AMİNO ASİTLER, PEPTİTLER ve PROTEİNLER

AMİNO ASİTLER, PEPTİTLER ve PROTEİNLER
Proteinler tüm hücrelerde ve hücrelerinde tüm bölümlerinde en çok bulunan
biyolojik makro moleküllerdir. Proteinler tek bir hücrede bile binlerce farklı
çeşitte ve büyüklüğü ufak peptidlerden, milyonlarca molekül ağırlıkta büyük
polimerlere değişebilen çeşitlilikte bulunur. Ayrıca proteinler biyolojik
işlevlerde aşırı çeşitlilik gösterir. Proteinler genetik bilginin ifadelendiği
moleküler araçlardır. Yunanca pro tos, anlam olarak ‘ilk’ veya ‘baştaki’
kelimesinden türemiştir.
Tüm proteinler, en eski çağlardaki bakterilerden veya en kompleks
canlılardan olsun, var olan aynı 20 amino asidin karakteristik doğrusal diziler
halinde kovalent olarak bağlanmasıyla oluşur. Bu amino asitlerin yan
zincirlerinin belirleyici kimyasal özelliklerinden dolayı bu 20 öncü molekül
protein yapısının yazıldığı dilin alfabesi olarak sayılabilir.
Farklı organizmalar bu yapısal parçalardan enzimler, hormonlar, antikorlar,
taşıyıcılar, kas, gözün lens proteini, tüyler, örümcek ağları, gergedan boynuzu,
süt proteinleri, antibiyotikler, mantar zehirleri ve diğer sayısız farklı biyolojik
aktiviteye sahip ürünler yapabilmektedir. Bu protein ürünlerinden enzimler, çok
çeşit ve özelliktedir. Hemen hemen tüm hücresel tepkimeler, enzimler tarafından
katalizlenir.
Amino Asitler
Proteinler amino asitlerin dehidrate (su kaybetmiş) polimerleridir, her bir
amino asit kalıntısı yanındakine özel bir tip kovalent bağ ile bağlanmaktadır.
(‘kalıntı’ terimi; bir amino asidin diğeriyle bağlanırken su kaybetmesini
yansıtır.) Proteinler çok çeşitli yöntemlerle yapısal amino asitlerine yıkılabilir
(hidrolizlenebilir). İlk olarak 1806’da asparajin keşfedilmiştir. Bulunan 20
amino asitten sonuncusu olan treonin 1938’e kadar tanımlanamamıştır.
1
Amino Asitler Ortak yapısal Özellikler Taşır
Proteinlerde bulunan 20 standart amino asidin hepsi de α-amino asittir.
Pratikte karşılaştırılabilecek şekilde, amino asit yapısındaki karbonlar iki
sistemle tanımlanır. R grubundaki ilave her bir karbon α-karbondan uzaklaştıkça
β,γ,δ,ε ve devam ederek adlandırılır. Diğer organik moleküllerin çoğunda
karbon atomları bir uçtan basitçe numaralandırılır, atom numarası en yüksek
atomları içeren karbona öncelik tanınır.
Bu son sisteme göre amino asidin karboksil grubu C-1, α karbonu ise C-2
olur.
Glisin dışındaki standart aminoasitlerde α karbon atomu 4 farklı grupla bağ
yapar: karboksil grubu, amino grubu, R grubu ve hidrojen atomu α-karbon
atomu bir kiral merkez’dir.
Kiral merkeze sahip tüm moleküller optikçe aktif’ tir, yani düzlemsel
polarize ışığı çevirirler.
Asimetrik karbon atomunun dört bağlantısının mutlak(bağıl) şekli için özel
bir bilimsel sınıflandırma geliştirilmiştir. Amino asitler ve basit şekerlerin
mutlak şekli için 1891 yılında Emil Fischer tarafından önerilen ve 3 karbonlu
şeker gliseraldehidin örnek alındığı D,L sistemiyle tanımlanmıştır.
2
Tüm kiral bileşikler için stereoizomerler, L-gliseraldehitle konfigürasyon
benzerliği olanlar L ve D-gliseraldehitle benzerliği olan stereoizomerler de D
olarak isimlendirilir. L-alaninin karboksil grubu, L-gliseraldehidin kiral
karbonunun yanındaki aldehit grubuyla (bu grup oksitlenince karboksil grubuna
dönüşecektir) aynı pozisyonda yer almaktadır. Tarihsel olarak benzer şekildeki
l ve d adlandırmaları levorotator (ışığı sola çeviren) ve dekstrarotator (ışığı
sağa çeviren) olarak kullanılırdı. Ancak L - aminoasitlerin hepsi levorotator
değildir ve sisteme mutlak şekildeki belirsizliklerden kaçınmak için gereksinilir.
Fischer’in sistemiyle L ve D, yalnızca kiral karbona bağlı dört grubun mutlak
şeklini belirtir.
Bir diğer sistem, RS sistemidir. Bu sistemde birden fazla sayıda kiral
merkeze sahip moleküllerin tam konfigürasyonları tanımlanmış ve organik
kimyanın sistematik bilimsel sınıflandırılması kullanılmıştır.
Protein Amino Asit Kalıntıları L Stereoizomerlerdir
Kiral merkezi olan biyolojik bileşiklerin hemen hemen hepsi, doğada D veya
L şeklinde tek bir stereoizomerik formda bulunur.
Çarpıcıdır ki, proteinlerdeki tüm amino asit kalıntıları L- stereoizomerlerdir.
D ve L izomerlerinin rasemik karışımı meydana gelir. Ancak canlı bir sistemde,
sağ ve sol el gibi, D ve L izomerleri de birbirinden ayrıdır. Hücreler özellikle
amino asitlerin L- izomerlerini sentezleyebilir, çünkü enzimlerin aktif bölgeleri
asimetriktir ve katalizledikleri tepkimelerin stereoözgüllüğüne neden olur.
Amino Asitler R Gruplarına Göre Sınıflandırılırlar
Amino asitler R gruplarının özelliklerine göre, özellikle polariteleri veya
biyolojik pH’da (yaklaşık ph 7.0) suyla tepkimeye girme eylemlerine göre 5 ana
sınıfta gruplandırılır. R gruplarının polaritesi, tamamen polar olmayan veya
hidrofobik (suda çözünmez)’likten, yüksek oranda polar veya hidrofilik (soda
çözünür)’liğe kadar çok çeşitlidir. 20 standart amino asidin yapıları aşağıda
görülmekte,
3
4
bir takım özellikleri Tablo da sıralanmaktadır. Her sınıfın kendi içinde polarite,
büyüklük ve R gruplarının şekli yönünden derecelendirmeler vardır.
5
Polar Olmayan Alifatik R grupları:
Bu amino asidin sınıfındaki R grupları polar olmayan ve
hidrofobiktir.Proteinlerde alanin,valin,lösin,izolösinin yan grupları bir araya
gelip kümeleşerek hidrofobik etkileşimlerle protein yapısını sabitler. Sülfür
içeren iki amino asitten biri olan metiyonin ise yan zincirde polar olmayan
tiyoeter grubu içerir.
Aromatik R grupları:
Aromatik yan zincirli fenilalanin, tirozin ve triptofan göreceli polar
olmayan (hidrofobik)lardır. Hepsi hidrofobik etkileşimlere katılabilir. Tirozinin
hidroksil grubu hidrojen bağı yapabilir. Tirozin hidroksil grubundan, triptofan
da indol halkasındaki azottan dolayı, fenilalanine göre daha polardır. Triptofan
ve tirozin bir dereceye kadarda fenilalaninin, ultraviyole ışığı absorblar.
Bu, 280 nm dalga boyunda birçok proteinin ışığı karakteristik
absorblamasını açıklar, bu özellik proteinlerin tanımlanmasında araştırmacılara
yardımcı olur.
6
Polar, Yüksüz R Grupları:
Serin, treonin, sistein, prolin,asparajin ve glutamini kapsar. Serin ve
treonin hidroksil gruplarıyla; sistein sülfidril grubuyla asparajin ve glutamin ise
amit gruplarıyla ılımlı polariteye katkıda bulunurlar. Asparajin ve glutamin,
proteinlerde bulunan diğer amino asitlerden aspartat ve glutamatın amitleridir.
Sistin iki sistein molekülünün veya kalıntısının disülfit bağıyla bağlanmış
halidir.
Bu disülfit- bağlı kalıntı kuvvetli hidrofobiktir (polar olmayan). Disülfit
bağları protein molekülünün bölümleri arasında veya farklı protein zincirleri
arasında kovalent bağ yaparak birçok proteinin yapısı için özel bir rol oynar.
Pozitif Yüklü (Bazik) R Grupları:
Hidrofilik R gruplarının çoğu pozitif veya negatif yüklüdür. Alifatik zincirin
ε pozisyonunda ikinci birincil amino grubuna sahip lizin, pozitif yüklü guanidin
grubuna sahip arjinin ve imidazol grubu içeren histidin pH 7,0’de pozitif yüklü
R- grubu içeren amino asitlerdir.
Histidin nötrale yakın pKa değerine sahip iyonize olabilen yan zincir içeren
tek standart amino asittir.Birçok enzim katalizli tepkimede, His kalıntısı proton
alıcısı/vericisi olarak tepkimeyi kolaylaştırır.
Negatif Yüklü (Asidik) R Grupları:
İkinci karboksil grubuna sahip aspartat ve glutamat, pH 7.0’ de net negatif
yüke sahip R grubu içeren iki amino asittir.
7
Standart Dışı Amino Asitler de önemli İşlevlere Sahiptir
Standart dışı amino asitlerden 4-hidroksiprolin prolinin, 5- hidroksilizin de
lizinin türevidir.
4- hidroksiprolin bitki hücre duvarı proteinlerinde ve her ikisi de bağ dokunun
fibröz proteini olan kollagende bulunurlar. 6-N- Metillizin kas dokusunun
kontraktil proteini olan miyozininin bir yapısal elamanıdır. Diğer önemli
8
standart dışı amino asit γ-karboksiglutamattır. Ve pıhtılaşma proteinlerinde
protrombinde ve biyolojik işlevi Ca+2 bağlamak olan diğer bazı proteinlerde
bulunur.
Selenosistein özel bir yapıdır. Protein sentezi sonrası modifikasyonla değil,
sentez sırasında oluşur. Sisteinin sülfürür yerine selenyum içerir. Aslında
serinden türetilir ve bilinen çok az sayıda protein selenosistein içerir.
Hücrelerde bunlara ek 300 aminoasit daha bulunur. Bunlar proteinlerin
yapısında yer almazlar ancak birçok işlevleri vardır.
Amino Asitler Asit ve Baz Gibi Davranabilir
Bir zwitteriyon asit (proton verici) gibi
ya da baz (proton alıcı) gibi davranabilir:
Bu çift yönlü yapıya sahip maddeler amfoterik ve sıklıkla amfolitler
(‘amfoterik elektrolitler’) olarak adlandırılırlar.
9
Amino Asitler Karakteristik Titrasyon Eğrilerine Sahiptir
Asit –baz titrasyonu, protonların derece derece ilavesini veya ayrılmasını
kapsar.
Glisinin diprotik formunun titrasyon eğrisini göstermektedir. Çok düşük
pH’ da, glisinin hâkim olan iyonik formu +H3N-CH2-COOH yani tamamen
protonlaşmış formudur. Titrasyonun birinci evresinin orta noktasında glisininCOOH grubu proton kaybeder. Herhangi bir titrasyonda, titre olmaya başlayan
protonlaşmış grubun pқa değerinin pH’ya eşit olduğu yerde orta noktaya ulaşılır.
Glisin için orta noktada pH 2.34’tür. pқa bir grubun proton kaybetme
eğilimini ölçer ve bu eğilim 10 kat azaldığında, pқa bir birim artar. Glisin
titrasyonunda bir diğer önemli nokta pH’nın 5.97’ye ulaştığı noktadır. Bu
noktada ilk protonun ayrılması tamamlanmış ve ikicisinin ayrılması başlamıştır.
Titrasyonun ikinci evresi glisinin –NH3+ grubunun protonunu kaybetmesine
karşıttır. –NH3+ grubunun pқa değerine eşittir.
Titrasyon pH 12 civarında tamamlanır ve bu noktada glisinin hâkim olan
formu H2N-CH2-COOH-‘ dir.
Glisinin titrasyon eğrisinden sağlanan birinci önemli bilgi, -COOH için 2.34
ve –NH3+ için 9.60 olan iki iyonize olabilen grubun nicel, pқa ölçüm değerlerini
verir.
10
Bu etki kısmen karboksil grubunun yüküne bakmaksızın elektronları çeken ve
amino gruplarının proton verme eğilimi artıran karboksil gruplarındaki
elektronegatif oksijen atomlarından kaynaklanmaktadır. Bu yüzden α-amino
grubunun pқa değeri metilamin gibi alifatik aminlerin değerinden daha düşüktür.
Kısaca herhangi bir işlevsel grubun pқa değeri büyük ölçüde bulunduğu
kimyasal çevreden etkilenir. Bu fenomen bazen, enzimlerin aktif bölgelerinde
özgül kalıntıların proton verici /alıcı gruplarının pқa değerlerinin etkili olduğu
tepkime mekanizmalarını açıklar.
İkinci önemli bilgi bu amino asidin tamponlama gücü olan iki bölgesinin
varlığıdır. Birinci pқa değeri 2.34’ün her iki yönündeki yaklaşık bir ph birimlik
bu bölge, Glisinin bu ph civarında iyi tampon etkisi gösterdiğinin işaretidir.
Diğer tamponlayıcı bölge pH 9.60 civarındadır. Glisinin tamponlama sınırları
içinde, verilen bir pH değerini tamponlamak için gerekli proton verici ve proton
alıcı formlarının oranı Henderson- Hasselbach eşitliği kullanılarak
hesaplanabilir.
Titrasyon Eğrileri amino Asitler Elektrik Yükünü Öngörür
Amino asitlerin net elektrik yükleriyle çözeltinin ph’sı arasındaki ilişkidir.
5.97’de glisinin çoğu dipolar formdadır. Net elektrik yükü sıfır olan bu
karakteristik ph’ya izoelektrik nokta veya izoelektrik pH denir ve pI olarak
yazılır.Yan zincirinde iyonize olabilen grup taşımayan glisin için izoelektrik
nokta iki pқa değerinin aritmetik ortalamasıdır.
11
Glisin pI değerinden yüksek herhangi bir ph değerinde net negatif yüke sahiptir
ve bir elektriksel alana yerleştirildiğinde pozitif elektroda (anot) doğru hareket
edecektir.pI’dan düşük pH değerlerinde ise glisin net pozitif yüke sahip olup
negatif elektroda (katot) doğru hareket edecektir. pH 1.0!de glisin hemen hemen
tamamen +H3N-CH2-COO- formundadır ve 1.0 net pozitif yüke sahiptir, ancak
pH 2.34’te eşit miktarda+H3N-CH2-COOH ve +H3N-CH2-COO- vardır ve
ortalama net pozitif yükü 0.5’tir.
Amino Asitlerin Asit –Baz Özellikleriyle Farklılaşır
-COOH grubu için 1.8 ile 2.4 arasında bir pқa değeri ve NH3+ grubu için 1.8 ile
11.0 arasında oldukça benzer pқa değerleri vardır.
İyonize olabilen R grublu amino asitlerin oldukça kompleks titrasyon eğrileri
vardır. Üç pқa değeri, üç olası iyonizasyon basamağı olan üç evreli titrasyon
eğrileridir.
İyonize olabilen R grubunun titrasyon evresi diğer ikisine eklenmiştir.
Glutamat ve histidin eğrileri
12
Glutamatın pI değeri 3.22’dir. Bunun nedeni pKa değerlerinin ortalaması 3.22
olan iki karboksil grubunun varlığıdır ve burada amino grubundan gelen +1
yükle net negatif -1 yük denge halindedir. Histidinin pI’sı benzer şekilde
protonlandığında, 7.59 (amino ve imidozal gruplarının pKa değerlerinin
ortalaması)’dur ve glisinden bir hayli yüksektir.
Peptitler ve Proteinler
Peptitler Amino Asit Zincirleridir
İki amino asit molekülü peptit bağı adı verilen bir amit bağıyla kovalent
bağlanabilir ve sonuçta dipeptit oluşur.
Peptit bağı oluşumu canlı hücrelerin başlıca tepkime sınıfı olan kondenzasyon
(katılma) tepkimesi için bir örnektir. Şekilde de görüldüğü gibi standart
biyokimyasal koşullarda tepkime dengesi ürün yerine tepkenler lehinedir. Az
sayıda amino asidin bağlanmasıyla oluşan yapıya oligopeptit, çok sayıda amino
asidin bağlanmasıyla oluşan yapıya da polipeptit adı verilir. Proteinler binlerce
amino asit kalıntısı içerebilir. Çoğu zaman ‘protein’ ve ‘polipeptit’ terimleri
13
birbirinin yerine kullanılmakta birlikte polipeptitler genel olarak moleküler
ağırlığı 10,000’in altında olanlardır.
Bir peptitte serbest α-amino grubunu içeren amino asit kalıntısı aminoterminal (veya N-terminal)kalıntı, diğer uçtaki serbest karboksil grubu içeren
kalıntı ise karboksil-terminal (veya C-terminal) kalıntıdır.
Peptit bağı hidrolizi egzergonik tepkime olmasına karşın yavaş gelişir çünkü
aktivasyon enerjisi oldukça yüksektir. Sonuçta proteinlerdeki peptit bağı yüksek
oranda karalıdır ve yarı ömürleri birçok hücre içi şartta ( t1/2 ) yaklaşık yedi
yıldır.
Peptitler İyonlaşma Davranışlarıyla Ayrılabilir
Peptitler zincirin her bir ucunda sadece bir serbest α-karboksil grubu içerirler.
Bu gruplar serbest amino asitlerdeki gibi iyonize olurlar. Ancak iyonizasyon
sabitleri farklıdır, çünkü α-karbondan gelen zıt yüklü grup yoktur. Uçlar
dışındaki tüm amino asitlerin α-amino ve α-karboksil grupları kovalent bağlanıp
peptit bağı oluşturduğu için, iyonize olarak peptitlerin total asit- baz
davranışlarına katkıda bulunmazlar. Fakat bazı amino asitlerin R grupları ve
molekülün asit- baz özelliğini etkiler.
14
Serbest amino asitlere benzer şekilde peptitlerin de karakteristik titrasyon
eğrileri vardır ve elektriksel alanda hareket edemedikleri karakteristik bir iso
elektrik pH (pI) değerleri de mevcuttur.
Biyolojik Olarak Aktif Peptitler ve Polipeptitler Çok Geniş Bir Büyüklük
Sınırına Sahiptir
Biyolojik olarak aktif peptit ve proteinlerin moleküler ağırlıklarını işlevleriyle
ilişkilendirecek bir genelleme yapılamaz.
Ticari olarak sentezlenen Aspartam veya NutraSweet olarak bilinen yapay
tatlandırıcı, dipeptit L-aspartil-L-fenil alanin metil esteri, buna örnektir.
Birçok ufak peptid çok düşük derişimlerde etkisini gösterir. Çok sayıda
omurgalı hormonu küçük peptitlerdir. Bunlardan oksitosin (dokuz amino asit
kalıntısı) arka hipofizden salınan ve uterus kasılmasını uyaran hormondur;
bradikinin (dokuz kalıntı)doku inflamasyonunu inhibe eder; tirotropin salgılatıcı
etken (üç kalıntı) hipotalamusta oluşur ve bir başka hormon olan ön hipofiz
bezindeki tirotropinin salınımını uyarır. Oldukça toksik mantar zehiri olan
amanitin ve bazı antibiyotikler de ufak peptitlerdir.
Küçük polipeptitler ve oligopeptidlerden büyükçe olanlarına örnek ise biri 30
diğeri 21 amino asit kalıntısı olan iki polipeptit zincirinden oluşmuş pankreatik
hormon insülindir.Glukagon ise insüline zıt etki gösteren bir diğer pankreatik
hormon olup 29 amino asit kalıntısı içerir. Ön hipofiz bezi hormonu
kortikotropin ise 39 kalıntı içerir; sığır kimotripsinojeni ise 245 kalıntı içerir. En
sınırda omurgalı kasında bulunan, yaklaşık 27,000 amino asit kalıntısı içeren ve
3,000,000 civarında molekül ağırlığına sahip olan titin yer alır. Doğada bulunan
15
polipeptitlerin çoğu daha küçüktür ve 2.000 amino asit kalıntısından az sayıda
kalıntı içerirler.
Bazı proteinler tek polipeptit zinciri içerirler diğerleri ise iki veya daha çok
sayıda nonkovalent birleşmiş polipetitten oluşurlar.
Çoklualtbirimli proteinde her bir polipeptit zinciri benzer veya farklı olabilir. En
azından iki benzer alt birimi varsa proteine oligomerik denir, benzer birimlere
protomerler denir. Örnek olarak hemoglobin iki benzer α zinciri ve iki benzer β
zinciri birbirine nonkovalent etkileşimlerle bağlıdır.
Çok az sayıda protein kovalent bağlı iki veya çok sayıda polipeptit zi,ncirini
içerir.
Biz başka bir kimyasal grup içermeyen basit bir proteinin molekül ağırlığını
110’a bölerek yaklaşık amino asit kalıntısı sayısını hesaplayabiliriz.
Polipeptitler Karakteristik amino Asit Bileşimlerine Sahiptir
20 standart amino asit proteinlerde daima eşit oranda bulunmaz. Bazı amino
asitler molekül başına sadece bir tane, bazıları hiç bulunmaz, bazılarıda çok
sayıda olabilir.
16
Bazı Proteinler Amino asitler Dışında Kimyasal Gruplar İçerir
Pek çok protein, örneğin ribonükleaz enzimi ve kimotripsinojen, sadece
amino asit kalıntıları içerir, diğer kimyasal grupları yoktur ve basit proteinler
olarak adlandırılırlar. Bazı proteinler ise amino asitlere ek kalıcı bir kimyasal
kısım içerir ki, bunlara da konjuge (birleşik) proteinler denir. Konjuge
proteinin amino asit olmayan kısmına prostetik grup denir. Konjuge proteinler
prostetik grubun kimyasal yapısı temel alınarak sınıflandırılırlar. Lipoproteinler
lipit, glikoproteinler şeker grupları, metalproteinler özgül bir metal içerir.
17
Protein Yapısının Birkaç Düzeyi Vardır
Başlıca dört protein yapı düzeyi tanımlanmıştır.
Kovalent bağlarla (başlıca peptit bağları ve disüfit bağları) polipeptit zinciri
birincil yapıdır. ikincil yapıda ise amino asit kalıntıları kısmen kararlı
düzenlemelerle tekrarlayan yapısal modeller oluşturur. Üçüncül yapı
polipeptidin tüm üç boyutlu katlanmalarının bir görüntüsüdür. Bir protein iki
veya daha çok sayıda polipeptit altbirimi içerdiğinde uzaysal düzeni dördüncül
yapı olarak tanımlanır.
Proteinlerle Çalışmalar
Proteinler Ayrılabilir ve Saflaştırılabilir
Önce saf olarak elde edilmesi esastır. Bir protein diğerinden farklı özelliklerin
olması saflaştırma yöntemleri için avantajdır. Protein kaynağı genellikle doku
veya mikrobiyal hücrelerdir. Protein saflaştırmadaki ilk basamak bu hücreleri
parçalamak ve ham özüt adı verilen çözeltiye proteinlerin geçmesini
sağlamaktır. Alt hücre fraksiyonları hazırlamak veya özgül organelleri izole
etmek için diferansiyal santrifüjleme yapılabilir.
Özüt veya organel bir kez elde edildikten sonra, çoğunlukla özüt proteinlerin
büyüklük, yük gibi bazı özelliklerine göre farklı fraksiyonlara ayrılma işlemine
tabi tutulur bu sürece fraksiyonasyon (tabakalandırma) denir. Proteinlerin pH,
ısı, tuz derişimi ve diğer etkenlerden etkilenen bir kompleks işlevi olan
çözünürlüklerindeki farklılıktan faydalanılır.
Yüksek tuz derişimlerinde proteinlerin çözünürlüğü düşüktür ve bu etki
tuzlayarak çöktürme (salting out) olarak adlandırılır. Amonyum sülfat (NH4 )2
SO4) suda yüksek çözünür olduğu için bu amaçla sıklıkla kullanılır. Büyük
proteinler için daha avantajlı olan diyaliz işleminde protein çözücüden
ayrıştırılır.
18
Proteinleri fraksiyonlamada kullanılan en güçlü teknik olan kolon
kromatografisinin avantajı, proteinleri yük, büyüklük, bağlanma anfinitesi ve
diğer özelliklerine göre ayırmasıdır.
Uygun kimyasal özelliğe sahip delikli katı maddeyle kolon
kaplanır(stasyoner ‘duran’ faz) ve tampon çözelti (mobil ‘hareketli’ faz) bundan
filtre edilir.
Katyon –değiştirme kromatografisinde net yüklü proteinler net negatif
yüklülere göre matriks boyunca mobil fazda daha yavaş göç ederler,
19
20
Çünkü duran fazda net pozitif yüklülerin ilişkisi sonucu göç yavaşlar.
Kromotografik metotların geliştirilmiş olanı HPLC veya yüksek performans
sıvı kromatografisidir. Daha önce izole edilmemiş bir proteini saflaştırmak için
hem tanımlanmış örneklerden hem de sağduyudan faydalanılır. Çoğu zaman,
proteini tamamen saflaştırmak için birçok farklı yöntem sırayla kullanılmalıdır.
Toplam hacmin fazla ve içerik sayısının en yüksek olduğu durumlarda ortak
görüş ilk olarak pahalı olmayan ‘tuzlayarak çöktürme’ yönteminin
kullanılmasıdır.
21
Sonraki basamaklarda daha incelikli ( ve pahalı) kromagrafik yöntemlerin
kullanılması uygun olur.
Proteinler Elektroforezle Ayrıştırılabilir ve Tanımlanabilir
Proteinleri ayrıştırmada bir diğer önemli teknik, yüklü proteinlerin elektrik
alanındaki güçlerini esas alan ve elektroforez adı verilen yöntemdir.
Bu yöntem genel olarak büyük miktardaki proteinleri saflaştırmak için
kullanılmaz, daha basit ve uygun alternatifler mevcuttur ve elektroforetik
metotlar proteinlerin yapı ve dolayısıyla işlevlerini ters etkiler.
Analitik yöntemdir. Bu yöntemin avantajı, burada proteinlerin hem
ayrıştırılması hem de görüntülenebilmesidir, araştırmacı karışımdaki farklı
protein sayısını veya özgün bir proteinin saflık derecesini tahmin edebilir.
Ayrıca elektroforez, proteinlerin izolelektrik noktaları ve yaklaşık molekül
ağırlıkları gibi çok önemli özelliklerini de tanımlamaya olanak sağlar.
22
Poliakrilamit jel bir elek gibi iş görür ve yük/kütle oranına göre proteinlerin
gücü yavaşlar. Göç, proteinin şeklinden de etkilenir. Elektroforezde
makromolekülü hareket ettiren güç elektriksel potansiyel (E)’dir. Elektroforetik
mobilitesi (µ) , partikülün hızının, (V) , elektriksel potansiyele oranıdır.
Elektroforetik yöntem çoğunlukla saflık ve molekül ağırlığını tahminlemek
için seçilir ve deterjan olan sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılır.
SDS çoğu proteine kabaca molekül ağırlığının belirlediği miktarda, iki amino
asit kalıntısına bir molekül SDS olacak şekilde bağlanır. Bağlı SDS net negatif
yükü artırır, SDS bağlandığında proteinin doğal şeklide değişir ve birçok protein
benzer şekil alır.
Proteinler tamamen kütle(molekül ağırlığı) temel alınarak ayrılır. Elektroforez
sonrasında proteinler, jele bağlanmayan fakat proteinlere bağlanan, Coomassie
blue (mavisi) gibi bir boyayla görüntülenir.
23
İzoelektrik odaklama, bir proteinin izoelektrik noktasını (pI) tanımlamada
kullanılan bir yöntemdir.
24
Düşük molekül ağırlıklı organik asitler ve bazların (amfolitler) karışımın jel
boyunca elektriksel alandaki dağılımları farklı pH değerlerini (pH gradyanı)
oluşturur.
Sırasıyla izoelektrik odaklanma ve SDS elektroforezin birlikte kullanımı ikiboyutlu elektroforez olarak adlandırılır. Ve kompleks protein karışımlarının
ayrışmasına olanak tanır.
25
**
26
İki boyutlu elektroforez molekül ağırlığı aynı molekül ağırlığı aynı fakat pI ayrı,
ya da pI değeri aynı molekül ağırlığı farklı proteinleri ayrıştırır.
Ayrışmamış Proteinler Ölçülebilir
Saflaştırmada esas, yöntemin her aşamasında diğer proteinler arasından o
proteini bulmak ve ölçmektir. Enzimler gibi proteinler için, enzim varlığında
substatın tepkime ürünlerine dönüş hızının arttığı enzimin katalitik etkisinin
ölçüldüğü yöntem veya çözelti veya doku özütündeki protein miktarı tayin
edilebilir. Katalizlenen tepkimenin
--- tüm dengesi
--- ürün oluşumunu veya substranın kullanımını ölçen analitik yöntem
--- enzimin metal iyonları gibi kofaktörler veya koenzimlere gereksinimi
--- enzim aktivitesinin substrat derişimine bağımlılığı
--- optimum pH
--- enzimin kararlı ve yüksek aktiviteye sahip olduğu sıcaklık bölgesi
bilinmelidir.
Uluslararası birimlere göre 1.0 birim enzim aktivitesi optimal koşullarda
ölçülen 250C ‘da 1 dakikada 1.0µmol substratı ürüne dönüştüren enzim
miktarıdır. Aktivite, çözelti içindeki toplam enzim birimidir. Özgül (spesifik)
aktivite ise total proteinin miligramı başına enzim biriminin sayısıdır.
Özgül aktivite enzim saflığının bir ölçüsüdür; enzim saflaştırıldıkça artar.
Proteinlerin Kovalent Yapısı
Birincil yapıdaki farklılıklar olasılıkla aydınlatıcı olabilir. Her protein farklı
sayı ve dizide amino asit kalıntısına sahiptir. Birincil yapı proteinin üç boyutlu
yapısındaki katlanmayı belirlerken, bu katlanma da proteinin işlevini belirler.
Bir Proteinin İşlevi Amino Asit dizisine Bağlıdır
E.coli bakterisi 3.000’den fazla farklı protein, insan ise, 50.000 ile 100.000
arası protein üretir. Her ikisinde de, proteinin her tipi tek bir üç boyutlu yapıya
sahiptir ve bu yapı tek bir işlev sağlar. Proteinin her bir tipi özgün bir amino asit
dizisine sahiptir. Farklı işlevleri olan proteinler, daima farklı amino asit dizileri
27
içerir. Birincil yapı değiştirilirse protein işlevi de değiştirilebilmektedir. Farklı
türlerdeki işlevsel olarak benzer proteinler karşılaştırıldığında bu proteinler
benzer amino asit dizisi içerir.
Diğer proyeinlerin yıkımının düzenlenmesinde rolü olan 76 amino asitlik
ubikuitin buna iyi bir örnektir.
İnsanlardaki proteinlerin tahminen %20- 30’u polimorfiktir, yani insan
popilasyonunda amino asit dizisi varyantları mevcuttur. Bu varyasyonların çoğu,
protein işlevini çok az veya hiç ekilemez. Proteinler sıklıkla, amino asit
dizilerinde biyolojik işlevleri için temel olacak önemli bölgeler içerirler.
Proteinden proteine değişir ve bu dizi üç boyutlu yapıyı, yapı da işlevi etkiler.
Çok Sayıda Amino Asit Dizisi Saptanmıştır
28
29
30
Kısa Polipeptitler Otomatik İşlemlerle Dizilenir
Biri, proteini hidrolizleyip amino asit içeriğini saptamaktır.(a)
*
Amino-terminal uçtaki amino asit kalıntısını etiketlemek ve tanımlamak
sıklıkla, hidroliz yöntemiyle çakışık kullanılır.(b) Bu amaçla Sanger, 1-floro2,4-dihitrobenzen (FDNB) ayıracını geliştirmiştir.
Diğer ayıraçlar olan dansil klorürü ve dabsilklorürü kullanılarak
dinitrofenilhidrazın türevlerinden daha kolay saptanabilen türevler oluşur.
31
Ancak bu yöntemle bir proteindeki farklı bir proteindeki farklı amino
terminallere sahip,kimyasal olarak parçalanmış yeni polipeptitlerin sayısı
belirlenebilir.
Bütün bir polipeptidi dizilendirmek için Edman tarafından kimyasal bir
yöntem geliştirilmiştir. Edman indirgemesi yöntemiyle bir peptitteki amino ucu
işaretlenerek uzaklaştırılır.(c)
Bu yöntem tüm seri tanımlanana kadar tekrarlanır. Edman indirgemesi,
sekanator (dizici) adı verilen bir cihazda gerçekleştirilir.
Büyük Proteinler Daha Küçük Parçalar Halinde Dizilenmelidir
Polipeptitin uzunluğu arttıkça amino asit dizisinin belirlenmesinin doğruluğu
azalır. İlk olarak protein kimyasal ve enzimatik yöntemlerle özgül fragmanlara
(parçacıklara) bölünür. Her fragman saflaştırılmalı ve Edman yöntemiyle dizileri
belirlenmelidir.
Disülfit Bağlarının Kırılması Sistin kalıntısındaki peptit bağlarından biri
Edman yöntemiyle yıkılsa da, disülfit bağıyla diğer polipeptit zincirine bağlı
kalır.
32
Disülfit bağlarının iki geri dönüşümsüz yıkılma işlemi aşağıdaki şekilde
gösterilmiştir.
Polipeptit Zincirinin Yıkılması çeşitli yöntemler kullanılabilir. Bazı proteazlar
Sadece özgül bir amino asitle bitişik peptit bağını yıkar.
Tripsin hidroliziyle genellikle altı daha küçük peptit oluşur. Bu fragmanlardan
yalnız birinin Lys ve Arg içeren bir karboksil-terminali yoktur. kromatografik
veya elektroforetik yöntemlerle ayrılır.
33
Peptitlerin Dizilenmesi Edman yöntemiyle dizisi saptanır.
Peptit Fragmanlarının Sıralanması Siyonejen bromür, sadece, Met’in
karbonil grubuyla katıldığı peptit bağını etkir. Ayrılan fragmanlar, önceki gibi
dizilim saptamasına tabi tutulur. İki parçalama yöntemiyle elde edilen amino asit
dizileri, birbirleri üzerine çakışacak şekilde getirilerek incelenir.(*)
Disülfit Bağlarının Yerinin Saptanması Eğer birincil yapıda disülfit bağları
bulunuyorsa, bunların saptanması dizileme işlemi tamamlandıktan sonra yapılır.
Her disülfit bağı için iki orijinal peptit kayıptır ve yeni uzun bir peptit oluşur. İki
kayıp peptit, karşılık gelen polipeptid teki disülfit bağları bağlı bölgeleri temsil
eder.
Amino Asit Dizileri Diğer Yöntemlerle de Belirlenebilir
Kütle spektrometresine dayanan yeni yöntemlerle kısa polipeptitler (20-30
amino asitten oluşan ) birkaç dakika içinde analiz edilebilir. Hızlı DNA dizileme
yöntemleri, genetik kodun açıklanması ve genlerin izolasyonuyla ilgili
tekniklerin gelişmesiyle polipeptidin dizisi, bunu kodlayan gendeki
nükleotidlerin dizisinden anlaşılabilir hale gelmiştir.
Bir hücredeki proteinler iki yönlü jel elektroforeziyle de ayrılabilir.(**) Her bir
protein bölgesi jelden özütlenebilir. Proteinlerden türeyen küçük peptitiler kütle
spektrometresiyle analiz edilebilir. Genellikle bir parçadan altı ile sekiz amino
asit kalıntısı proteinin tamamını kodlayan genin gösterilmesi için yeterlidir.
Amino Asit Dizileri Önemli Biyokimyasal Bilgi Sağlar
Bir proteindeki amino asit dizisi, proteinin üç boyutlu yapısı, işlevi, hücresel
yeri ve evrimi hakkında bilgi sağlar. Bu bilgiler diğer bilinen dizilerin
incelenmesiyle sağlanır.
Amino asit serisinin proteinin üç boyutlu şeklini nasıl tanımladığı bilinmediği
gibi diziden işlevinin nasıl belirlendiği ayrıntılı olarak bilinmemektedir.
Amino uçta bulunan bazı özel diziler hücre dışına çıkarılmak için tanınırken,
bir kısmı da çekirdeğe, hücre yüzeyine, sitozole ve diğer hücresel bölümlerine
gönderilmek üzere tanınır.
34
Küçük Peptitiler ve Proteinler Kimyasal Olarak Sentezlenebilir
Peptit elde etmenin üç yolu vardır.
1- Dokudan saflaştırma yoluyla, ancak bazı peptitlerin düşük derişimleri
nedeniyle zor bir yoldur.
2- Genetik mühendisliği
3- Doğrudan kimyasal sentez.
Pek çok güçlü tekniğin kullanılması kimyasal sentezi pek çok açıdan önemli
bir tercih haline getirir. Ayrıca, ticari uygulamalara ilaveten büyük
proteinlerin özgül bölgelerinin sentezi, proteinin yapısı ve işlevinin
çalışılması açısından artan bir öneme sahiptir.
35
36
37