S22. Sensör Bakteri Geliştirilmesi için Escherichia coliHücrelerinin

Sensör Bakteri Geliştirilmesi için Escherichia coli Hücrelerinin Transformasyon
Optimizasyonları
Başak Alan, Özgür Ozan Ceylan, Cansu Çelik, Berkhan Genç, Sevecen Kaplan, Süleyman
Mert Yiğitbaşı
Danışman: Prof. Dr. Feride İffet Şahin
ÖZET:
Uluslararası
Genetik
Mühendisliğiyle
Geliştirilmiş
Makine
(International
Genetically
Engineered Machine-iGEM) yarışması Massachusetts Teknoloji Enstitüsü tarafından
üniversite öğrencilerinin katılımıyla düzenlenmektedir. Yarışma kapsamında genler ve
genetik kontrol
fonksiyonlar
üniteleri
birleştirilerek bakteri
kazandırılmaktadır.
Çalışma
ve diğer organizmalara özelleşmiş
grubumuz
yarışmaya
katılmak
“Baskent_Meds” takım ismiyle kayıt yaptırmıştır. Takımımız Legionella
için
pneumophila’yı
tür düzeyinde özgül olarak algılayabilen ve ifadelenme düzeyinde bu algıya cevap vererek
bazı Stafilokok suşların salgıladığı anti-Legionella peptidini üretebilen Escherichia coli
hücreleri oluşturmayı hedeflemektedir. Projemiz kapsamlı ve uzun soluklu bir çalışma
olup, Dönem II Çalışma Grubu’nda sensör hücrelerin oluşturulması için Legionella
pneumophila quorum sensing mekanizmasından sorumlu lqs gen bölgesinin E. coli
hücrelerine
klonlanabilmesi
için
alıcı
uyumlu
hücre
gruplarının
oluşturulması
ve
transformasyon yöntemlerinin optimize edilmesi amaçlanmıştır (2, 19).
Anahtar kelimeler: Kompetan bakteri suşu, transformasyon, plazmid izolasyonu
Giriş: Legionella bakterileri gram negatif patojen mikroorganizmalardır. Su depolama
tankları, havuzlar, klimalar gibi sistemler bu bakterinin çoğalması için elverişli ortamlardır
(3, 11). Elliye yakın çeşidi tespit edilmiş olup, L.pneumophilla, Legionella kökenli tüm
enfeksiyonların yaklaşık %90’ına kaynaklık etmektedir. Virulans faktörünü insanda
intrasellüler yaşam sürdürdüğü akciğer alveolar hücrelerinde göstermektedir. Bakterilerin
bulunduğu ortamda düşük veya yüksek miktardaki popülasyon yoğunluğunu ayırt
edebilmesi türlere özel sinyal moleküllerinin algılanması ile mümkün olmaktadır.
Böylelikle hücre sayısındaki değişikliğe cevap olarak gen ekspresyonu, simbiyozis,
virülans, antibiyotik üretimi ve biyofilm oluşumunun popülasyon düzeyinde kontrolü
düzenlenebilmektedir (8, 17, 19, 22). Bu olay “Quorum Sensing (QS)” olarak ifade
edilmektedir. Legionella pneumophila ve Vibrio cholera türlerinin quorum sensing
molekülleri α-hidrosilketon türleridir (15, 18, 21). L. pneumophila’da lqsA (autoinducer
synthase), lqsR (response regulator) ve lqsS (sensor kinase) genlerinden oluşan lqs
(legionalla quorum sensing) gen kümesi quorum sensing mekanizmasından sorumludur
(20, 21). Sebep olduğu ölümlerin çoğu, kolay tespit edilememesi ya da belirtilerinin
Klebsiella pneumoniae belirtileri ile karıştırılmasından kaynaklanmaktadır. L. pneumophila
lqs algılama sisteminin bazı gen bileşenlerinin başka bir bakteriye aktarılması ile L.
pneumophila’yı tür düzeyinde özgül olarak algılayabilen ve ifadelenme düzeyinde bu
algıya cevap verebilen hücreler oluşturmak mümkündür (16).
GEREÇ VE YÖNTEM:
Besiyeri Hazırlanması
50 ml SOC medium hazırlanması:
İlk olarak; 1 gr tryptone (Tryptic Soy Broth), 0.25 gr yeast extract, 0.5 ml 1 M NaCl, 41.7
ml 3 M KCl konulur ve distile su(dH2O) ile 49 mL’ye tamamlanır ardından 121 C’de 20’
otoklavlanır.
İkinci olarak hazırlanan; 0,9522 gr MgCl2 (5 ml), 1,233 g MgSO4.7H2O konularak, dH2O
ile 5 ml’ye tamamlanır ve filtre sterilizasyonu (0,2
m) uygulanır. Hazırlanan 2M glikoz
çözeltisinden 5 ml bu çözeltiye eklenir.
İlk hazırlanan çözeltiye steril koşullarda 0,5 mL ikinci çözeltiden ve 0,5 ml son çözeltiden
eklenir.
Luria Broth Agar-Ampisillin (100 g/mL) hazırlanması:
10 g LB broth ve 6 g agar agar dH2O ile 400 ml ye tamamlanır. pH 7,5’a ayarlanır.
121 C’da 20’ otoklavlanır.
Ampisillin stok çözeltisi (40 mg/mL):
200 mg ampisillin 5 ml steril dH2O eklenir. Ardından filtre sterilizasyonu (0,2 m) yapılır.
Ampisillin, LBA solüsyonuna petriler dökülmeden eklenir ve petriler dökülür (7).
JM109, DH5α ve XL1-Blue E. coli Suşlarından CaCl2 Çöktürme Yöntemi ile
Kompetan (Alıcı Uyumlu) Hücre Eldesi
Bir gece katı besiyerinde (Luria Broth Agar; LBA) büyüyen kültürler sıvı besiyerine (LB)
inoküle edilir. Ardından 37 C, yaklaşık 3 saat inkübasyon yapılır ve 30 dakikada bir 600
nm’de optik yoğunluk (OD) ölçülür. OD yaklaşık 0,6 olduğunda kültürler 15 ml’lik falkon
tüplerde 10’ buz üzerinde inkübe edilir. İnkübe edilen kültürler 4 C’ da 4000 rpm’de 10’
santrifüj edilir. Süpernatant atılır ve pellet kurutulur. Pellete 2 ml 0,1M CaCl2 eklenerek
pellet çözülür. Tekrar 4 C’ de 4000 rpm de 10’ santrifüj edilir. Süpernatant atılır ve pellet
1,2 ml 0,1M CaCl2 içeren 200
l süspansiyon eppendorf tüplere dağıtılır. Elde edilen
hücreler -40 C’da saklanır.
Transformasyon
Transformasyon aşamasında kullanılan vektörler lqs bölgesini içeren pUCBM20 (pNT-1),
lqsA genini içeren pMMB207C-RBS (pTS-2) ekspresyon vektörü, luc genini içeren
pUSEamp(+) ve kontrol pGEM®-3Z vektörleridir. Transformasyonda kullanılan tüm plastik
malzeme soğuk olarak kullanılır. -40 C’dan çıkartılan hücreler buz üzerinde eritilir ve
erimenin hemen ardından hücrelerin ısısı yükselmeden 50
l hücre kültürüne 5
l vektör
eklenir. 30’ buzda inkübe edildikten sonra 60’’ 42 C’daki su banyosunda inkübasyon
yapılır. 2’ buz inkübasyonunun ardından 450
l SOC besiyeri eklenir. 37 C’da 3 saat
çalkalamalı inkübasyon ile kültürler 60’ çoğaltılır. 100
l kültür ampisillin içeren LBA
besiyerine yayma yöntemi ile inoküle edilir (4).
Plazmid İzolasyonu
QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Almanya) kullanılarak üretici firmanın önerileri
doğrultusunda plazmid izolasyonu yapıldı. Bu kapsamda; bir gece 37 C’da inkübe edilen 5
ml (LB) taze kültür 8000 rpm’de 3’ santrifüjlenir ve süpernatant atılır. 250 µl “Buffer P1”
eklenerek pellet çözülür ve mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. 250 µl “Buffer P2” eklenir ve
örnek berraklaşıncaya kadar 4-6 kere ters düz edilerek karıştırılır. 350 µl “Buffer N3”
eklenir ve 4-6 kere ters düz edilerek karıştırılır. 13.000 rpm’de 10’ mikrosantrifüj yapılır.
Süpernatant elüsyon kolonuna alınır ve 60’’ santrifüj yapılır. Kolondan geçen süzüntü
atılır. Kolon, 0,5 mL “Buffer PB” eklenerek yıkanır ve 60’’ santrifüj yapılır. Kolondan geçen
süzüntü atılır. Kolon 0,75 mL “Buffer PE” eklenerek yıkanır ve 60’’ santrifüj yapılır.
Kolondan geçen süzüntü atılır. Kolon 2 ml’lik eppendorf tüpe yerleştirilir ve kolona 50 µl
“Buffer EB” eklenir, 1’ beklemenin ardından 1’ santrifüj yapılarak plazmid süzüntüde elde
edilir. Elde edilen plazmid -20 C’da saklanır.
Koloni Polimeraz Zincir Reaksiyonu (kPZR)
Koloni polimeraz zincir reaksiyonunun (6) karışımının içeriği Tablo 1’de verilmektedir.
Hazırlanan PZR karışımına steril kürdan ile seçilen tek koloni eklenir. 96 C’da 5’
inkübasyonun ardından PZR tüpüne 1 ünite Taq polimeraz eklendikten sonra Tablo 2 de
koşulları belirtilen PZR uygulanır.
Tablo 1
Reaksiyon karışımı
l
dH O
35,8
10X PZR Tamponu
5
25mM MgCl
5
2
2
2,5mM dNTP
4
100p mol/ l ileri ve geri primerler
0,5/0,5
Tablo 2
C
dk
Siklus
1
İlk denatürasyon
96
2
Denatürasyon
95
1
Bağlanma
59
1
Uzama
72
2
Son uzama
72
5
İnkübasyon
4
35
1
-
Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz Jel Hazırlanması:
9 g agaroz tartılır ve 60 ml 1X tris borik sit EDTA (TBE) eklenir. Agaroz, mikrodalga
fırında ısıtılarak kaynatılarak solüsyon berraklaşıncaya kadar çözdürülür. etidyum bromür
son konsantrasyonu 0,5
g/ml olacak şekilde eklenir ve çalkalayarak tüm çözeltiye
dağılması sağlanır. Solüsyonun biraz soğuması beklendikten sonra agaroz tabağına
yavaşça dökülür ve polimerizasyon için beklemeye bırakılır.
Örneklerin Jele Yüklenmesi:
Jel 1X TBE tamponu içeren tanka yerleştirilir. Örnekler yükleme tamponu (6X;
Fermentas, USA) ile 1:5 oranında karıştırılarak kuyucuklara yüklenir. Başka bir kuyucuğa
6 l markör (Fermentas) yüklenir. Elektroforez 90 V’da 70 dakika yürütülür (5).
Bu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri
Araştırma Kurulu tarafından
onaylanmış (DA12/05) ve Başkent Üniversitesi Araştırma Fonunca desteklenmiştir.
BULGULAR
Her üç kompetan suş ile yapılan transformasyon çalışmaları sonucunda, JM109 suşundan
elde edilen kompetan hücrelerin transformasyon verimliğinin daha yüksek olduğu
saptandı (Şekil1).
Şekil 1: Her üç suş için transformasyon sonuçları
Seçilen transforme kolonilerden izole edilen pUSEamp ve pGEM-3Z vektörleri agaroz jel
elektroforezi ile görüntülendi (Şekil 2). pUSEamp(+)-luc vektörü ile transformasyon, luc
primerleri kullanılarak koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve agaroz jel elektroforezi
ile doğrulandı (Şekil 3).
Şekil 2: Seçilen transfome JM109 kolonileri ve izole edilen pUSEamp ve pGEM-3Z
vektörlerinin agaroz jel elektroforez görüntüleri
Şekil 3: Her üç suş için transformasyon sonuçları
200 ng pNT-1 ve pTS-2 plazmid miktarı ile gerçekleştirilen transformasyonun yüksek
moleküler ağırlıklı bu plazmidler için yeterli olmadığı saptandı (Şekil 4). Çalışmalarımız bu
plazmidlerin E. coli hücrelerine transformasyonu için devam etmektedir.
Şekil 4: JM109 hücrelerine pNT-1 ve pTS-2 plazmidleri ile yapılan transformasyon
sonuçları
iGEM Hakkında
Uluslararası
Genetik
Mühendisliğiyle
Geliştirilmiş
Makine
(International
Genetically
Engineered Machine–iGEM) Massachusetts Teknoloji Enstitüsü (MIT) tarafından 2004
yılından itibaren dünyanın çeşitli bölgelerindeki üniversite takımlarının katılımı ile
düzenlenmekte olan bir yarışmadır. Bu takımlar, sentetik biyoloji ve mühendislik
yaklaşımlarını
kullanarak
fonksiyonel
biyolojik
sistemler
oluşturmaktadır.
Yarışma
kapsamında, akademisyenler ve gönüllü araştırmacılar, DNA tabanlı yeniden standart
biyolojik parçalar oluşturup tüm araştırmacıların kullanımına sunmuştur. Bu genetik
parçaları kapsayan bir DNA seti ile çalışmaya başlayan biyoteknoloji konusuna meraklı
yüksek lisans, lisans ve lise seviyelerindeki öğrencilerden oluşan takımlar günlük
yaşamda karşılaşılan problemlere çözüm olabilecek yeni genetik programlar oluşturmaya
çalışıyorlar. Bu yaklaşım oldukça karmaşık olan biyolojik veri birikimini belirli kıstaslara
göre kategorize ederek belirli standartlar oluşturmak ve bu standartları kullanarak
hazırlanacak biyolojik parçaları (genler ve genetik kontrol üniteleri) bir bilgi bankasında
kataloglamak üzerine oturuyor.
Yarışmanın finalinde ise takım üyeleri, araştırma projelerini içinde akademisyenlerin,
endüstri ve sosyal bilimler alanında uzman kişilerin bulunduğu bir jüriye ve diğer
takımlara
sunuyor. Yarışma sonucu üniversite takımlarına proje fikirlerinin tutarlılığı,
deneylerinde ulaştıkları sonuçlar ve projelerinin bilim dünyasına katkısı göz önünde
bulundurularak 6 klasmanda Altın, Gümüş ve Bronz madalyalar veriliyor(9).
Gelecek hedefimiz; Legionella pneumophila’yı tür düzeyinde özgül olarak algılayabilen ve
ifadelenme düzeyinde bu algıya cevap vererek, bazı Stafilokok suşların salgıladığı antiLegionella peptidini üretebilen Escherichia coli hücreleri oluşturmaktır. Proje kapsamında,
iki adet transforme E. coli üretilecektir (2). Bunlardan bir tanesi L. pneumophilia LqsA
gen bölgesini içeren plazmid ile, ikincisi ise L. pneumophilia LqsR ve LqsS gen bölgelerini
ve Warnericin RK® peptidini (22 aa düz peptit) içeren plazmid ile transforme edilmiş
olacaktır (12, 20, 23, 25, 26). Bu plazmid büyüklük olarak taşıyabilirse, renk reaksiyonu
oluşturacak bir gen bölgesi de içerecektir. LqsA ile transforme E. coli, çalışmamızda
ürettiğimiz kompozit plazmitin Legionella pneumophilia’yı algıladığını göstermek amacıyla
kontrol bakteri olarak kullanılacaktır. Projeden beklentimiz, hazırladığımız plazmitin
Legionella pneumophiliayı tanıyarak, kontamine edebileceği yüzeylerde çoğalmasını
engellemesini sağlamaktır.
KAYNAKLAR
1) Bastos MCF, Ceotto H, Coelho MLV, et al. Staphylococcal Antimicrobial Peptides:
Relevant Properties and Potential Current Biotechnological Applications. Pharma
Biotech. 2009; 10:38-61
2) Choi JH, Lee SY. Secretory and extracellular production of recombinant proteins
using Escherichia coli. Appl Microbiol Biotech. 2004; 64:625–635
3) Declerck P. Biofilms: the environmental playground of Legionella pneumophilaemi.
Environ Microbiol. 2010; 12(3):557–566
4) Frederick
M.
Ausubel (Editor), Roger
Kingston (Editor), David
D.
Moore (Editor), J.
Brent (Editor), Robert
G.
Seidman (Editor), John
E.
A.
Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), Short Protocols in Molecular Biology, 4th
Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1999; 1-27
5) Frederick
M.
Ausubel (Editor), Roger
Kingston (Editor), David
D.
Moore (Editor), J.
Brent (Editor), Robert
G.
Seidman (Editor), John
E.
A.
Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), Short Protocols in Molecular Biology, 4th
Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1999; 2-14
6) Frederick
M.
Ausubel (Editor), Roger
Kingston (Editor), David
D.
Moore (Editor), J.
Brent (Editor), Robert
G.
Seidman (Editor), John
E.
A.
Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), Short Protocols in Molecular Biology, 4th
Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1999; 15-3
7) Frederick
M.
Ausubel (Editor), Roger
Kingston (Editor), David
D.
Moore (Editor), J.
Brent (Editor), Robert
G.
Seidman (Editor), John
E.
A.
Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), Short Protocols in Molecular Biology, 4th
Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1999; 1-2
8) Guerrieri El, Bondi M, Sabia C et al. Effect of Bacterial Interference on Biofilm
Development by Legionella pneumophila. Curr Microbiol. 2008; 57:532–536
9) http://igem.org/Main_Page
10) Huang Y, Huang ,J Chen Y. Alpha-helical cationic antimicrobial peptides:
relationships of structure and function. Protein Cell 2010; 1(2):143–152
11) Loret JF, Robert S, Thomas V, et al. Comparison of disinfectants for biofilm,
protozoa and Legionella control. J Water Health. 2005; 3(4):423-33
12) Low KO, Mahadi NM, Rahim RA, et al. An effective extracellular protein secretion
by an ABC transporter system in Escherichia coli: statistical modeling and
optimization of cyclodextrin glucanotransferase secretory production. J Ind
Microbiol Biotechnol. 2011; 38:1587–1597
13) Mohammed Al-Mahrous M, Jack WR, Sandiford SK, et al. Identification of a
haemolysin-like peptide with antibacterial activity using the draft genome
sequence of Staphylococcus epidermidis strain A487. Immunol Med Microbiol.
2011; 62:273–282
14) Marchand A, Verdon J, Lacombe C, et al. Anti-Legionella activity of staphylococcal
hemolytic peptides. Peptides 2011; 32:845–851
15) Molofsky AB and Swanson MS. Legionella pneumophila CsrA is a pivotal repressor
of traits and activator of replication. Molecular Microbiology 2003; 50(2):445–461.
16) Murray PR, Rosenthal KS, and Pfaller MS, Medical Microbiology, 6th Ed, Mosby Elsevier,
Philadelpia, PA, USA; 2009; 365-370
17) Sahr T, Bruggemann H, Buchrieser C, et al. Two small mcRNAs jointly govern
virulence and transmission in Legionella pneumophila.Molecular
Microbiology
2009; 72(3):741-762
18) Tiaden A, Spirig T, Hilbi H. Bacterial gene regulation by a-hydroxyketone
signaling. Trends Microbiol. 2010; 18(7):288-97
19) Tiaden A, Spirig T, Carranza P et al. Synergistic Contribution of the Legionella
pneumophila
lqs
Genes
to
Pathogen-Host
Interactions.
J
Bacteriol. 2008;
190(22):7532-47
20) Tiaden A, Spirig T, Hilbi H, et al. The Legionella pneumophila response regulator
LqsR promotes host cell interactions as an elementof the virulence regulatory
network controlled by RpoS and LetA . Cellular Microbiology 2007; 9(12):29032920
21) Tiaden A, Spirig T, Hilbi H, et al. The legionella Autoinducer Synthase LqsA
Produces an α-Hydroxyketane Signaling Molecule. The journal of Biological
Chemistry 2008; 283(26):18113-18123
22) Tiaden A, Spirig T, Sahr T, et al. The autoinducer synthase LqsA and putative
sensorkinase LqsS regulate phagocyte interactions,extracellular filaments and a
genomic island of Legionella pneumophila. Environ Microbiol. 2010; 12(5):12431259
23) Verdon J, Falge M, Maier E, et al. Detergent-Like Activity and a-Helical Structure
of Warnericin RK,an Anti-Legionella Peptide. Biophy J. 2009; 97:1933–1940
24) Verdon J, Girardin N, Lacombe C et al. δ-hemolysin, an update on a membraneinteracting peptide. Peptides 2009; 30:817–823
25) Verdon J, Labanowski J, Sahr T et al. Fatty acid composition modulates sensitivity
of Legionella pneumophila to warnericin RK, an antimicrobial peptide. Biochim
Biophy Acta. 2011; 1808:1146–1153
26) Verdon J,Héchard Y,Lacombe C. Characterization of anti-Legionella activity of
warnericin RK and delta-lysin I from Staphylococcus warneri. Peptides 2008;
29:978-984