mantarların ep0dem0yoloj0k t0plend0r0lmes0

MANTARLARIN EPİDEMİYOLOJİK
TİPLENDİRİLMESİ
Dr. Ayşe Kalkancı
Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
Ankara
Taksonomik terimler
•
•
•
•
•
•
•
•
Alem (Kingdom)
Bölüm veya şube (divisio, filum)
Sınıf
Takım
Aile
Cins
Seksiyon
Tür
Kwon-Chung K J Clin Infect Dis. 2012;54:S8-S15
İzolat ve köken (strain) nedir ?
• İzolat: tek bir
mikroorganizmanın tek
kolonisinden elde edilen
saf kültürdür. Burada bir
tiplendirme yöntemi
yoktur. Sadece saf kültür
vardır.
• Köken (strain):
tiplendirildiği zaman
birbirinden ayrılamayan
izolat setidir.
İzolat ve köken (strain) nedir ?
• İzolat: tek bir
mikroorganizmanın tek
kolonisinden elde edilen
saf kültürdür. Burada bir
tiplendirme yöntemi
yoktur. Sadece saf kültür
vardır.
• Köken (strain):
tiplendirildiği zaman
birbirinden ayrılamayan
izolat setidir.
Köken 1
Köken 2
Köken 3
Köken 4
Tiplendirme nedir ?
• Tiplendirme sonucunda basit bir soruya cevap
ararız;
İzolatlar aynı mıdır ? Farklı mıdır ?
▫ Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar tek bir
atadan klonal olarak gelişirler
▫ Klonal izolatlar aynı tiptir ve ilişkisiz izolatlardan
farklı bir tip gösterirler
Terimler
• Epidemi: Bir etkenin hızla salgın yapması
• Pandemi: Aynı hastalığın deniz aşırı ülkelerde,
uzak coğrafyalarda görülmesi
• Epidemiyoloji: Çevresel, mikrobiyolojik ve klinik
bilgilerin bir arada değerlendirilmesi
• Moleküler epidemiyoloji: Mikroorganizmaların
DNA bilgisinin çevresel, mikrobiyolojik ve klinik
bilgiler ile birlikte karşılaştırılarak
değerlendirilmesi
Epidemiyoloji
• Fenotipik analizler organizmanın biyolojik
özelliklerini değerlendirir
• Moleküler epidemiyoloji genomik DNA veya
plazmid DNA’sının genotipik analizidir
▫ Tür, köken (strain), veya tipe özgül DNA dizileri
genotipik analizin temelini oluşturur
Tiplendirme sisteminin değerlendirilmesi
KRİTER
TANIMI
Tiplendirebilirlik
Mikroorganizma türlerinin çoğu ile net olarak
karşılaştırılabilir sonuçlar verebilme kapasitesi
Tekrarlanabilirlik
Tekrarlandığında aynı mikroorganizma türü ile aynı profil
tipinin elde edilmesi kapasitesi
Ayırım gücü
Aynı mikroorganizma türünün farklı kökenlerini (strain)
birbirinden ayırabilmeye yetecek sonuçlar verebilme
Diğer kriterler
Yöntem hızlı, kolay, ucuz, ve teknik olarak basit olmalıdır.
Laboratory Training for Field Epidemiologists
Laboratory Training for Epidemiologists
Tiplendirme
• Fenotipik tiplendirme
▫ Koloni tipi, antifungal duyarlılık profili, serotip,
• Genotipik tiplendirme
▫ DNA temelli yöntemler, protein temelli yöntemler
ve dizi analizi yöntemleri
Yöntem
DNA temelli yöntemler
Bölgeye özgül PCR-RFLP
Genomik DNA’nın restriksiyon endonükleaz analizi
Pulsed-field jel elektroforezi
(Elektroforetik karyotipleme)
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism)
Mikrosatellit analizi
Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST)
Dizi analizi
Protein temelli yöntemler
İmmünblot parmak izi
Poliakrilamid jel elektroforezi
Multilokus enzim elektroforezi
İkinci kuşak yöntemler
Birinci kuşak
yöntemler
Genomik DNA izolasyonu
restriksiyon ve Southern
Blotting
Plazmid analizi
Restriksiyon enzim analizi
Mantar hücresi
Dördüncü kuşak
yöntemler
Üçüncü kuşak
yöntemler
MLST
Mikro satellit analizi
RAPD
PFGE
Amplifikasyon (çoğaltma) olmadan
genotiplendirme
Yöntem
DNA temelli yöntemler
Bölgeye özgül PCR-RFLP
Genomik DNA’nın restriksiyon endonükleaz analizi
Pulsed-field jel elektroforezi
(Elektroforetik karyotipleme)
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism)
Mikrosatellit analizi
Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST)
Dizi analizi
Protein temelli yöntemler
İmmünblot parmak izi
Poliakrilamid jel elektroforezi
Multilokus enzim elektroforezi
PFGE
Mikroorganizma
süspansiyonu
Agaroz içinde DNA eldesi
Enzim ile restriksiyon
Değişen açılardan
elektroforez
Karyotip analizi
Amplifikasyon sonrası genotiplendirme
EcoRI
Yöntem
DNA temelli yöntemler
Bölgeye özgül PCR-RFLP
Genomik DNA’nın restriksiyon endonükleaz analizi
Pulsed-field jel elektroforezi
(Elektroforetik karyotipleme)
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism)
Mikrosatellit analizi
Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST)
Dizi analizi
Protein temelli yöntemler
İmmünblot parmak izi
Poliakrilamid jel elektroforezi
Multilokus enzim elektroforezi
DNA dizi analizi
PCR
Saflaştırma
“Cycle Sequencing” (ddNTP)
Presipitasyon
Kapiller jel elektroforezi ve okuma
“Cycle Sequencing” (ddNTP)
5’
3’ Kalıp
G C A T G C
5’ Primer
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
ddCTP
GddC
GCATGddC
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
ddATP
GCddA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
ddTTP
GCAddT
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
ddCTP
ddG
GCATddG
rDNA gen bölgesi
5.8S
D1/2
18S
5S
28S
IGS1
IGS2
18S
ITS1 ITS2
ITS : Internal Transcribed Spacer
IGS : Intergenic Spacer
8,188 bp
Hangi bölgeyi dizileyelim ?
Sı
nı
f Aile
18S
28S
ITS
IGS
Cins
Tür
Köken
Yöntem
DNA temelli yöntemler
Bölgeye özgül PCR-RFLP
Genomik DNA’nın restriksiyon endonükleaz analizi
Pulsed-field jel elektroforezi
(Elektroforetik karyotipleme)
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism)
Mikrosatellit analizi
Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST)
Dizi analizi
Protein temelli yöntemler
İmmünblot parmak izi
Poliakrilamid jel elektroforezi
Multilokus enzim elektroforezi
Mikro satellit analizi nedir ?
• Rasgele tekrar eden DNA dizilerine mikro satellit
nedir.
• Kısa tekrar bölgeleri (Short tandem repeats)
• Çoğaltılarak karşılaştırılmaları ile kökenler
tiplendirilir
• 35 C. glabrata kökeni
• RPMI2, MT1, Cg6
• CgERG11 geni, CgPDR1, NTM1, URA3 bölgeleri
dizilendi.
• GENOTİP ile DİRENÇ arasında ilişki yok
• Mikrosatellit analizi uygulanabilir
• Ayırt etme gücü var, ancak ideal değil.
Mikoloji alanında kullanımı açısından
karşılaştırılmaları
Yöntem
PCR-RFLP
REA
Tiplendirebilirlik
Tekrarlanabilirlik Ayı
rı
m gücü
Karşı
laştı
rma
kolaylı
ğı
Teknik
kolaylı
k
Kolay
Mükemmel
İyi
Orta
Mükemmel
İyi
İyi
İyi
Zayı
f
Mükemmel
Orta
PFGE
Mükemmel
İyi
Mükemmel
Mükemmel
RAPD
Mükemmel
İyi
İyi
Kötü
Kolay
Mikrosatellit
analizi
Mükemmel
iyi
Mükemmel
İyi
Kolay
İyi
Mükemmel
İyi
Mükemmel
Zor
Dizi analizi
Moleküler tiplendirme ile şu basit
sorulara cevap ararız;
•
•
•
•
•
•
İzolatlar aynı mı ?
İzolatlar farklı mı ?
Salgın var mı ?
Hastadan hastaya nasıl bulaştı ?
Re-enfeksiyon mu ?
“Breakthough” yani tedavi altında alevlenme var mı ?
•
•
•
•
35 kandidemi episodu
C. parapislosis ve C. albicans
C.metapsilosis veya C. orthopsilosis yok
Anestezi ve Nöroloji YBÜ’de genotip kümelenmesi
• Nozokomiyal bulaş !!!
•
•
•
•
•
4 yenidoğan, kandidemi
C. pelliculosa (anamorfu Pichia anomala)
Tür tanımı için ITS bölgesi dizi analizi
Genotiplendirme için RAPD
TEK GENOTİP
• Nozokomiyal bulaş !!!
7 ayrı karyotip
6 ayrı genotip
• 6 merkez, 107 izolat
• IGS bölgesi dizi analizi
• Bilinen 8 T. asahii genotipi, 1 adet yeni genotip
• Genotip 1 (% 79)
Nosokomiyal kandidemi analizi
•
•
•
•
•
•
•
İzlanda
1991-2006
Retrospektif
217 izolat
Olgulara ait bilgiler
DNA parmak izi (“fingerprinting”)
M13 (GACA) primeri ile RAPD veya AP-PCR
Asmundsdottir LR, Erlendsdottir H, Haraldsson G, Guo H, Xu J,
Gottfredsson M. Molecular Epidemiology of Candidemia: Evidence
of Clusters of Smoldering Nosocomial Infections. Clinical Infectious
Diseases 2008; 47:e17–24.
Asmundsdottir LR, Erlendsdottir H, Haraldsson G, Guo H, Xu J,
Gottfredsson M. Molecular Epidemiology of Candidemia: Evidence
of Clusters of Smoldering Nosocomial Infections. Clinical Infectious
Diseases 2008; 47:e17–24.
Barkot nedir ?
• Sitokrom oksidaz 1 (CO1) hayvanlarda
barkodlama için kullanılmıştır
• Mantarlarda CO1, ITS denenmiştir
• Protein kodlayan genler !!!
▫ Ortak bir primer dizisi yok (Schoch, 2012)
▫ Intronların varlığı kısıtlayıcı.
http://www.fungalbarcoding.org/
• MLST ayırım gücü düşük
• Mikrosatellit daha iyi bir tiplendirme yöntemi
• MLST tür tanımı için ideal
Sık yapılan hatalar
• Kültür ortamındaki üremenin tek köken olmaması
▫ Çoklu köken taşıyıcılığı hasta yaşı ile birlikte artar
• İnceleme süresinin geniş olması
• İncelenecek topluluk büyük olması
Öneriler
Çalışmaya başlamadan önce
• Hasta kimlik bilgileri
▫ İsim, adres, telefon, yaş, cinsiyet, ırk, meslek
• Klinik bilgiler
▫ Uygulanan invaziv girişimler, altta yatan hastalıklar,
antibiyotik tedavisi
• Klasik epidemiyolojik bilgiler
▫ Hastanın doğduğu ve hastalığın ortaya çıktığı yer,
yatış ve çıkış bilgileri, yattığı birimler
Öneriler
Çalışma sırasında ve sonrasında
•
•
•
•
•
•
Tek koloni üzerinden çalışılmalıdır
Hiçbir yöntem altın standart değildir
Birden fazla yöntem bir arada kullanılabilir
Sonuçlar bilgisayar destekli incelenmelidir
Jel fotoğrafları çekilmelidir
Veri bankalarında saklanmalıdır
TEŞEKKÜR EDERİM