Eren Demirpolat - Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

1. GİRİŞ VE AMAÇ
Retrovirüsler, HIV’ in (Human İmmunodeficiency Virus) de dahil olduğu bir RNA
virüs ailesidir. Retrovirüslerin tamamı replikasyon sırasında revers transkriptaz enzimi
aracılığıyla revers transkripsiyon yapmaktadırlar. HIV virüsü enfeksiyon yapma şekli
açısından replikasyonunu devam ettirebilmesi için revers transkripsiyon yapmaya
mecburdur.
Revers transkripsiyon, virüs RNA (Ribonükleik asit) zincirinin birden çok fonksiyona
sahip revers transkriptaz enzimi aracılığıyla, DNA (Deoksiribonükleik asit) zincirine
dönüştürülmesidir. DNA sentezlendikten sonra virüs konakçı DNA’ sına entegre olma
yeteneği kazanır. Bu olay virüs replikasyonunda ve enfeksiyonun gelişiminde önemli
rol oynamaktadır. Virüs, DNA’ sını konakçı hücreye entegre ettikten sonra konakçının
hücresel fonksiyonlarını kullanarak kendi RNA’ larını ve diğer yaşamsal proteinlerini
sentezlemeye hazır hale gelir. Revers transkripsiyon işlemi retrovirüslerin tamamında
gözlenmektedir. Revers transkripsiyon, özellikle HIV enfeksiyonunun tedavisinde
inhibisyonu sağlanan ilk hedeftir ve bununla beraber ilk kullanılan antiHIV ilaç da bir
nükleozit analog revers transkriptaz inhibitörü (NRTI) olan Zidovudindir. NRTI’ lar
dışında nükleozit analoğu olmayan revers transkriptaz inhibitörleri (NNRTI) de
kullanılmaktadır. Günümüzde bu iki ilaç grubundan seçilen iki ilaç yanında bir proteaz
inhibitörü de tedaviye eklenmekte ve HAART olarak adlandırılan (Highly Active
Antiretroviral Therapy) üçlü kombinasyonlar elde edilmektedir.
Virüsün ilaç kombinasyonlarına karşı direnç kazanması yanında NRTI’ ların da
birbirlerinin etkilerini antagonize etmeleri sonucunda tedavi başarısız olabilmektedir.
Bundan dolayı NRTI’ lar birbirleriyle kombine edilmeden önce ilaçların antagonizma
profilleri göz önüne alınarak, birbirlerinin etkilerini azaltan ilaçlar kombinasyonda
beraber kullanılmamalıdır. Böylece bu ilaçların kombinasyonu engellenerek HIV
tedavisinin başarısı arttırılabilir ve tedaviden kaynaklanan eksiklikler giderilerek HIV
replikasyonu daha etkin bir şekilde baskılanabilir. Sinerjistik ve aditif etki gösteren
kombinasyonların kullanılması da tedavinin başarısını yükseltecektir.
Revers transkriptaz inhibitörlerinin etkinliği plazma viral yükü ve lenfosit sayıları ile
ölçülebilmektedir. Bir ilacın tedavi kürünün etkinliğinin değerlendirilmesi ise genelde
16 haftalık bir süreden sonra yapılmakta ve gerekiyorsa değişiklikler yapılmaktadır.
Hastalar uzun süreli olarak NRTI’ ları kullanabilmekte, bu ilaçlara ikinci veya üçüncü
bir ilaç daha eklenebilmektedir. İlacın viral yükü ve lenfosit sayısını hangi hasta
gruplarında
ne
kadar
yükselttiğinin
bilinmesi
tedavi
sırasında
yapılan
ilaç
değişikliklerinin daha doğru yapılabilmesini sağlayacaktır. İlaç seçiminde daha önceden
kullanılan ve virüste mutasyonlara yol açan ilaçlar da önemli rol oynamaktadır. Aynı tip
mutasyonlardan etkilenen ilaçlar arasında çapraz direnç oluşabilmektedir. Dolayısıyla
virüsün hangi ilaçlara karşı direncinin mevcut olduğunun araştırılması gerekir.
2
2. GENEL BİLGİLER
2.1. İNSAN İMMÜNYETMEZLİK VİRÜSÜ
2.1.1. HIV ve AIDS Tarihçesi
AIDS (Acquired İmmun Deficiency Syndrome) hastalığı ilk kez 1981 yılında
tanımlanmıştır. AIDS’ in ortaya çıkmasıyla birlikte hastalığa sebep olan yeni tipte bir
insan retrovirüsü de keşfedilmiştir. Hastalıkta fırsatçı enfeksiyonların, bazı kanser
formlarının ve nörolojik bozukların bağışıklık sistemini zayıflatarak ölüme yol açtığı
tespit edilmiştir. 1983 yılında Barre-Sinoussi ve arkadaşları Pasteur Enstitüsü’ nde
lenfadenopatili hastanın lenf düğümlerinden bir retrovirüs izole etmiş ve bu virüse
lenfadenopatiyle ilişkili virüs (LAV) adını vermişlerdir. 1984 yılında Robert Gallo
tarafından AIDS’ li bir hastanın periferik kan lenfositlerinden sitopatik etkili bir
retrovirüs izole edilmiş ve virüse, insan T-lenfotropik virüs tip 3 (HTLV-3) adı
verilmiştir. Aynı yıl içinde Levy ve arkadaşları başka bir hastadan AIDS ile ilişkili
retrovirüsü (ARV) izole etmişlerdir. 1985 yılında ise maymunlardan T-lenfotropik virüs
tip 3 (STLV-3) elde edilmiştir. Birbirini takip eden yıllardan sonra en son 1986’ da Batı
Afrika’ da AIDS ile ilişkili virüs (HIV-2) saptanmış ve AIDS’ e yol açan virüslere ortak
bir kararla HIV adı verilmiştir. HIV, Retroviridae’ ların Lentiviridae alt ailesinde yer
almaktadır ve bilinen en karmaşık retrovirüstür. Kökenleri bilinmemekle beraber
insanlara maymunlardan bulaştığı düşünülmektedir. Virüsün HIV-1 ve HIV-2 alt tipleri
vardır. HIV-1 ve HIV-2’ nin her ikisi de AIDS’ e yol açar; ancak HIV-2 taşıyanlarda
hastalık daha geç ortaya çıkmaktadır ve hastalığın mortalitesi düşüktür. Batı Afrika’ da
yaygın
olarak
görülür.
HIV-1
ise
tüm
Dünya’
da
görülen
tiptir.
HIV-1’ in A’ dan I’ ya toplam 9 alt tipi varken, HIV-2’ nin A’ dan E’ ye olmak
üzere 5 alt tipi vardır. Retrovirüslerin ortak özelliği ise, uzun kuluçka dönemine sahip
hastalıklara yol açmalarıdır (1,2,12).
2.1.2. HIV ve AIDS Epidemiyolojisi
2007 yılı Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre Dünya’ da toplam 33 milyon +/(3milyon) HIV enfeksiyonlu kişi bulunmaktadır. HIV enfeksiyonu en sık Afrika
kıtasında görülmektedir. (%15-28) Hastalığın yayılımı 1990’ dan günümüze kadar
azalmadan artış göstermiştir (8,10,13).
Türkiye’ de ise 1985’ ten 2006’ ya kadar kümülatif toplamda 2544 HIV vakası
görülmüştür. Bu vakaların 623’ ünde AIDS gelişmiş ve AIDS gelişen vakaların 160’ ı
ölmüştür. Özellikle 2006 yılında 290 yeni vaka bildirilmiştir. Bu vakaların ise 31’ inde
AIDS gelişmiş ve AIDS gelişen vakaların 2’ si ölmüştür. Türkiye’ de 2006 yılında 1.9
milyon kişi HIV açısından testlerle taranmıştır. Aynı yıl içerisinde toplam 784 hastaya
HIV tedavisi başlanmıştır (8,10,13).
2.1.3. Virüsün Şematik Yapısı
HIV, 110nm çapında, konik/küresel görünümlüdür. Virüsün en dış tabakası lipit bir
membrandan oluşmuştur ve viral zarf olarak adlandırılır. Zarf üzerinde 72 tane çıkıntı
şeklinde yüzey glikoproteinleri bulunur. Bu çıkıntılar hidrofilik özellikteki gp120
(ekstrasellüler glikoprotein 120 kilodalton, 550 aminoasitli) ve hidrofobik özellikteki
gp41’ den (transmembran glikoprotein 41 kilodalton, 350 aminoasitli) oluşur. gp120
non kovalan bağlarla gp41’ e bağlanmıştır ve gp 41’ in üzerinde yer alır (16).
HIV’ in en iç kısmında (çekirdekte) birbirinin aynı iki adet RNA genomu ve revers
transkriptaz, integraz, proteaz enzimleri yer almaktadır. Bu yapı p24’ ün (protein 24
kilodalton) oluşturduğu kapsit ile sarılmıştır (1,2).
Konak hücrede yaşam döngüsünü tamamlayıp salınmış virüs, konak hücre zarından
Class HLA-1 ve Class HLA-2 (Human leukocyte antigen) antijenlerini de alır.
Normalde bu antijenler bağışıklık hücreleri tarafından başka bir hücreyi tanımada
kullanılırlar. HLA-1 sitotoksik T hücrelerine antijen sunarken, HLA-2 yardımcı T
hücrelerine antijen sunar (1,2). HIV’ in şematik görünümü Şekil-1‘ de gösterilmiştir.
4
Şekil-1 Virüsün Şematik Görünümü (6)
2.1.4. HIV’ in Genomik Yapısı
HIV genomu tek iplikli,artı kutuplu RNA’ dan oluşmuş birbirinin aynı iki moleküle
sahiptir ve diploid yapıdadır. RNA, 9 kilobaz uzunluğundadır ve 9749 adet nükleotide
sahiptir (16).
Virüs genomunda 9 gen bölgesi bulunmaktadır ve toplam 15 farklı yapısal protein
kodlanır. Bu gen bölgeleri yapısal, aksesuar ve düzenleyici olarak üçe ayrılır (16). gag,
pol ve env yapısal genlerdir. Düzenleyici genlerden tat ve rev replikasyonda
kullanılırken nef, vif, vpr, vpu genleri replikasyonda görev almayıp aksesuar genler
olarak adlandırılırlar. Genlerin görevlerine aşağıda değinilmiştir (1,2,7,11).
I.
Bütün retrovirüslerde bulunan genler (Yapısal genler):
 gag (group specific antigen) geni, viriondaki matriks MA:p17, kapsit CA:p24,
nükleokapsit NC:p7 ve p6 proteinlerini kodlar.
 pol geni (polimeraz geni), viral enzimlerden revers transkriptazı (alt üniteleri
p55, p51, p66), proteazı (PR: p10), integrazı (IN: p32) kodlamaktadır.
5
 env (for envelope-zarf için) geni, gp 160’ ı kodlar. gp 160, proteaz enzimi
tarafından yüzey glikoproteinlerini oluşturan gp41 ve gp120’ ye kırpılır.
 LTR (long terminal repeat): Viral genomun her iki ucunda yer alırlar ve herhangi
bir proteini kodlamazlar. Yapısal özellikleri yanında düzenleyici özellikleri de
vardır.
II.
Sadece HIV’ de bulunan ve replikasyon için gereken düzenleyici genler:
 tat (transkripsiyonun transaktivatör geni), viral ve hücresel transkripsiyontransaktivasyondan sorumludur. Transaktivasyonu sağlayan p14’ ü kodlar.
 rev (viral ekspresyon regülatör gen), mRNA (mesajcı ribonükleik asit)’ ların
çekirdekten sitoplazmaya taşınmasını sağlar. Viral ekspresyonu sağlayan p19’ u
kodlar.
 nef (negatif regülatör gen), LTR promoter bölgesinde repliksayonu süprese
ederken virüsü CD8+ (cluster of differantiation 8+) T-lenfositlerin atağından
korur. Replikasyonda simülatör rolü olan NEF proteinini kodlar.
III.
Sadece HIV’ de bulunan ve replikasyonda kullanılmayan düzenleyici genler
(aksesuar genler)
 vif (viral infectivity factor), enfektifliği şiddetlendiren viral enfektiflik faktör
proteinini kodlar. vif, virüsün paketlenmesi ve olgunlaşması için yürütülen
olaylarda da görev alır.
 vpu (viral protein U), CD4 ekspresyonunu
azaltır, virüsün hücre dışına
çıkmasını sağlayan viral protein U’ yu kodlar. (HIV-2 alt tipinde bu protein
yoktur)
 vpr (viral protein R), viral protein R’ yi kodlar. HIV-2 de vpx geni vardır
(1,2,16,22).
Bu bilgilerle birlikte HIV’ in genetik organizayonunu Şekil-2‘ de inceleyebiliriz.
6
Şekil-2 Virüsün Genetik Organizasyonu
2.1.5. HIV’ in Önemli Özellikleri ve Hücrelere Bulaşma Mekanizması
gp120 ve gp41’ in görevleri enfekte edilecek hücreleri bağlamaktır. HIV’ in konakçıya
bağlanması için gereken konakçı reseptörü ise CD4 molekülüdür. CD4, T-lenfositlerin
yüzeyinde bolca bulunurken makrofajlar ve dentritik hücrelerde daha az bulunur.
Yüzeyinde CD taşıyan hücreler diğer hücrelerin yüzey moleküllerini CD aracılığıyla
tanımlarlar. CD4 ekspresyonu olmadığı düşünülen CD8 ve retinal hücreler gibi
hücrelerin de aslında yüzeyinde mevcut yöntemlerle saptanamayacak kadar az miktarda
CD4 bulunduğu ve az sayıdaki CD4’ ün bile virüsün hücre içine girmesinde yeterli
olduğu düşünülmektedir. Hücre enfeksiyonunun başlangıcında gp120’ nin CD4’ e
bağlanması haricinde (van der Waals ve hidrojen bağları etkileşimiyle) virüsün hücreye
girişini sağlayan CCR5 (kemokin C-C motif reseptör 5) ve CXCR4 (kemokin C-X-C
motif reseptör 4) yardımcı reseptörleri de vardır. Virüsün, konakçıya direkt bağlanıp
hücreyi öldürmesi dışında sinsityum yoluyla da hücreler öldürülebilir. Sinsityumda,
virüslü hücreler ile virüssüz hücreler birbirlerinin gp120 ve gp41’ leriyle birleşirler. Bu
olaya füzyon denilmektedir. Füzyon sonucu oluşan çok çekirdekli hücreler daha
sonradan
ölmektedirler.
Sinsityum,
T-lenfositlerinin
öldürüldüğü
önemli
bir
mekanizmadır. Bağışıklık sisteminin en önemli unsuru olan T-lenfositlerin sayısının
7
azalması ile hücresel bağışıklık sistemi zayıflar. Bağışıklık sistemi zayıfladığından
konağın fırsatçı patojenlerin yaptığı enfeksiyonlara tutulma olasılığı yükselir. Aslında
CD8+ hücreleri virüslü hücreleri yok etme kabiliyetindedir; ancak virüs nef (negatif
regülatör gen) geni sayesinde enfekte olmuş konakçı hücresinin CD4 ve MHC-1 (major
histocompatibility complex) moleküllerinin dizilimini değiştirir. Bu değişim sonucu
CD8+ hücreler enfekte hücreleri tanıyamazlar ve virüs kendisini saklamış olur; çünkü
hasta hücreler MHC-1 tarafından CD8+’ lara sunulmaktadır. CD8+’ lar virüslü hücrenin
antijenini tanıyamadıklarından virüslü hücreyi öldüremezler (1-3,7,16).
2.1.6. AIDS Hakkında Bilgi
HIV esas olarak korunmasız cinsel temas sırasında ve enfekte kanın taşınması
sonucunda bulaşmaktadır. Ayrıca, anneden bebeğe gebelik süresince plasenta
üzerinden, doğum anındayken veya emzirme sırasında sütle bulaşır. Enfeksiyon hem
serbest HIV’ in hem de HIV ile enfekte hücrelerin taşınmasıyla bulaşabilir. Tükrük ve
gözyaşı sıvılarında HIV bulunmasına rağmen bu sıvıların HIV geçişinde etkin olduğuna
dair kanıtlar yoktur. Dolayısıyla, HIV’ li kişiler ile aynı eşyaları kullanmak hastalık
açısından risk oluşturmayabilir. Bulaşma konusunda bir diğer önemli etken kan naklidir.
Günümüzde, kanların enfeksiyona karşı taranmasıyla kan nakli ile bulaşı azalmıştır.
Tarama testlerinde virüsün p24 antijenini saptayan yöntemler kullanılarak taşıyıcının
enfeksiyonu henüz erken evredeyken bile saptanabilmektedir. Antikorlara yönelik
yapılan testlerde hastalığın erken döneminde virüse karşı oluşmuş antikorlar
bulunmadığından hatalarla karşılaşılabilir. HIV, hepatit B ile benzer yollarla bulaşır;
ancak HIV enfeksiyonu çok daha zor aktarılır. Enfeksiyon geliştirebilecek HIV dozu,
hepatit B’ nin enfeksiyon yapması için gereken dozdan çok daha yüksektir. HIV
enfeksiyonundan sonra hızlı bir CD8 artışı görülse de konakçının virüsün hızlı
replikasyonuna karşı savunması yetersiz kalmaktadır. Uzun süre HIV proteinlerinin
sentez edilmesi ve enfekte olan hücrelerin ölmesi sebebiyle (HIV’ in asıl hedefi Tlenfositlerdi) bağışıklık sistemi zayıflar. CD4 hücre sayısının 400/mm3 altına inmesiyle
de AIDS oluşmaktadır. AIDS durumunda hastanın fırsatçı enfeksiyonlara karşı
savunması zayıflar ve kişi tüm hastalıklara karşı daha duyarlı bir hale gelir. Örneğin;
pnömoni sonucu ölen AIDS hastalarının sayısı azımsanamayacak kadar fazladır (1, 2,
13).
8
2.1.7. HIV’ in Replikasyonu
HIV’ in gp120 zarf glikoproteininin aminoterminal bölgesi (N) konak hücrenin CD4
(58kd) reseptörüne bağlanır. gp120’ nin konformasyonu değişir ve konağın kemokin
almaçlarıyla (CXCR4,CCR5) etkileşir. Bunun sonucunda gp41 proteininin önü
açıldıktan sonra konak hücre zarı gp41’ in hidrofobik füzyon peptitleriyle yakalanır ve
füzogenik aktivasyon başlar. gp41 peptitleri konak hücre zarının içine girerek konak
zarında delikler oluşturur. Delikten konak hücresine, çekirdek
zarf içinde revers
transkriptaz, RNA ve integraz aktarılır. Hücre zarıyla etkileşen virüs bileşenleri ise
(CD4:gp120, CXCR4, CCR5) zar yüzeyinde kalır. Sitoplazmaya aktarılan protein zarf
soyulur ve RNA ile revers transkriptaz açığa çıkar. Hücreye giriş tamamlandıktan sonra
revers transkriptaz genom RNA’ sını DNA’ ya (proviral DNA) transkribe eder. DNA
preintegrasyon kompleks içinde yer alır ve bu haliyle konak hücre çekirdek porlarından
içeri giriş yapar. Bu aşamada viral DNA, integraz yardımıyla kovalan bağ yaparak
konak hücre DNA’ sına entegre olur. Konak hücre RNA polimerazı kullanılarak
proviral DNA’ dan viral mRNA üretilirken çok sayıda büyük poliproteinlere de çevirisi
yapılır. tat, rev ve yardımcı proteinler (vif, vpr, vpu, nef) oluşturulduktan sonra rev, belli
bir eşik konsantrasyona ulaştığında gag, pol, env oluşturulur (7). Zarf glikoproteinleri
endoplazmik retikulumda, diğer proteinlerse ribozomda sentezlenir. Sitoplazmada
sentezlenen kapsid proteinleri konak hücre zarına yakın bir bölgede RNA ve revers
transkriptazın etrafını sarar. Endoplazmik retikulumdan taşınan zarf glikoproteinleri de
konak hücre zarına yerleştirilir. Kapsid proteini ile kaplanmış, olgunlaşmamış viral
partikül, zarf glikoproteinlerini de alarak konak hücre zarı yüzeyinde tomurcuklanarak
konak hücre zarından salınır. Viral zarf üzerine, konak hücre zarına ait HLA antijenleri
de geçer. gag ve pol protezla kırpılarak gag’ dan p24 ve p17 oluşurken; pol’ dan revers
transkriptaz, integraz ve protez oluşur. Replikasyon ile ilgili bilgi Şekil-3‘ te verilmiştir
(1,2,16).
9
Şekil-3 Virüsün Yaşam Siklusu (6)
2.2. REVERS TRANSKRİPSİYON
Revers transkripsiyon işlemi retrovirüsler, retrotranspozonlar ve hepadnavirüslerde
gerçekleşmektedir. Revers transkriptaz enzimi 51 ve 66 kDA heterodimer alt ünitelerine
sahiptir. p66, 560 aminoasit uzunluğundayken; p51, 440 aminoasitlidir. p51 alt ünitesi
p66’ nın proteaz ile kırpılmasıyla oluşmaktadır. Enzim, RNA bağımlı DNA polimeraz
aktivitesi, DNA bağımlı DNA polimeraz aktivitesi ve ribonükleaz H aktivitesi
göstermektedir (17). p66 alt ünitesi polimeraz ve ribonükleaz H özelliğine sahipken,
p51’ in polimeraz üzerinde etkisi azdır. p51, p66’ nın polimerazı sağlayan aktif
bölgesindeki aynı aminoasitlere sahip olsa da polimeraz açısından gerçekten aktif bir
bölgeye sahip değildir. Revers transkriptaz, DNA polimeraz aktivitesinde RNA’ yı ve
DNA’ yı şablon olarak kullanarak DNA sentezleyebilmektedir. Katalitik özelliğiyle de
ribonükleaz H, RNA-DNA hibridinden sadece RNA parçasını hidrolize etmektedir.
DNA parçasını hidrolize etmemektedir (24). Tüm DNA polimerazlar gibi revers
transkriptaz enzimi de komplementer DNA (cDNA) sentezi yapabilmek için serbest bir
10
3’ OH grubuna ihtiyaç duyar. İn vitro ortamda çok çeşitli moleküller bu ihtiyacı
karşılayabilse de retrovirüsler sadece hücresel tRNA’ yı kullanmaktadırlar. HIV-1 ve
HIV-2’ nin kullandığı replikasyon primeri tRNALys3 (taşıyıcı ribonükleik asit Lysine 3)’
tür (4).
Revers transkripsiyon işlemi eşsiz bir mekanizmayla gerçekleşmektedir. Virüs revers
transkripsiyon sırasında iki önemli engelle karşılaşmaktadır. Birincisi, RNA genomu
uçtan uca düzgün bir şekilde DNA’ ya dönüştürülememektedir; çünkü primer bağlanma
bölgelerinin (LTR’ de kod bulunmaz) kopyalanması imkansızdır. İkincisi, yeni viral
genomlar hücresel RNA polimeraz 2 tarafından üretiliyor olsa bile transkripsiyon
başlangıcı için sinyal gönderilmesi zorunluluğudur (9). Bu yüzden retrovirüsler hem 5’
hem de 3’ RNA sonlanımlarında fazladan birer tane RNA kopyasına sahiptirler. Bunlar
U5 ve U3’ tür. Uzun terminal tekrarı (LTR-long terminal repeats) U3-R-U5
dizilimindedir ve integrasyon, proviral DNA’ nın çoğaltılması gibi cis aktiviteli olayları
yönetir. R bölgelerinin birbiriyle uyumlu olmaları şablon değişimine olanak
sağlamaktadır (7).
Revers transkripsiyon işleminin tamamı sadece bir viral enzimle yani revers
transkriptazla (RT) in vitro ortamda gerçekleştirilebilir; fakat in vivo ortamda belli viral
ve de hücresel proteinler revers transkripsiyonun etkinliğini artırmaktadır. Bunlar tat,
nef, vif, vpr, IN, NC:p7 (nükleokapsit protein 7 kilodalton), hücresel proteinler, TAR
RNA’ dır. Ayrıca retroviral DNA sentezi, bazı parçaları ve bütün yapısıyla bu işlemin
farklı adımlarını etkileyen bir nükleoprotein kompleksinde meydana gelmektedir (11).
Bu kompleksi revers transkriptaz enzimi, tRNALys3 ve 18 nükleotitlik PBS (primer
binding site) oluşturmaktadır. PBS kısmı viral RNA’ nın en uç kısmında yer alır (9).
Nükleoprotein komplekste başka tRNA’ lar da bulunmaktadır, ancak tRNALys3 yüzdesi
diğerlerinin neredeyse 10 katı kadardır. Dolayısıyla tRNA Lys3’ ün seçimli bir kullanımı
vardır. tRNALys3 viral RNA’ nın PBS kısmındaki 18 nükleotitlik bölgeye de mükemmel
bir şekilde uymaktadır (7,18). tRNA tiplerinden hangisinin kullanılacağını retrovirüsün
tipi de belirlemektedir. Örneğin; avian ve murine retrovirüsleri tRNATpr ve tRNAPro
tiplerini kullanmaktadır (19).
Replikasyon başlangıcında hücresel tRNALys3’ ün 3’ OH grubu, viral RNA’ nın 5’
ucundaki primer bağlanma bölgesine bağlanır. PBS’ nin 5’ ve tRNA’ nın 3’ etkileşimi
dışında PBS’ nin U5 bölgesinin A’ dan zengin kıvrımıyla (A-rich loop) tRNA’ nın U’
11
dan zengin kıvrımı birbiriyle kaynaşmaktadır. Aynı zamanda tRNALys3 nükleokapsit
proteindeki A’ dan zengin kıvrımla da etkileşmektedir (18).
Yapılan çalışmalarda RNA’ sından A’ dan zengin kıvrımı çıkarılan HIV’ in revers
transkripsiyon özelliğinin azaldığı bulunmuştur. Ayrıca, PBS kısmı tRNAhis, tRNAmet’
in 3’ ucuna uyacak şekilde mutasyona uğratılmış HIV’ in, enfekte hücre kültüründe
düzgün şekilde revers transkripsiyon yapamadığı gözlenmiştir (11,14).
Revers transkripsiyonun etkinliğini artıran bir diğer etkileşim ise tRNALys3’ ün T omega
C kolu ile birebir uyumlu olan 8 nükleotitlik PAS (primer activation signal) motifidir.
PAS motifi tRNA’ nın primer olarak kullanımını artırmaktadır; ancak tRNA
yerleşiminde yer almamaktadır. Bu etkinlik in vitro çalışmalarda araştırılarak
doğrulanmıştır (18).
Revers transkriptaz öncelikle RNA bağımlı DNA polimeraz aktivitesiyle ilk DNA
zincirini oluşturur. Bu ilk oluşturulan zincire (-) strong stop DNA [(-)ssDNA] denir ve
181 nükleotide sahiptir (11). (-) ssDNA sentezini kontrol eden faktörler tamamen
anlaşılmış değildir; ancak 7 kilodaltonluk (kDA) çift çinko bağlanma domaini içeren
NC’ nin bu olayda kritik öneme sahip olduğu düşünülmektedir. NC proteininin
tRNALys3’ ün etkin bir şekilde bağlanmasını ve revers transkripsiyonun etkinliğini
arttırmada büyük katkısı vardır (15).
2.2.1. Revers Transkripsiyonun Basamakları
tRNALys3’ ün 3’ OH grubu, viral RNA’ nın 5’ ucundaki primer bağlanma bölgesine
(PBS) bağlanır ve senteze başlar. (Şekil-4 1. aşama) Sentez viral RNA’ nın 5’ ucundaki
PBS kısmında başlar, çevirisi yapılmayan R bölgesinde de devam eder (14). tRNALys3
R-U5 kısmını aynen sentezler. (2. aşama) Sentezlenen zincirin ucunda RNA kalıntısı
(R-U5) vardır ve hibrid DNA-RNA olarak adlandırılır. Hibridin ucundaki RNA
parçasının fosfodiesteraz bağları revers transkriptazın ribonükleaz H (RNaseH)
aktivitesiyle hidrolize edilir. (3. aşama) Daha sonra RT (-) ssDNA’ dan ayrılıp viral
RNA’ nın 3’ ucuna bağlanarak şablon değiştirir. (4. aşama) Bu olay her iki uçtaki (5’
ve 3’) R bölgelerinin birbirleriyle tamamen uyumlu olmalarıyla sağlanmaktadır. R
bölgeleri üst üste gelerek şablon değişikliğiyle viral RNA’ nın 3’ ucunun karşısında U5
bölgesi sayesinde viral RNA’ nın 5’ sonlanımını oluşturmuş olur. tRNALys3, 5’ uçtan 3’
uca doğru karşısındaki RNA’ dan DNA sentezler. Sentez yönü şablon RNA zincirine
göre düşünülünce RNA’ nın 3’ ucundan 5’ ucuna doğru olmaktadır. Sentezlenecek olan
12
(-) ssDNA ise 5’ ucundan 3’ ucuna doğru oluşturulmaktadır. Revers transkriptaz, viral
RNA’ ya ilk bağlandığı yerden sentezleme işlemine başlayacak olsaydı, yeni zincir 3’
uçtan 5’ uca doğru sentezlenecekti. Sentez her zaman 5’ uçtan 3’ uca doğru
gerçekleştiğinden dolayı şablon değişikliğine gidilerek R-U5 bölgesi çıkarılmış olan
RNA’ nın R-U3 bölgesindeki R bölgesinin karşısına geçilir. Bu olay RNA’ nın 3’ ve 5’
sonlanımlarındaki R bölgelerinin birbiriyle uyumlu olması ve tRNALys3’ ün viral RNA’
ya ilk bağlandığı anda, viral RNA’ nın 5’ kısmının (U5-R) sentezlemesiyle
gerçekleşmektedir. Şablon değişiminden sonra (-) ssDNA’ nın kalan kısmı da
oluşturulur. (5. aşama) (-) ssDNA karşısındaki RNA zincirinin 3’ ucundaki U3-R
bölgesi ve geriye kalan kısmın çoğu, bir kez daha revers transkriptazın ribonükleaz H
aktivitesiyle kesilir. (6. aşama) Geriye kalan RNA kalıntısının 5’ ucundan 3’ ucuna
doğru U3-R-U5-PBS kısmı tekrar oluşturulur. (7. aşama) Bu işlemden sonra tRNALys3
(-) ssDNA’ dan ayrılır. (8. aşama) Yeniden oluşturulmuş U3-R-U5-PBS kısmı dışında
kalan RNA kalıntısı hidrolize edilir. Bu aşamadan sonra (-) ssDNA zinciri karşısındaki
U3-R-U5-PBS kısmı şablon değiştirerek (-) ssDNA’ nın 5’ ucundan 3’ ucuna bağlanır.
(9. aşama) Bu bağlanma da (-) ssDNA’ nın 3’ ucundaki R bölgesi ile U3-R-U5-PBS
parçasındaki R bölgesinin birbirine uyumuyla sağlanmaktadır. Daha sonra revers
transkriptaz, DNA bağımlı DNA polimeraz aktivitesiyle (-) ssDNA zincirinin 3’
ucundaki eksik olan U5-R-U3 bölgesinin ve ikinci sentezlenecek olan zincirin 5’
ucundan 3’ ucuna doğru sentezini yapar. (10. aşama) Sentezde RNA’ nın 3’ uzun
terminal bölgesindeki (LTR) polipürin track (PPT) ile pol geninin sonundaki cPPT
primerleri kullanılır. Sonrasında cPPT uzaklaştırılır. (11. aşama) İkinci sentezlenen
zincire ise (+) zincir DNA denir. Sentezlenen iki DNA da düz şekillidir ve daha sonra
çembersel cDNA (complementer DNA) haline dönüştürülür (16). Sentezlenen DNA’
nın her iki ucunda da LTR kısımları mevcuttur ve bu sayede konak DNA’ sına entegre
olabilmektedir (18). Revers transkripsiyon, basamaklarıyla birlikte Şekil-4’ te
gösterilmiştir.
13
Şekil-4 HIV Revers Transkripsiyonun Şematik Gösterimi (4)
Kırmızı nokta revers transkriptaz, 1. aşamadaki revers transkriptazın yanında
görünen loblu şekil ise tRNALys3’ tür.
14
2.3. NÜKLEOZİT ANALOĞU REVERS TRANSKRİPTAZ İNHİBİTÖRLERİ
(NRTI)
NRTI’ lar, HIV’ e karşı etkili olan ilaçlar arasında en çok araştırılan ilaç grubu
olmuştur. Etki mekanizmalarının özünü hem viral hem de hücresel fonksiyonlarla
etkileşimleri oluşturmaktadır. Hücresel olarak hücre büyümesini ve ölümünü
etkilemektedirler. Aslında NRTI’ ların ilk örneği Zidovudine bir antikanserojen ilaç
olarak geliştirilmiş; ancak kansere karşı etkinliğinin az olduğu görülmüştür. Sonradan
yapılan in vitro çalışmalarda Zidovudine’ nin HIV’ e karşı etkili olduğu tespit
edilmiştir. NRTI’ lar ve antikanserojen ilaçlar bazı ortak yan etkiler gösterdiklerinden
birbirlerine benzemektedirler (5).
NRTI grubunda bulunan ilaçlar Zidovudine (AZT), Zalcitabine (ddC), Didanosine
(ddI), Stavudine (d4T), Lamivudine (3TC), Emtricitabine (FTC) ve Abacavir (ABC)’
dir. Bu ilaçlar günümüzde aktif olarak kullanılmaktadır. Günümüzde kullanılan ilaçların
uzun ve kısa sürede oluşturduğu yan etkiler, mitokondriyal toksisite ve tüm
antiretroviral ilaçlarda görülen virüsün ilaca karşı direnç kazanması sorunları sebebiyle
yeni NRTI’ lar araştırılmaktadır. Bunlar Alovudine, Amdoxovir, Racivir, Reverset, SPD
754, Elvucitabine’ dir (20). AZT ile 3TC’ nin ikili kombinasyonu (Combivir) ve bu ikili
kombinasyona ek olarak ABC’ nin (Trizivir) de dahil olduğu üçlü bir kombinasyon da
piyasada müstahzar olarak bulunmaktadır. NRTI’ ların analogluk durumlarına göre
sınıflandırılması tablo-1’ de gösterilmiştir.
Tablo-1 Baz Analogluğuna Göre NRTI’ ların Sınıflandırılması
Timidin
Analoğu
Sitidin
Analoğu
İnozin
Analoğu
Guanozin
Analoğu
Yeni Sitozin
Analoğu
Zidovudine
Zalcitabine
Didanosine
Abacavir
SPD 754
Stavudine
Lamivudine
Amdoxovir
Elvucitabine
Alovudine
Reverset
Racivir
Emtricitabine
15
NRTI’ lar AIDS tedavisinde kullanılan ilk ilaç grubudur. Zidovudin klinik olarak ilk
test edilmiş antiretroviral ilaçtır. NRTI’ lar proteaz inhibitörleri ile ve/veya nükleozit
olmayan revers transkriptaz inhibitörleri ile kombine halde HAART’ ın bir parçası
olarak kullanılırlar. Genelde iki revers transkriptaz inhibitörüne ek olarak bir proteaz
inhibitörü kombinasyonu yapılmaktadır. HAART, HIV’ e bağlı morbidite ve mortaliteyi
önemli derecede azaltmıştır. HAART’ ın başarısı viral replikasyonu baskılama
derecesine bağlıdır. Özellikle monoterapi yerine kombine ilaçların kullanılması
virüslerin ilaçlara karşı direnç kazanmasını da azaltmıştır; ancak ilaç dozları düzgün
şekilde ayarlanmazsa birden çok ilaca karşı direnç kazanmış
virüsler de ortaya
çıkabilmektedir (22). Bunun yanında kombine edilen ilaçlar birbirlerinin etkilerini
değiştirebilmektedir. Antagonistik, sinerjistik , aditif etkiler doza bağımlı olduğu gibi
dozdan bağımsız olarak da görülebilmektedir.
Nükleotit analog revers transkriptaz inhibitörleri grubundaki tek ilaç ise tenofovirdir.
Emtricitabine ile kombine halde kullanılmaktadır. 2006 yılında FDA (Food and Drug
Administration) tarafından patent verilmiş Truvada isimli ilacı piyasada bulunmaktadır.
Genel olarak ilaçlara göz atacak olursak:
AZT (3’-azido-2’,3’-dideoxythymidine), bir ön ilaçtır ve hücresel timidin kinazın
fosforilasyonuyla revers transkriptazı inhibe eden aktif formuna dönüşür. Hücre içine
pasif difüzyon ile girer. Oral yoldan alındığında biyoyararlanımı %66’ dır. FDA
tarafından onay almış ilk antiHIV ilaçtır. Önceden hastaların CD4+ hücre sayısı 500’ ün
altına düştüğünde ilacın CD4+ hücre sayısını artırma özelliğinden dolayı monoterapi
şeklinde tedavinin başlangıcında kullanılıyordu; ancak günümüzde ise bu ilacın tekli
ilaç tedavisinde kullanılması pek tercih edilmemektedir. Diğer NRTI’ lar ile
karşılaştırıldığında AZT’ nin eksikliği ise monoterapi şeklinde kullanımı sonucunda
virüsün ilaca karşı kolayca direnç geliştirmesidir. Direnç gelişiminde ilacın uzun yıllar
kullanılıyor olması da etkili olabilir. İlaç, serebral spinal sıvıya geçebilmekte ve
hastalığa bağlı gelişen myopati, ensefalopati gibi nörolojik bozuklukları da
azaltmaktadır (5).
ddC (2’,3’-dideoxycytidine), AZT ile aynı dönemde geliştirilmiş bir ilaçtır. İlacın etki
şekli AZT ile aynıdır. Oral biyoyararlanımı %86’ dır. Özellikle AZT’ ye cevap
vermeyen HIV hastalarında diğer ilaçlarla kombine edilerek kullanılmaktadır.
16
Monoterapi olarak kullanılması için çok toksiktir; çünkü yüksek dozlarda kullanım
gerektirir.
ddI (2’,3’-dideoxyinosine), inhibisyon için öncelikle 3 fosforlu haline çevrildikten
sonra inozin formundan adenozin formuna dönüştürülmelidir. Oral biyoyararlanımı
%40’ tır ve serebral spinal sıvıya da geçerek plazma konsantrasyonun %20 kadarını bu
bölgede oluşturmaktadır. AZT ve ddC’ ye göre pankreatit ve nöropati gibi daha fazla
yan etki göstermektedir.
d4T (2’,3’-didehydro-2’,3’-dideoxythymidine), ilacın 3’ hidroksil grubu pentoz
halkasının 2’ ve 3’ karbonlarıyla bağ yapmıştır. İlerlemiş HIV enfeksiyonunda diğer
ilaçlarla kombine halde kullanılmaktadır (5)
3TC (2’,3’-dideoxycytidine), AZT ve ddC’ ye göre daha etkili olmasına rağmen konak
hücreye karşı daha az toksiktir. HIV’ e karşı etkili olan ilaçlar arasında HIV dışında
HLTV-1 ve HBV’ ye karşı da etki gösteren bir ilaçtır.
ABC [5’TP-deoxyguanosine (dGTP)], inhbisyonu hem dGTP ile yarışıp dGTP
bağlanma bölgesine kendisi bağlanarak hem de kendisi bu bölgeye bağlanmazsa bile
dGTP’ nin viral zincire bağlanmasını önleyerek gerçekleştirir. İlaç 3’ OH grubu
taşımadığından revers transkripsiyonla sentezlenen DNA zincirine bağlanıp DNA
uzaması için elzem olan 5’-3’ fosfodiester bağının oluşumunu engeller. HIV’ e karşı
etkinliği sınırlı bir ilaçtır (5).
2.3.1. NRTI’ ların Etki Mekanizması
NRTI’ ların ana hedefi revers transkriptaz enzimidir. Revers transkriptaz enzimi DNA
polimeraz özelliği gösterirken hata yapabilir. Hata oranı bir replikasyon döngüsünde baz
başına 3 × 10−5’ tir (22). DNA polimerizasyonu sırasında substrat olarak deoksi
nükleozit trifosfatlar (dNTP) kullanılmaktadır. Dolayısıyla dNTP’ lerin analogları
kullanılarak DNA sentezi inhibe edilebilir. NRTI’ lar deoksiriboz halkasının 3’
konumlarında hidroksil grubu yerine farklı gruplar taşıyan veya hiçbir grup taşımayan
sentetik purin ve pirimidin molekülleridir. NRTI vücutta NRTI monofosfat (MP), NRTI
difosfat (DP), NRTI trifosfat (TP) şeklinde birbirini izleyen fosforilasyon işlemlerinden
geçer. İlaçların aktif formu bu fosforilasyon olaylarından sonraki üç fosfora sahip
halidir. Fosforillenecek ilaç miktarını sınırlayan etkenler ise vücuttaki hücresel kinaz
(TK) ve nükleozit DP kinaz enzimleridir. Fosforillenme derecesi hücresel kinazlar,
17
hücre içi dNTP konsantrasyonu ve dideoksinükleozit ile deoksinükleozit arasındaki
orana bağlıdır. Fosforillenme derecesi NRTI’ ların proviral DNA sentezi sırasında
sentezlenen DNA’ ya bağlanarak revers transkripsiyonu inhibe etmesini yakından
etkiler. Öyle ki, fosforillenmeyi sınırlayan faktörler asıl etkiyi gösteren TP oluşmasını
azaltarak ortamda aktif olmayan DP ve MP birikmesine sebep olmaktadır. NRTI’ ların
hücre içi fosforilasyonu hücre tipi, hücre siklusu, hücre aktivasyonu ve hücrenin
enfeksiyonuna göre değişmektedir; çünkü aktive olmuş hedef hücredeki nükleozit kinaz
aktivitesi ve enzimatik nükleozit sentezi hücre siklusunun S fazına kadar artmamaktadır.
Bu sebeple NRTI’ lar aktive olmuş ve olmamış hücrelerde farklı fosforilasyon
derecelerine sahiptir. Örneğin AZT’ nin uyarılmış monositlerdeki veya aktive olmamış
mononükleer hücrelerdeki fosforilasyon miktarı uyarılmış T hücrelerindekine göre daha
azdır (5). Bazı çalışmalarda Zidovudinin sadece hücresel timidin kinaz ile değil daha az
derecede de olsa mitokondriyal timidin kinaz ile fosforillendiği gösterilmiştir (23).
Aktif TP revers transkripsiyonu iki şekilde inhibe etmektedir. İlaç revers transkriptaza
bağlanan endojen dNTP’ ler ile yarışarak substrat bağlanma bölgesine bağlanabilir ve
inhibisyonu gerçekleştirebilir. Diğer bir yandan ise NRTI’ lar proviral DNA sentezi
sırasında zincirin yok edicisi olarak davranarak inhibisyonu gerçekleştirebilir. İkinci
mekanizmada NRTI TP, NRTI MP şeklinde, sentezlenen DNA’ ya bağlanarak henüz
olgunlaşmamış olan zincirin uzamasını önlemektedir. Revers transkriptaz enzimi TP
formunu normal bir substrat olarak algılamaktadır (20). Aslında NRTI MP formu
yanına sonradan gelecek olan nükleotit ile fosfodiester bağı yapacak 3’ OH grubu
taşımaz ve bundan dolayı zincirin uzamasını durdurur ve bu olaya fosforolizis denir.
Zincir uzaması bir nükleotidin 5’ karbonu ile diğer nükleotidin 3’ karbonu arasında
fosfodiester bağının oluşup nükleotitlerin yan yana dizilmesiyle gerçekleşmektedir (5).
2.3.2. NRTI’ ların Sebep Olduğu Mitokondriyal Toksisite
NRTI’ ların yapmış olduğu mitokondriyal yan etki mitokondriyal polimerizasyon ve
hücresel metabolizma üzerindeki etkilerine ve yapmış oldukları oksidatif strese bağlı
olarak açıklanmaktadır. NRTI’ ların yaygın olarak kullanımından dolayı mitokondriyal
mutasyonlar sık gerçekleşmektedir. NRTI’ lar genetik rahatsızlıklarda görülen
mitokondriyal disfonksiyona benzer bir tablo oluşturduklarından deneysel olarak
mitokondiyal disfonksiyon oluşturmak için de araştırmalarda kullanılmaktadırlar (28).
18
Konakçı çekirdek genleri oksidatif fosforilasyonu sağlayan genlerin (OXPHOS, the
principal source of myocardial energy) çoğunu kodlamaktadır; ancak bu OXPHOS
genlerinin 13 polipeptidini ise sadece mitokondriyal DNA (mtDNA) kodlamaktadır.
OXPHOS genleri hücresel ATP üretimiyle görevlidir. Mitokondriyal DNA ise DNA
polimeraz
gama
tarafından
kopyalanmaktadır.
NRTI’
ların
yapmış
olduğu
mitokondriyal disfonksiyonda mitokondriyal polimeraz fonksiyonun etkilenmesi ana
sebebi oluşturmaktadır; çünkü invitro çalışmalarda NRTI’ ların seçici olarak DNA
polimeraz gama enzimini inhibe ettiği kanıtlanmıştır. Bu çalışmaya bağlı olarak en çok
inhibisyon yapan ilaçtan en az inhibisyon yapan ilaca doğru bir sıralama ise şu şekilde
yapılmıştır. DDC-DDI-D4T-3TC-AZT-ABV. mtDNA’ yı replike eden enzimin
inhibisyonu sonucu mitokondrilerde mtDNA miktarı önemli ölçüde azalmaktadır.
NRTI’ lar diğer hücresel polimeraz enzmlerinden beta, alfa ve E’ yi aynı şekilde inhibe
etmemektedir. AZT ile tedavi edilen farelerin bacak kaslarında ve maymunların kalp ile
iskelet kaslarında mtDNA sayısının azaldığı gösterilmiştir. Özellikle bu azalma,
maymunlarda
anormal
OXPHOS
enzim
aktivitesine
bağlanırken;
farelerde
mitokondriyal RNA ve proteinlerin sayısının azalmasına bağlanmıştır (26). DNA
polimeraz gama (DNA pol-gama) ökaryotik mtDNA enzimidir ve çekirdek genomu
tarafından kodlanmaktadır. Enzim iki alt üniteye sahiptir ve bunlardan biri kompleksin
DNA’ ya bağlanmasının daha sıkı olmasını sağlamaktadır. Mitokondrideki enerji
üretiminin azalması sonucu mitokondriyal polimerizasyon da azalmaktadır. Bazı
çalışmalarda bu enerji üretiminin azlığına bağlı olarak gelişen mitokondriyal bozukluğa
bağlı konjestif kalp yetmezliği de araştırılmıştır. Dolayısıyla fazla sayıda mitokondri
içeren dokular bu bozukluktan daha fazla etkilenmektedir (25).
Esas olarak oksidatif streste ise, reaktif oksijen türevlerinin üretimindeki dengesizliğe
bağlı olarak hücrede çok sayıda bulunmaları ve bunların antioksidan mekanizmalarla
inaktive edilememesi sonucu mitokondride hasar oluşturması söz konusudur. Bunun
sonucunda reaktif etkenler mitokondriye zarar vermektedir. Mitokondride reaktif
oksijen üretimi de meydana geldiğinden oksidatif strese yatkınlık oluşmaktadır. Bu
reaktif oksijen türevlerine süperoksit, hidrojen peroksit, lipit peroksit, peroksi nitrit,
radikal hidroksiller örnek olarak verilebilir. 10 g. AZT verilmiş farelerden izole edilen
karaciğer hücrelerinin mitokondrilerinde mitokondriyal adenilat kinaz ve adenozin
nükleotit taşıyıcısının inhibe edildiği gösterilmiştir (26).
19
Genel toksisite ve mitokondriyal toksisite açısından ilaçların stereokimyasal formunun
farklılığı toksisitede de farklılık oluşturmaktadır. beta-L-(-)-2’,3’dideoxy-3’-thiacytidine
(3TC) 2’,3’-dideoxycytidine (ddC)’ nin (-) stereoizomeridir. 3TC (-) SddC olarak da
adlandırılmaktadır. Günümüzde kullanılan NRTI’ lar arasında 3TC doğal olmayan L
konfigürasyonu içeren tek ilaçtır. İlginçtir ki, bu L izomer D izomere göre daha az
toksik ve yüksek etkilidir. 3TC ve ddC arasındaki stereokimyasal selektivite ve
izomeriden kaynaklanan yan etki farklılığı tam da anlaşılmış değildir. (+) ve (-) TC’ nin
her ikisi ise ddC’ den daha az toksiktir. (+) TC (-) TC’ ye göre mitokondriyal polimeraz
gamanın daha güçlü inhibitörüdür (29).
AZT’ nin kullanımını kısıtlayan en önemli faktör ağır yan etkileridir. Jose´ Garcı´a de la
Asuncio´n ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada AZT’ nin oksidatif strese bağlı
mitokondriyal toksisitesi ve bu toksisiteden antioksidan vitaminlerle korunulup
korunulamayacağı araştırılmıştır. AZT tedavisi mitokondriyal lipit peroksidasyonuna ve
mitokondriyal glutatyon oksidasyonuna da yol açmaktadır. Toksisitesine bağlı olarak
dilate kardiyomyopatiyi de içine alan kardiyovasküler rahatsızlıklar oluşmaktadır. Daha
önceden yapılan çalışmalarda ise fare karaciğeri ve iskelet kası üzerinde mitokondriye
bağlı bozukluklar tespit edilmiştir. Yan etkilerin görülmesi kullanılan ilaç dozuna da
bağlı olduğundan yüksek dozlarda yan etki oluşma ihtimali artmaktadır.
Jose´ Garcı´a de la Asuncio´n ve arkadaşları AZT’ nin 10mg/kg/gün dozunda 35 gün
boyunca içme suyuyla verildiği farelerin kalp hücrelerinde reaktif oksijen türevlerinin
(ROS) arttığı bulunmuştur. Aynı çalışmada diyetle alınabilecek dozun çok üzerinde bir
dozda 10g/kg C vitamini ve 0.6g/kg E vitamini ile AZT’ nin yan etkisi bertaraf
edilmeye çalışılmıştır. AZT ile tedavi edilen grupta ilacı almamış gruba göre oxo-dG (8oxo-7,8-dihydro-2V-deoxyguanosine-oksidatif hasarın bioişaretçisi) miktarının %120
daha fazla olduğu görülmüştür. Vitamin verilen grupta ROS miktarının vitamin
verilmeyen gruba göre daha az olduğu da gözlenmiştir. AZT’ nin ROS üzerinden
yapmış olduğu en önemli yan etki kardiyomyopatidir. Vitaminlerle bu yan etkinin
oluşmasının engellenmesi sebebiyle AZT’ nin mitokondriyal yan etkisinin sebebi
oksidatif strese bağlı olduğu düşünülmektedir. ROS miktarları HPLC yöntemleri ile
ölçülmüştür (27).
20
2.3.3. NRTI’ lara Karşı Oluşan Direnç
NRTI’ lar HIV’ e karşı kullanılan ilk ilaç grubu olduğundan bu ilaçlarla monoterapi
uygulanması virüsün hızlı bir direnç geliştirmesine sebep olmaktadır. Öyle ki, HAART’
da bile virüs direnç kazanmaya başlamıştır. HAART ile tedavide kesinti veya optimum
doz uygulanmaması sonucu viral replikasyon tam baskılanamamakta ve viral
mutasyonların oluşması sonucu direnç gelişebilmektedir. Tedavi edilmemiş hastalarda
yapılan in vivo çalışmalarda 2 günlük sürede viral turnoverın 107 ile 109 yeni partikül
değerinde olduğu hesaplanmıştır ve HIV genomunun her bölgesinde mutasyonlar
oluştuğu gözlenmiştir. Mutasyona uğrayan HIV’ in ilaçlara karşı replikasyon yeteneği
mutasyona uğramamış virüslere göre çok yüksektir. Aslında ilaçla karşılaşmamış
virüste bile mutasyonlar meydana gelmekte ve ilaca karşı direnç görülebilmektedir.
Revers transkripsiyonda doğal olarak meydana gelen hatalar sonucu genetik açıdan
birbirinden farklı virüsler oluşmaktadır. Revers transkripsiyondaki doğal hataların
günde 109 yeni partikül olduğu saptanmıştır. Bu hatalar sebebiyle her virüs birbirinden
farklı genoma sahip olur ve ilaç da her seferinde farklı genomlu virüslerle karşılaşır.
Sonuç olarak, virüsün daha ilaçla bile karşılaşmadan ilaca karşı direnç kazanması söz
konusu olmaktadır. Dirençli virüslere karşı farklı ilaç kombinasyonları ve daha yüksek
dozda ilaç kullanımı gerekmektedir. Dirençli virüsler bir ilaca direnç kazandıktan sonra
çapraz direnç göstererek, tedaviye yeni eklenecek ilaçlara karşı da direnç gösterebilir.
Özellikle kombine ilaçlara karşı dirençli virüsler arasında direncin aktarıldığı da
düşünülmektedir (7, 30, 31).
Genotipik mutasyonlar tedavi sırasında virüsün ilk başvurduğu mutasyonlar olmuştur.
Virüsün yapmış olduğu birincil mutasyonlarda enzimdeki ilaç bağlanma bölgesinde
değişiklikler meydana gelir, ilaç hedefine bağlanamaz. İlaç, inhibisyonu sağlayabildiği
normal dozda beklenen inhibisyonu sağlayamaz. Yapılan in vitro çalışmalarda ilacın
mutant virüsleri inhibe edebilmesi için normal IC50’ den (inhibitor concentration %50)
daha fazla miktarda verilmesi gerektiği saptanmıştır. Örneğin, AZT’ ye karşı geliştirilen
K70R mutasyonuna ek olarak 215. ve 41. kodonlarında mutasyon sonucunda AZT’ nin
IC50 değeri 60 kat artmaktadır. 67. ve 219. kodon mutasyonlarıyla 500 ile 1000 katlık
bir IC50 artışı meydana gelmektedir. IC50 değeri artışı, ilaç etkinliğinin azaldığını
göstermektedir. Mutasyonlar sonucunda viral replikasyon yeteneğinin arttırılması da
ilaç dozunun yükseltilmesinde rol oynayan başka bir sebeptir (7, 30, 31).
21
İkincil mutasyonlar ise birincil mutasyonlar tamamlandıktan sonra meydana gelir ve
virüsün genel direnç durumunun artırılmasına katkıda bulunur. Birincil mutasyondaki
eksiklikler/hatalar ve ilacın bağlanma bölgesi üzerinde çok az etkileri vardır. Genotipik
mutasyon çalışmalarında ana viral genlerde meydana gelen mutasyonlar saptanmıştır.
İlacın sentezlenmekte olan DNA’ ya bağlanma afinitesi KD ile, ilacın DNA’ ya
bağlanma oranı/hızı kPOL ile ifade edilmektedir. Mutasyonlar sonucu bu değerler
değişmektedir. NRTI’ lar revers transkripsiyon sırasında uzamakta olan DNA’ ya
bağlanıp fosforolizis yaparak zincir uzamasını engellerken virüs de bu işlemin tersi olan
pirofosforolizis yaparak ilacın bağlandığı bölgeden çıkarılmasını sağlar. İlaç bağlandığı
bölgeden çıkarıldıktan sonra DNA zinciri uzamaya devam eder. Pirofosforolizis
kaynaklı direnç özellikle AZT trifosfatın DNA’ dan çıkarılmasında görülür; ancak aynı
direnç d4T’ ye karşı da gerçekleştiğinden klinik anlamda AZT ile d4T arasında çapraz
direnç görülebileceği düşünülmektedir (7,30,31).
22
3-GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. NRTI’ LARIN SİNERJİSTİKLİĞİNİN VE ANTAGONİSTİKLİĞİNİN IN
VITRO
ORTAMDA
DEĞERLERİYLE
IC50
BERABER
DEĞERLENDİRİLMESİ
3.1.1. Çalışma Hakkında Bilgi
HIV tedavisinde sıkça kullanılan HAART genel olarak iki NRTI’ ya ek olarak bir
proteaz inhibitörünün kombinasyonundan oluşmaktadır. Kombine edilen NRTI’ ların
birbirlerini nasıl etkiledikleri bu noktada önem kazanmaktadır. İlaçların sinerjistik ve
antagonistik etkileri tedavinin başarısını derinden etkilemektedir. Sinerjizma sonucu iki
ilacın kombine halde etkisi, her iki ilacın tek başına gösterdiği etkiden daha fazla
olmakta ve HIV replikasyonu daha iyi baskılanmaktadır. Antagonizmada ise iki ilaç
birbirilerinin etkilerini azaltarak beklenen etkiyi verememekte ve her iki ilacın tek
başına kullanıldığında elde edilen etkiden daha az etkinlik oluşmaktadır. Tedavide
sinerjizma
gösteren
ilaçlar
tercih
edilirken
antagonistik
etki
oluşturulan
kombinasyonlardan kaçınılmaktadır. Çalışmada NRTI’ ların kombinasyonu sonucu
hangilerinin antagonistik/sinerjistik etki gösterdiği in vitro ortamda araştırılmıştır. Bu
çalışma sonucunda HAART’ da kombine edilebilecek ilaçlar konusunda bilgi sahibi
olabileceğiz (35).
Çalışma T-hücrelerine göre daha işlevsel olan ve makrofajların da öncül hücresi
periferal mononükleer kan hücrelerinde (PBMC) yapılmıştır. PBMC’ ler lusiferaz
enzimi taşıyan HIV-1 tarafından enfekte edilmiştir. Lusiferaz lüsiferine tesir ederek ışık
meydana getiren bir enzimdir ve belirteç olarak kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan
23
kombinasyonlar zidovudine+stavudine (ZDV+d4T), lamivudine+abacavir (3TC+ABC),
lamivudine+didanosine (3TC+ddI), lamivudine+stavudine (3TC+d4T), stavudinedidanosine (d4T+ddI), zidovudine+lamivudine (ZDV+3TC), abacavir+didanosine
(ABC+ddI), zidovudine+didanosine (ZDV+ddI) ve abacavir+stavudine (ABC+d4T)’
dir. İki ilacın kombinasyonu sonucu oluşan etki kantitatif bir metod olan Chou ve
Talalay’ ın median etkili yöntemi prensibine göre ölçülmüştür. d4T+ddI ve ZDV+3TC
kombinasyonlarında sinerjistik etki gözlenmiştir. Buna karşılık 3TC+ddI, ABC+ddI ve
ZDV+ddI kombinasyonlarında ise antagonizma görülmüştür. 3TC+ABC, 3TC+d4T
kombinasyonlarında ise düşük düzeyde antagonizma görülmüştür. Sonuçlar ayrıntılı
olarak bulgular kısmında yer almaktadır. Sonuç olarak metod, kombine edilen iki
NRTI’ nın HIV replikasyonu üzerindeki etkilerini ölçmeye olanak sağlamaktadır (35).
3.1.2. Materyaller ve İlaçlar
3.1.2.1. İlaçlar
NRTI’ lar Zidovudine (ZDV) GlaxoSmithKline (Hertforshire, United Kingdom)’ dan;
Lamivudine (3TC) GlaxoSmithKline (Madrid, Spain)’ dan; Stavudine (d4T)-didanosine
(ddI) Bristol Myers Squibb Company (Madrid, Spain)’ dan, Abacavir (ABC),
GlaxoSmithKline (Hertforshire, United Kingdom)’ dan alınmıştır. İlaçların tamamının
stok çözeltileri 10mM’ luk distile su içerisinde hazırlanmıştır (35).
3.1.2.2. Hücre Kültürü
293T hücreleri SV40 T antijenini taşıyan ve adenovirüsle dönüştürülmüş insan
embriyonik böbrek hücreleridir (37). PBMC’ ler sağlıklı donorlerin kanlarından FicollHypaque gradiyenti ile santrifüjlenerek izole edilmiş ve 1 g/ml‘ lik fitohemaglutinin
ile 48 saat bekletilerek aktive edilmiştir. 20 g/ml’ lik IL-2 hücreleri ise Dulbecco
modifiyeli Eagle’ ın ortamında (DMEM) muhafaza edilmiştir/beslenmiştir. PBMC’ ler
ise 37°C’ de RPMI-1640 ortamı (içinde vitamin, aminoasit, büyüme faktörleri vardır)
içerisinde muhafaza edilmiştir/beslenmiştir. Kültür ortamı ise %10’ luk sığır serumu
(FCS), 2mM L-glutamin, 10 g/ml streptomisin ve 100 U/ml penisilin ile takviye
edilmiştir (35).
24
3.1.3 Transfeksiyon
Transfeksiyon hücre plazma membranında geçici delik oluşumu sağlanarak DNA’ nın
hücre içine alınmasının sağlanmasıdır. Sahte tipteki rekombinant virüslerini üretmek
için 293T hücreleri, kalsiyum fosfat metoduyla ko-transfekte edilmişlerdir. Metot da
daha önceden saflaştırılmış olan 2 g pNL4.3.Luc.R-E ve 10 g pcDNA3-VSV
plazmidleri kullanılmıştır. pcDNA3-VSV plazmidleri veziküler stomatitis (VSV) virüs
G proteinini kodlayan cDNA’ yı içermektedir. Transfeksiyondan önceki günde 293T
hücreleri 5 × 105 sayısında olacak şekilde 60mm çaplı petri kaplarına ekilmiştir.
Transfeksiyondan 48 saat sonra süpernatantlar besi ortamından toplanmış ve 5 dakika
boyunca 500g ‘ de santrifüjle ayrıştırılmıştır (35).
3.1.4. İlaç Duyarlılık Analizi
Virüslerin ilaçlara karşı duyarlılığı 96 kuyucuklu plakalara yerleştirilen PBMC’ lerin
enfekte edilmesi sonrasında plakadaki ilaçlı ve ilaçsız ortamın gözlenmesi ile tespit
edilebilmektedir. Enfeksiyon 50 L’ den 200 L’ye kadar değişen virüs stok çözeltileri
ile yapılmaktadır. PBMC’ ler ile ilaçların kültüründe her bir ilacın, birbirini seri
şeklinde takip eden ve biri diğerinin 5 katı konsantrasyonda olan 8 adet çözeltisi
hazırlanmıştır. (Ör:0,001-0,005-0,025-0,125-0,625-3,125-15,625-78,125) İlaçların seri
şeklindeki çözeltileri kombine halde de kültüre katılmışlardır. Kültüre aynı zamanda IL2 hücreleri de eklenmiştir. Virüs enfeksiyonunun kombine ilaçlar tarafından inhbisyonu
ilaçların birbirine eşdeğer konsantrasyonları şeklinde değerlendirilmiştir. Dolayısıyla
aynı inhibisyonu sağlayabilen farklı kombinasyonlu ilaçların değerleri bulunmuştur. Bu
da ilaç konsantrasyonları değiştirilip denenerek sağlanmıştır. Virüs replikasyonunun
ölçülmesi için hücreler enfeksiyondan 48 saat sonra parçalanmış ve zaten lusiferaz
enzimiyle işaretlenmiş olan virüslerin lusiferaz aktiviteleri ölçülmüştür (38). Ölçüm
Lusiferaz ölçen Promega Madison, WI ile 96 kuyucuklu plakalarda luminometre
(Orion,Berthold, Germany) kullanılarak yapılmıştır. Bu yöntem daha önceden 2007’ de
Garci Perez ve arkadaşları tarafından da kullanılmıştır. Her bir ilaç kombinasyonu
birbirinden bağımsız en az üç deneyle değerlendirilmiştir. Deneylerin her birinde ise üç
adet kültür kullanılmış ve ortalamaları hesaplanmıştır. Deneylerin sonuçları da bu
ortalamaların sonuçları şeklinde sunulmuştur (35).
25
3.1.5. Sinerjizmin ve Antagonizmin Değerlendirilmesi
İki ilaç kombinasyonunun etkisi ortanca değerini prensip edinen bir kantitatif metod
olan median-efekt ile değerlendirilmiştir. Metod, Chou ve Talalay tarafından 1984
yılında türetilmiştir. Bu ortanca değeri etkili yöntem ilacın etkisi ile ilacın dozu,
sitotoksisitesi, sitotoksik etkisi arasında en basit şekilde ilişki kurulabilmesini
sağlamaktadır. Denklem ise şu şekildedir.
D:İlacın dozu, Dm:İlacın gücünü (potentliğini) gösteren ortanca etkili doz (bu değer
median-efekt grafiğinin x bölülümünden elde edilmektedir), fa: doz tarafından etkilenen
bölüm/fraksiyon, fu: doz tarafından etkilenmeyen bölüm/fraksiyon (1-fa=fu), m: doz
etkinlik eğrisinin şeklini/keskinliğini veren katsayı (bu değer median-efekt grafiğinin
eğiminden bulunmaktadır) (35)
Median efekt denklemi x yüzdesini inhibe eden ilaç dozunu hesaplamak için kullanılır.
Bu değer de Dx olarak gösterilir. CI (kombinasyon indeksi) ise şu şekilde hesaplanır:
Denklem karşılıklı özel (ilaçların aynı veya benzer şekilde etki etmesi vardır) ve
karşılıklı özel olmayan (ilaçlar birbirinden bağımsız etki eder) şekilde işletilebilir.
CaluSyn (Biosoft,Cambridge,United Kingdom) yazılımı her iki varsayımla da
hesaplama yapabilmektedir. Kombinasyon indisininin değerlendirilebilmesi için tüm
bileşenlerde karşılıklı özel varsayımı kabul edilmiştir. İlaçların sinerjistik, antagonistik,
aditif etkileri CI aralığına bağlı olarak değerlendirilmiştir. CI değerine göre
değerlendirme ise şu şekildedir:
Değer
Sonuç
CI
0.7-0.9 arasında
CI
0.7-0.9 ve 1.10-1.30 arasında Zayıf Sinerji veya Zayıf Antagonistik Etki
CI
0.7 altı ve 1.30 üzeri
Aditif Etki
Sinerjistik veya Antagonistik Etki
26
CI değerleri fa (doz tarafından değiştirilen bölüm) ile değiştiğinde ise farklı inhibisyon
konsantrasyonlarındaki ortalama CI’ lar değerlendirilmektedir. (ED50, ED75, ED90) (35)
3.1.6. İstatistiksel Analiz
Sinerjistik ve antagonistik ilaç kombinasyonlarındaki ufak değişiklikler parametrik
olmayan Mann-Whitney U testi ile SPSS yazılımı kullanılarak değerlendirilmiştir.
Çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni doğrulaması da uygulanmıştır (35).
3.2. ANTİVİRAL TEDAVİYE EK OLARAK 48 HAFTA BOYUNCA ABACAVİR
VERİLEN HASTALARIN CD4+ ve VİRAL YÜK AÇISINDAN GÖZLENMESİ
3.2.1. Çalışma Hakkında Bilgi
Antiretroviral tedavinin ana hedefi, enfeksiyonun erken evresinde viral replikasyonu
baskılayarak viral yükü azaltmak veya viral yük azaltılamıyorsa bile, en azından virüs
sayısının artışının yavaşlatılmasıdır. Bu amaç için mevcut antiretroviral tedaviye
(current antiretroviral therapy-CART) güçlü bir ajan eklenir. Bu ajan, etkin, dozu kolay
ayarlanabilir, virüsün kendisine karşı direnç kazanamayacağı ve diğer antiretroviral
ilaçlarla etkileşime girmeyecek özelliklere sahip olmalıdır.(36)
Abacavir, güçlü bir revers transkriptaz inhibitörü olan 2’ deoxyguanosine analoğuna
metabolize olur. İlacın 300 mg’ lık dozu günde iki kez olmak üzere, diyet ve
içeceklerde herhangi bir kısıtlama yapılmadan kullanılır. ABC’ nin tek başına ve ZDV
ile kombinasyonu halinde 12 hafta boyunca kullanıldığı hastalarda, plazma HIV-1
RNA’ sının 1.7-2.2 log10 kopya/ml düzeyinde azaldığı görülmüştür. ABC+3TC+ZDV
kombinasyonunda RT mutasyonlarının oluşumu azalmış ve 16 haftalık tedaviden sonra
sadece M184 mutasyonu gözlenmiştir. Tekli mutasyonlar, virüsün ABC’ ye karşı
duyarlılığında çok az bir düşüş yapmaktadır. Özellikle, sadece M184 mutasyonuna
sahip virüslere karşı ABC’ nin etkinliği devam etmektedir (36).
Çalışmada antiretroviral tedaviye devam eden hastalar kullanılmıştır ve bu hastalarda
ABC’ nin etkinliği araştırılmıştır. Buna ek olarak bu hastalardan 3TC kullanmış
olanlarda M184 mutasyonuna uğramış virüsler bulunabileceğinden, ABC’ nin etkisi bu
grupta özellikle değerlendirilmiştir. 3TC kullanan hastalarda ABC’ nin etkinliğinin
araştırılması ayrı bir öneme sahiptir. Daha önceden yapılmış 16 haftalık çalışmalarda
ABC, belirgin bir antiretroviral etki göstermiştir; ancak 16 haftalık süre tedavinin
27
sürekliliği açısından yeterli bir süre değildir. Bu sebepten ötürü çalışma 48 hafta olarak
ayarlanmış ve sonuçları araştırılmıştır.(36)
3.2.2. Çalışma Grubu ve Deneyin Tasarımı
Bağımsız bir kurul olan the Comite Consultatif pour la Protection desPersonnes dans la
Recherche Biomedicale çalışmayı değerlendirmiş, onaylamış ve çalışma protokolünü ve
yasal düzenlemeleri ayarlamıştır. Çalışma iyi klinik uygulamalara uygun olacak şekilde
yürütülmüştür (36).
HIV-1 enfeksiyonlu erkek ve kadın hastalar 10 Avrupa ülkesinin 32 farklı bölgesinden
seçilmiştir. Hastaların tamamı 18 yaşın üzerindedir ve çalışmaya kendi rızalarıyla
katılmayı kabul ettiklerini resmi olarak beyan etmişlerdir. Hastaların tamamının CD4+
hücre sayısı 100 hücre/L’ nin üzerindedir ve hastalıkları süresince CD4+ sayıları bu
değerin altına hiçbir zaman düşmemiştir. Hastaların HIV-1 RNA konsantrasyonları ise
değişmeyen düzeyde 400 kopya/ml ile 50.000 kopya/ml arasındadır. Tüm hastalar daha
önceden antiretroviral tedavi almıştır. NRTI, NNRTI ve proteaz inhibitörlerinden oluşan
kombinasyon tedavilerini ise 36 haftadan daha az kullanmışlardır. HIV-1 RNA
konsantrasyonlarının sabit olması kombinasyon tedavisinde en azından 12 haftalık bir
süre boyunca değişim yapılmadığını da göstermektedir. Uzmanlar, ancak 16 haftalık bir
süreden sonra kombinasyon tedavisinden yarar görüleceğini düşünmektedirler.
Hastalar, merkezi rastgele dağıtıma göre dağıtılmış ve mevcut tedavilerine günlük
300mg x 2 şeklinde ABC veya aynı dozda plasebo eklenmiştir. Hastalar mevcut NRTI
tedavilerinin uzunluğuna bağlı olarak, 3-9 ay boyunca tedavi alanlar, 9 aydan fazla
tedavi almış olanlar, 18 aydan az alanlar, 18 aydan fazla alanlar ve 36 aydan az alanlar
şeklinde ve ayrıca 3TC kullanıp kullanmadıklarına göre bölümlere ayrılmışlardır. Her
bir hasta 48 hafta boyunca randomize tedavi almıştır. 8. haftada ve sonraki her 8 haftada
bir ise tedavide değişimler yapılmıştır. 8. hafta için değişim kriteri plazma HIV-1 RNA
değerinde taban değerine göre 0.5 log10 kopya/ml yükseliş veya plazma HIV-1 RNA
düzeyinin 50.000 kopya/ml olmasıdır. 16. hafta ve sonraki her 8 hafta için değişim
kriteri ise birbirine bağlı iki plazma HIV-1 RNA değerinin arasındaki farkın 400
kopya/ml’ den daha az olmasıdır. Çalışmada yapılan değişim gibi AIDS tanımlayan
Kategori C (centers for disease control category c/CDC C)’ ye göre de her zaman bir
değişim kriteri göz önünde bulundurulmalıdır. Tedavi sırasında konulan değişim kriteri
ile karşılaşılırsa, ABC ve/veya kombine tedavi bileşenleri gözden geçirilerek ilaç
28
bileşenlerinde tedavi standardına göre ayarlama yapılır. Değişim kriterini karşılamış
olan ve ABC kullanmayı seçen hastalar için plasebo ABC verilmesi kesilmemiştir ve
tedaviye aynı düzende devam edilmiştir. Aynı şekilde değişim kriterini karşılamış ve
randomize tedaviye devam etmeyi seçenlerde ise sonraki ziyaretlerinden herhangi
birinde ABC’ ye geçme seçeneği de sunulmuştur.(36)
3.2.3. Değerlendirme
Kan örnekleri tedaviden önce ve tedavi sırasında tedaviden 3 gün önce, tedavinin 1.
gününde, tedavinin 2. ve 4. haftalarıyla her 4 haftada bir olacak şekilde alınmıştır. Kan
örneklerinde CD4+ hücresi, lenfosit hücresi, plazma HIV-1 RNA sayısı ölçümü ve
genotipik-fenotipik analizler yapılmıştır. Hastaların kliniği her ziyaret edişlerinde
advers olaylara karşı tedbirler alınmıştır (36).
3.2.4. Laboratuar Metotları
3.2.4.1. Viral Yük
HIV-1 RNA ölçümleri merkezi bir laboratuarda Roche Amplicor HIV-1 Monitor
testiyle yapılmıştır. (v1.0, standart, saptama limiti 400 kopya/ml) Amplicor HIV-1 ile
400 kopya/ml değerinin altında bulunan plazma HIV-1 RNA örnekleri, Amplicor HIV-1
Ultrasensitive Monitor (v1.5, saptama limiti 50 kopya/ml) ile tekrar analiz edilmiştir.
(Roche, Basel, Switzerland)(36)
3.2.4.2. Taban Genotipik ve Fenotipik Analizleri
HIV-1 RT kodlayan bölge dış primer çifti A35/NE1 ve iç primer çifti comb2/comb3 ile
açığa çıkarılmıştır. Sıralama reaksiyonları, PRISM siklus boyama kitinde (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) yürütülmüş, ABI 377 DNA ayırıcısında ise analizi
yapılmıştır. 1 L’ lik kümeli PCR ürünü ise kitte, şablon olarak kullanılmıştır. Çıktı
bölüm verisi factura içerisine aktarılmış ve Dizi Navigator ile programlanmıştır.
Genotipik değişimler NRTI ve NNRTI’ nin fenotipik direnciyle ilişkili kodonlarda
araştırılmıştır. ddI, ddC, d4T, ZDV, 3TC ve ABC’ nin fenotipik direnç deneyleri Virco
NV, Belçika tarafından rekombinant virüs deneyi kullanılarak yürütülmüştür. Fenotip,
doğal virüsle karşılaştırıldığında direnç sonucu ilacın IC50’ sindeki birkaç katlık artışla
ifade edilmektedir (36).
3.2.4.3. Verilerin Analizi
Yaklaşık olarak 200 hasta, ABC+CART ve sadece CART olarak iki tedavi koluna
bölünecek şekilde kayıt altına alınmıştır. Birebir randomizasyon ile tedavi grupları
arasındaki farklar % 90 duyarlılık ve % 5 belirginlik ile saptanmıştır (36).
29
Veri, tedavi edilmekte (ITT-intent to treat) ve tedavi edilmiş (AT-as treated) olarak iki
gruba ayrılmıştır. Etkinlik analizi için asıl grup ITT (değişim=başarısızlık) grubudur;
çünkü bu veri grubu tedaviyle ilişkili tüm randomize hastaların verilerini barındırmakla
beraber, hastaların daha önceden almış oldukları tedavi rejimini ve çalışma parçalarının
en son sonuçlarını yok saymaktadır. Randomoize edilmiş ancak çalışma sonlanmadan
çalışmadan çıkan, tedavi rejimi değiştiren veya kayıp verilere sahip hastalar tedavi
başarısızlığı olarak değerlendirilmiştir. ‘Değişim hesaba katılmış ITT’ isimli analiz,
tabandan ve CD4+ hücre sayısından ötürü HIV-1 RNA değişimi için ek olarak
yapılmıştır. Bu analizde tedavisini değiştiren hastalar tedavi başarısızlığı olarak
değerlendirilmemiştir. Onun yerine plazma HIV-1 RNA değerleri başarı veya başarızlık
açısından ölçüt alınmıştır. AT analizlerinde ise sadece randomize tedaviye devam eden
hastalar yer almaktadır. Randomize çalışmayla belirlenen tedavinin en azından bir
dozunu alan hastalar ise güvenlik analizlerine dahil edilmiştir (36).
30
4-BULGULAR
4. 1. NRTI’ LARIN SİNERJİSTİKLİĞİNİN VE ANTAGONİSTİKLİĞİNİN IN
VITRO
ORTAMDA
IC50
DEĞERLERİYLE
BERABER
DEĞERLENDİRİLMESİ
4.1.1. Kombinasyonların Sinerjizm ve Antagonizm Açısından Araştırılması
ZDV, ddI, d4T, 3TC, ABC duyarlılık analizlerinde her bir ilaç tek başına ve
kombinasyonları halinde VSV zarflı pNL4.3-luc R-E- viral klonu ile incelenmiştir. İlaç
kombinasyonları
klinik
olarak
da
tedavide
kombine
halde
kullanılan
kombinasyonlardan seçilmiştir. ZDV+d4T, 3TC+ABC, 3TC+ddI, 3TC+d4T, d4T+ddI,
ZDV+3TC, ABC+ddI, ZDV+ddI ABC+d4T kombinasyoları deneyde kullanılmıştır.
Lusiferaz enzimi aktivitesinden elde edilen ölçümler bilgisayar programına (CaluSyn)
aktarılmış ve NRTI kombinasyonlarının etkileri hesaplanmıştır. İlaçların tek başına
kullanımlarında istenilen inhibisyonu elde etmek için gereken miktarları ile ilgili veriler
ise Tablo-2’ de gösterilmiştir (35).
Tablo-2 Nrti’ lerin tek başlarına IC50, m, r değerleri (35)
ZDV
d4T
ddI
3TC
ABC
Ortalama IC50 (M) 0.009
0.135
0.902
0.045
0.559
M
0.714
0.809
0.941
0.892
0.950
R
0.956
0.951
0.967
0.963
0.948
IC50: Viral replikasyonun %50’ sini inhibe etmek için gereken konsantrasyon, m: Doz etkinlik eğrisinin
sigmoidisite indeksi, r:Linear koreleasyon katsayısı (r değerinin 0.9’ dan büyük olması testteki
doğruluğun yüksek olduğunu gösterir)
Sinerjist, antagonist, aditif etkilere ulaşmamızı sağlayan CI değerleri de daha önceden
anlatıldığı gibi hesaplanmıştır.
Kullanılan tüm konsantrasyonlardaki (ED50, ED75, ED90, ED:efektif doz) sinerjistik
etki şu kombinasyonlarda gözlenmiştir. d4T+ddI, ZDV+3TC, ABC+d4T (Sinerjistik
CI:0.7’ den küçük). Bu kombinasyonların CI değeri 0.7’ den küçüktür. Kullanılan tüm
inhibitör konsantrasyonlarda antagonistik etki ise şu kombinasyonlarda gözlenmiştir.
3TC+ddI, ABC+ddI (Antagonistik CI:1.30’ dan büyük). Bu kombinasyonların CI
değeri 1.30’ dan büyüktür. Aynı şekilde ED50 konsantrasyonunda CI değeri 1.30’ dan
büyük çıkan ZDV+ddI, 3TC+ABC, 3TC+d4T; kombinasyonlarında da antagonistik
etki
görülmüştür;
ancak
ZDV+ddI,
3TC+ABC
kombinasyonlarının
ED90
konsantrasyonunda zayıf antagonistik etki; 3TC+d4T kombinasyonunda ise aditif etki
görülmüştür. ZDV+d4T’ de ise ED50’ de sinerjistik, ED75’ de aditif, ED90’ da ise
antagonistik etki görülmüştür. Değerler Şekil-5’ te gösterilmiştir. Aynı değerlerin
(ED50,90 için) tablo haline getirilmiş hali de Tablo-3’ te verilmiştir (35).
Şekil-5 ED50 ve ED90 değerleri için CI değerleri tablosu (35)
y ekseni CI değerlerini x ekseni kombinasyonları göstermektedir. Grafkikteki beyaz sınır
sinerjistik etkiyi (CI 0.9-1.1), Açık gri sınır zayıf sinerjiyi (CI 0.7-0.9) ve zayıf
antagonistikliği (1.10-1.30), koyu gri kısım antagonistikliği (CI 0.7’ den küçük ve 1.3’ ten
büyük) temsil etmektedir.
Bazı klinik çalışmalarda ddI, ABC, 3TC ilaçlarının farklı kombinasyonları kullanılmış;
ancak beklenmedik bir şekilde virüse karşı tedavi tamamen başarısız olmuştur. Deneyde
bu ilaçların bir arada olduğu kombinasyonlarda da antagonistik etki aynı şekilde
32
gözlenmiştir. Klinik anlamda daha iyi sonuçlar alabilmek adına ikili kombinasyonların
istatistiksel çalışması da hazırlanmıştır. İstatistiksel çalışmada 3TC+ddI, ABC+ddI,
3TC+ABC
kombinasyonları kullanılmıştır. ED50 ve ED90 konsantrasyonlarında
3TC+ddI kombinasyonunda anlamlı bir farklılık elde edilmiştir. (Mann Whitney
testinde p değeri 0.0166’ dan küçüktü) ABC+ddI, ABC+3TC kombinasyonlarında ise
sinerjistik kombinasyonlarla karşılaştırıldığında anlamlı bir farklılık görülmemiştir. (p
değeri 0.0166’ dan büyüktü) (35)
Tablo-3 ED50,75,90 konsantrasyonlarında ilaç kombinasyonlarının Chou-Talalay metoduyla
değerlendirilmesi (35)
Kombinasyon
ED50(M)
SD50
ED75(M)
SD75
ED90(M)
SD90
ZDV+3TC
0.58
0.17
0.45
0.14
0.34
0.13
ZDV+d4T
0.63
0.22
1.07
0.38
1.96
0.80
d4T+ddI
0.67
0.17
0.66
0.11
0.69
0.17
ABC+d4T
0.87
0.08
0.82
0.07
0.66
0.09
ABC+ddI
1.30
0.09
1.32
0.36
1.33
0.33
3TC+d4T
1.47
0.33
1.19
0.24
1.01
0.30
ZDV+ddI
1.49
0.48
1.33
0.44
1.16
0.31
3TC+ABC
1.49
0.19
1.33
0.09
1.28
0.09
3TC+ddI
1.64
0.38
1.48
0.18
1.55
0.23
1.30’ dan büyük değerler antagonizmayı, 1.10-1.30 arasındaki değerler aditif etkiyi, 0.7-0.9 arası değerler
zayıf sinerjiyi, 0.7’ den küçük değerler sinerjiyi göstermektedir. SD:standart sapmayı göstermektedir. Her
kombinasyon 3 ile 6 kez denemiş ve bu deneyler de üçlü verilerle araştırılmıştır.
4.2. ANTİVİRAL TEDAVİYE EK OLARAK 48 HAFTA BOYUNCA ABACAVİR
VERİLEN HASTALARIN CD4+ VE VİRAL YÜK AÇISINDAN GÖZLENMESİ
4.2.1. Çalışma Grubu
Çalışmaya toplam 185 hasta kaydedilmiştir. 92 tanesi ABC+CART gurubunda, 93
tanesi ise CART grubundadır. Taban ortanca plazma HIV-1 RNA konsantrasyonları ve
CD4+ hücre sayısı her iki grup için de benzerdir. Bu değerler Tablo-4’ te gösterilmiştir.
ABC+CART grubunda CART grubuna göre CDC C sınıflamasına uyan hasta sayısı
daha fazladır. Genel olarak 101 hastanın (%55) plazma HIV-1 RNA sayısı 5000
kopya/ml değerinden daha düşüktür. Mevcut NRTI tedavisi alan hastalarda tedavi
aldıkları süreler neredeyse aynıdır ve genel olarak 143/185 (%77) hasta en az 9 aylık
NRTI tedavisi görmüştür. Gruplar arasında 3TC kullanımı da benzerdir. Her iki grupta
33
da 67’ şer hasta daha önceden 3TC kullanmıştır. 3TC açısından oran CART % 72,
CART+ABC %73’ tür. Hastaların tamamında en yaygın olarak kullanılan CART
bileşenlerinin yüzdesi ise 3TC (%71), ZDV (%66), d4T (%35), ddI (%20), ddC (%11),
saquinavir (%11), indinavir (%7) ve nevirapine (%2) şeklindedir. Diğer tüm
antiretroviral ilaçlar %1’ den daha az oranda kullanılmıştır. Hastaların hiçbiri CART’ ta
tekli ilaç tedavisi kullanmamıştır. En çok kullanılan CART kombinasyonları ise
3TC+ZDV (%36), ZDV+ddI (%10), d4T+3TC (%19) iken üçlü kombinasyon ise %21’
dir. Diğer tüm kombinasyonlar %10’ dan daha az oranda kullanılmıştır. Çalışmaya
girmeden önce birden fazla CART almış olan hastalar vardır. Çalışma sırasında 170
hasta (%92) birden çok tedavi almıştır (36).
Tablo-4 Grupların Genel Ortanca Değerleri (36)
ABC + CART
CART
Ortanca HIV-1 RNA değeri ve
dağılımı (log10 kopya/ml)
3.66, (2.60 - 4.51)
3.52, (2.60 - 4.85)
Ortanca CD4 hücre sayısı ve
dağılımı kopya/L
408, (125 - 1228)
411, (139 - 109)
CDC Kategori C ve % n
67, (%73)
67, (%72)
3 ile 9 ay arası
20, (%22)
22, (%24)
9 ile 18 ay arası
67, (%73)
64, (%69)
18 ile 36 ay arası
2, (%5)
7, (%8)
CART, n (%)
ABC: Abacavir, CART: Current antiretroviral therapy, CDC: Centers for disease control and prevention
3TC: lamivudine
4.2.2. Hasta Sonuçları
Genel olarak ABC+CART grubundaki 48/92 (%52) hasta ve CART grubundaki 14/93
(%15) hasta 48 haftalık randomize tedaviyi tamamlamıştır. Toplamda 47/185 (%25)
hasta çalışmaya devam edememiştir. Bu 47 hastadan 25 tanesi advers reaksiyonlardan
dolayı çalışmadan çıkarılmıştır. 25 hastanın ise 13 tanesi ABC+CART grubundan, 12
tanesi ise CART grubundandır. 48 haftalık çalışma süresince ABC+CART grubundan
11 (%12), ABC grubundan ise 34 (%37) hasta olmak üzere toplam 45 hasta ABC’ ye
geçmiştir (36).
34
4.2.3. Plazma HIV-1 RNA Yanıtı
48 haftanın sonunda ITT verilerine bakıldığında, ABC+CART grubunda (23/92-%25),
CART grubuna göre (5/93-%5) plazma HIV-1 RNA sayısı 400 kopya/ml düzeyinden
daha az olan hasta sayısı daha fazladır. AT verilerine bakıldığında ise ABC+CART
grubunda 19/36 (%53), CART grubunda ise 5/12 (%42) hastada plazma HIV-1 RNA
sayısı 400 kopya/ml’ den daha azdır. Yine çalışma sonu ITT verilerine göre
ABC+CART grubundan 12/92 (%13) hastanın plazma HIV-1 RNA sayısı 50 kopya/ml’
den daha az bulunurken, CART grubunda ise bu değer 0’ dır. AT verilerinde plazma
HIV-1 RNA düzeyleri karşılaştırılamayacak kadar küçük çıkmıştır. 48. haftada plazma
HIV-1 RNA değeri 400 kopya/ml değerinin altında olan hastalar ile ilgili bilgi Tablo-5’
te verilmiştir (36).
Tablo-5 48. hafta sonunda plazma HIV-1 RNA değerleri 400 kopya/ml altında olan hastalar (36)
ABC + CART
CART
ITT (değişim dahil)
n = 92
n = 93
Tüm hastalar, 3TC kullanmamış
6/25, (%24)
1/26, (%4)
Tüm hastalar, 3TC kullanmış
17/67, (%25)
4/67, (%6)
Tüm hastalar, 3 ile 9 ay boyunca
3TC kullanmış olanlar
4/20, (%20)
0/22
Tüm hastalar, 9 ile 18 ay boyunca
3TC kullanmış olanlar
19/67, (%28)
3/64, (%5)
Tüm hastalar, 18 ile 36 ay boyunca
3TC kullanmış olanlar
0/5
2/7, (%29)
Toplam
23/92, (%25)
5/93, (%5)
Tedavi edilmiş
n = 36
n = 42
Toplam
19/36, (%53)
5/12, (%42)
48. hafta sonunda plazma HIV-1 RNA değeri 400 kopya/ml altında olan hastaların çalışmaya ve 3TC
kullanım süresine göre gruplandırılması
Mevcut CART’ a ABC eklenmesi plazma HIV-1 RNA düzeyinde hızlı bir düşüşe sebep
olmuştur. Bu düşüş ile ilgili grafik Şekil-6 ‘ta gösterilmiştir. Plazma HIV-1 RNA
konsantrasyonları CART grubunda 20. haftaya kadar sabit kalmıştır. CART’ ın 16.
hafta ve sonrasındaki ilaç değişimleri sonucunda plazma HIV-1 RNA konsantrasyonları
35
ABC+CART grubundakine benzer şekilde düşmeye başlamıştır. 48. hafta sonunda
ABC+CART grubunda ortanca plazma HIV-1 RNA değeri taban değerinden 1.06 log10
kopya/ml kadar CART grubunda (ITT, değişimli dahil) ise 0.92 log10 kopya/ml kadar
düşüş göstermiştir (36).
CART
ABC+CART
Şekil-6 Plazma HIV-1 RNA değerlerinin haftaya göre değişimi
Simgesi plasebo ABC’ ye ek olarak CART’ a devam etmiş hastalardır.
Simgesi günde iki kez 300mg. ABC’ ye ek olarak CART’ a devam etmiş hastalardır.
4.2.4. 3TC Kullanımının Viral Cevaba Etkisi
ITT verilerine göre 3TC kullanmış ve kullanmamış hastalarda ABC’ nin etkisi
benzerdir. 48. hafta sonunda ABC+CART grubunda 3TC kullanmış hastalardan 17/67
(%25)’ sinde ve CART grubunda 3TC kullanmış hastalardan 4/67 (%6)’ sında plazma
HIV-1 RNA değeri 400 kopya/ml düzeyinden daha az olarak gözlenmiştir. 3TC
kullanmamış hastalarda da benzer sonuç elde edilmiştir. ABC+CART grubunda 3TC
kullanmamış hastaların 6/25 (%24)’ ünde ve CART grubunda 3TC kullanmamış
hastaların 1/26 (%4)’ ünde plazma HIV-1 RNA değeri 400 kopya/ml’ nin altında
gözlenmiştir (36).
36
AT verilerine göre ise anlamlı bir karşılaştırma yapılamamıştır; çünkü ABC+CART
grubunda sadece 4, CART grubunda ise 8 tane 3TC kullanmamış hasta bulunmaktadır.
4.2.5. Daha Önceden Alınmış Olan Tedavinin Süresinin Etkisi
18 aya kadar NRTI tedavisi almış olanlarda çalışmanın 48. Haftasında, ABC+CART
grubunda, CART grubuna göre plazma HIV-1 RNA değeri 400 kopya/ml düzeyinden
daha az olan hasta sayısı daha fazladır. Genel olarak değerler, ABC+CART grubunda
23/87 (%26), CART grubunda 3/86 (%3) hasta olarak gözlenmiştir. 18 aydan 36 aya
kadar NRTI kullanmış hasta sayısı az olduğundan 18-36 ay grubu için karşılaştırma
yapılamamıştır (36).
4.2.6. Taban Plazma HIV-1 RNA Değerinin Viral Cevaba Etkisi
Plazma HIV-1 RNA değeri düşük olan hastalarda (5000 kopya/ml’ den az), plazma
HIV-1 RNA değeri yüksek olanlardakine göre (5000 kopya/ml’ den fazla) ABC’ nin
etkinliği daha iyidir. ABC+CART grubundan düşük plazma HIV-1 RNA değerine sahip
19/46 (%41) hastada ve yüksek değerli 4/44 (%9) hastada 48. hafta sonunda plazma
viral yükü 400 kopya/ml düzeyinin altına düşmüştür (36).
4.2.7. CD4+ Hücre Sayısı Cevabı
Taban ortanca CD4+ hücre sayısı ABC+CART grubunda 408 iken CART grubunda bu
değer 411’ dir. 48. hafta sonunda ise CD4+ hücre sayısındaki değişim, ABC+CART
grubu için +102 hücre/L (aralık -88, +442), CART grubu için +57 hücre/L (-269,
+402) şeklinde olmuştur. (ITT, değişim dahil)
AT verilerinde ise taban değerleri aynı iken 48. hafta sonunda ABC+CART grubu için
değişim +111 (-36, 442) ve CART grubu için +34 (-140, 153) şeklindedir (36).
4.2.8. Viroloji Sonuçları
Tabanda ABC+CART grubunda 69 hastadan ve CART grubunda 74 hastadan HIV-1
RT dizisinin düzgün bir şekilde incelenebileceği örnekler alınabilmiştir. Fenotipik
sonuçlar gösteren hasta sayıları ise ABC+CART için 42, CART için 44’ tür (36).
4.2.9. Taban Genotipinin Viral Cevaba Etkisi
RT direncine sebep olan mutasyon gösteren örneklerin dağılımı geniştir. Bilgi Tablo-6’
da gösterilmiştir. ABC+CART grubundan 49/69 (%71) hastada, CART grubundan
51/74 (%69) hastada mutasyonlar gözlenmiştir. En çok görülen mutasyon tipi M184’
37
tür. ABC+CART grubundan 25/69 (%36) hastada ve CART grubunda 31/74 (%42)
hastada M184 mutasyonu görülmüştür. İkinci en çok görülen mutasyon tipi timidin
analoğu mutasyonlarıdır. (TAM-M41L, D67N, K70R, L120W, T215Y/F, K219Q/N/E)
ABC’ nin invivo ve invitro çalışmalarında M184 dışında diğer mutasyonlar
seçilmemiştir. (K65R, L74V, Y115F) (36)
Tablo-6 Hastaların 3TC’ ye Göre Genotip Değerlendirmesi (36)
ABC + CART (n = 69)
RT
mutasyonları
3TC
kullanmamış
(n = 19)
CART (n=74)
3TC
kullanan
3TC
kullanmamış
3TC
kullanan
(n = 50)
(n = 20)
(n = 54)
Normal Virüs
1
0
4
1
Sadece M184’ lü
0
25
0
31
≤2 TAM
9
0
7
3
≥3 TAM
8
1
6
0
≤2 TAM+
0
18
1
16
0
6
0
3
1
0
2
0
0
1
1
5
M184V/I
≥3 TAM+
M184V/I
Çoklu İlaç
Direnci
(151M, 62V, 75I,
77L, 116Y)
NNRTI
mutasyonları
3TC kullanmış ve kullanmamış hastalardan alınan örnekler arasında genotipik açıdan
belirgin farklılıklar vardır. 3TC kullanmamış hastalarda TAM’ ler 3TC kullanmışlara
göre daha fazla gözlenmiştir. (3TC’siz 17/19-%89, 3TC’ li 25/50-%50) CART
grubundan çoğu hasta 16. Haftada ABC seçeneğini seçmiştir. Bundan dolayı taban
genotipleri antiviral cevapla bu seferliğine ilişkilendirilememiştir. 16. haftada
ABC+CART grubu hastalarında sadece M184 mutasyonu görülen hastalarda (16/25,
%64) plazma HIV-1 RNA değeri 400 kopya/ml altındadır ve bu değerdeki düşüş 1 log10
kopya/ml değerinden daha fazladır. Sadece ABC kullanan 19/25 (%76) hastada plazma
38
viral yükü yine 400 kopya/ml’ den daha az ve değerdeki düşüş 0.5 log10 kopya/ml’ den
daha fazladır. M184 ile beraber 2 TAM veya sadece 2 TAM geçirmiş virüslere sahip
hastalarda düşüş 0.5 log10 kopya/ml’ den daha fazladır (36).
4.2.10. Fenotipik Bulgular
Hastaların tamamında ABC’ ye karşı duyarlı olan virüsler izole edilmiştir. ABC+CART
grubundan 8 hastada (%19) ve CART grubundan 6 hastada (%14) orta derecede ABC
direnci mevcuttu. Bu hastalardaki virüs için ABC’ nin IC50 değeri normal virüs için olan
değerinden 4 ile 8 katlık bir artış göstermiştir. Yüksek düzeyde direnç gösteren virüsler
ise ABC+CART grubunda görülmezken, CART grubunda 2 hastada (%5) görülmüştür.
Bu hastalarda ise ABC’ nin IC50 değeri 8 kattan daha fazla arttırılmalıdır. 3TC’ ye karşı
oluşan genel fenotipik direnç, izolatların %70’ inde görülmüştür ve bu direncin ABC’
ye karşı çapraz direnç oluşmasına sebep olmadığı tespit edilmiştir. Bu saptama
hastalardaki virüslerin ABC’ ye karşı duyarlılığının iyi olmasıyla da uyumludur.
Normalde de tek başına M184V mutasyonuna sahip olan virüsler invivo ve invitro
ortamda ABC’ ye karşı duyarlılıklarını sürdürmektedirler. Esas olarak ABC+CART
grubundan alınan örneklerde ZDV’ ye karşı %33 ve 3TC’ ye karşı %12’ lik bir direnç
mevcuttur. ZDV ve 3TC ilaçlarının IC50 değerleri 4 kattan daha fazla artmıştır. Aynı
durum CART grubunda ZDV’ ye karşı %41, 3TC’ ye karşı %9 düzeyindedir (36,42).
4.2.11. Advers Olaylar
Advers reaksiyonlar 16 haftadan sonra bile pek belirgin olmamıştır; çünkü hastalar
protokollerin tanımladığı gibi ilaç değişimi yapmıştır. Randomize olmayan dönemde
görülen en önemli advers olaylar yorgunluk, ishal, bulantı ve huzursuzluktur. İlaca bağlı
advers olaylar hastaların %5‘ i kadarında görülmüştür. Randomize tedavi döneminde ise
mide bulantısı ABC+CART grubunda ortalama 21 gün ( dağılım 2-246), CART
grubunda 33 gün (dağılım 2-57) görülmüştür. Bulantılar genel olarak hafif-orta
düzeydedir. ABC+CART’ tan 18 hastada (%20), CART’ tan 11 hastada (%12) ciddi
advers olaylar meydana gelmiştir. Bu hastalardan ABC+CART grubundan üç ve CART
grubundan bir hasta bu advers olaylardan dolayı çalışmayı bırakmak zorunda kalmıştır.
ABC kullanmış 155 hastanın 4’ ünde ABC ile ilişkili hipersensitivite reaksiyonu
görülmüştür. Bu 4 vakanın 3’ ü randomize tedavi alırken, 1 tanesi ise ABC’ ye geçiş
yaptığında oluşmuştur. Genel olarak ABC ile ilişkili hipersensitivite reaksiyonu
39
görülme sıklığı % 2.2’ dir. 4 vakanın durumu ABC tedavisi kesildikten sonra
düzelmiştir. Yan etkiler ile ilgili bilgi Tablo-7’ de gösterilmiştir (36).
Tablo-7 Gruplara göre yan etki bilgisi (36)
Randomize Dönem
ABC+ART n(%)
ART n(%)
Randomize
Olmayan Dönem
Tüm hastalar n (%)
n = 91
n = 93
n = 100
Bulantı
17 (19)
6 (6)
6 (6)
Lipit metabolizması
9 (10)
7 (8)
5 (5)
İshal
9 (10)
5 (5)
9 (9)
Huzursuzluk, yorgunluk
8 (9)
5 (5)
7 (7)
Bulantı, kusma
6 (7)
1 (1)
1 (1)
Baş ağrısı
5 (5)
8 (9)
3 (3)
Advers Olay
bozukluğu
40
5-TARTIŞMA VE SONUÇ
5. 1. NRTI’ LARIN SİNERJİSTİKLİĞİNİN VE ANTAGONİSTİKLİĞİNİN IN
VITRO
ORTAMDA
IC50
DEĞERLERİYLE
BERABER
DEĞERLENDİRİLMESİ
Çoklu ilaç kombinasyonlarının analizi, HIV-1 enfeksiyonuna karşı terapötik etkiyi
artırmada önemlidir. Bu çalışmada iki NRTI arasındaki sinerjizmayı ve antagonizmayı
tanımlayabilmek için in vitro ortam oluşturulmuştur. Lusiferaz enzimi geninin viral
genoma klonlanması sonucu viral replikasyonun hızlı bir şekilde kantitatif olarak
ölçülebilmesi sağlanmaktadır. Bu da in vitro ortamın en büyük avantajıdır. Viral
replikasyonun
bu
şekilde
ölçülmesi
p24
HIV-gag
saptanması
veya
metil
tiyazoltetrazolyum deneyi gibi klasik yöntemlere göre duyarlılığı artırmaktadır ve daha
doğru bir ölçüme olanak sağlamaktadır. Üstelik veziküler stomatitis virüs zarfının
psödotiplenmesi PBMC enfeksiyonunun da klasik uygulamalara göre daha iyi olmasını
sağlamaktadır. PBMC’ lerin hedef hücre olarak kullanılması ilaçların tümör
hücrelerindeki farklı konsantrasyonlarını da ortadan kaldırmaktadır ve ilacın tek tip
konsantrasyonda
dağılımını
sağlamaktadır.
Tüm
bu
üstünlükler
sistemin
uygulanabilirliğini garantilemekte ve elde edilmiş verilerin de birbirleriyle uygunluğunu
artırmaktadır. Kurulan sistemde hata oranı daha az olmaktadır. Bunların yanında
sistemin ana kısıtlayıcı özelliği ise donorlerin PBMC’ lerindeki farklılıklara ve
muhtemelen hücre içi ilaç metabolizmasındaki diğer bilinmeyen parametrelere bağlı
olarak tanımlanmamasıdır. Bu yüzden deneyler birkaç kez tekrarlanmalı ve sonuçlar
dikkatli bir şekilde değerlendirilmelidir. Çelişkilere rağmen sonuçlar tutarlı ve
araştırılan ilaç kombinasyonundaki sinerjizm, antagonizm, aditif etki çalışmaları da
birbiriyle uyumlu çıkmıştır. Bir diğer kısıtlayıcı özellik ise sonuçların alt tip B temeline
dayandırılmasıdır. Grup M’ nin tüm alttipleri ise farklı antiviral ilaç ailelerine karşı
hassastır. Bununla beraber ilaçlara karşı dirençle ilişkilendirilen virüsteki revers
transkriptaz ve proteaz pozisyonlarının polimorfizmi, belli non-clade B virüslerinde de
fazlaca görülmektedir. İlaçların hedefindeki proteinlerdeki değişimler virüsün
replikasyon kapasitesini artırdığı gibi ilaçlara karşı dirençli virüslerin sayısını da
artırabilir. Bütün bu görüşler potansiyel olarak sonuçları etkileyebilir, çünkü ilaç
direnciyle ilişkili polimorfizm farklı ilaç kombinasyonları arasında gözlenmiş sinerjiyi
azaltabilir veya in vitro ortamdaki viral replikasyon azaldığından dolayı analizlerin
yapılması güçleşebilir. Laboratuarda ilerlemekte olan çalışmada bu sorun Dünya
çapında da en yaygın olarak kullanılan lusiferaz C-kökenli klon ile azaltılmaya
çalışılmaktadır (35).
Özet olarak, burada tanımlanan sistem, farklı ilaç kombinasyonları kullanılarak
sağlanan PBMC’ lerdeki HIV replikasyonunun inhibisyonunun, 96 kuyucuklu
plakalarda 48 saat içinde değerlendirilebilmesine olanak sağlamaktadır. Aynı zamanda
sistem maliyet ve güvenlik odaklı özelliği de taşımaktadır (35).
Kurulan sistem ile farklı kombinasyonlardaki NRTI’ lar arasındaki etkileşim
incelenmiştir. Tablo-2’ de ve Şekil-5’ de gösterildiği gibi farklı örneklerdeki sinerji ve
antagonizmalar bulunmuştur. İlginçtir ki; deneyde kullanılan bazı kombinasyonlar
klinik denemelerde de antagonizm göstermiş ve tedavide başarısızlığa yol açmıştır.
Genel olarak, üç NRTI içeren kombinasyonlar iki NRTI’ ya ek olarak kullanılan bir
NNRTI veya bir proteaz inhibitörüne göre daha az etkilidir (36). Özellikle
3TC+TDF+ABC, TDF+ABC+ddI, ddI+3TC+TDF oluşan üçlü ilaç rejimleri klinikte
başarısı çok düşük olan kombinasyonlardır. ddI ve TDF NRTI’ ların yedeği olarak
düşünülse de bu iki ilacın kombinasyonlar içinde kullanımı son çalışmalarda da
görüldüğü gibi önerilmemektedir. (AIDS Study Group-GESIDA, National AIDS Plan
Expert Committee, 2007) Bu klinik çalışmalarda olduğu gibi deneyimizde de 3TC+ddI
kombinasyonunun ED50,ED75 ve ED90 değerlerinde açıkça birbirlerini antagonize ettiği
gösterilmiştir. Aynı kombinasyon ZDV+3TC kombinasyonu ile karşılaştırıldığında bu
sonucu çıkartmamızda anlamlı bir istatistiksel öneme de sahiptir. (Mann Whitney testi
ve Bonferroni koreleasyonunda, p değeri 0.0166’ dan küçüktür) ABC+ddI ve
42
ABC+3TC
kombinasyonları
ise
antagonistik
olmasına
rağmen
sinerjistik
kombinasyonlarla karşılaştırıldığında istatistiksel açıdan anlamlı bir farklılığa sahip
değildir. Çalışma sonucunda 3TC içeren kombinasyonların güvenliği ve etkinliği ddI
içeren kombinasyonlara göre daha iyidir. Antagonistik olan 3TC+ABC ve 3TC+ddI
kombinasyonlarının in vivo ortamda HAART’ ın üçüncü bir bileşeni olarak
kullanıldığında virüse karşı istenen etkiyi oluşturamadıkları gözlenmiştir; çünkü ilaçlar
birbirinin etkinliğini azaltmaktadır (39).
Tedavideki bu beklenmedik başarısızlık tam olarak açıklanamasa da bu başarısızlığın
farmakokinetik veya toksisite etkileşimleriyle ilgili olabileceği öne sürülmüştür; ancak
uzun ve kısa dönem tedavi başarısızlığında, hücre düzeyindeki farmakokinetik
etkileşimlerin de göz önünde bulundurulması gerekir (40). NRTI’ lar farklı hücresel
kinazlar tarafından metabolize edilmektedir. İlacın monofosfat formundan önce difosfat
formuna daha sonra da trifosfat formuna dönüştüğü bu fosforilasyon süreci, aktif ilacın
oluşumunda hız sınırlayıcı olabilmektedir. İlacın aktif formu oluşamayacağından
istenilen etki de görülememektedir. Bazı ilaç kombinasyonlarındaki antagonistik etki
metabolik yolaktaki hücresel fosforilasyon enzimleri için yarışmadan kaynaklanıyor
olabilir. NRTI’ lar analogluk durumlarına göre farklı hücresel kinazlarla metabolize
olmaktadırlar (35).
Diğer bir yandan, ZDV+3TC arasında antagonistik özellik gösteren kombinasyonlara
göre istatistiksel anlamda da farklılık var olduğundan sinerjik etki gözlenmiştir. Tüm bu
sonuçlar klinik anlamda tedavideki daha ileri seçeneklerin önünü açacağından kullanışlı
olabilir (35).
İlginç bir şekilde bazı kombinasyonlardaki CI değerleri kullanılan ilaç ED değerine
bağlı olarak farklılık göstermiştir. Örneğin d4T+ZDV kombinasyonunda, d4T ED50 ve
ED75 değerinde sinerjistik etki gösterirken, ED90 değerinde antagonistik etki
göstermiştir. Bu sonuçtan da anlaşıldığı gibi ilaçlar kombine edilirken konsantrasyon
dozları da göz önünde bulundurulmalıdır. Öyle ki, d4T’ nin ED90 değerini sağlayacak
dozda kombinasyonu ED75 ve ED50’ dekilerden daha az etkili bir ilaç kombinasyonun
ortaya çıkmasına sebep olacaktır. Daha az etki görülmesine ek olarak ED90 değerinde
d4T ZDV’ yi antagonize etmektedir (41). Dolayısıyla tamamen etkisiz bir
kombinasyonla da karşılaşmak mümkündür. Buradaki antagonistik etki, benzer hücresel
43
kinazları kullanarak aktifleşen ilaçların bir arada kombinasyonu sonucu, aynı enzimler
için yarışmasından kaynaklanıyor olabilir (35).
Sonuç olarak, bu çalışma ikili ilaç kombinasyonlarıyla ilgili tutarlı, tekrarlanabilir ve
ulaşılan sonuç itibariyle anlamlı bir deneydir. Çalışma antagonistik, sinerjistik ve aditif
etkinlik açısından farklı NRTI kombinasyonlarının tanımlamasını yapmaktadır. Bu
çalışmadaki gözlemler özellikle NRTI’ nın HAART’ ın üçüncü bileşeni olarak
kullanıldığında gözlenen antagonistik etkinliği ile klinik verilerle de doğrulanmaktadır
(35).
5.2. ANTİVİRAL TEDAVİYE EK OLARAK 48 HAFTA BOYUNCA ABACAVİR
VERİLEN HASTALARIN CD4+ VE VİRAL YÜK AÇISINDAN GÖZLENMESİ
Çalışmada ABC’ nin, CART almakta olan hastaların tedavi rejimine eklenmesiyle
plazma viral yükünde belirli bir düşüş oluştuğu ve 48 hafta boyunca bu düşük değerin
devam ettiği bulunmuştur. ABC+CART grubunda, CART grubuna göre plazma HIV-1
RNA sayısı 400 ve 50 kopya/ml değerinin altında olan hasta sayısı 48. hafta sonunda
daha fazladır. ABC, hastalar tarafından çalışma boyunca iyi tolere edilmiştir. Çalışma
sırasında ilaca karşı aşırı duyarlılık geliştirmiş hasta sayısı, ABC için beklenen değerde
olmuştur. Beklenen değer ise %3’ tür (36).
Önceden 3TC kullanmış hastalarda ABC duyarlılığında herhangi bir farklılık
görülmemiştir. 3TC kullanmış ve kullanmamış hastalarda da ABC’ ye yanıt benzer
düzeyde olmuştur. 3TC kullanan grupta beklenildiği gibi M184V mutasyonu taşıyan
HIV-1 saptanmıştır. Tek başına M184V mutasyonu taşımakta olan 56/143 (%39) hasta,
M184V ile diğer mutasyonları da kombine halde taşıyan 44/143 (%31) hasta mevcuttur.
Sadece M184V mutasyonu taşıyan hastalar ABC’ ye karşı iyi yanıt vermişlerdir ve
hastaların %64’ ünde (16/25) plazma HIV-1 RNA değerin 400 kopya/ml hedefi altında
seyretmiştir. Daha önceden alınmış 18 aya kadar süren NRTI içeren CART’ ın, ABC
tedavisi üzerinde etkisi olmadığı bulunmuştur; ancak 18 aydan daha uzun süren
tedavide kıyaslama yapabilmek için yeterli veri ve hasta mevcut değildir. Uzun süren
CART sonucunda, ABC’ nin etkisinin değişip değişmediği araştırılmalıdır. Plazma viral
yükü 5000 kopya/ml altında hastalarda, plazma viral yükü 5000 kopya/ml’ den fazla
olanlara göre plazma HIV-1 RNA değeri 400 kopya/ml altında olan hasta sayısı daha
fazladır. Değerler, 5000 altında 19/46 (%41), 5000 üzerinde 4/44 (%9) şeklindedir (36).
44
CART grubundaki hastalardan 16. haftada değişim kriterine uyup ABC’ ye geçenlerin
plazma HIV-1 RNA ve CD4+ hücre sayısı değerlerinde belirgin bir değişim
gözlenmiştir. Plazma HIV-1 RNA değerleri 20. haftaya kadar değişim göstermezken
aynı haftadan sonra ABC+CART grubundakiler ile aynı düzeye gelmiştir. Bu dönemde
CART grubu için CD4+ hücre sayıları viral yüke bağlı olarak yüksek seyretmiştir;
ancak 48 hafta sonundaki değerlere bakıldığında ABC+CART grubundaki hastaların
CD4+ sayıları CART grubundakilere göre daha fazla yükselmiştir. (102 hücre/L’ ye
karşılık 57 hücre/L) ABC+CART grubundaki hastaların CD4+ hücre sayıları çalışma
sonunda 500 hücre/L değerinin üzerine çıkmıştır. CART grubundaki hastaların CD4+
hücre sayıları 28. haftaya kadar taban değerlerinde seyretmiştir. Hücre sayılarının
yükselmeye başlaması ise muhtemelen hastaların ABC’ ye geçmesine bağlıdır (36).
Çalışma boyunca standart olarak iki NRTI ilaç ile ikili tedavi uygulanmıştır. Hastalar
çalışma öncesinde de genel olarak ikili tedavi almışlardır ve çoğu 3TC kullanmıştır.
Hastalardan alınan virüslerde çok çeşitli mutasyonlar olsa da çalışmanın 16. haftasına
kadar bu mutasyonlara bağlı virüs sayısında artış görülmemiştir. Bu da hastaların
çalışmaya girmeden önce sabit ve artmakta olmayan virüs sayılarına sahip olduklarını
göstermektedir. Plazma HIV-1 RNA ve CD4+ hücre sayılarındaki ani düşüş virüsün
ABC duyarlılığına bağlıdır. Öyle ki, antiretroviral tedaviyi daha önceden almış
hastalarda sadece M184V mutasyonuna veya NRTI kombinasyonlarına bağlı oluşan
diğer mutasyonlara sahip virüs taşıyanlarda ABC, antiretroviral etkisini göstermeye
devam etmiştir. M184V mutasyonunun ABC ile tedavinin etkinliğini azaltmadığı bilgisi
de daha önceden yapılmış çalışmalarla doğrulanmıştır (36,43).
Sonuç olarak mevcut tedavinin ABC ile desteklenerek etkinliğinin arttırılması sonucu
hastaların viral yükü hızlı bir düşüş göstermiş ve 48 hafta boyunca da düşük değerlerde
seyretmiştir. Bu çalışma göstermiştir ki ABC, 3TC kullanmış olup viral yükü düşük
olan hastalarda ve az NRTI mutasyonu geçirmiş virüslere karşı da tedaviyi
kuvvetlendirmek için kullanılabilir. Buna karşılık, yüksek viral yüke sahip ve fazla
mutasyonlu virüs taşıyan hastalarda ise ABC, diğer NRTI’ lar ile kombine halde tedavi
stratejisini değiştirmek amacıyla kullanılabilir (36).
45
6-KAYNAKLAR
1-Waren Levinson. Lange Tıbbi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji (8.Baskı). Çeviri: Dr. İsmail H.
Dündar, Dr. Eren Erkeni, Dr. Banu Kılıç, Dr. Hamdi R. Memişoğlu, Dr. Kadri Özcan, Dr.
Tuncay Özgünen Dr. Fügen Yarkın. Güneş Kitabevleri, Ankara 2006; ss 358-368.
2-Ayşe Willke Topçu, Güner Söyletir, Mehmet Doğanay. Enfeksiyon Hastalıkları ve
Mikrobiyolojisi. Bölüm: Virüsler ve Enfeksiyonları. Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul 2002; Cilt
II ss 1322-1339.
3- Prof.Dr. Oğuz Kayaalp.Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji (11. Baskı). Hacettepe
Taş Kitapçılık, Ankara 2005; ss 299-302.
4-Truus E.M. Abbink, Ben Berkhout. HIV-1 Reverse Transcription İnitiation: A Potential
Target for Novel Antivirals. Virus Research 2008; 134:4-18.
5-B. Macchi, A. Mastino. Pharmacological and biological aspects of basic research on
nucleoside-based reverse transcriptase inhibitors. Pharmacological Research 2002; 46,6:473482.
6-Amerikan ulusal allerjik ve bulaşıcı hastalıklar enstitüsü web sayfası (2009).
HIV replikasyonunun şekli.
[http://www3.niaid.nih.gov/topics/HIVAIDS/Understanding/Biology/hivReplicationCycle.htm]
Erişim Tarihi: 15 Aralık 2009.
7-Jonckheere H, Anné J, De Clercq Rega E. The HIV-1 reverse transcription (RT) process as
target for RT inhibitors. Med. Res. Rev. 2000; 2:129–154
8-Dünya Sağlık Örgütü Sitesi. Dünya Sağlık Örgütü Verileri/ Türkiye’nin HIV ve AIDS profili/
Sağlık Bakanlığının göndermiş olduğu veriler. (2009)
46
Erişim:[http://www.euro.who.int/aids/ctryinfo/overview/20060118_46 ], Erişim Tarihi:17
Kasım 2009.
9-Arts E.J, Stetor S.R, et al. Initiation of (-) strand dNA synthesis from tRNALys3 on lentiviral
RNAs:implications of specific HIV-1 RNA-tRNA,Lys3 interactions inhibiting primer utilization
by retroviral reverse transcriptases (retroviral replication/HIV-1 reverse transcription). Proc.
Natl. Acad. Sci 1996; 93:10063-10068.
10-Türkiye Sağlık Bakanlığı Sitesi (2010) HIV/AIDS Verileri. Erişim:
[http://www.saglik.gov.tr/TR/Genel/DosyaGoster.aspx?BELGEANAH=9412&DIL=1&DOSY
AISIM=131.htm/132.htm/133.htm], Erişim Tarihi:1 Ocak 2010.
11-Harrich D, Hooker B. Mechanistic aspects of HIV-1 reverse transcription initiation. Rev.
Med. Virol 2002; 12:31-45.
12-Karamanoğlu B. Sülfidril grubu içeren bileşiklerin Tat proteini üzerine etkileri. Yüksek
Lisans Tezi, Erciyes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Kayseri 2009; 3-17.
13-Ağaçfidan A, Akın L, Altan P. Türkiye’de cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar ve
HIV/AİDS’in sürveyans sistemine ilişkin durum analizi , T.C. Sağlık Bakanlığı Temel Sağlık
Hizmetleri Genel Müdürlüğü yayını, T.C.Sağlık Bakanlığı Ana Çocuk Sağlığı ve Aile
Planlaması Genel Müdürlüğü Türkiye Üreme Sağlığı Programı GDSHM için Dış Ulaşım
Rehberi, Ankara 2007.
14-Freund F, Boulme F,Litvak and Laura S, Tarrago Litvak S. The initiation of HIV-2 revers
transcription:a secondary structure model of the tRNA-tRNA Lys3 duplex Nucleic Acids
Research 2001; 29(13):2757-2765.
15-Hsu M, Rong L, de Rocquigny H, P. Roques B et al. The effect of mutations in the HIV-1
nucleocapsid protein on strand transfer in cell-free reverse transcription reactions nucleic acid
research 2000; 28(8):1724-1729.
16-Yusuf Özbal. HIV-1 enfeksiyon patogenezi. Erciyes Tıp Dergisi 2007; 29(3):228-234.
17-Mandal D, Dash C, J. Le Grice S F et al. Analysis of HIV-1 replication block due to
substitutions at F61 residue of reverse transcriptase reveals additional defects involving the
RNase H function. Nucleic Acids Research 2006; 34(10):2853-2863.
18-Ooms M, Cupac D, Abbink T E M, Huthoff H et al. The availability of the primer activation
signal (PAS) affects the efficiency of HIV-1 reverse transcription initiation Nucleic Acids
Research 2007; 35(5):1649-1659.
47
19-Goldschmidt V R, Ehresmann C, Ehresmann B et al. Does the HIV-1 primer activation
signal interact with tRNALys3 during the initiation of reverse transcription. Nucleic Acids
Research 2003; 31(3):850-859.
20-Michael J Otto. New nucleoside reverse transcriptase inhibitors for the treatment of HIV
infections. Current Opinion in Pharmacology 2004; 4:431-436.
21-Christine Brennan, Demetrius J. Porche. HIV immunopathogenesis. Journal of the
Association of Nurses In AIDS Care 1997; 8(4):7-22.
22-Lisa F. Rezende, Vinayaka R. Prasad. Nucleoside-analog resistance mutations in HIV-1
reverse transcriptase and their influence on polymerase fidelity and viral mutation rates. The
International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2004; 36:1716–1734.
23-Raymond F. Schinazi, Brenda I. Hernandez-Santiago, Selwyn J. Hurwitz. Pharmacology of
current and promising nucleosides for the treatment of Human İmmunodeficiency Viruses,
Antiviral Research 2006; 71:322–334.
24-Sharon J. Schultz, James J. Champoux. RNase H activity:structure, specificity, and function
in reverse transcription. Virus Research 2008; 134:86-103.
25-William Lewis. Mitochondrial dysfunction and nucleoside reverse transcriptase inhibitor
therapy:experimental clarifications and persistent clinical questions. Antiviral Research 2003;
58:189-197.
26-Tamir Dagana, Craig Sablea, June Brayb et al. Mitochondrial dysfunction and antiretroviral
nucleoside analog toxicities:what is the evidence. Mitochondrion 2002; 1:397-412.
27-Jose´ Garcı´a de la Asuncio´na, Marı´a L. del Olmob, Luis G. Go´mez Cambronero et al.
AZT induces oxidative damage to cardiac mitochondria:protective effect of vitamins C and E,
Life Sciences 2004; 76:47-56.
28-Ofelia A. Olivero. Mechanisms of genotoxicity of nucleoside reverse transcriptase inhibitors.
Environmental and MolecularMutagenesis 2007; 48:215-223.
29-Karen S. Anderson. Perspectives on the molecular mechanism of inhibition and toxicity of
nucleoside analogs that target HIV-1 reverse transcriptase. Biochimica et Biophysica Acta
2002; 1587:296-299.
30-Lisa F. Rezende, Vinayaka R. Prasad. Nucleoside-analog resistance mutations in HIV-1
reverse transcriptase and their İnfluence on polymerase fidelity and viral mutation rates. The
International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2004; 36:1716-1734.
48
31-Dünya Sağlık Örgütü. HIV/AIDS Antiretroviral Newsletter Issue Revised Version of The
First Six Issues 2002; 7:29-47.
32-Luis Men´endez-Arias. Mechanisms of resistance to nucleoside analogue inhibitors of HIV-1
reverse transcriptase. Virus Research 2008; 134:124-146.
33-C. W. Hooker, William B. LOTT, D. Harrich. Inhibitors of Human Immunodeficiency Virus
Type 1 reverse transcriptase target distinct phases of early reverse transcription. Journal of
Virology 2001; 75(7):3095-3104.
34-Gareth J. Veal, Sudhir Agrawal, Randal A. Byrn. Synergistic inhibition of HIV-1 by an
antisense oligonucleotide and nucleoside analog reverse transcriptase inhibitors. Antiviral
Research 1998; 38:63-73.
35-M. Perez, Olmeda, J. Garcia, Perez, E. Mateos et al. Invitro analysis of synergism and
antagonism of different nucleoside/nucleotide analogue combinations on the inhibition of
human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of Medical Virology 2009;
81:211-216.
36-C. Katlama, B. Clotet, A. Plettenberg et al. Intensification of stable background therapy with
abacavir in antiretroviral therapy experienced patients:48-week data from a randomized, doubleblind trial. HIV Medicine 2001; 2:27-34.
37-W. S. Pear, G.P. Nolan, M. L. Scott, D. Baltimore. Production of high-titer helper-free
retroviruses by transient transfection. Cell Biology 1993; 90:8392-8396.
38- J. Garcia-Perez, S. Sanchez-Palomino, M. Perez-Olmeda, B. Fernandez, J. Alcami. A new
strategy based on recombinant viruses as a tool for assessing drug susceptibility of human
immunodeficiency virus type 1. Journal of Medical Virology 2007; 79:127–137.
39- Joel E. Gallant,1 Allan E. Rodriguez,2 Winkler G. Weinberg. Early Virologic Nonresponse
to Tenofovir, Abacavir, and Lamivudine in HIV-Infected Antiretroviral-Naive Subjects. The
Journal of Infectious Diseases 2005; 192:1921–1930.
40-P. Barreiro, T. García, T.Benayas et al. Combinations of nucleoside/nucleotide analogues for
HIV therapy. AIDS Reviews 2004; 6:234-243.
41- P. G. Hoggard, S. Kewn, M. G. Barry et al. Effects of drugs on 29,39-Dideoxy-29,39
didehydrothymidine phosphorylation in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1997;
41-6:1231-1236.
42-Tisdale M, Alnadaf T, Cousens D. Combination of mutations in human immunodeficiency
virus type 1 reverse transcriptase required for resistance to the carbocyclic nucleoside 1592u89.
Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1094-1098.
49
43-Descamps D, Flandre P, Calvez V et al. Mechanisms of virologic failure in previously
untreated HIV-infected patients from a trial of induction-maintenance therapy. JAMA 2000;
283: 205-211.
50
ÖZGEÇMİŞ
1987 yılında Hatay’ da doğdum. 1992 yılında Kayseri’ de ikamet etmeye başladım.
İlköğretimimi Kayseri’ deki Ahmet Paşa İlköğretim Okulu ve 50. Yıl Dedeman
İlköğretim okulunda tamamladım. Lise eğitimime ise Kayseri’ deki Nuh Mehmet
Baldöktü Anadolu Lisesi’ nde devam ettim. 2005 yılında liseden mezun olduktan sonra
Erciyes Üniversitesi Mustafa Kılıçer Eczacılık Fakültesi’ ne kaydımı yaptırdım. 2010
yılı itibariyle Eczacılık Fakültesi’ nin beşinci sınıfında öğrenimime devam etmekteyim.
51