gıda biyoteknolojisi-2

3/6/2016
• Protein sentezi
GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ-3
1
2
Genetik bilgi akışının moleküler
işlemleri 3 basamağa ayrılır
Genler ve genetik kod
Gen: DNA’nın genetik bilgiyi taşıyan bölümleri. Bütün genler DNA’dan oluşur.
1 replikasyon
• Bir gendeki bilgileri A,G,T,C bazlarının sıralanışı belirler.
2) Transkripsiyon (kopyalama): DNA bir ara molekül
olan RNA aracılığıyla protein sentezinde rol
oynar. Bilgilerin RNA’ya dönüşümüne
transkripsiyon denir. Bir veya birden fazla
polipeptiti şifreleyen RNA molekülüne de Elçi
(mesajcı) RNA (mRNA) denir.
• DNA’da bulunan bilgiler RNA’ya taşınır ve RNA aracılığı ile proteinlere
dönüştürülür
Moleküler biyolojinin
santral dogması
• Bazı genler Transfer RNA (tRNA) ve ribozomal
RNA (rRNA) sentezi için gerekli bilgileri içerirler.
Bunlar protein sentezinde rol oynarlar ancak,
protein yapacak genetik bilgileri kodlamazlar.
• DNA, RNA ve proteinlerin 3’ü de genetik bilgi içerdiğinden bilgi
makromolekülleri olarak isimlendirilirler.
3
3) Translasyon (tercüme): mRNA’daki bilgiyi kalıp
olarak kullanarak protein sentezleme
• Bir polipeptit zincirindeki amino asitlerin sırası, mRNA’daki bazların
özel dizilişi tarafından tanımlanır.
• Bir polipeptitin amino asit sırası ile bir genin baz sırası arasında
doğrusal bir ilişki vardır.
Translasyon işlemi mRNA ile
olduğundan, genetik kod DNA
olarak değilde mRNA olarak yazılır
• bir mRNA molekülü üzerindeki her 3 baz bir amino asidi kodlar .
Amino asitleri kodlayan bu 3’lü bazlara Kodon denir.
mRNA’nın muhtemel 64 kodonu
bulunmaktadır.
4
Ancak bunlardan 61’i a.a’leri
kodlamaktadır. 3 kodon a.a
kodlamaz. Bunlar stop kodonudur.
• Her bir kodon özel bir aminoasidi kodlar
Genetik kodun en ilginç özelliği bir amino
asidin farklı kodonlar tarafından
kodlanmasıdır.
• Genetik kod protein kodlayan sistemle proteine dönüştürülür. Bu
sistem ribozomlar (protein ve rRNA’dan oluşur), tRNA ve çeşitli
enzimlerden oluşur.
Herhangi bir yerdeki aminoasit bilindiğinde
bu yerdeki kodonun otomatik olarak
bilinmesi sözkonusu değildir.
5
Diğer yandan DNA dizisini ve doğru
okuma zincirini bilerek proteindeki
aminoasit belirlenebilir
6
1
3/6/2016
PROTEİN SENTEZİ
• Canlı bir hücrede pek çok metabolik olay ve reaksiyon proteinler
tarafından yürütülür
• Proteinler yapısal eleman olarak da önem taşırlar
Kan plazma proteinleri
Hormonlar
Antikorlar
Enzimler
Kloroplast
Mitokondri
Hücre duvarı ve proteinde yer alan proteinler vb yapısal ve işlevsel
protein gruplarıdır
• Bu durum DNA dizisinden aminoasit dizisini
belirlemeye müsaade eder ve genetik devrin
kalbini oluşturur.
7
Protein sentezi
8
Protein sentezinde temel olarak iki proses vardır
1)Transkripsiyon: DNA sarmalındaki iki komplementer polinükleotit zincirinden
asıl kodlayıcı kolun dizisinin yeniden oluşmasına transkripsiyon (kopyalama)
denir.
• Protein sentezi çok karmaşık bir olay olmakla birlikte çok hızlı
gerçekleşir. Örn E.coli ribozomlarında 100 amino asitlik bir
polipeptit zinciri 5 sn’de sentezlenir.
Transkripsiyon ile 3 tip RNA oluşur.
• Genç bir hücre içinde 5.000-50.000 arasında bulunan
ribozomlarda aynı anda yüzlerce, binlerce proteinin
sentezlenmesi söz konusudur.
• mRNA kodlayıcı DNA zincirinin bir reoksi kopyasıdır. Protein sentezi için
gerekli bilgiyi ribozomlara taşır.
• Hücrede bulunan proteinlerin ne zaman ve hangi miktarda
sentezleneceği diğer moleküller tarafından kontrol altında
tutulduğundan bu karmaşık olaya temel komponentler yanında
yüzlerce molekül ve faktör katılmaktadır
• tRNA ve rRNA ise protein sentezinin ikinci prosesi olan translasyon
(tercüme) olayında mRNA’nın da katılımıyla görev yapar.
2) Translasyon: Transkripsiyonla oluşan RNA’lar kullanılarak protein sentezi
gerçekleştirilir.
9
1) Transkripsiyon : RNA sentezi
DNA ve RNA yapısında 3 anahtar fark vardır
• RNA deoksiriboz yerine riboz içerir
• RNA timin yerine Urasil bazı içerir
• RNA tek zincirlidir
• DNA’yı etkileyen enzimler RNA’yı etkilemez
• RNA’yı etkileyen enzimler de DNA’yı etkilemez
• Hem timin hem de urasil adeninle eşleşebildiklerinden,
bu değişiklik baz eşleşmesini etkilemez
11
10
•
Genetik bilgilerin DNA’dan RNA’ya
transkripsiyonu, RNA polimeraz enzimi
tarafından gerçekleştirilir.
•
DNA’da olduğu gibi RNA polimeraz da
fosfodiester bağlarının oluşumunu katalizler
•
RNA polimeraz bir kalıp olarak DNA ihtiyaç
duyar.
•
RNA’nın öncüleri ise ATP, GTP, UTP ve CTP
ribonükleotit trifosfatlardır.
•
Zincirin uzaması sırasında daha önce
yerleşmiş olan nükleotitin 3’-OH’ına
ribonükleotit trifosfat ilave edilir ve enerjice
zengin iki fosfat bağının ayrılmasıyla
nükleotitler polimerize olur. Açığa çıkan
enerji reaksiyonun yürütülmesinde kullanılır
12
2
3/6/2016
RNA polimerazlar
• RNA polimerazın DNA kalıbı çift zincirli bir DNA molekülüdür.
• DNA sentezinde olduğu
gibi RNA sentezinde de
zincir uzaması 5’-3’
yönünde gerçekleşir ve
kalıp yeni sentezlenen
zincire antiparaleldir.
• Herhangi bir gen için iki zincirden sadece bir tanesi transkriptlenir.
Bununla beraber genler, DNA’nın her iki zincirinde de olabildiklerinden
transkripsiyon işlemi farklı zamanlarda her iki zincirde de gerçekleşebilir.
•
Bütün organizmalarda RNA polimerazlar için bu prensipler geçerlidir.
Prokaryotlar ve ökaryotlar arasında önemli farklılıklar vardır.
 Prokaryotlarda tek tip RNA polimeraz vardır
 Ökaryotlarda ise her biri farklı tip genlerin transkripsiyonunda yer alan 3
RNA polimeraz (l,ll,lll) vardır.
• DNA polimerazın aksine
RNA polimeraz, primer
gereksinim duymaz.
13
14
•
Bakteriyel RNA polimeraz yapısal olarak en basit olanı ve en detaylı bilinenidir.
Promotorlar
•
E.coli’nin enzimi β, β’,α, σ (sigma) olmak üzere 4 farklı alt üniteye (polipeptit zinciri)
sahiptir.
• RNA sentezinin doğru bir şekilde başlayabilmesi için önce RNA
polimerazın DNA üzerinde bulunan uygun bölgeleri tanıması
gerekmektedir. Bu bölgelere promotor denir.
•
Alt üniteler birbirleriyle etkileşerek RNA polimeraz haloenzimi olarak isimlendirilen
aktif enzimi oluşturur.
•
Ancak σ faktör diğerleri gibi güçlü bağlanmaz kolayca yapıdan ayrılarak RNA
polimeraz kor enzim (α,β,β’) olarak isimlendirilen enzimin oluşmasına neden olur.
Sigmanın rolü RNA sentezinin
başlaması için DNA üzerindeki
uygun bölgenin tanınmasını
sağlamaktır.
15
• Poromotor RNA sentezinin başladığı bölgeden 35 baz çifti yukarıda
bulunur ve bu nokta -35 pozisyonu olarak isimlendirilir. promotor dizisi
transkribe edilmez.
• Promotorun enzim tarafından tanınması, enzimin promotora bağlanması,
DNA’nın transkripsiyon için çözülmesi ve RNA sentezinin başlaması
promotorun içerdiği iki spesifik dizi (konsensus dizileri) ile sağlanır. Bunlar:
 5’-TTGACA-3’ transkripsiyonun başlangıcına göre -35 pozisyonunda
bulunur
 5’-TATAAT-3’ -10 pozisyonunda bulunur (TATA kutusu veya Pribnow box
denir)
17
16
• E. Coli’de tespit
edilen diğer -35
promotor dizileri
• Bu dizilerin hepsi
sigma tarafından
tanınır
18
3
3/6/2016
Transkripsiyonun
sonlanması
•
Protein sentezinin güvenilirliği bakımından
transkripsiyonun başlangıcı gibi
sonlanması (terminasyon) da oldukça
önemlidir. Çeşitli şekillerde transkripsiyon
sonlanabilmektedir:
Rho bağımlı terminasyon
• Bu tip sonladırıcılar, özel
protein faktörlere ihtiyaç
duyarlar.
• E.coli’deki transkripsiyon
sonlandırıcılardan biri
Rho adında bir proteine
ihtiyaç duyar.
RNA sentezinin sonlaması DNA üzerindeki özel
baz dizilerinde meydana gelir.
• Prokaryotlarda çoğunlukla merkez kısmı
tekrar etmeyen ters yönlü bir tekrar
dizisinden oluşan yaklaşık 40 bazlık bir
terminasyon dizisi vardır.
•
Böyle bir dizi transkriptlendiği zaman RNA
zincir içi baz eşleşmesiyle saç tokası
şeklinde çift zincirli yapı oluşturur.
•
Böyle bir dizi üridinlerle devam ettiği
zaman transkripsiyon sonlanır. mRNA,
RNA polimerazdan ayrılır
19
20
2) Translasyon
Elçi, Ribozamal ve transfer RNA’ların ömrü
• Çoğu genler (mRNA) proteinleri kodlar. Fakat bazıları da rRNA
ve tRNA gibi protein sentezinde görev alan RNA’ları kodlar.
• Transkripsiyonla mRNA’ya aktarılan genetik bilginin
proteinlere dönüştürülmesi
• Prokaryotlarda çoğu mRNA’lar kısa ömürlüdür (birkaç dak gibi).
Bu süre sonunda hücresel ribonükleazlar tarafından parçalanır.
• Translasyonun her biri değişik moleküllere ve faktörlere
gereksinim duyan 5 evresi bulunur
a) aminoasitlerin aktivasyonu
b) polipeptit sentezinin başlaması
c) Polipeptit zincirinin uzaması
d) polipeptit sentezinin sonlanması
e) polipeptit zincirinde modifikasyon
• tRNA ve rRNA’lar kararlıdır. Kararlılık bu RNA’ların ribonüklezlar
tarafından aşırı derecede katlanmış yapılar oluşturmalarından
kaynaklanır
• mRNA’lar katlanmış yapılar oluşturmaz
21
22
•
Ribozomlar hücre yapıları içinde en
karmaşık ve anlaşılması en zor
organellerden biridir.
•
• mRNA üzerindeki 3’lü baz dizilerinin belli bir düzene göre okunduğu
ve aminoasit diline çevrildiği yer ribozomlardır. O nedenle
ribozomlar tercüme bürolarına benzetilir.
Temel olarak RNA ve proteinlerden oluşan
ribozomlar oldukça ayrıntılı
düzenlenmişlerdir.
•
• Ribozomların translasyon için seçicilikleri yoktur , hangi genetik bilgi
gelirse onun çevirisini yaparlar.
Ribozomal proteinlerin oranları hem çok
yüksektir (%60) hem de çeşitleri çok
fazladır.
Ribozomlar
•
Prokaryotlarda 52, ökaryotlarda ise en az
82 farklı protein bulunmaktadır.
• Ribozomlara bilgiyi getiren mRNA üzerinde bulunan ve herbiri bir
aminoasidi belirleyen kodonlar ile doğru aminoasitler arasındaki
ilişkiyi kuran adaptör moleküller ise tRNA’lardır.
•
Prokaryotik ve ökaryatik ribozomlarının
büyüklük ve sayıları farklı olmakla birlikte
temel yapıları benzemektedir.
• Kısaca kodonlar ile aminoasitlerin doğru buluşmalarını ribozomlar
sağlar.
•
Her iki tip bir büyük bir de küçük alt birim
içermektedir.
23
24
4
3/6/2016
• Ökaryotlarda 80S, prokaryotlarda ise 70S ribozomlar
tanımlanmıştır
PROKARYOTLAR (70 S ribozom)
ÖKARYOTLAR (80S ribozom)
Büyük alt birim
(50S)
Küçük alt birim
(30S)
Büyük alt birim
(60S)
Küçük alt birim
(40S)
23S rRNA (2904
nükleotit)
+ 31 protein
16S rRNA (1541
nükleotit)
+ 21 protein
28S rRNA (4718
nükleotit) + 49
protein
18S rRNA (184
nükloetit)
+ 33 protein
5S rRNA (120
nükleotit)
Transfer RNA
• Sedimantasyon katsayıları 4 S’tir
• Hücrede bulunan en küçük
nükleik asitlerdir (73-93
nükleotit).
• Molekülün %50-70’lik bölümü
bazlar arası hidrojen köprüleri
kurarak çift zincirler
oluşturmaktadır.
5.8S rRNA (120
nükleotit)
• Prokaryotlarda yaklaşık 60,
ökaryotik hücrelerde 100-110
farklı tRNA bulunmaktadır.
S: Svedberg unitesi
(10-13 sn
25
26
• tRNA’lar, RNA’da normal olarak bulunan bazların
kimyasal olarak değişimi sonucu oluşmuş
nispeten farklı pürin ve pirimidinler de içerirler
(psödoüridin, inozin, dehidroürüdin, ribotimidin,
metil guanozin, metil inozin)
• Translasyonda doğru aminoasitleri
ribozomlara getirmekle görevli tRNA’lar farklı
aminoasitleri taşır.
• Her aminoasit (a.a) için en az bir tRNA
molekülü görev yapar.
• Bazı a.a’ler için iki,üç veya dört tRNA bulunur.
tRNA’nın görünümü yonca yaprağı şeklindedir. 4
kısma ayrılır:
•
•
•
•
Antikodon halka
Alıcı uç
TψC halkası
D halkası
27
• Bütün tRNA’ların 3’ ucunda (alıcı uç) üç eşleşmeyen nükleotit
bulunur.
28
• tRNA’nın antikodon bölgesinde mRNA daki kodon ile eşleşen
bazlar vardır. Bunlara antikodon denir.
• Bu nükleotitler daima CCA’dir.
• Amino asit tRNA üzerindeki bu adeninin riboz şekerine bir ester
bağı ile kovalent bağlanır. (aa’in COOH grubu ile ribozun OH
grubu bağlanır)
• Antikodon halkasında 3 nükleotit mevcuttur, baz eşleşmesiyle
özel olarak kodonu tanır. tRNA’nın en değişken bölgelerinden
biri bu bölgedir.
• tRNA’nın diğer kısımları , ribozomla (hem rRNA hem
proteinlerle) ribozomal olmayan translasyon proteinleriyle
ilişkiye girer ve sentetaz enzimini harekete geçirir.
29
30
5
3/6/2016
a) Aminoasitlerin aktivasyonu
• aminoaçil tRNA sentetazlar a.a’i
ATP reaksiyona sokarak aa’i
aktifleştirir
• tRNA’ların doğru a.a’lerle eşleşmesi enzimler (aminoaçil
transferazlar=aminoaçil tRNA sentetazlar) sayesinde olur
• aminoaçil tRNA sentetazlar ilgili aminoasit ve o aminoasit için
özel tRNA’yı tanırlar.
•
• Oluşan amino açil-AMP uygun tRNA
molekülü ile etkileşime girene kadar
enzime bağlı kalır
Amnino asit + ATP
aminoaçil-AMP + P-P
• Aktifleşen aminoasit tRNA’ya
transfer edilir
aaminoaçil-AMP + tRNA
Aminoaçil TRNA + AMP
31
• Bazı amino asitler için tRNA
üzerindeki tanıma bölgeleri
32
b) Translasyonun başlaması (initiasyon)
• Translasyon daima metiyonin (AUG) ile başlar. Bu
prokaryotlarda formil metiyonindir.
• Başlangıç kodonu AUG’dir.
• Prokaryotlarda proteinin sentezinin başlaması daima
serbest bir 30S ribozom alt ünitesiyle olur.
• 30S ribozom alt ünitesi, formil metiyonin tRNA ve IF1,
IF2, IF3 adında çok sayıda başlama proteinleri, bir
başlama kompleksi oluşturur.
33
• Formil grubunun metiyonine eklenmesi metiyonil tRNA formil transferaz
tarafından katalizlenir.
• Proteinin ilk molekülü olan metiyonin bu formil grubu sayesinde
ribozum 50S büyük alt birimi üzerinde bulunan peptidil bölge
olarak bilinen spesifik bölgeye tutunmayı garantiler.
• Bu modifikasyon metiyonin transfer RNA’ya eklendikten sonra gerçekleşir.
•
34
• Ayrıca formil grubu molekülün peptitil zincirine metiyonin gibi
eklenmesini önler.
Fmet metiyoninle aynı kodon tarafından kodlanır (AUG). Fakat başlangıçta
metiyonin yerine fmet kullanılır.
• AUG metiyoni tanımlayan tek kodondur
• tRNA başlangıç kodonuna bağlandıktan sonra formil grubu
uzaklaştırılır. Böylece ilk aa metiyonin olur.
• Protein sentezi tamamlandıktan sonra genellikle metiyonin,
protein üzerinden uzaklaştırılır (metiyonin aminopeptidaz
tarafından).
35
36
6
3/6/2016
• Bu dizinin komplementeri olan 3’-UCCUCCA-5’ dizisi 16S sRNA üzerindedir
ve translasyonun başlayabilmesi için mRNA ve 16S rRNA bu bölgeden
birbirlerine bağlanırlar.
Shine Dalgarno dizisi
• mRNA’da başlangıç kodonu olan AUG’den 5-8 baz dizisi
öncesinde pürince zengin bazlardan oluşan Shine-Dalgarno
dizisi vardır.
• Böylece translasyonu başlatacak olan AUG başlangıç kodonu doğru
noktadan yerini almış olur.
• Ribozom Shine –Dalgarno bölgesine bağlandıktan sonra bir mesaj
içerisindeki her başlangıç noktasını bulabilir.
• 5’-AGGAGGU-3’
• Bu dizinin translasyonu yapılmaz.
• Bu dizi ile translasyonun doğru yerde, doğru noktadan
başlaması sağlanır.
37
38
c) Zincirin uzaması (elongasyon)
• mRNA ribozom üzerinde özellikle
30 S alt üniteye bağlanır.
• Zincirin uzamasında EF-Tu, EF-Ts ve EF-G
olarak adlandırılan uzama faktörlerine
gereksinim duyulur.
• tRNA’lar 50S alt ünitesinde iki
bölge ile etkileşirler
• A-bölgesi: Alıcı bölge
• P-bölgesi: peptit bölgesi: fmettRNA’nın bağlandığı yer
• Bir aminoaçil tRNA’nın A bölgesine taşınması
ve tutunması EF-Tu adındaki zincir uzama
faktörü tarafından yapılır.
• A-bölgesi: yeni yüklü tRNA’nın ilk
tutunduğu yerdir. İkinci kodona
denk gelen tRNA
• Bunun için bir GTP molekülüne ihtiyaç vardır
39
40
• Ribozomda yanyana TRNA’lara bağlı durumda bulunan bu iki aminoasidin peptit
bağını peptidil transferaz (23 S bölgesinin bir komponentidir) enzimi katalize
eder.
• Enzim tRNA’ya bağlı birinci aa’in ester bağını kırarak, ikinci aa’in amino grubu
arasında pepti bağını oluşturur.
41
• Yüksüz tRNA önce ribozomun üzerinde bulunan çıkış bölgesine
hareket eder. Daha sonra ribozomu terk ederek başka
translasyonları başlatmak üzere hazırlanır
42
7
3/6/2016
Translokasyon
•
Zincir uzaması ve yeni bir tRNA eklenebilmesi için peptiti tutan tRNA A bölgesinden
P bölgesine taşınmak (Translokasyon) zorundadır. Böylece yeni yüklü tRNA için Abölgesi açılmış olur.
•
Translokasyon için EF-G faktörü ve GTP molekülüne ihtiyaç vardır.
•
Translokasyon işleminde ribozomlar hareket eder (mRNA hareket etmez)
•
Her taşınma basamağında ribozom 3 nükleotit ilerleyerek A bölgesi üzerindeki yeni
bir kodonla eşleşir.
43
• Tek bir mRNA molekülü, birbirini takip eden çok sayıda ribozom
tarafından polizom denilen bir kompleks oluşturarak translasyona
uğrayabilir.
• Polizomlar translasyonun hızını ve verimliliğini arttırır.
• Her bir ribozomun aktivitesi, komşusu olan diğer ribozomdan
bağımsızdır.
• Böylece bir polizom kompleksindeki her bir ribozom birbirinden
bağımsız tam polipeptitleri yapar.
44
c) Sentezin sonlanması (terminasyon)
• Protein sentezinin terminasyonu, ribozom
bir anlamsız (stop) kodona geldiği zaman
gerçekleşir.
• Stop kodonlar : UAA, UAG, UGA
• Hiçbir tRNA stop kodonlarına bağlanmaz.
• Salınma faktörü adında özel bir protein (RF
faktörü) zincir sonlama işaretini tanır ve
polipeptiti uçtaki tRNA’dan keserek oluşan
ürünü salar.
• Daha sonra ribozom alt ünitelere ayrılır.
45
46
8