DNA`nın İzolasyonu ve Analizi
advertisement
DNA Genetik bilgiyi taşıyan çift sarmal moleküldür. 5C’lu şeker, fosfat ve bazları içeren nükleotidlerden oluşur. Doğadaki canlıların tümüne yakın kısmında genetik materyal DNA’dır. DNA hücre içerisinde, *Çekirdek, *Mitokondri ve *Kloroplastlarda bulunmaktadır. İnsan genomik DNA’sı 3x 109 nukleotid uzunluğundadır. Genomik DNA bütün nükleusu bulunan hücrelerde bulunur ve bu hücreler genomik DNA analizleri için kullanılabilir. Örneğin; prenatal tanı için amniyotik sıvıdaki fetal hücrelerden veya koryonik hücrelerde genomik DNA elde edilebilir. Erişkinlerde periferal kandaki lökositler en kolay ulaşılabilen DNA kaynağıdır. EDTA’lı tüplere alınan 10 ml kan yaklaşık olarak 108 beyaz kan hücresi içerir ve bu miktar hücreden elde edilecek genomik DNA pek çok genetik test için yeterlidir. DNA’nın Özellikleri, Negatif yüklüdür, Suda çözünebilir, Alkolde çözünmez. DNA İZOLASYON YÖNTEMLERİNDE BİRBİRİNİ İZLEYEN ÜÇ TEMEL AŞAMA BULUNMAKTADIR: 1- Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması, 2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi, 3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması, ***DNA’nın analizi Denatürasyon: Çift zincirli DNA molekülü yüksek pH veya yüksek sıcaklık etkisinde bırakıldığında sarmal yapısında çözünmeler meydana gelir. Renatürasyon: Koşullar tekrar normal duruma getirildiğinde iki iplik sarmal yapıyı oluşturmak üzere birleşir.Yani denatürasyon geri dönüşümlüdür. DNA saflaştırma metotlarının belirlenmesinde kromozom DNA’sı ve kromozom dışı DNA’lar olmak üzere iki ana grup temel almıştır. Kromozom ve plazmide DNA’ların saflaştırılmasında birbirinden ayrılmasında DNA’ların moleküler yapısı oldukça önemlidir. ●Kromozom DNA’sının izolasyonu *Bakterilerden kromozom (genom) DNA’sı izolasyonu, *Mayalardan kromozom DNA’sı izolasyonu, *Memelilerden kromozom DNA’sı izolasyonu, *Bitkilerden kromozom DNA’sı izolasyonu ●Kromozom dışı DNA’nın izolasyonu *Plazmid DNA’sı izolasyonu *Organel DNA’sı izolasyonu DNA’nın Analizi Nükleik asitlerin nanogram veya mikrogram düzeyindeki miktarlarının belirlenmesinde absorbsiyon temeline dayanan spektrofotometrik yöntemler kullanılır Ayrıca nükleik asitlerin doğrudan görüntülenmesinde özgün dizilerde kesim yapan restriksiyon endonükleaz enzimlerinin etkisi sonucu oluşan farklı boyutlardaki DNA parçalarının saptanmasında elektroforetik yöntemler kullanılır. 1ml EDTA’lı kan+4ml hücre parçalama çözeltisi 15dk 0ºC inkübasyon 3000xg’de 10dk santrifüj Çökelti+4ml parçalama çözeltisi 3000xg’de 10dk santrifüj Çökelti+1ml çekirdek parçalayıcı çözeltisi+ 25μl %10 SDS+15 μl proteinaz K(20mg/ml)+ 200 μl dH2O 37ºC gece boyu inkübasyon 1ml dH2O + 5ml 5M NaCl 10000xg 20dk santrifüj Üst sıvı + 2 hacim soğuk etanol eklenir DNA pipet ucuyla alınır, 300μl dH2O içerisinde çözülür. Hücre Parçalama Çözeltisi 155 mM NH4Cl 10 mM KHCO3 0.1 mM EDTA Çekirdek Parçalama Çözeltisi (pH: 8.2) 10 mM Tris-HCl 400 mM NaCl 2 mM EDTA SDS: %10 gr/ml stok olarak hazırlandı. Proteinaz K: 20 mg/ml stok olarak hazırlandı. TE Çözeltisi 10 Mm Tris-Cl pH:7,4 0,1 mM EDTA Bileşim Miktar İçerik Proteinaz K 31,25 mg Proteinaz K B1 solüsyonu 55 ml Guanidin HCl/tween solüsyonu B2 solüsyonu 55 ml %100 etanol B3 solüsyonu 137.5 ml Etanol/guanidin HCl solüsyonu B4 solüsyonu 160 ml Etanol, tris, NaCl B5 solüsyonu 55 ml 10 mM tris-HCl *Enzimler(RNase) RNA’yı yok etmek için, *Enzimler (Proteases) DNA molekülüne bağlı olarak bulunan proteinleri yok etmek için, *İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin çöktürülmesinde, *Amonyum sülfat ve sodyum sülfat:Proteinlerin çöktürülmesinde, *Etil asetat, Toluen, SDS membran yapısını bozmada, ***İzole edilen DNA +4°C’da uzun süre saklanabilir.
