Hücre Kültürlerinde Virüs Üreme Belirtileri
advertisement
VİRÜSLERİN ÜRETİLMELERİ Prof.Dr.Ömer POYRAZ Virüslerin Üreme Özellikleri • Virüsler zorunlu hücre içi parazitleri olup, üremeleri için mutlaka canlı hücrelere ihtiyaçları bulunmaktadır. • Metabolik enzimleri bulunmadığı için, enfekte ettikleri hücrelerin tüm fonksiyonlarını kendi lehlerine kullanırlar. • Yani içinde bulundukları hücreyi bir nevi esir alırlar. Virüslerin üretilmesinde üç canlı sistem kullanılır. 1 - Deney hayvanları 2 - Embriyonlu yumurta 3 - Hücre kültürü DENEY HAYVANLARINDA VİRÜS ÜRETİMİ Kullanım Amacı • Genellikle araştırma amacıyla kullanılır. • Rutin hizmetler için hem zaman alıcıdır, hem de pratik değildir. • Daha çok serolojik deneylerde kullanılacak antijenlerin hazırlanması ve aşı hazırlanması amacıyla kullanılır. Deney Hayvanı Seçimi • Deney hayvanı olarak genellikle fare, tavşan, kobay, keme gibi hayvanlar kullanılır. • Her deney hayvanında her virüsün üretilmesi mümkün değildir. • Virüs üretimi için, o virüse duyarlı deney hayvanının seçilmesi gerekir. • Bunun yanında bakımı kolay olması ve kolay bulunması nedeniyle deneylerin birçoğunda fare tercih edilir. • İnsanlardaki hastalıklara benzer bir tablo oluşturulması yönünden en önemli deney hayvanı ise maymundur. • Deneye alınacak hayvanlar sağlıklı olmalıdır. • Gizli, latent herhangi bir viral enfeksiyonu bulunmamalıdır. Deney Hayvanlarının Görünümü Tavşan Kobay Keme (Rat) Beyaz Fare Ekim Tekniği • Ekimler mutlaka aseptik ortamlarda ve steril şartlarda yapılmalıdır. • Hangi virüs ekilecekse ona uygun bir ekim yeri belirlenmelidir. • Virüsün hedef organına ve oluşturduğu patolojiye göre en uygun ekim yeri ve yöntemi belirlenmelidir. • Ekimin güvenliği açısından gerekirse deney hayvanına anastezi yapılmalır. Ekim Yerleri 1 - Deri Üzerine Ekim 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - Deri İçerisine Ekim Deri Altına Ekim Kas İçi Ekim Periton İçi Ekim Damar İçi Ekim Kalp İçi Ekim Beyin İçi Ekim Burun İçi Ekim Göz İçi Ekim Deri Üzerine Ekim Ekim yeri olarak genellikle karın ve göğüs derisi kullanılır. Ekim yapılacak bölgede deri ilk önce traş ve dezenfekte edilir. Daha sonra hassaslaşması için deri yüzeyi kanatmayacak şekilde çizilir, ya da zımpara ile oğuşturulur. Materyal katı ise deri yüzeyine oğuşturularak sürülür, sıvı ise hassalaşmış bölgeye bir damla damlatılarak ekim yapılır. Hayvanın enfekte olmaması için ekim yeri steril tülbentle sarılır. Deri İçerisine Ekim Genellikle sırt derinden ekim yapılır. Deri traş ve dezenfekte edildikten sonra, ince uçlu iğne ile deri içine girilerek 0,1 cm3 virüs solüsyonu enjekte edilir. Deri Altına Ekim Sırt veya karın bölgesinde, deri altına enjektörle girilerek ekim yapılır. Kas İçi Ekim Genellikle kalçadaki kaba etlere enjektörle dik olarak girilerek ekim yapılır. Periton İçi Ekim Hayvanın baş kısmı aşağı doğru tutularak, karnın alt bölgesinde , orta çizginin sağ veya solundan enjektörle dik olarak girilerek ekim yapılır. Damar İçi Ekim Tavşanda kulak venine, farede kuyruk venine, tavuklarda kanat altı venine enjektörle girilerek ekim yapılır. Kalp İçi Ekim Sırt üstü yatırılarak tutulan hayvanın göğüs kafesindeki ekim için uygun bölgeden enjektörle dik olarak girilerek ekim yapılır. Beyin İçi Ekim İki kulak arasındaki orta bölgeden enjektörle girilerek ekim yapılır. Kafatası sert olan hayvanlarda bu bölgede matkapla delik açıldıktan sonra, enjektörle girilerek ekim yapılır. Burun İçi Ekim Burun bölgesi yukarıya bakacak şekilde tutulan hayvanın burun deliklerinden enjektörle ya da damlalıkla damlatılarak ekim yapılır. Göz İçi Ekim Göz içine enjektörle ya da damlalıkla damlatmak suretiyle ekim yapılır. Ekim Yapılan Hayvanların Denetimi • Ekim yapılan deney hayvanları özel bölümlerde veya kafeslerde gözlem altına alınırlar. • Her gün sabah akşam kontrol edilerek hastalık belirtileri, felç veya ölüm olup olmadığı araştırılır. • Ölen ya da hastalık semptomu görülen hayvanların otopsi ile çeşitli organ ve dokuları alınarak, yeniden deney hayvanlarına veya doku kültürlerine ekimleri yapılır. • Aynı belirtileri oluşturup oluşturmadığı araştırılır. • Gözlem süresi içerisinde hiçbir patolojik belirti göstermeyen hayvanlar da, gözlem süresi sonunda öldürülerek otopsileri yapılır. • Organ ve dokularında hastalık belirtisi olup olmadığı araştırılır. Virüs Üreme Belirtileri • Virüs ile enfekte hayvanlarda tüylerin kabarması, sırtın kamburlaşması, felç, düşkünlük, ateş yükselmesi, kanama, deri lezyonları gibi klinik bulgular ve ölüm görülebilmektedir. EMBRİYONLU YUMURTADA VİRÜS ÜRETİMİ Kullanım Amacı • Embriyonlu yumurta muayene maddesinden bir çok virüsün izole edilmesinde oldukça duyarlı bir sistemdir. • Ayrıca aşı hazırlanmasında ve çeşitli serolojik deneyler için antijen hazırlanmasında da kullanılır. • Virüs izolasyonunda embriyonlu yumurta önceden çok sık kullanılırken, günümüzde hücre kültürlerinin geliştirilmesiyle çok fazla kullanılmamaktadır. Yumurta Seçimi • Virüs izolasyonu amacıyla ekim için en uygun yumurta beyaz kabuklu yumurtalardır. • Beyaz kabuklu yumurtalarda embriyonun ve damarlanmaların görülmesi daha kolaydır. • Ekim yapılacak yumurtaların taze olması, fekonde olması, sarsılmamış olması, serin bir ortamda muhafaza edilmiş olması gerekir. • Kolay bulunması ve çoğu virüslerin izolasyonu için uygun olması nedeniyle genellikle tavuk yumurtaları kullanılır. • Bunun yanında diğer hayvanların yumurtaları da kullanılabilmektedir. • Özellikle inkübasyon süresi uzun olan virüslerin izolasyonunda, kuluçka süresi daha uzun (28 gün) olan ördek veya kaz yumurtaları kullanılır. Yumurtada Embriyo Geliştirilmesi • İlk önce laboratuvara gelen yumurtalar özel muayene kutularına konularak içerisinde embriyo olup olmadığı araştırılır. • Embriyo oluşmuş olan yumurtalar kullanılmaz. • Yumurta muayene kutusu, içerisinde ampül yanan, üst kısmında yumurtanın oturacağı delik bulunan bir kutudur. • Karanlık odada bu şekilde yumurta alttan aydınlatılarak içerisinde embriyo oluşumu gözlenir. • İçerisinde embriyo bulunmayan yumurtalar, özel yumurta inkübatörüne konularak beş gün süreyle embriyo gelişmesi için beklenir. • Yumurta inkübatörü, istenilen ısıya ayarlanabilen, içerisine yumurtaların dizildiği rafları bulunan, rafları periyodik olarak 45oC sağa ve sola yatarak hareket eden bir nevi etüvdür. Yumurtada Embriyo Geliştirilmesi • Bu hareket sayesinde yumurta içinde gelişen embriyonun yumurta zarına yapışarak ölmesi engellenir. • Ayrıca nem oluşturmak için inkübatör içerisine bir kap içerisinde su konulur. • Bu şekilde 36-37oC'de inkübe edilen yumurtalar 5. günden sonra alınarak içerisinde embryo gelişip gelişmediği kontrol edilir. • Embriyo gelişimi, yumurtanın karanlık odada yumurta kutusu içerisinde incelenmesi ile, bir yüzeyde koyu bir leke ve çevresinde damarlaşmalar şeklinde görülür. • Ayrıca embriyonun hareket edip etmediğine bakılarak canlı olup olmadığı araştırılır. • Ölen embriyo kabuk zarına yapışacağı için, hareketi ortadan kalkar. • Tavuk yumurtasının kuluçka süresi 21 gün kadardır. • Yumurtalar inkübatörde bu süre sonuna kadar inkübe edilecek olursa, embriyonun gelişimi tamamlanarak yumurtadan civciv çıkar. İçerisinde Embriyo Gelişen Yumurtanın Görünümü • • • • • • • • • • Embriyonlu yumurta; embriyo, içi sıvı dolu iki kese ve zarlardan oluşmaktadır. Yumurtanın sert olan dış kabuğunun iç kısımında beyaz renkli, fibrin yapısında bir zar bulunur. Bu zar kabuk zarı olarak adlandırılmakta olup, yumurtanın kabuğuna yapışık durumdadır. Kabuk zarı yumurtanın künt tarafında hava kesesi adı verilen bir boşluk oluşturur. Bu zarın alt kısmında koryoallantoik zar adı verilen, bol damarlı bir zar daha bulunmakta olup, bu zar allantoik kese adı verilen, içi sıvı dolu bir kese meydana getirir. Kese içerisindeki sıvıya allantoik sıvı adı verilir. İç kısımda yer alan embriyoyu ise, amniotik zarların oluşturduğu bir kese içine alır. Bu kese içinde 1-2 ml hacminde amniotik sıvı bulunur. Ayrıca embriyoya bir kordon ile bağlı olan sarı kese vardır. Bu kese içerisinde vitellus yer almakta olup, bu madde embriyonun gelişimi için gereklidir. İçerisinde Embriyo Gelişen Yumurtanın Görünümü Ekim Yerleri ve Ekim Yapılışı • Kontaminasyonu önlemek amacıyla ekim yapılan odaların steril olması gerekir. • Bu odaların sterilizasyonu ise ultraviyole ışınları ile sağlanır. • Farklı virüsler, yumurtanın farklı yerlerinde üremektedir. • Ayrıca her virüsün inkübasyon süresi farklıdır. • Hangi bölgeye ekim yapılacaksa, o bölgenin maksimum büyüklüğe ulaşmasını sağlamak için, ona göre inkübe edilmesi gerekir. • Ekim yapılacak yumurtaların önce karanlık odada hava boşluğu sınırları belirlenir. • Bu sınır kurşun kalemle çizilerek işaretlenir. • Daha sonra embriyonun geliştiği taraf işaretlenerek, hangi bölgeye ekim yapılacaksa ona uygun teknikle ekim yapılır. Ekim Yerleri ve Ekim Yapılışı Sarı Keseye Ekim • Bu bölgeye ekim için genellikle 6-8 günlük embriyonlu yumurta kullanılır. • Bu dönemde yumurtanın sarısı, yumurtanın büyük bir bölümünü işgal etmiş durumdadır. • Yumurtanın kabuğu hava boşluğunun tam ortasına rastlayan noktadan delinir. • Buradan enjektörle girilerek, iğnenin ucu yumurtanın ortasına doğru 2 - 3 cm ilerletilir. • Bu sayede sarı keseye ulaşılmış olur. • Bu bölgeye enjeksiyon yapıldıktan sonra delik kapatılır ve yumurta dik olarak inkübatöre kaldırılır. Amniotik Keseye Ekim • Bu amaçla 7-14 günlük embriyonlu yumurta kullanılır. • Bu süre içerisinde amniotik kese maksimum büyüklüktedir. • Ekim için ilk önce hava kesesinin tam ortasından bir delik açılır. • Bu delikten uzunca bir iğne ile karanlık odada, yumurta kutusu üzerinde gözlemleyerek, dik olarak girilir. • Amniotik keseye girildiği anda embriyo iğnenin hareketi ile refleks yoluyla geri çekilir. • Bu durum görüldükten sonra ekim yapılır. Allantoik Keseye Ekim • Bu ekim için genellikle 9-10 günlük embriyonlu yumurta kullanılır. • Bu süre içerisinde allantoik boşluk oldukça geniştir. • Yumurta ışıkta incelenerek gerek hava kesesinin sınırları, gerekse embriyonun yeri kabuk üzerinde kurşun kalemle işaretlenir. • Yumurta dik durumda iken hava boşluğunun tepe noktası ile, hava boşluğunun bittiği noktanın ortasındaki bir noktadan kabuk delinir. • Buradan enjektör iğnesi ile yaklaşık 1 cm kadar girilerek ekim yapılır. • Delik balmumu ya da parafinle kapatılır. Korioallantoik Membrana Ekim • Bu amaçla 9-12 günlük embriyonlu yumurta kullanılır. • Yumurta karanlık odada incelenerek hava kesesi sınırları ve embriyo tarafında geniş kan damarlarının bulunmadığı bir bölge işaretlenir. • Hava boşluğu ise tam tepe noktasından işaretlenir. • Her iki işaretli noktadan yumurta kabuğu delinir. • Hava boşluğu tarafına bir puar tutturularak, buradaki hava emilir. • Bu surette hava boşluğu suni olarak embriyonun bulunduğu tarafa doğru kayar. • Deliğin altındaki kabuk zarı steril bir iğne ile delinir. • Bu sayede korioallantoik zar açığa çıkmış olur. • Bu açılan delikten iğne ile bir damla virüs solüsyonu damlatılır. • İğne geri çekildikten sonra delik sellofan bant ya da parafilm ile kapatılır. • Yumurtalar suni hava boşluğu üste gelecek şekilde 37 o C' de inkübe edilir. Korioallantoik Membrana Ekim Ekim Yapılan Yumurtaların İnkübasyonu ve İncelenmesi • Ekim yapılan yumurtaların, ekim yapıldığı yerdeki delikler parafilm ya da sellofan bant ile kapatıldıktan sonra, bu yumurtalar inkübatörüne konulur. • İnkübatörün ısısı ekilen virüsün özelliğine göre ayarlanır. • O virüsün en ideal üreme ısısı kaç derece ise, inkübatör o ısıya ayarlanır. • Yapılan ekimin özelliğine göre yumurtalar dik ya da yatık olarak hareketli raflara yerleştirilir. • Ekilen virüsün inkübasyon süresi kadar yumurtalar etüvde inkübe edilir. • Yumurtalar her gün etüvden alınarak embriyo oluşup oluşmadığı araştırılır. • İlk 24 saat içinde olan ölümler virüse bağlı olmayacağı için deneyden çıkarılır. • Daha sonraki günlerde embriyosu ölen yumurtalar incelemeye alınır. • • • • • Ekim Yapılan Yumurtaların İnkübasyonu ve İncelenmesi İnkübasyon süresi sonunda embriyo ölmemiş bile olsa, yumurtalar alınarak virüs üreme belirtisi olup olmadığına bakılır. Yumurtalar özel yöntemlerle açılarak ekim yapılan bölgelerde üreme belirtisi olup olmadığı araştırılır. Yumurta kabuğu açıldığında ilk önce enjektörle yumurta sıvıları çekilip, ayrı ayrı tüplere aktarılır. Yumurta zarları alınarak bir petri kutusuna konulur. Alınan bu örnekler makroskobik, mikroskobik ve serolojik yöntemlerle incelenirler. Virüs Üreme Belirtileri 1 - Embriyonun Ölümü : Virüs üremesine bağlı olarak embriyo ölebilir. Bu durum daha çok genel enfeksiyonlar sonucu olur. Ölen embriyonlar hemorajik ve kırmızı renkte görülür. Ölümlerin bakteriyel kontaminasyona bağlı olup olmadığının araştırılması için besiyerlerine ekimler yapılır. Ayrıca bakteriye bağlı ölümlerde genellikle embriyo sıvıları bulanık görünümde ve pis kokuludur. 2 - Zarlarda Lezyon Oluşumu : Özellikle Çiçek ve Herpes virüsler zarlarda poks adı verilen lezyonlar oluştururlar. Virüs Üreme Belirtileri 3 - Hemaglütinin Oluşumu : Allantoik ve amniotik sıvıda virüs üremesine bağlı olarak hemaglutininler oluşabilir. Alınan bu sıvılar duyarlı eritrositler ile karşılaştırılarak hemaglutinasyon olup olmadığı araştırılır. 4 - Viral Antijenlerin Oluşumu : Bilinen antikorlar kullanılarak emriyo sıvısında ve dokusunda viral antijenlerin olup olmadığı araştırılır. 5 - İnklüzyon Cisimciği Oluşumu : Virüs üremesine bağlı olarak embriyonun kendisinde veya zarlarında inklüzyon cisimcikleri oluşur. HÜCRE KÜLTÜRÜNDE VİRÜS ÜRETİMİ Hücre Kültürü • Canlı organ ve dokulardaki hücrelerin izole edilerek laboratuvar koşullarında üretilme ve çoğaltılmalarına hücre kültürü adı verilir. • Kültürün temeli uygun bir canlıdan alınmış yaşayan hücreler ve bu hücrelerin yaşama ve üremesini sağlayan besleyici nitelikteki fizyolojik sıvıdır. Hücre Kaynağı • Hücre kaynağı olarak üreme özelliği güçlü olan organ ve dokular seçilir. • Bu organlar insan ve hayvan embriyosuna ait amnion, deri, kas, bağırsak, akciğer, böbrek, testis, uterus, tonsilla, konjuktiva, karaciğer, maymun böbreği ve insanlara ait kötü huylu tümör dokusudur. • Bu organlar içinde ise en çok kullanılan maymun böbrek hücreleri, insan embriyonu amniotik dokusu, Habis tümörlerden He-la hücreleridir. Hücre Kültürü Hazırlanışı • Kültür hazırlanacak doku veya organdan alınan parçalar önce yüzeyindeki zarlardan arındırılırlar. • Bir kaç defa tamponlu steril SF ile yıkanarak kan ve diğer atıklardan temizlenirler. • Daha sonra steril şartlarda bistüri ya da makas yardımıyla mümkün olduğunca küçük parçalara bölünürler. • Kan ve mukus parçalarını uzaklaştırmak için tekrar steril SF ile yıkanırlar. • Bir tüp ya da şişe içerisinde toplanan bu parçalar üzerine, proteinleri eriten bir enzim olan tripsin ya da kollagenaz enzimi ilave edilir. Hücre Kültürü Hazırlanışı • Benmaride 350C'de 10 dakika tutularak hücrelerin ayrışması sağlanır. • Hücrelerin ayrışması, berrak olan sıvının bulanıklaşmasıyla anlaşılır. • Tripsin enzimini uzaklaştırmak amacıyla hücre ihtiva eden sıvı santrifüj edilir. • Üst sıvı atıldıktan sonra dipte kalan hücreler 2-3 defa steril SF ile yıkanır. • Saf hale gelen ve tripsinin etkisinden kurtulan hücreler besleyici bir sıvı içine konularak, düz yüzeyli şişelere aktarılırlar. • Etüvde 37 oC' de inkübe edilerek hücrelerin tüm yüzeyi kaplayacak şekilde üremesi sağlanır. Kültürdeki Hücrelerin Üremesi • Canlı hücrelerin üremek için gösterdiği en önemli özellik, katı bir yüzeye tutunmasıdır. • Bu nedenle kültürdeki hücreler, hücre kültürü şişesinin yüzeyine tutunarak üremeye başlarlar. • Üreyen hücreler yan yana dizilerek tek tabaka oluştururlar. • Belirli süre inkübe edildikten sonra tek tabaka haline gelen hücre kültürleri ekim için hazır hale gelmiş olurlar. • Tek tabaka hücre kültürleri virüslerin üretilmesi ve oluşturduğu sitopatik etkinin tanımlanması yönünden iyi bir inceleme sistemidir. Kültürde Üreyen Hücrelerin Şekilleri • Başta embriyonik dokulardan olmak üzere, bazı dokulardan elde edilen hücreler ilk üretildiklerinde birbirine paralel, iğ şeklinde, uçları sivri, ortaları şişkin görünümde dizilim gösterirler. • Bu tür hücrelere fibroblast hücre adı verilir. Bazı dokulardan alınan hücreler bal peteği şeklinde dizilirler. • Bu tür hücrelere epitel hücreleri adı verilir. • Diğer bazı dokulardan alınan hücreler ise epitel hücrelerine benzeyen görünümde dizilirler. • Bu hücreler tam epitel hücreleri olmadığı için, bu hücrelere epiteloid ya da epitelyal hücreler adı verilir. Hücre Kültüründe Üreyen Hücrelerin Görünümleri Şematik Görünüm Fibroblastik Hücre Mikroskopik Görünüm Epitel Hücresi Hücre Kültürü Şekilleri 1 – Tek tabaka hücre kültürleri 2 – Süspansiyon hücre kültürleri Tek Tabaka Hücre Kültürleri • Hücre kültürü içerisine konulan hücrelerin hareket ettirilmeden inkübe edilmesiyle hazırlanırlar. • Hareketsiz olan kültürdeki hücreler, kültür şişesinin yüzeyine yapışarak üremeye devam ederler. • Bu sayede bir süre sonra tek tabaka halinde yüzeyi kaplarlar. • Tek tabaka kültürler sabit ya da döner şekilde hazırlanabilirler. • Sabit tipte inkübasyon sırasında kültür hiç karıştırılmaz. • Bu durumda hücreler kültür şişesinin bir yüzeyine yapışırlar. • Döner tipte ise kültür şişesi hafif bir şekilde döndürülerek inkübe edilirler. • Bu sayede hücreler silindir şeklinde olan şişenin tüm yüzeyine yapışarak ürerler. Tek tabaka hücre kültürlerinin şematik ve mikroskopik görünümleri Süspansiyon Hücre Kültürleri • Kültür şişesi içerisine ekim yapıldıktan sonra, hücrelerin yüzeye yapışmasını engellemek için, hücre kültürleri inkübasyon sırasında mekanik olarak karıştırılır. • Bu sayede üreyen hücreler sıvı içinde süspansiyon halinde bulunurlar. • Buna bağlı olarak da hücreler bol miktarda üreme fırsatı yakalarlar. • Bu tür kültürler genellikle antijen ve aşı hazırlanmasında kullanılır. Hücre Kültürlerinde Kullanılan Besiyerleri 1 - Hücre Üretme Besiyerleri : Bu besiyerleri doğal ve sentetik maddelerin belirli oranlarda karıştırılmasıyla hazırlanırlar. Hücrelerin çabuk üremesini aktive etmek için azami düzeyde besleyici madde içerirler. Hücre üremesi maksimum düzeye geldiğinde, ya da hücreler tek tabaka halinde ürediğinde bu besiyeri dökülerek hücre kültürüne virüs ekimi yapılır. 2 - Virüs Üretme Besiyerleri : Hücre kültürlerine virüs ekimi yapıldıktan sonra, kültür içerisine virüs üretme besiyerinden bir miktar ilave edilir. Bu besiyerinin özelliği hücrelerin üremesini aktive etmeyen, yalnızca hücrelerin canlılıklarını sürdürmesini sağlayan nitelikte olmasıdır. Bu yüzden bu tür besiyerleri daha az besleyici maddeler içerirler. Besiyerinde Bulunan Temel Maddeler • Besiyerlerinin esasını tamponlanmış fizyolojik tuzlu su oluşturur. • Bu sıvı içerisinde anorganik maddeler, vitaminler, enzimler, plazma ve diğer besleyici maddeler bulunur. • Ayrıca bakteri ve mantar üremesini engellemek için besiyeri içerisine antimikrobikler katılır. Kökenlerine Göre Hücre Kültürü Çeşitleri 1 - Primer hücre kültürleri 2 - Sekonder hücre kültürleri 3 - Devamlı hücre kültürleri Primer Hücre Kültürleri • Direkt olarak organ ve dokulardan alınan parçalardan hazırlanan hücre kültürleridir. • Bunların yalnızca 1 veya 2 pasajları yapılabilmektedir. • Genellikle fötal orijinli insan ve hayvan dokularından hazırlanırlar. • Orijin doku ile aynı karyotipe sahiptirler. Sekonder Hücre Kültürleri • Primer hücre kültürlerinde üreyen hücrelerin alınarak tekrar tripsin ile ayrıştırılması ve yeniden besleyici ortamlara konularak üretilmesiyle hazırlanırlar. • Bu yapılan işleme pasaj adı verilir. Bu tür kültürlerin genellikle • 40-50 defa pasajı yapılabilir. • Hücre popülasyonunun yaklaşık % 75'i orijin hücrelerle aynı karyotipe sahiptir. • Genellikle fetal orijinli normal insan ve hayvan dokularından hazırlanırlar. Devamlı Hücre Kültürleri • Bu tür hücre kültürleri, pasajlar yapmak suretiyle sonsuza kadar devam ettirilebilen hücre kültürleridir. • Bunlar da insan ve hayvan orijinli dokulardan hazırlanabilirler. • Normal dokudan hazırlanabileceği gibi genelde tümör dokusundan orijin alırlar. • Bu tür kültürlerin hücreleri orijinal konağın fenotipik ve genotipik özelliklerinden farklılıklar gösterirler. • Hücre popülasyonunun % 75'inden daha az kısmı orijin hücrelerle aynı karyotipe sahiptir. • Hücreler transformasyona uğramış olup, kromozom sayısı ve niteliği değiştiği için anormal olarak kabul edilir. Hücre Kültürleri ve Özellikleri. Hücre Kültürlerine Virüs Ekim Tekniği • Hastadan alınan muayene maddesinin en kısa zamanda laboratuvara ulaştırılarak ekilmesi gerekir. • Alınan muayene maddesi bir havana konularak tamponlu fizyolojik su içerisinde, steril kum ile iyice ezilir. • Ezilen materyal bir santrifüj tüpüne alınarak 2500-3000 devirde santrifüj edilir. • Bu sayede doku partikülleri ve kum dip kısıma çökmüş olur. • Üst kısım virüs ihtiva eden kısım olup ayrı bir tüpe alınır. • Bu materyalden bir kaç cm3 alınarak hücre üremiş kültürlere ekilir. • İçerisinde bakteri bulunabilecek örnekler ya mekanik olarak filtrelerden süzülür ya da içerisine antibiyotik ve antimikotik katılır. • Ayrıca yüksek devirlerde santrifüj edilerek de bakteriler ve mantarlar virüslü kısımdan ayrıştırılabilirler. Hücre Kültürlerinde Virüs Üreme Belirtileri • Tek tabaka olmuş hücre kültürleri üzerine virüs ekildikten sonra, virüsün inkübasyon süresine uygun olarak belirli bir süre inkübe edilir. • Bu süre sonunda kültürde virüs üreyip üremediğinin araştırılması gerekir. • Kültürlerde virüs üremesi çeşitli belirtilere bakılarak anlaşılır. Sitopatik Etki ( CPE ) • Virüs ile enfekte olan hücrelerde, virüs üremesine bağlı olarak hücrelerin morfolojik yapılarının bozulması, balonlaşması, bulundukları yüzeyden hücre kültürü sıvısına dökülmesi, nekrozlaşması ve erimesi gibi görünümlere sitopatik etki adı verilmekte olup kısaca CPE olarak gösterilir. Sitopatik Etkinin Şematik ve Mikroskopik Görünümü Metabolik Değişim • Hücre kültürlerinde canlı hücrelerin metabolik faaliyetlerine ve artıklarına bağlı olarak besiyerinin başlangıçta nötr olan pH'sı asit tarafa doğru kayar. • PH' nın değişimi ise besiyeri içerisine katılan pH indikatörü ile anlaşılır. • PH asit tarafa kaydığı zaman besiyerinin pembe olan rengi sarıya dönüşür. • Hücre kültürü içerisinde virüs ürediği zaman, hücrelerin metabolik faaliyetleri durduğu için besiyerinin pH' sı değişmeden kalır. • Bu durumda pembe olan besiyerinin rengi değişmez. • Yani besiyerinin rengi değişirse virüs üremesi yok, değişmezse virüs üremesi var anlamına gelir. Plak Oluşumu • Tam tabaka olmuş hücre kültürlerine virüs ekildikten sonra, üzerine agar kaplanacak olursa, içerisinde virüs bulunan hücreler etrafında sınırlı bir virüs çoğalması olmaktadır. • Enfekte hücrelerin patlamasıyla ortama dökülen virüsler yalnızca kendi çevrelerindeki hücreleri enfekte ederler. • Bu durum ise sınırlı hücre erimesine bağlı olarak şeffaf yuvarlak alanların oluşmasına yol açar. • Bu şeffaf alanlara plak adı verilmekte olup, gözle görülebilirler. • Sağlam hücrelerin bulunduğu alanlar ise bulanık olarak görülür. • Agar kaplanmadığı durumlarda dökülen virüsler hücre sıvısına karışarak ortamdaki tüm hücreleri enfekte edeceği için, bu şekilde plak oluşumu gözlenmez. • Plak oluşumu yalnızca kültürde CPE yapan virüs üremesi durumunda meydana gelir. Hücre kültüründe plak oluşumunun şematik görünümü İnklüzyon Cisimciği Oluşumu • Bazı virüslerin hücre kültürlerinde üremesi sırasında, hücre içerisinde inklüzyon cisimciği adı verilen yapılar oluşur. • Oluşan inklüzyon cisimciklerini direkt olarak hücre kültüründe görmek mümkün değildir. • Bu yüzden hücre kültürlerinden alınan örnek sitolojik yöntemlerle boyanıp, ışık mikroskobunda incelenir. • Hücre içinde gerek sitoplazmada, gerekse nükleusta inklüzyon cisimciği olup olmadığı araştırılır. İnklüzyon Cisimciklerinin Görünümü Hemaglütinasyon Oluşumu • Hemaglütinasyon yapma özelliği bulunan ve aynı zamanda CPE yapan virüsler, hücre kültürlerinde üretildiklerinde konak hücreler parçalandığı için, virüsler hücre kültürü sıvısı içerisine dökülürler. • Bu durumda hücre kültürü sıvısı alınarak tüpler içerisinde virüsün duyarlı olduğu eritrosit süspansiyonu ile karşılaştırılırlar. • Bu sıvıda hemaglütinasyon yapan virüs bulunması durumunda eritrositler hemaglütine olarak tüpün dip kısımına dantela görünümünde çökerler Hemadsorbsiyon Deneyi • CPE yapmayan virüslerde hemaglutinasyon özelliği bulunması durumunda hücreler parçalanmadığı için, hemaglutinin yapan virüsler hücre içinde kalırlar. • Yani hücre kültürü sıvısında hemaglütinasyon varlığını saptamak mümkün olmaz. • Bu tür CPE yapmayan virüslerde hemaglutinasyon özelliğini ortaya çıkarmak için, hücre kültürü içerisine % 2'lik eritrosit süspansiyonu ilave edilir. • Yaklaşık 1 saat süreyle inkübe edildikten sonra, kültür şişesi, kültür incelemek amacıyla kullanılan invert mikroskop altına konularak incelenir. • İçinde hemaglutinin ihtiva eden virüs bulunan hücreler etrafında eritrositlerin küme yaptığı görülür. • Virüs bulunmayan kültürlerde ise, eritrositler hücreler arasında homojen olarak dağılım gösterirler. Hücre kültüründe hemadsorbsiyon deneyinin görünümü İnterferens • CPE yapmayan virüslerin tanısına yönelik uygulanan bir deneydir. • CPE yapmayan virüs üreme ihtimali olan hücre kültürlerine, inkübasyon süresi sonunda virüs üreyip üremediğini anlamak için, CPE yaptığı kesin olarak bilinen başka bir virüs ekilir. • Bir süre inkübe edildikten sonra hücre kültüründe CPE olup olmadığı araştırılır. • Eğer CPE görülmezse önceki virüs, sonradan ekilen virüsün üremesine engel olduğu anlamına gelir. • CPE oluşumu gözlenirse kültürde önceden virüs üremesi olmadığı anlaşılır. • Yani CPE pozitifse virüs üremesi yok, CPE negatifse virüs üremesi vardır. Viral Antijenlerin Varlığı • Bilinen antikorlar kullanılarak çeşitli serolojik deneylerle hücre kültürü sıvısında viral antijenlerin olup olmadığı araştırılır. LETAL DOZ50 ve İNFEKTİF DOZ50'NİN ARAŞTIRILMASI • Letal Doz 50 ( LD 50 ) Çeşitli sulandırımlarda enfekte edildikleri deney hayvanlarının yarısını öldüren virüs dozudur. • Doku Kültürü İnfektif Doz 50 ( TCID 50 ) Çeşitli sulandırımlarda ekildikleri hücre kültürlerinin yarısını enfekte eden virüs dozudur. Hesaplama İşlemi • Hesaplamada Reed ve Muench yöntemi kullanılır. • Bu amaçla virüslerin 101,102,103 ........şeklinde sulandırımları yapılır. • Bu sulandırımlardan eşit hacımlarda alınarak, her sulandırımdan aynı sayıda deney hayvanına ya da doku kültürüne ekim yapılır. • Belirli süre inkübasyondan sonra enfekte olan, enfekte olmayan, ölen ya da ölmeyenlerin sayısı kaydedilir. • Elde edilen sonuçlar önce tablo şeklinde yazılır. • Her sulandırım için yukarıdan aşağıya doğru ölenlerin sayısını toplayarak toplam ölen sayısı, aşağıdan yukarıya doğru canlı kalanların sayısını toplayarak toplam canlı sayısı belirlenir. • Yine her sulandırım için toplam ölü/canlı oranı ve bu orana göre toplam ölüm yüzdesi belirlenir. • Daha sonra bilinen formüller yardımıyla LD50 veya TCID50 hesaplaması yapılır. Letal Doz50' nin hesaplanışı Letal Doz50' nin hesaplanışı • Bulunan sayı % 50'nin hemen üzerinde ölüm gösteren virüs süspansiyonunun sulandırım oranına eklenir. • Bu durumda % 50' nin üzerinde ölüm olan virüs sulandırımı 10-3 olduğu için,10(3)+(-0,5) = 10-3,5. • Yani bu durumda LD50 = 10-3,5 dir. VİRÜSLERDE HEMAGLÜTİNİN ÜNİTESİNİN SAPTANMASI • Hemaglütinasyon yapma özelliğinde olan virüsler üretildikten sonra, gittikçe azalan oranda bir seri tüp içerisinde sulandırılır. • Üzerlerine virüsün duyarlı olduğu eritrosit süspansiyonu eklenir. • Bir süre bekledikten sonra, % 50 oranında, yani belirli belirsiz (+-) görünümde hemaglütinasyon oluşturan sulandırım, virüsün 1 hemaglütinasyon ünitesini verir. • Diğer bir deyimle hemaglutinasyon görülmeyen ilk tüpten bir önceki tüp, % 50 hemaglutinasyon anlamına gelir.
