GENOMİK ANALİZLER

YAKINDOĞU
ÜNİVERSİTESİ
GENOMİKANALİZLER
MahmutÇerkezErgören,PhD
UygulamalıHücreKültürüKursu
3-4Haziran2016
LeFoşa,KKTC
Genomik/ProteomikAnalizler
-omiks(ing.–omics):Biyolojideçalışılanalanırefereeder,örneğin;genomiks,proteomiks.
-om(ing.–ome):Çalışmaalanlarınhedeflerinigösterir,örneğin;genom,proteom.
Genomiks:Organizmagenomlarınınçalışılması.
Proteomiks:Proteinyapıveişlevleriningenişölçekteçalışılması.
GenlerinModifikasyonu
veKlonlanması
Fizyolojik
TranskriptomAnalizleri
Rekonstrüksüyonlar içinGenomikTestler
ProteomAnalizi
ModellemeAnalizleri
Genomikanalizyapılabilmesiiçin:
ANALİZ
FENOTİP
Hücre/Doku/Organ
invitrohücreha_
NükleikAsit(DNAveRNA)ektraksiyonu
Proteinizolasyonu
PROTEOMİKS
GENOTİP
İkincilveÜçüncülYapısı
Karakterizasyonu
YADA
İşlevselanalizler
(invitrotest)
Hücregenomdizianalizindeişakışı:
invitrohücreha_
Doku/Organ
SNP/CNV
Hücrecpikimliklendirmesi
Genommodifikasyonu
ANALİZ
Genocpleme:Dizianalizi
DNAekstraksiyonu
TEKhücregenomdizianalizindeişakışı:
LazerYakalama
Mikrodissessiyon
(LCM)
veya
invitrohücreha_
Doku/Organ
Flowsitometri
veya
FloresanAkcve
HücreAyırma
(FACS)
veya
Mikrofluidler
Tekhücreizolasyonu
SNP/CNV
Hücrecpikimliklendirmesi
Genommodifikasyonu
ANALİZ
Genocpleme:Dizianalizi
DNAekstraksiyonu
Tümgenomhaplocpanalizler
DNAekstraksiyonu
Ayda1
yumurta
Herbir
ejakulaPa106
sperm
Genocpleme:Dizianalizi
BüyükölçekliGerm-line
denovomutasyon
tayini
“Mayockyönlendirme”
Genharitalama/SNPkimliklendirme/
Popülasyonçalışmaları
Genocpleme
•  MolekülerbiyolojitekniklerikullanılarakbireyinDNAdizisininincelenmesi,
başkabireylerleyadareferansDNAdizisiilekarşılaşTrarak,bireyingenoUp
farklılıklarınıbelirlemeişlemidir.
•  BireylerinebeveynlerindenkalıTlanalellerigösterir.
TekNükleocdPolimorfizmi
(SingleNükleocdPolimorfizm–SNP)
Aynı türün genomları
çeşitlilikleridir.
arasındaki
varyasyon
1. İnsan genomlarındaki genom değisiklikleri kisilere
göredeğismelerinerağmenetkileriyoktur.
2. Diğer değisiklikler fenoUpi, vücut yapısını belirleyen
normal değerleri, metabolizmayı, pigmentasyonu vb
etkileyebilirveherkisiyiözelyapar.
3.Bazıvaryantlarpatojenikcr.
6 milyondan fazla SNP
kimliklendirildi.
Her500bazda0.5-10kez
gözlenebilirler.
~60,000genleriniçinde
Myerset.al.2008NatureGene,cs40,1124-1129
3milyarnükleocd
300bingen
İnsanGenomProjesi–1990/2004
“TheLanguageofGod”FrancisCollins
~33bingen
~GenomdaSNP’lervar
Uluslararasıİnsan
HaplocpHaritaProjesi
(HapMap)–2005/-
11farklıpopülasyon
~21bingen
~Her50/100bç1SNP
GenocplemedeKullanılanTeknikler:
1.  RestriksiyonFragmentUzunlukPolimorfizmi(RFLP)
2.  RastgeleÇoğalTlmışPolimorfikTanımlama(RAPD)
3.  ÇoğalTlmış Fragment Uzunluk Polimorfizmi Tanımlama
(AFLPD)
4.  Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) / Gerçek Zamanlı – PCR
(RT-PCR)
5.  Alel-SpesifikOligonükleocdProb–Hibridizasyon
6.  DNAdizianalizi
7.  DNAmikroarray/SNParray
Alel-SpesifikOligonükleocdProb–Hibridizasyon
GenomikDNA
! BilinenSNPler.
! Ucuz.
ASO(C)
AlelSpesifikOligonükleocdler
ASO(T)
! Radyasyonyadafloresanboya.
Genocp
Prob
Prob
Dot-blotüzerindekiDNAörnekleri
DiziAnalizi
•  Verilen DNA fragmenUnin nükleoUd (adenin, guanin, sitozin, Umin)
sıralamasınıbelirlemeişlemidir.
DNAdizianalizinedenönemlidir?
!  Dizinin sıralanışını belirler, böylece organizmanın neden ve nasıl
yaşadığıhakkındabilgiverir.
!  Bireylerin genleri, geneUk bölgeleri (genler ya da operonlar), bir
kromozomuyadatümgenomudizianalizleriilebelirlenebilir.
!  Hayvanlar, bitkiler, bakteri vb gibi geneUk bilgi taşıyan her kaynaktan
elde edilen DNA veya RNA moleküllerinden nükleoUd dizi analizi
yapılabilir.
AdliBilimler
Evrim
Biyolojisi
Geneck
DNADizi
Analizi
Molekuler
Biyoloji
Metagenomik
Mikrobiyoloji
Tıp
DiziAnaliziYöntemleri
1.SangerDiziAnalizi(DideoksiDNAdizianaliziveyazincirsonlandırma)
invitroDNAreplikasyonuesnasındaDNA
polimeraz taracndan zincir sonlandıran
dideoksinükleoUtlerirastgeleseçerekdizi
belirlemesinedayanmaktadır.
Sanger dizi analizi tekniği hala büyük
ölçüdekullanılmaktadır.
500bç<dizileriçinideal.
2.Pyrosekanslama
Dideoksi nükleoUdleri ile zincir sonlandırma
yerine “sentezle dizi analizi” yöntemine
dayanır.
3.Shotgundizianalizi
1000bç-tümkromozomanalizi
4.KöprüPCR
KaTbiryüzeyebağlananprimerlerlegüçlendirilmiş
"DNAkolonileri"yada"DNAkümelenmeleri"dizi
analiziformudur.
5.YeniNesilDizileme(NextGeneraconSequencing–NGS)
•  Varyasyonprofilendirilmesi
–  GeneUkvaryasyon
–  Transkriptvaryason
–  EpigeneUkvaryasyon
–  Metagenomikvaryasyon
•  Keşif
–  Yenigenomlar
–  Yenigenler
–  Yenitranskriptler
–  Küçük/uzunnon-codingDNA
Yeniden-sekanslamabirbireyeaitgenomanalizi,aynıtürünfarklı
bireylerindeki geneUk varyasyonları temsil etmediği için
gereklidir.
Bugün
RNADizianalisi(RNASeq)
• Kodlayanveyakodlanmayanbölgelerdekitransciprtprofillendirilmesi
Epigenomik
• Tümgenomprotein-DNAetkileşimi
• Genregülasyonununkalıtsalvegeridönüşümlüifadesi
YeniNesilDizilemeMetodları
1.  Massivelyparallelsignaturesequencing(MPSS)
2.  Polonysequencing
3.  454pyrosequencing(beadmicroreactor)
4.  Illumina(Solexa)sequencing
5.  SOLiDsequencing(2baseencoding)
GenelÖzellikeri
A.GenomikDNA’nınrastgelefragmentasyonu
B.BoncukyadadüzlemselkaTyüzeydesteklerkullanılaraktektek
DNAfragmentlerininimmobilizasyonunusağlamalı.
C. PCR kullanarak DNA fragmentlerinin kaT yüzeyde amplifiye
etmekveböylecepolimerazkolonilerioluşturmak.
D. Dizi analizi ve floresan ya da kemilüninesans kullanarak her
döngüdensonrainsitusorgulamak/kontroletmek.
DNAmikroarray(DNA-chips,Gene-Chips,SNP-chips)
! 
Silikon,camveyanaylontabakaüzerindesabitkonumlardabilinenkısakomplementer
DNAoligonükleoUtlerisıraylayerleşUrirler.
! 
OligonükleoUdler deneysel olarak belirlenirler ve (1) microspotlama ya da (2) bir çip
üzerindesentezlenirler.
! 
Kullanıcı tanımlı SNP çipleri Ucari olarak temin edilebilir, ve> 400,000 farklı probu
içerebilir.
HuangH.etal.2015Microarrays4(4),570-595
Genlerinekspresyonseviyeleriniölçmekyadabirgenomdabirden
fazlagenbölgesindegenocplemesikullanilır.
Her bir DNA probu (veya oligo)
10-12 pikomol özel DNA dizisini
içerir.
cDNA örneği hibridizasyon için
kullanılanbirgenyadabaşkaDNA
elemanınınkısaparçasıolabilir.
Prob-hedefleyerek hibritlemede
hedef nükleik asit sekanslarının
göreceli olarak belirlemek için -
gümüş- veya kemilüminesans
eUketlemeiletespitedilir.
DNAMikroarrayUygulamaAlanları:
1)  GenEkspresyonProfilendirilmesi
2)  KomperacfGenomHibridizasyon(CGH)
3)  GeneID
4)  KromacnimmünopresipitasyononChip
5)  DamID
6)  SNPdeteksiyonu
7)  AlternacfKesimDeteksiyonu
8)  FüzyonGenArray
9)TilingArray
RNAdizianalizindeişakışı:
RT&Ikinci-zincir
sentezi
PCR
invitrohücreha_
RNA
cDNA
Doku/Organ
RealTimeKonfirmasyon
EkspresyonProfilleri
ÇoğalmışcDNA
DiziAnalizi
RNAdizianaliziuygulamarı:
•  Genekspresyonu
•  SNPkeşfi
•  Post-transkripsiyonelSNP
•  Ko-ekspresyonyolakları
bgisequence.comsitesindenalindi.
HedefBölgeSeçimi
PCRAmplifikasyonu
DiziAnalizi
(ShortgunyadaYüksekverimlilikli)
GenomAnotasyon
DNAdizianalizi
ProteinTahmini
Yolaklar
KomperacfAnaliz
GELECEK… GenomDüzenleme
Hedeflenen nükleazların rekombinasyon vektörleri
kullanarak ya da kullanılmayarak uygulanmasına
“genomdüzenleme"denir.
Genom düzenleme araçları, in vitro ve in vivo olarak
hedeflenen mutasyonların elde edilmesinde, gen yer
değişcrmesindevegendüzelclmesindekullanılabilir.
Nükleazakcvitesinin sekansıspesifikveDNA'ya
bağlanabilmesi için, istenilen bölgeye özgü DNAbağlamaproteinlerikullanılabilir(DNA-binding).
Buproteinler:
(1)Zinc-fingerproteinleri(ZFPs)
(2) Transkripsiyon akUvatörü benzer efektör (TALE)
(transcripUonacUvator-likeeffector)proteinleri
(3)Kümelenmişdüzenliaraboşluklukısapalindromik
tekrarlar (CRISPR/Cas) (Clustered regulatory
interspacedshortpalindromicrepeats)
FDAonayıalındıktansonra...
ZFNsklinikdeneylerletestediliyor.
TALENveCRISPR/Casteknolojilerinispetenyeni
vehenüzklinikuygulamalardatestedilmemişUr.
CRISPR / Cas İngiltere'de insan embriyo ediUng
içinonaylanmışTr.
ZincFingerNükleaz(ZFN)
3+ZFModül,herbiri3bç
Nükleazfüzyonu
TALEfektorNükleaz(TALEN)
10+TALModül,herbiri1bç
Nükleazfüzyonu
CRISPR/Cas9
1hedefRNA
Nükleazabağlanma
CRISPR/CasSistemi
Clustered,Regularly-Interspaced,ShortPalindromicRepeats(CRISPR)–Associated
proteinsystem(/Cas)
VirusveplasmidlerekarşıprokaryoUkimmünsistem.
S.pyogenesSF370TipIICRISPRlokusu4geniçerir:
I.Cas9nükleaz
II.2non-codingCRISPRRNA(crRNA)
III.trans-akUvatörcrRNA(tracrRNA)
IV.Prekürsör(oncu)crRNA(pre-crRNA)
özdeşdoğrudantekrarlartaracndanaraboşluklunükleazkılavuz
RNAbileşenleri,buyabancıgeneckdizileriDSB
(double-strandbreak,ci|-zincirkırıkları)
oluşturmakiçinspesifikDNAdizilerineCas9
endonükleaziniyönlendirmekcr.
CRISPR/Cas9TeknolojisindenSonraBiyolojisinSonAdımı
TamamlanmışOldu
DNAyapısı/dizilenmesi
PCR
SNPtayini/Ekspresyoncalismlari
Genomdüzenleme
KökHücre-CRISPR/Cas9GenomModifikasyonu
CRISPR/Cas9+ESCveyaiPSC=TEDAVİ
Hücre
Kültürü
Geneck
Moleküler
Biyoloji
Tıp
Workshop:
1. İstenilengenbölgesininnükleoUddizisinenasılulaşabiliriz?
2. DNAdizisindekitekrarlıbölgelerintespitedilmesi?
3.HedefbölgedekiSNPtayinivepopulasyondakiönemi?
4.HedefSNP’inhastalıkyapıcıözelliklerininaraştırılması?