Enzim Analizi - mustafagermec

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ UYGULAMA DERSİ NO:5
Enzim Analizleri
1. Enzimler
Enzimler, hücreler ve organizmalardaki reaksiyonları katalizleyen ve kontrol eden protein
yapısındaki bileşiklerdir. Reaksiyon hızını klasik kimyasal katalizörler ile kıyaslanamayacak
kadar
artırırlar.
Enzimlerin
katalitik
gücünü
anlayabilmek
için
hidrojen
peroksitindekompozisyon reaksiyonu iyi bir örnek oluşturmaktadır. H2O2’in su ve oksijene
parçalanması termodinamik açıdan istemli bir reaksiyondur. Fakat H2O2 çözeltisi şişe
içerisinde pratikçe bozunmadan aylarca saklanabilir. Çözeltiye az miktarda FeCI3 ilave
edilirse bozunma reaksiyonunun 1000 kat arttığı gözlenir. İnorganik demir (3) tuzu yerine
demir (3) iyonu içeren protein (Hemoglobin) kullanılırsa bozunma 1000 kat daha
hızlanacaktır. Çoğu hücrelerde bulunankatalaz enzimi ise H2O2’in bozunma hızını 109 kat
artırmaktadır. Bazı hücresel reaksiyonlar sonucu oluşan H2O2 çok tehlikeli bir oksidandır ve
bu tehlike hücrede bulunan katalaz sayesinde ortadan kaldırılır.
Enzimler katalizör tanımına uyarlar, az miktarı yeterlidir, reaksiyon sırasında değişime
uğramaz, reaksiyon hızını çok artırır ve dengenin çabuk yerleşmesini sağlar ama asla
reaksiyon dengesini değiştirmezler. Bugün bilinen yaklaşık 4000 enzim mezofilik
organizmalardan elde edilmiştir. Mezofilik organizmalardan elde edilen enzimler nötralpH
bölgesinde ve dar bir aralıkta, 25-450C sıcaklıkta, atmosfer basıncı dolayında aktive
göstermektedir.
Doğal enzimlerden katalitik potansiyellerinden daha verimli yararlanmanın bir yolu
immobilizasyondur. İmmobilizasyon, çeşitli fiziksel veya kimyasal yollardan destek materyali
vasıtasıyla hareketin sınırlandırılmasıdır. Bu sayede hem enzimin kararlılığı artmakta hem de
enzim preparatı birçok kez kullanılmaktadır (Bu konu ileriki uygulamalarda ayrıntılı olarak
anlatılacaktır).
Enzimler temel yapı olarak monomerik veya oligomerik protein molekülleridir. Çoğu
enzimler amino asitlerden oluşan polipeptid zincir veya zincirleri yanında kofaktörleri (Cu,
Fe, K, Mg, Mn, Mo, Ni, Se, Zn), prostetik grupları (NAD, FAD, B vitaminleri), karbonhidrat
veya lipid gruplarını da içerebilirler. Enzimleri diğer katalizörlerden ayıran üç temel özellik
vardır:
 Yüksek katalitik güç
 Spesifiklik
 Katalitik aktivitelerinin ayarlanabilir olması.
2. Enzim Aktivitesi ve Ölçümü
Enzim aktivitesi, enzimin belli koşullarda sahip olduğu aktif enzim miktarının bir
ölçüsüdür ve birim zamanda (saniyede) değişime veya dönüşüme uğratılan Substratınmol
sayısı ile ifade edilir. Bu tanımlama SI-Birimler sistemine uygun olup bu sistemde enzim
aktivite birimi katal’dir. 1 katal = 1 mol/saniye’dir. Daha pratik ve yaygın olarak kullanılan
aktivite birimi Uluslararası Birim’dir ve IU veya EU şeklinde kısaltılır. Uluslararası Birim,
1
dakikada bir mikromolsubstratı dönüşüme uğratan enzimin aktivitesidir (1 Enzim ünitesi (EU)
= 1 µmol/dak). Görüldüğü gibi uluslararası enzim aktivite birimi tanımında enzim miktarı yer
almamaktadır. Bu tanıma enzim miktarı eklendiğinde spesifik aktivite birimi ortaya çıkar. 1
mg enzim tarafından 1 dakikada dönüşüme uğratılan enzimin aktivitesi o enzimin spesifik
aktivitesidir. Spesifik aktivite enzim preparatının saflık düzeyinin bir ölçüsüdür.
Enzim aktivitesi, enzimatik reaksiyonda substratkonsantrasyonundaki azalma veya ürün
konsantrasyonundaki artış yardımı ile izlenir.
2.1.
Aktivite tayin yöntemleri
Enzim aktivite tayininde kullanılan yöntemler şunlardır:







Spektrofotmetrik yöntemler: Reaksiyon ortamında absorplanan ışık miktarındaki
değişim izlenir. Örneğin; spektrofotometrik yöntemde mannanaz enzimi aktivitesi,
540 nm dalga boyunda ölçülmektedir.
Fluorimetrik yöntemler
Lüminesans yöntemler
İmmunokimyasal yöntemler
İyon selektif ve oksijen selektif elektronlar
Radyometrik yöntemler
Kalorimetrik ve manometrik teknikler
3. Mannanaz Enzimi Aktivitesinin Tayini ve Miktarının Belirlenmesi
3.1.




3.2.
DNS Hazırlanması
10 g Dinitrosalisilik asit
0.5 g Sodyum sülfit
10 g Sodyum hidroksit
Üzerine 1 L DI su
Substratın Hazırlanması
1. Aşama
1,5 L 50 mM’lik Sodyum sitrat hazırlanır. Bunun için;
y =50 mM X MA X 1,5 L
400 mL, 50 mM’lik sitrik asit hazırlanır. Bunun için;
y =50 mM X MA X 0,4 L
1,5 L Sodyum sitrat üzerine yavaş yavaş sitrik asit solüsyonu ilave ederek ph 6’ya
ayarlanır.
2
2. Aşama
2 L’likerlenmayerepH 6’lık 1,5 L solüsyonundan ilave edilir ve üst çizgisi işaretlenir.
2L’lik erlenmayerde bulunan 1.5L’lik solüsyondan 400 mL’si alınır. Kalan 1,1 L’lik solüsyon
içine manyetik balık atılarak 200°C’da karıştırılır. Isıtma ve karıştırma devam ederken 7,5 g
“LocustBeanGum (LBG)” ilave edilerek çözündürülür. LBG’nin topaklaşmaması için yavaş
yavaş ilave edilir. Son olarak oda sıcaklığında soğumaya bırakılan solüsyon +4’de manyetik
karıştırıcı ile 18-24 saat arası sürekli karıştırılır. Geriye kalan pH’ı 6 olan solüsyondan (400
mL), hazırlanan LBG’nin işaretlenen hacim çizgisine kadar ilave edilir.
3.3.
Mannanaz Enzimi Aktivitesinin Belirlenmesi
Fermentasyon ortamından alınan örneklerde mannanaz aktivitesi belirlenecektir. Bu
amaçla endo-beta-1,4 mannanaz, DNS (dinitro salisilik asit) metodu ile belirlenecektir.
Öncelikle Na-sitrat tamponunda (pH 6) keçiboynuzu gamı solüsyonu (%0.05 w/v)
hazırlanacak ve belirtilen solüsyonun 1.8 ml’si ile 0.2 ml 20 kat seyreltilmiş fermentasyon
örneklerinin berrak kısmı bir test tüpünde karıştırılacaktır. Su banyosunda 50ºC’de 5
dakikainkübasyona bırakıldıktan sonra 3 ml DNS çözeltisi eklenecek ve tüpler daha sonra
90ºC’lik su banyosunda 15 dakika kaynatıldıktan sonra soğutulmak üzere buz banyosuna
aktarılacaktır.
Elde edilen örnekler 540 nm’despektrofotometrede ölçülecek ve değerler mannoz
standart kurvesinden faydalanılarak aktivite belirlenmesinde kullanılacaktır. Mannanaz
aktivitesinin tanımlanmasına uygun olarak elde edilen aktivite değerleri U/ml olarak
belirlenecektir. Enzim aktivitesinin bir birimi (1U=16.7nkat), bir dakikada 1 µmol Dmannoz’a eşit gelen indirgen şekerleri serbest hale geçiren enzim miktarı olarak
tanımlanmıştır.
Mannoz standart kurvesi, farklı konsantrasyonlarda D-mannozun (0-10 µmol/ml)
hazırlanması ve DNS metodu uygulandıktan sonra 540 nm’deabsorbanslarının ölçülmesi ile
çizilecektir. Standart kurve çizildikten sonra aşağıdaki denklem oluşturulacaktır.
(1)
Denklemde,
a: Standart kurvenin eğimi
b: Standart kurvenin kesim noktası
Cmannoz= Mannozkonsantrasyonu (µmol/ml)
3
Ort. Abs
0
0,280
0,767
1,516
2,884
Mannoz
Konsantrasyonu
(mmol/L)
0
1
2,5
5
10
Örneklerin indirgen şeker içeriği Eşitlik 1’e göre hesaplanacaktır. Mannanaz aktivitesinin
belirlenmesinde her bir örnek için mannozkonsantrasyonuna eşit olan indirgen şeker miktarı
kullanılacaktır. Bu amaçla;
(2)
Denklemde,
DF:Dilüsyon faktörü
RV: Test tüpündeki toplam hacim/enzim solüsyonunun hacmi
t: Reaksiyonda kalma zamanı (dak)
Yukarıdaki eşitlik kullanılarak enzim aktivitesi hesaplanır.
“Enzim Analizleri” konusuna ait rapor soruları:
1.
Yapılan enzim analizi sonucunda elde edilen ortalama mannozAbsorbas
değeri 0.350 nm’dir. Bunun sonucunda mannanaz enzimi aktivitesinikatal, microkatal
ve nanokatalolarak hesaplayınız? (1 U = 1/60 microkatal = 16.7nanokatal)
Veriler
20
Dilüsyon faktörü
5 ml
Test tüpündeki toplam hacim
0,2 ml
Enzim solüsyonunu hacmi
300 saniye
Zaman
2.
Enzimlerin genel özellikleri nelerdir? Enzim aktivitesi ve ölçümünün temel
prensibi hakkında bilgi veriniz?
Bonus:Enzim aktivitesine etki eden faktörler nelerdir? (10 puan)
DİKKAT!
4
Rapor yazımında “Enzim Analizleri” konusuna ait yukarıda yer alan rapor sorularını
cevaplayınız (40 puan).
5