi için gerekli genetik mesajı nükleustaki
DNA’dan sitoplazmadaki ribozomlara taşıyan RNA’lardır.
Protein sentezi için kalıp görevi görür.
mRNA üzerindeki, her biri bir amino aside uyan üçlü baz
gruplarına kodon denir.
17
18
3
18.11.2008
tRNA (transfer RNA, taşıyıcı
RNA)
sekonder
yapıları yonca
yaprağı
şeklinde olan
RNA’dır
protein
sentezine
girecek amino
asitleri sentez
yerine taşır.
19
Bir antikodondaki bazlar, protein sentezi için kalıp görevi
gören mRNA’nın üzerinde bulunan, tRNA ile taşınan
amino aside uyan kodondaki bazların tamamlayıcısıdırlar
20
rRNA (Ribozomal RNA)
ribozomların
yapısındaki
RNA’dır;
Ile taşır
Svedberg ünitesi (S)
olarak belli
sedimantasyon
katsayılarına sahip
olan çeşitli rRNA’lar
kombine olarak
ribozomları
oluştururlar
AUC
Ile’ne uyar
21
22
Nükleik asitlerin reaksiyonları
DNA’nın nükleotid dizisi, organizmanın protein
moleküllerinin tümünün sentezinde bilgi kaynağıdır
DNA molekülü, sakladığı genetik bilgilerin sonraki
nesillere aktarılması için kendi kopyasını oluşturur
(replikasyon).
Bir protein molekülüne ait olarak DNA’da saklanan
genetik bilgiler, önce bir RNA molekülünün sentezi
suretiyle kopyalanır veya yazılır (transkripsiyon).
transkripsiyonla RNA’ya kopyalanmış olan genetik
bilgiler daha sonra okunarak bir protein molekülü haline
çevrilir (translasyon).
Transkripsiyon ve translasyon olaylarının toplamı gen
ifadesi (gen ekspresyonu) olarak adlandırılır.
23
24
4
18.11.2008
SANGER METODU
Frederick Sanger, Cambridge'de Medical Research Council'de 10 küsur yıllık bir
çalışmanın sonucunda, 1955'te insülinin amino asit dizilimini ortaya koyarak
1958 Kimya Nobel'ini almaya hak kazandı.
* Sequences, sequences, sequences, Sanger F., Annual Rev. Biochem. 57, 128, 1988
25
*DNA dizi analizinden sık kullanılan yöntem Fred SANGER ve
arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma yöntemidir(Sanger
et al., 1977).
*Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın
kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir.
*Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik
için kalıp olarak kullanılır.
*DNA sentezini sağlamak için Taq DNA polimeraz kullanılabilir.
*Yöntemin temeli DNA polimerazın dNTP’lerin (deoksiribonükleozittrifosfat)
yanısıra deoksiribozun 3’pozisyonunda OH grubu taşımayan ddNTP’leride
(dideoksiribonükleozittrifosfat) substrat olarak kullanabilmesine dayanır.
*Sentezlenen DNA’ya bir ddNTP’nin katılması 3’pozisyonunda OH grubu
olmadığı için sentezi durdurur.
27
26
dATP
ddATP
28
*Dizi analizi yapılırken dört ayrı reaksiyon karışımı hazırlanır.
*Her bir karışım kalıp DNA zinciri, bir primer, dNTP’lerin dördü ve az
miktarda ddNTP’lerden birini içerir.
*Özgül zincir sonlanması için her bir reaksiyonda farklı bir ddNTP
bulunur.
*Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleotit
kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA
fragmenti meydana gelir.
*Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez
uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülür.
*Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en
önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur.
*İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde, tespit edilen parçacıklar
reaksiyon karışımına konulan ddNTP’nin tipine göre okunur.
29
30
5
18.11.2008
UYGULAMA (1)
1-Bençlerde duran buz içerisinde 4 adet ependorf tüpü bulunmaktadır.
A tüpünde - izole edilmiş genomik insan DNA’sı
B tüpünde – izole edilmiş HIV virüsü DNA’sı
C tüpünde – izole edilmiş balık DNA’sı
D tüpünde – saf su
Sorular
1) DNA bulunan tüpleri tespit etmek için ne yapmanız gerekir? (kantitatif
tayin)
2) Bu işlemi nasıl gerçekleştirirsiniz?
3) Tam olarak miktar tayini yapabilir misiniz?
4) Diyelim içinde DNA olan tüpleri buldunuz, saflığını nasıl kontrol edersiniz?
5) Örnekler neden buz içinde?
31
32
33
34
35
36
6
18.11.2008
EtBr Nokta Testi
*DNA konsantrasyonunun belirlenmesinde etidium bromür (EtBr) nokta
testi basit ama güvenilir sonuçlar veren bir metoddur.
*U.V ışığın absorpsiyonu nükleik asit örneklerindeki DNA
konsantrasyonunun belirlenmesinde sıkça kullanılmaktadır.
*Örnek içerisindeki DNA miktarı ile açığa çıkan U.V floresan ışığın
miktarı arasında doğru bir orantı vardır.
*Bilinmeyen DNA nokta yoğunluklarının bir bilgisayar yazılımı
yardımıyla standart DNA noktaları ile karşılaştırılması esasına
dayanmaktadır .
*CTAB DNA izolasyon protokolüne göre DNA izolasyonları yapılan
örneklerin kantitatif DNA miktar tayinleri EtBr nokta testi ile yapılmıştır.
*Uygulanan protokolde şu aşamalar gerçekleştirilmiştir;
37
●Calf thymus DNA’sı (Sigma D1501) kullanılarak 170 ng/µl konsantrasyonda
stok solüsyon hazırlanmış ve 0, 3, 6, 10, 12.5, 21.5, 25, 42.5, 50, 85, 100 ve
170 ng/µl olacak şekilde dilusyona uğratılmıştır.
●10 mg/ml olan stok EtBr solüsyonu 10.000 kat seyreltilerek protokolde
kullanılacak olan konsantrasyona (1 ng/µl) getirilmiştir.
●Öncelikle parafilm üzerine aralıklı olarak 10 µl EtBr (1 ng/µl) koyulur. Daha
sonra standart DNA ile izole edilen ve miktarı bilinmeyen DNA stoklarından
1’er µl EtBr üzerine eklenir. Örneklere aynı sayıda pipetleme yapılarak EtBr ve
DNA’ların karışması sağlanır.
●U.V. jel görüntüleme cihazının içine serilen streç filmin üst kısmına EtBr ile
karıştırılmış standart DNA örnekleri konsantrasyonu az olandan çok olana doğru
sıralanırken alt kısma da EtBr ile karıştırılmış miktarı bilinmeyen DNA örnekleri
pipet yardımıyla koyulur ve fotoğrafları çekilir (ekil 3.2.3).
●Çekilen fotoğraflarda, standart ve miktarı bilinmeyen DNA örneklerinin ışık
yoğunluk ölçümleri ImageJ programı (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html.)
kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
38
●Standart ve DNA miktarı bilinmeyen örneklerin ışık yoğunluk ölçüm sonuçları
Microsoft Excel’e aktarılmıştır. Standart DNA örneklerinin ölçüm sonuçları
doğrultusunda oluşturulan grafikten yararlanılarak miktarı bilinmeyen DNA
örneklerinin konsantrasyonları hesaplanmıştır
39
7