tc ege üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü acc mutant telomerik
advertisement
T. C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ACC MUTANT TELOMERİK TEKRARLARLA TRANSFORME KLUVEROMYCES LACTIS HÜCRELERİNDE TELOMER DEVAMLILIĞININ MEKANİZMASI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Programı Yüksek Lisans Tezi Bilge DEBELEÇ BÜTÜNER DANIŞMAN Prof.Dr. Zeki TOPÇU İZMİR 2007 i ii ÖNSÖZ Günümüzde insan sağlığını tehdit eden önemli hastalıklardan biri olan kanserin mekanizmasının anlaşılmasına ilişkin çalışmalar, ilaç hedeflerinin belirlenmesi açısından önemli bir araştırma alanıdır. Telomerler ve insan hastalıkları arasındaki bağlantının anlaşılması da bu açıdan önemlidir. Projemizin de, telomer ve telomerazı hedef alan ilaç geliştirme çalışmaları açısından yol gösterici olacağı düşüncesindeyiz. Bu çalışma esnasındaki katkılarından dolayı proje yöneticisi ve tez danışmanım Prof. Dr. Zeki Topçu’ya teşekkür ederim. Tez çalışmam esnasında laboratuarda birlikte çalıştığım arkadaşlarım Arş.Gör. Nuriye Serra İstanbullu ve Arş.Gör. Özlem Küçükoğlu’na, tezin yazılma sürecinde hayatımı kolaylaştırmak adına gösterdikleri çabaları için Arş. Gör. Şüra Baykan Erel’e ve Arş. Gör. Ayşe Nur Yurtman’a, yaşamımın her alanındaki desteklerinden dolayı eşim İsmail Bütüner’e ve ailem Hanife-Erdoğan Debeleç’e çok teşekkür ederim. iii İÇİNDEKİLER 1. Bölüm I .................................................................................................................... 1 1.1. Giriş .................................................................................................................. 1 1.2. Genel Bilgiler ................................................................................................... 3 1.2.1. Telomer-Telomeraz Kompleksi................................................................ 3 1.2.1.1. Telomer ............................................................................................. 3 1.2.1.1.1. Telomerik DNA ........................................................................ 4 1.2.1.1.2. Telomerik Proteinler ................................................................. 7 1.2.1.1.2.1. Çift Zincirli Telomerik DNA Bağlanma Proteinleri......... 8 1.2.1.1.2.2. Tek Zincirli Telomerik DNA Bağlanma Proteinleri......... 8 1.2.1.2. Doğrusal Kromozom Uçlarının Replikasyon Problemi .................... 9 1.2.1.3. Telomeraz Ribonükleoprotein Kompleksi........................................ 9 1.2.2. Telomerlerde Meydana Gelen İşlemler .................................................. 12 1.2.2.1. Telomerik Tekrarların Replikasyonu.............................................. 12 1.2.2.2. Telomerik Tekrarların Uzatılması................................................... 13 1.2.2.3. Telomer Uzunluğunun Düzenlenmesi ............................................ 13 1.2.2.4. Telomerlerdeki Rekombinasyonel Olayların Düzenlenmesi .......... 15 1.2.3. Genetik Rekombinasyon......................................................................... 15 1.2.4. Kluveromyces lactis ................................................................................ 16 1.2.5. Telomerazdan Bağımsız Telomer Devamlılığı....................................... 17 1.2.5.1. Mayada Rekombinasyonel Telomer Devamlılığı ........................... 18 1.2.5.1.1. Telomeraz Aktivitesine Sahip Olmayan Mutant Maya Hücreleri................................................................................. 18 1.2.5.1.2. Rekombinasyonel Telomer Uzaması Modelleri...................... 20 iv 1.2.5.2. Memeli Hücrelerinde Telomerazdan Bağımsız Telomer Devamlılığı .................................................................................... 21 1.2.6. Alternatif Telomer Uzaması ve Kanser .................................................. 23 2. Bölüm II Gereç ve Yöntem .................................................................................... 26 2.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ...................................................................... 26 2.2. Kullanılan Cihaz ve Aletler............................................................................ 27 2.3. Kullanılan Besiyeri ve Çözeltiler ................................................................... 28 2.4. Laboratuar Çalışmaları ................................................................................... 30 2.4.1. Çalışma Düzeneği................................................................................... 30 2.4.2. Maya Kökenleri ...................................................................................... 31 2.4.3. Mutant Telomerik Tekrar Taşıyan K. lactis Hücrelerinin Oluşturulması ve Transformasyonu ...................................................... 31 2.4.4. Fenotipik Değerlendirme ........................................................................ 34 2.4.5. K. lactis Genomik DNA İzolasyonu....................................................... 36 2.4.6. Telomerik DNA Analizleri ..................................................................... 36 2.4.7. Southern Blot.......................................................................................... 38 2.4.8. K. lactis Transformantlarının -His ve -Ura Besiyerlerinde Analizleri.... 38 3. Bölüm III Bulgular................................................................................................. 39 4. Bölüm IV Tartışma ................................................................................................ 52 5. Bölüm V Sonuç ve Öneriler................................................................................... 58 6. Bölüm VI Özet ve Abstract.................................................................................... 60 7. Bölüm VII Kaynaklar............................................................................................. 62 v TABLO DİZİNİ Tablo 1: Çeşitli türlerde telomerik tekrar dizileri..................................................... 5 Tablo 2: Doğal, Acc ve Bcl mutant telomerik tekrar dizileri ................................. 32 Tablo 3: Fenotip özellikleri takip edilen ve DNA izolasyonu yapılan koloni sayıları........................................................................................... 39 Tablo 4: Transformantların zamana göre fenotip değişimleri ................................ 40 Tablo 5: WA2, A2,A4,B3 transformantları için hafif ve şiddetli senes fenotipi gösteren koloni sayıları............................................................... 42 Tablo 6: Acc ve Bcl transformantları için hafif ve şiddetli senes fenotipi gösteren koloni sayıları ............................................................................ 43 Tablo 7: Mutant telomerik tekrarların rekombinasyonel dağılım özellikleri ......... 50 Tablo 8: His+ ve Ura+ transformant sayıları.......................................................... 51 ŞEKİL DİZİNİ Şekil 1: Çalışmanın temel basamakları ................................................................. 31 Şekil 2: Mutant Telomerik Tekrar Taşıyan K. lactis Hücrelerinin Oluşturulması ve Transformasyonu ......................................................... 33 Şekil 3: K. lactis transformantlarının fenotiplerinin tipik skorları ....................... 35 Şekil 4: WA2, A2,A4,B3 Transformantlarının zamana göre fenotip değişimleri................................................................................................ 40 Şekil 5: Acc ve Bcl transformantlarının zamana göre fenotip değişimleri ........... 41 Şekil 6: Acc ve Bcl transformantlarının senes fenotip gösterme yüzdeleri........... 43 Şekil 7: Acc ve Bcl transformantlarının jel fotoğrafları........................................ 44 Şekil 8: 32 P işaretli KLl-25 telomerik oligo probu ile gerçekleştirilen hibridizasyon işleminin ardından elde edilen fotoğraflar......................... 47 vi ACC MUTANT TELOMERİK TEKRARLARLA TRANSFORME KLUVEROMYCES LACTIS HÜCRELERİNDE TELOMER DEVAMLILIĞININ MEKANİZMASI Uzm. Ecz. Bilge DEBELEÇ BÜTÜNER Yüksek Lisans Tezi, Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Zeki TOPÇU Ocak 2007, 71 sayfa Telomerler ökaryotik kromozom uçlarında bulunan, DNA ve proteinden oluşan yapılardır. Kanser ve insan eşey hücreleri de dahil olmak üzere ölümsüz ökaryotik hücrelerde telomer devamlılığı telomeraz enzimi ile sağlanır. Ancak telomer boylarının devamlılığının sağlanmasında telomeraz enzimi dışında “Alternatif Telomer Uzaması” olarak adlandırılan başka mekanizmaların da var olduğu düşünülmekte, ancak bu mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Çalışmamız, insan telomerik yapılarına benzerliği ile bilinen Kluyveromyces lactis modeliyle telomerazdan bağımsız telomer devamlılığını ve bunun farmasötik önemini araştırmayı amaçlamıştır. Telomer, telomeraz ve bu enzimin etkileşimde bulunduğu telomerik proteinler, umut verici antikarsinojenik ilaç hedefleri olarak değerlendirildiğinden, sonuçlarımız, alternatif telomer uzaması mekanizmalarının, antikanser tedavi stratejilerinin hedefi olarak kullanılması konusunda yeni tartışmalar açacaktır. Anahtar sözcükler: Telomer, rekombinasyon, alternatif telomer uzaması, antikanser ilaç hedefi. E-posta: [email protected] vii THE TELOMERE LENGTHENING MECHANISM IN KLUVEROMYCES LACTIS ORGANISM TRANSFORMED WITH ACC MUTANT TELOMERIC REPEATS Uzm. Ecz. Bilge DEBELEÇ BÜTÜNER M.Sc Thesis in Dept. Of Pharmaceutical Biotechnology Supervisor: Prof. Dr. Zeki TOPÇU January 2007, 71 pages Telomeres are the DNA-protein complexes found at the ends of eukaryotic chromosomes. Most immortal cells, including cancer cells and human germinal cells maintain the telomeric length by the enzyme, telomerase. However, the telomeric length maintenance is also thought to be carried out by the pathways called “Alternative Lengthening of Telomeres /ALT” other than telomerase but little is known about the mechanism of these alternative pathways. This thesis aimed to study telomerase-independent telomere maintenance pathway and its pharmaceutical significance using the yeast Kluyveromyces lactis, as a model organism, with considerable similarity to human telomeres. Because of the telomere, telomerase and a number of telomerase-interacting proteins are currently considered as the potential targets of anticancer drugs, our results will trigger new discussions in relation to employment of these alternative telomere maintenence mechanisms as the targets of anti-cancer therapy strategies. Keywords: Telomere, recombination, telomeres, anticancer drug target. E-mail: [email protected] viii Alternative lengthening of BÖLÜM I 1.1. GİRİŞ Telomer doğrusal kromozomların ucunda yer alan yapısal bir bileşendir. Gen ekspresyonunun düzenlenmesinde, rekombinasyonda, mayoz ve mitoz bölünme gibi kromozom fonksiyonlarında önemli yere sahiptir. Kromozom uçlarının bozulmadan kalmasını sağlayarak kromozoma kararlılık vermektedir. Telomeraz adlı enzim, telomerin kısalmasını önlemek için, yapısındaki RNA kalıbını kullanarak sentezlediği telomerik tekrar dizilerini kromozomun ucuna ilave etmektedir. Ancak ökaryotlarda, somatik hücrelerin çoğunda telomeraz aktif değildir. Bu nedenle her hücre bölünmesinde kromozom uçları kısalır. Birçok hücre bölünmesinden sonra da kromozomlar kritik derecede kısalır ve hücre daha fazla bölünme kapasitesini yitirir (25). Telomeraz aktivitesine sahip olmayan bazı ökaryotik hücreler (bazı kanser hücreleri de dahil olmak üzere) Alternatif Telomer Uzaması (Alternative Lengthening of Telomeres /ALT) yoluyla da telomer devamlılığını sağlayabilirler. Bunun için telomer füzyonu ya da rekombinasyon mekanizmalarından biri kullanılabilir. Saccharomyces cerevisiae ve Kluveromyces lactis başta olmak üzere mayalar rekombinasyonu kullanırlar. Telomeraz aktivitesi bulunmayan mutant maya hücreleri, ardışık hücre bölünmeleri sonucu kötüleşen büyüme fenotipleri göstermekte, hücrelerin çoğu ölmekte, az sayıdaki iyileşen hücreler de uzamış telomerler bulundurmaktadır (49,51). ix Telomerler ve insan hastalıkları arasındaki bağlantının anlaşılması için, telomer fonksiyon kaybının hücre büyümesini bloke etmek amacıyla ve hücrelerin bu sorunun üstesinden gelmek amacıyla kullandıkları mekanizmaların anlaşılması gerekmektedir. Rekombinasyonel telomer uzaması, insan kanser olgularının %10’unda telomer devamlılığı mekanizması olarak görülmektedir. Maya hücrelerinde olduğu gibi memeli hücrelerinde de görülen telomerazdan bağımsız telomer devamlılığı mekanizmalarının aydınlatılması, antikanser tedavide bu mekanizmanın hedeflenmesi açısından aydınlatıcı olacaktır (49). Bu çalışmada araştırmayı amaçladığımız nokta, tek bir mutant telomerik tekrarın telomeraz aktivitesine sahip olmayan mutant bir K. lactis’te rekombinasyon yoluyla telomer uzamasına neden olup olamayacağıdır. Hızlı ve önemli derecede telomer uzamasına neden olduğu bilinen Acc mutant telomerik tekrarından elde edilen sonuçlar, mutasyonel olarak etkisiz olduğu bilinen Bcl telomerik tekrarı ile karşılaştırılmıştır. 1.2. GENEL BİLGİLER 1.2.1. Telomer-Telomeraz Kompleksi Telomerlerle ilgili ilk araştımalar 1930’larda Barbara McClintock ve Hermann Muller tarafından gerçekleştirilmiş ve bu iki araştımacı, farklı organizmalarla birbirlerinden ayrı olarak yaptıkları çalışmalarda, kromozom uçlarında kararlılığı x sağlayan özel bir bileşen olduğunu belirlemişlerdir. Daha sonra 1978 yılında Elizabeth Blackburn, Tetrahymena telomerlerindeki TTGGGG tekrar dizilerini saptamıştır. Bu çalışmadan itibaren birçok organizmanın telomerik tekrar dizileri tanımlanmış, telomer yapısının aydınlatılması ile ilgili çok yol katedilmiştir (6,25). 1.2.1.1. Telomer Telomer doğrusal kromozomların ucunda yer alan yapısal bir bileşendir. Kromozomun üst düzey organizasyonunda ve hücre proliferasyonunda fonksiyon gösterir. Kromozom uçlarını bir başlık gibi (“capping”) koruyan telomerik kompleks, fonksiyonel telomeraz ile kombinasyon halinde, telomerin, rekombinasyona yatkın çift zincir kırıklarından ayırt edilmesine olanak veren özgün bir yapıya sahiptir. Bu özgün yapı, telomerik DNA’nın histon yapısında olmayan proteinlerle kompleks halde oluşturduğu “T-loop” yapısıdır (4,8,9). Kromozom uçlarının bozulmadan kalmasını sağlayarak kromozoma kararlılık vermektedir (51,76). Kromozom kararlılığı için telomerlerin diğer kromozom uçları ile füzyondan kaçınması gerekirken, DNA çift zincir kırıklarının başarılı şekilde onarılması için, kırık uçların tekrar birleştirilmeleri gerekmektedir. Telomerler ve DNA çift zincir kırıkları arasındaki bu farka rağmen, telomer fonksiyonu ve DNA onarımı için ortak olarak ihtiyaç duyulan birçok proteinden dolayı (Bazı DNA onarım proteinleri telomerazın telomerler üzerindeki aktivitesini kontrol etmektedir.) hücre döngüsü esnasında, kromozom uçlarının geçici olarak DNA çift zincir kırıklarına benzeme olasılığı akla gelmektedir. DNA onarım proteinlerinin onarımdaki rolü DNA çift zincirlerinin birleştirilmesiyken, telomerlerde etmektedir (6,15,29,41). xi telomeraz aktivitesini kontrol 1.2.1.1.1. Telomerik DNA Telomerik dizi ilk olarak Tetrahymena’da tanımlanmıştır (11). İki tip telomer dizisi bulunmuştur. Birinci tip, telomerik DNA dizileri olarak adlandırılır. Telomeraz tarafından tayin edilen 5-26 bç uzunluğundaki nükleotit dizisinin, arka arkaya tekrarlanmasıyla oluşur. Telomerik DNA tipik olarak G-kümelerince zengin bir zincir ve buna komplementer sitozince zengin bir zincir içerir. Kromozom ucuna doğru 5’-3’ yönünde uzanır ve bir 3’ uç çıkıntısı oluşturur (3). Telomerler, tek hücreli organizmalardan daha yüksek yapılı bitki ve hayvanlara kadar, türler arası farklılıklarla beraber, yapı ve fonksiyon bakımından önemli derecede benzerlik göstermektedir. Birçok türdeki telomerik tekrar dizisi aynı ya da benzerdir (86). Örneğin omurgalıların çoğu TTAGGG tekrarına sahiptir. Tablo 1’de farklı organizmaların telomerik tekrar dizilerinden örnekler verilmiştir (3). Tablo 1: Çeşitli türlerde telomerik tekrar dizileri: Telomerik tekrar dizileri kromozomun 3’ ucunda 5’-3’ yönünde gösterilmektedir. xii Grup Memeliler Küfler Protozoa Bitki Alg Maya Organizma Homo sapiens Physarum polycephalum Tetrahymena Oxytricha Arabidopsis Chlamydomonas Schizosaccharomyces pombe Telomerik Tekrar dizisi AGGGTT AGGGTT GGGGTT GGGGTTTT AGGGTTT AGGGTTTT (A)G2-5TTAC Saccharomyces cerevisiae G1-3T Evrim boyunca telomerik dizilerin neden bu kadar az değişiklik gösterdiğine ilişkin açıklamalardan biri, telomerik DNA’nın birçok protein için özgül bağlanma bölgeleri olarak görev yapmasıdır. Ayrıca telomeraz RNA kalıbının, enzimin aktif bölgesine katkıda bulunması gibi, telomerazın fonksiyonunu kısıtlayan faktörlerin de, telomerik dizinin evrimleşmesine engel olduğu düşünülmektedir (51,86). Telomerler, mutlaka aynı tekrar dizisinden meydana gelmeyebilirler. Saccharomyces cerevisiae (T(G)2-3(TG)1-6) ve Schizosaccharomyces pombe gibi bazı organizmalar, telomerazlarının kalıtsal olarak çeşitli tekrar dizilerini sentezleme eğiliminde olmasından dolayı çeşitli tekrar dizilerinden oluşmuş telomerlere sahiptirler. İnsanların da aralarında bulunduğu bazı diğer türlerde ise çeşitli tekrar dizileri yalnızca telomerlerin iç kısımlarında bulunmaktadır. Bu farklı tekrar dizileri, telomeraz yerine DNA polimerazın replike ettiği telomer kısımlarındaki rasgele mutasyonlar sonucu oluşmaktadır (51,60,64). Kromozom ucunda telomerik DNA’nın ortalama miktarı organizmalar arasında ve aynı organizmanın farklı hücreleri arasında farklılık göstermektedir. Örneğin farenin her telomeri 150 kb uzunluğunda iken, Oxytricha 20 bp’lik telomerik diziye sahiptir (25,86). Kromozom uçlarını bir başlık gibi koruyan “capping” fonksiyonunun mekanizması ya telomerlerin ucundaki tek zincirli bölgede özelleşmiş DNA yapısı xiii ile (G-kuartet) ya da telomerik proteinler ile gerçekleşir (26). Guanince zengin ardışık tekrarlı telomerik dizilerin organizmalarda yaygın olarak korunmuş olması, telomerlerin özgün yapıları için belirli DNA dizilerine ihtiyaç duyduklarını düşündürmektedir. Dört zincirli olan en stabil DNA yapısı G-kuartet olarak adlandırılmaktadır (7). Guanince zengin yapının telomer fonksiyonundaki rolü iki tip yapı ile açıklanabilir. Birinci tip yapıda, 12-16 nükleotit uzunluğundaki guanince zengin oligonükleotit dizileri, molekül içi ikincil bağlar oluşturarak kendi üzerine katlanmaktadır. İkinci yapıda, guanince zengin, en az 4 kısa guanin kümesi içeren, daha uzun oligonükleotitler yine kendi üstüne katlanarak daha yoğun bir şekil meydana getirmekte ve lineer kromozom ucunu koruyan yoğun bir yapı oluşturmaktadır (5). İkinci grup telomerik DNA, telomer-bağlantılı diziler ya da subtelomerik dizilerdir ve hem telomerin içinde hem de bitişiğinde bulunurlar. Türlere bağlı olarak yapı ve fonksiyon bakımından farklılıklar gösterirler. Aynı türde kromozom uçlarında benzer subtelomerik diziler bulunabildiği gibi, türün bazı kromozomlarında bulunup bazılarında bulunmaması da mümkündür. S. cerevisiae’de subtelomerik X ve Y’ elementleri saptanmıştır. Biri veya her ikisi birden telomerlerin çoğunda ya da tamamında bulunmaktadır (86). Fonksiyonları ve kromozom kararlılığındaki rolleri tam olarak bilinmemekle beraber, bu diziler telomerin fonksiyonunu artırabilirler. Örneğin S. cerevisiae’deki subtelomerik Y’ elementi, telomeraz fonksiyonunun kaybolması veya telomer replikasyonunun bozulması durumunda amplifiye edilmektedir. Hücrenin telomer fonksiyonu ve hayatta kalma yeteneğini sürdürmesinde rol oynamaktadır (5,45,51). Telomerler kimyasal ve protein problarla etkileşime geçmeye dirençli korunmalı bir yapıya sahiptir. Telomer pozisyonunun etkisine (Telomer Position xiv Effect/ TPE) bağlı olarak, telomerler yakınındaki genin transkripsiyonunu baskılamaktadırlar (28). 1.2.1.1.2. Telomerik Proteinler Telomerler kromozom ucunun korunması işlevlerini telomer-telomeraz kompleksi içinde yer alan telomerik bağlanma proteinleri ile birlikte gerçekleştirirler. Telomerik bağlanma proteinleri, telomeraz aktivitesini düzenleyerek ya da telomerik tekrar dizilerinin hasara uğratılmasına karşı kromozom ucunu koruyarak telomer devamlılığını etkilemektedir (18,60). Telomerik DNA’nın kromozom ucunda DNA kaybını önlemesindeki kritik fonksiyonu, koruyucu “capping” işlemine katılan birçok özgül protein için bağlanma bölgesi olarak görev yapmasından kaynaklanır. “capping” çok sayıda proteinin, diziye özgül olarak telomerik DNA’ya bağlanmasıyla gerçekleşen kompleks bir işlemdir, 4 yolla gerçekleştirilir: (i) Telomerik ucun DNA hasarı onarım mekanizmalarını harekete geçirmesini engelleyerek, (ii) Uç-uca kromozom birleşmesini engelleyerek, (iii) Telomerik bölgeler arasında homolog rekombinasyonu engelleyerek, (iv) Telomer uzunluğunu düzenleyerek. Telomerik bağlanma proteinleri, telomerlerin ucunda, uçların çift zincir kırıklarından ayırt edilmesini sağlayan “T-loop” yapısının oluşumuna katılırlar. Bu yapı, telomerlerin 3’ uçlarını degradasyondan korur ve telomerazın telomer üzerindeki aktivitesini sınırlar (15,35). Tek ve çift zincir bağlanma proteinleri, telomeraz ve telomeraza bağlı proteinler, çift zincir kırığı onarımı proteinleri gibi telomer fonksiyonuna katılan tüm bu protein bileşenlerin, telomerik bölgede gerektiği zaman uygun şekilde fonksiyon gösterebilmeleri için, telomerik bölgedeki bulunuşları düzenlenmekte, proteinlerin tamamı aynı anda telomerik bölgede bulunmamaktadır (65). xv S. cerevisiae kromozomunun telomerik DNA’sı nükleozomal olmayan farklı bir kromatin yapısındadır. Bu yapıya telozom denir. Mayalara göre telomerleri daha uzun olan memelilerde ise telomerik DNA’nın büyük kısmı nükleozom olarak paketlenmiş halde, uç kısımlarındaki telomerik DNA ise maya telozomuna benzer yapıdadır (20,86). 1.2.1.1.2.1. Çift Zincirli Telomerik DNA Bağlanma Proteinleri Tomurcuklanan ve bölünen mayalar ile memeli hücrelerinde tanımlanan birçok telomerik çift zincirli DNA bağlanma proteini yanında Kluveromyces lactis’te Rap1p ve Taz1p ile insan telomer bağlanma proteini TRF1 ve TRF2’nin (Telomeric Repeat-binding Factor) fonksiyonel altbirimleri de tanımlanmıştır. Rap1p ve TRF1 dizi homolojisi içermemekle beraber telomerlerde bazı ortak fonksiyonlara sahiptirler (9,37,43). Mayada, transkripsiyonu düzenleyen Rap1p proteinin telomerik DNA’ya bağlanması için telomerik tekrar bölgesinde 40 bç’lik bir konsensüs diziye gereksinimi vardır (5). Ancak sadece telomerik DNA’yla değil, subtelomerik kromatin yapısıyla bağlantılı olduğuna ilişkin de veri mevcuttur (20). 1.2.1.1.2.2. Tek Zincirli Telomerik DNA Bağlanma Proteinleri İncelenmiş tüm organizmalarda, telomerik DNA’nın 3’ ucu tek zincirli diziden oluşmaktadır. Bu tek zincirli bölgenin, telomeraz-substrat tanıması için gerekli olduğu düşünülmektedir. Ekzonükleazlar tarafından yıkıma duyarlı olan ve hücre tarafından hasarlı DNA olarak da algılanabilecek telomerik tek zincirli bölge, kromozom uçlarının füzyonuna da neden olabilir. Bu sorunu bertaraf etmek için 3’ telomerik DNA uçları telomer-telomeraz kompleksi içinde gizlenmiş şekilde bulunmaktadır. Telomerik tek zincir bağlanma proteinleri, diziye özgül olarak tek xvi zincirli telomerik DNA’ya bağlanarak kompleks oluşturmaktadırlar. Bu kompleks telomeraz tarafından dizinin gereğinden fazla uzatılmasını da engellemektedir. Mayada Est1p, Est2p, Est3p, Cdc13 tek zincirli telomerik bağlanma proteinleri tanımlanmıştır (9,51,60). 1.2.1.2. Doğrusal Kromozom Uçlarının Replikasyon Problemi Prokaryotik organizmalarda halkasal olan kromozom yapısı ökaryotlarda doğrusaldır. Replikasyon esnasında kromozom “uçlarında” özel bir sorunla karşılaşılır. Kesintisiz zincirdeki sentez normal olarak kromozom ucuna kadar devam ederken, kesintili zincirde RNA primeri uzaklaştığında sorun ortaya çıkar. Normal olarak 3’-OH grubuna nükleotit ilavesi yapılarak primerin uzaklaşması sonucu oluşan boşluklar doldurulmalıdır. RNA primeri kromozomun orta bölümlerindeki replikasyon çatallarından uzaklaştığında oluşan boşluk, DNA Polimeraz tarafından doldurulmaktadır. Ancak kromozomun ucunda 3’-OH grubunu sağlayacak bir kalıp zincir yoktur. Sonuç olarak her sentezin sonunda kromozom, RNA primerinin boyu kadar kısalacaktır. Bu önemli problemi çözmek amacıyla bazı organizmalar evrim sürecinin erken döneminde moleküler bir çözüm geliştirmişlerdir (6,15,25,29,51). 1.2.1.3. Telomeraz Ribonükleoprotein Kompleksi Telomer bütünlüğünü sağlamadaki anahtar özellik, telomerik DNA’nın, kromozom uçlarının korunabileceği kritik uzunlukta tutulabilmesidir (75). Bunun için telomeraz enzimi, telomerin kısalmasını önlemek için, yapısındaki RNA kalıbını kullanarak sentezlediği telomerik tekrar dizilerini kromozomun ucuna ilave etmektedir. Telomeraz ilk olarak Tetrahymena’da tanımlanmış ve 5’-CAACCCCAA -3’ dizisinden oluşan 159 nükleotitlik RNA bileşenini kullanarak bu organizmanın xvii telomerik tekrar dizisi olan (TTGGGG)n’nin ardışık tekrarlarını oluşturmak üzere, nükleotitleri polimerize ettiği gösterilmiştir (3). Telomeraz, telomerin yalnızca guanince zengin zincirini sentezler. Komplementer zincirin tamamlanması, primazpolimeraz kompleksi tarafından kontrol edilerek, yarı-korumalı DNA replikasyonu mekanizması ile gerçekleştirilir. Enzim tekrar dizisinin birçok kopyasını kesintili zincirin 3’ ucuna 5’-3’ sentez yönünde ilave eder. Kalıp olarak kullanılan bu uzantıya komplementer primer eklenmesi ve polimeraz tarafından zincir uzamasının tamamlanmasıyla replikasyon döngüsü sonucu genetik materyal kaybı engellenmiş olur (4,6,25,44). Telomeraz, ribonükleoprotein yapısında ve bünyesinde katalitik aktivitesi için gerekli bir RNA bileşeni (TER) ile protein bileşeni (TERT) bulunduran bir revers transkriptazdır. Her replikasyon sonrası telomerin kısalmasını önlemek için telomerik tekrar dizilerini kromozomun ucuna ilave etmektedir. TERT, RNA’yı kalıp olarak kullanarak DNA dizisi sentezleyen revers transkriptaz özelliğindeki bileşendir. Enzimin aktivitesi için gerekli diğer bileşen RNA (memelilerde TR ve mayalarda TLC1 olarak adlandırılır) ise kopyalanacak telomerik DNA tekrarları için kalıp olarak kullanılan kısa bir RNA dizisidir (10,51,60). Mayalarda telomeraz enzim kompleksi iki aktif bölge ve iki TER molekülü içeren dimerik bir yapıdır. Telomeraz RNA kalıbı 16 nükleotitten oluşmaktadır ve TER molekülünün uzunluğu çoğunlukla 1 kb civarındadır (15,51). İnsan telomeraz enzim kompleksi, 451 nükleotitlik RNA bileşeni içerir (19). Telomeraz diğer polimerazlara benzer şekilde, bir çekirdek enzim yapısı ve buna bağlı diğer faktörlerin kombinasyonundan oluşan bir holoenzim kompleksi şeklindedir. TERT dışında bazı telomeraza-bağlı proteinler telomeraz aktivitesi için anahtar roller üstlenirler. Mayalarda enzimin iki düzenleyici bileşeni Est1p ve Est3p, xviii in vivo olarak enzimin telomer replikasyonunu gerçekleştirebilmesi için gereklidir. Bu proteinlerin yokluğunda, telomerazın telomerik DNA’yı uzatamamasına bağlı olarak telomerler kısalmaktadır (21,44,60). Telomerlerle etkileşim içinde olan telomeraz kompleksi çok sayıda bileşen içermektedir ve bunlardan herhangi biri, telomeraz aktivitesinin düzenlenmesi için hedef olabilmektedir. Telomerazla bağlantılı altüniteler, enzim aktivitesinin zamanlamasını ve miktarını ayarlamaktadırlar. Bu mekanizmalardan biri, enzimin kendi altünitelerinin aktiviteyi pozitif yönde düzenlemesidir. Telomerin dubleks bölgesine bağlanan proteinler de telomeraz ile fiziksel olarak bağlantıda olmadıkları halde, enzim aktivitesini düzenleyici rol oynamaktadır. Mayalarda Rap1p ve insan hücrelerinde TRF1 ve TRF2 proteinleri, guanince zengin tekrarların sayısını belirleyebilmekte ve telomer yeterli uzunluğa geldiğinde telomeraz aktivitesini inhibe etmektedirler (43). Yaşa bağlı olarak, farklı yaştaki insan hücrelerinde ya da hücre bölünmesi sayısına bağlı olarak, insan fibroblast hücre kültüründe telomer uzunluğu analiz edildiğinde, yaş ve hücre bölünmesi sayısı arttıkça, telomerik dizinin dereceli olarak kısaldığı saptanmıştır. Normal memeli somatik hücrelerinin çoğunda telomeraz aktivitesi ya çok düşük bulunmuş ya da hiç bulunamamıştır. Bu nedenle her hücre bölünmesinde kromozom uçları kısalır. Birçok hücre bölünmesinden sonra da kromozomlar kritik derecede kısalır ve hücre daha fazla bölünme kapasitesini yitirir. Kromozom kısalmasının doğal hücre yaşlanmasının bir parçası olduğu ve biyolojik saat işlevi gördüğü düşünülmektedir. Ancak memeli eşey hücrelerinde, erken dönemdeki embriyonik hücrelerde, ölümsüz hücre kültürlerinde ve belirli kanser hücrelerinde telomeraz aktivitesi saptanmıştır (5,19,35). 1.2.2. Telomerlerde Meydana Gelen İşlemler Telomerik DNA’nın replikasyonu, bildiğimiz DNA kalıplı DNA replikasyonu ile tek telomerik DNA zincirinin telomeraz tarafından uzatılması işleminin bir kombinasyonudur. Telomerik DNA da kromozomal DNA’nın diğer kısımları gibi kopyalanmaktadır. Daha sonra telomeraz, RNA bileşenini kalıp olarak kullanarak xix yeni telomerik tekrar dizilerini sentezlemekte ve kromozom ucuna eklemektedir. Telomeraz aktivitesine sahip olmayan maya ve insan hücreleri, sınırlı bir süre normal olarak büyüyebilmekte, telomerleri kısaldıkça dereceli olarak daha çok sayıda hücre bölünme yeteneğini kaybetmektedir (48). 1.2.2.1. Telomerik Tekrarların Replikasyonu Lineer DNA uçlarının replikasyonundaki sorun göz önüne alındığında, kromozom uçlarının replikasyonu, genomun diğer kısımlarınınkinden farklı bir mekanizmayla gerçekleştirilmektedir. Birinci yaygın çözüm, primaz-polimeraz kompleksinin, telomeraz tarafından sentezlenen ve kalıp olarak kullanılan uzantıya, komplementer primer eklemesi ve polimeraz tarafından zincirin uzatılmasıdır. İkinci mekanizmada yine telomeraz tarafından sentezlenen uzantı saç tokası (hair pin) şeklinde kıvrılır. Karşı karşıya gelen guanozinler arasında hidrojen bağları (G ≡G) kurulur. Kromozomun ucunda primerin uzaklaşmasıyla oluşan boşluğu DNA Polimeraz I’in doldurabilmesi için gerekli olan serbest 3’OH ucu oluşturulmuştur. Bundan sonra saç tokası yapısı kırılır ve sonuçta replikasyon döngüsü sonucu genetik materyal kaybı olmaz (51,86). 1.2.2.2. Telomerik Tekrarların Uzatılması Telomeraz, telomer devamlılığı için ökaryotlar arasında yaygın olan bir mekanizma olsa da tüm ökaryot organizmalarda telomeraz aktivitesi yoktur. Bu konuda en çok araştırılmış organizma olan Drosophila melanogaster’de telomeraz bulunmamaktadır. Büyük retroelementlerin kromozom ucuna periyodik olarak eklenmesiyle telomer devamlılığını sağlamaktadır. Bu tekrar diziler kromozom ucunu koruyan heterokromatin yapısını oluşturmaktadırlar (15). Lineer DNA uçlarının uzatılmasını sağlayan bir başka yol da genetik rekombinasyondur (49,86). 1.2.2.3. Telomer Uzunluğunun Düzenlenmesi DNA ve buna bağlı proteinlerin oluşturduğu heterokromatin benzeri kompleks bir yapı olan telomerlerin, kromozom kararlılığını sağlamanın yanında, mayoz ve mitoz hücre bölünmesinde de bazı fonksiyonlara sahip olduğu düşünülmektedir. Uzunluklarının ve yapılarının, bu fonksiyonlarını gerçekleştirebilecekleri uygunlukta olması gerekmektedir. Telomer uzunluğunun düzenlenmesi, telomerik bölge kısaldığında telomerazın telomerler üzerinde aktivite göstermesine izin verilmesi ve yeterince uzadığında bu aktivitenin sınırlanmasıyla gerçekleştirilir (15). Telomer uzunluğuna duyarlı bir sistemin telomerik tekrar sayısını ve bağlanan proteinleri ölçtüğü ve bu bilgiyi telomerik tekrarları ekleyen (telomeraz) ya da uzaklaştıran (özel ekzonükleazlar) mekanizmalara aktardığı düşünülmektadir. Sonuç olarak, çift zincir telomerik DNA bağlanma proteinleri telomerleri diziye özgül olarak tanımakta ve telomerik DNA-protein kompleksi farklı proteinlerin etkileşimi sonucu oluşturulmaktadır (21). Telomeraz aktivitesi olan hücrelerde, telomerik DNA’nın tanımlanmış en uzun ve en kısa uzunluğuna gelmesini düzenleyen ve uygun uzunlukta kalmasını sağlayan xx çeşitli faktörler mevcuttur. Örneğin mayada en kısa sınır telomerik DNA uzunluğu 300-500 bç iken insanda birkaç kilobaz uzunluğa ulaşabilmektedir. Ortalama telomer uzunluğu ile hücreler arasındaki telomer uzunluğu çeşitliliği arasında bir korelasyon bulunmaktadır. Çok uzun telomerler, daha kısa olanlara göre uzunluk bakımından daha heterojendirler (51). Telomerik proteinler tarafından telomerlerin uzunluğu negatif yönde kontrol edilebilmektedir. Rap1p proteini C-terminal kuyruğu aracılığıyla telomerazın kromozom ucuna erişmesini engelleyerek telomer uzunluğunu negatif yönde düzenlemektedir. Çift zincirli telomerik DNA bağlanma proteinlerinin bağlanmasının inhibe edilmesinin, anormal telomer uzamasına neden olduğu saptanmıştır. Ancak Rap1p proteini telomerik DNA’ya diziye özgül olarak bağlanmaktadır. Mayalarda telomerik dizilerdeki çeşitli mutasyonların, telomer uzunluğuna etkisine ilişkin çalışmalarda, telomer uzunluğu ile Rap1p proteininin ilişkili olduğu mutant telomerik tekrara bağlanma afinitesindeki kayıp arasında bir korelasyon saptanmıştır. Ayrıca çift mutasyona (hem telomerik dizide mutasyona, hem de Rap1p proteininin C-kuyruğunda kısalma meydana getiren mutasyona) sahip maya hücrelerinde, telomerlerin aşırı uzadığı ve parçalandığı belirlenmiştir (38,51). Telomeraz RNA kalıbında mutasyona sahip S. cerevisiae ve K. lactis mutantlarında, telomer uzunluğunu pozitif yönde etkileyen bazı faktörlerin kalıp diziye bağımlı olduğu ve telomeraz enzimleri in vitro olarak aktif olduğu halde, telomerik DNA’nın dereceli olarak kısaldığı görülmüştür (23). Memeli TRF1 ve TRF2 proteinleri telomer uzamasını negatif yönde kontrol ederler. Memeli telomerik bağlanma proteini TRF2’nin fonksiyonunun bozulması, kromozom ucunda guanince zengin 3’ uzantısının kaybına neden olmaktadır (23). 1.2.2.4. Telomerlerdeki Rekombinasyonel Olayların Düzenlenmesi Aktif telomeraz varlığında, telomerlerde rekombinasyon olayları sık olarak gerçekleşmez. S. cerevisiae ve K. lactis hücrelerinde telomeraz aktivitesinin bertaraf edilmesi, hücrelerde büyüme özelliklerinde bozulmalar görülmeden önce, telomerik ve subtelomerik rekombinasyon olaylarının oranını artırmaktadır. K. lactis’te telomerik rekombinasyon olayları telomerik bölge uzunluğundaki ani artışlar şeklinde görülmektedir. Mutant telomeraz RNA kalıbına sahip olan ve telomerleri normal uzunluktakinden daha kısa halde stabil olan mutant hücreler, subtelomerik gen konversiyonu oranında artış göstermektedir. Bu veriler, bazı hücre içi bileşenler tarafından, çift zincir kırıkları gibi algılanan kısalmış telomerlerin, rekombinojenik olduğu hipotezi ile de örtüşmektedir (52). Kromozom uçlarında, homolog olmayan uç birleşmesi (NHEJ) sonucu telomer füzyonları meydana gelmektedir. K. lactis hücrelerinde telomerik tekrarlardaki belirli mutasyonlar, yüksek sıklıkta telomer füzyonuna neden olurlar. Bu, normal şartlarda kromozom uçlarını, NHEJ’den koruyan telomerik proteinlerin bağlanma bölgelerinin bozulmasından kaynaklanmaktadır (51). xxi 1.2.3. Genetik Rekombinasyon Mayoz sırasında homolog kromozomlar eşleştiğinde kromozom segmentlerinin (bölümlerinin) karşılıklı değiş-tokuşu gerçekleşebilir. Yüksek oranda DNA dizi homolojisi içeren iki kromozom arasında, eşdeğer pozisyonlardaki DNA dizilerinin karşılıklı yer değiştirmesi şeklindeki bu olaya genel ya da homolog rekombinasyon denir. Değiş-tokuşun genetik materyal kaybı olmaksızın gerçekleşebilmesi DNA dizileri arasındaki eşlenikliğe bağlıdır. Genetik rekombinasyon bir dizi enzimatik işlem sonucu gerçekleşir. Karşılıklı gelen iki homolog dizide; 1. Her bir çiftte aynı pozisyonda endonükleaz aracılığıyla tek zincirde kırık oluşur. 2. Çift zincirlerde kesim sonucu açıkta olan uçlar yer değiştirir ve diğer zincirin ipliği ile eşleşir. 3. Boşta olan uçlar ligaz tarafında birleştirilir ve rekombinant çiftler oluşur. 4. Değiş-tokuş sonucu çapraz köprü yapısı ortaya çıkar, çapraz köprünü pozisyonu dallanma-göçü olarak adlandırılan olayla koromozom boyunca hareket eder. Bu hareket her bir çift zincirde karşılıklı gelen bazlar arasındaki hidrojen bağlarının kırılıp yer değiştirerek tekrar oluşmasıyla gerçekleşir. Bu hareket sonucu her iki homolog üzerindeki heterodubleks DNA uzunluğu artar. 5. Dubleksler ayrıldıktan sonra karakteristik Holliday yapısı ortaya çıkar. 6. Daha değiş-tokuşa katılmamış karşı homologlardaki iki zincir endonükleazla kırılır ve tekrar birleşme sonucu rekombinant dubleksler oluşur (36). 1.2.4. Kluveromyces lactis xxii Mayalar filogenetik sınıflandırmada fungus takımına dahildirler. Tek hücreli olmaları ve bölünerek ya da tomurcuklanarak çoğalmaları ortak özellikleridir (76). Maya genetiği çalışmaları telomer araştırmaları için son derece değerlidir. Çoğu ökaryotta olduğu gibi telomerik DNA’ları guanince zengin kısa ardışık tekrar dizilerinden meydana gelmektedir. Kluveromyces lactis’in de dahil olduğu Ascomycetus mayaları, telomerik tekrar dizilerinin çeşitliliği bakımından ökaryotlar arasında alışılmadık bir durum sergilemektedirler. Ökaryotlarda telomerik tekrar dizisi, ortalama 5-8 bç iken, mayalar arasında birim tekrar uzunluğu 8-26 bç arasındadır (49,76). K. lactis telomeri 25 bp’lik (ACGGATTTGATTAGGTATGTGGTGT) telomerik tekrar dizisinin 10-20 kopyasından oluşmaktadır. K. lactis subtelomerik bölgeleri henüz detaylı şekilde aydınlatılamamıştır. 12 kromozomundan 10’una ait subtelomerik bölgelerin karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir (59). Saccharomyces cerevisiae ve Kluveromyces lactis başta olmak üzere mayalar alternatif telomer devamlılığı mekanizması olarak rekombinasyonu kullanırlar. İnsan ALT hücre kültürü telomerleri ile, maya PSS hücrelerindeki telomerlerin tekrar dizilerinin ardışık yapısı bakımından benzerlik saptanmıştır. Bu nedenle ALT mekanizmasının aydınlatılması için yapılan çalışmalarda, maya modellerinin yol gösterici olacağı düşünülmektedir (46). Ayrıca laboratuar koşullarında kolay üretilebilme özellikleri ve moleküler genetik tekniklerle çalışabilmeye uygun olmaları da göz önüne alındığında, tek hücreli ökaryotik bir organizma olarak, rekombinasyonel telomer devamlılığının anlaşılabilmesi için yapılan çalışmalarda uygun model organizmalardır (76). K. lactis, telomer çalışmaları için S. cerevisiae’ye göre bazı açılardan avantajlar göstermektedir. Telomerik tekrar dizilerini aynı zamanda subtelomerik bölgede de değil, yalnızca telomerlerde bulundurmaları, rekombinasyonla değişen telomerik yapının analizini kolaylaştırmaktadır (49). 1.2.5. Telomerazdan Bağımsız Telomer Devamlılığı xxiii Ökaryotların çoğunda telomerler, telomerazın sentezlediği kısa tekrar dizileri ile uzatıldığı halde, telomeraz aktivitesine sahip olmayan bazı ökaryotik hücreler (bazı kanser hücreleri de dahil olmak üzere) Alternatif Telomer Uzaması (Alternative Lengthening of Telomeres /ALT) yoluyla da telomer devamlılığını sağlamaktadırlar. Telomeraz aktivitesine sahip olmayan bazı maya ve memeli hücrelerinde telomerazdan bağımsız telomer devamlılığının olduğu gösterilmiştir (12,18,49,52,73). ALT mekanizmasının işareti (marker) olarak kullanılması mümkün olan “Promiyelositik lösemi proteini/PML” tanımlanmıştır (“ALT-associated Promyelocytic leukemia (PML) Bodies (APBs)”). PML proteini, promiyelositik lösemide füzyon olaylarına katılması nedeniyle bu şekilde adlandırılmıştır. ALT’ın karakteristik özelliği olan heterojen yapıdaki uzun telomer dizileriyle birlikte, ALT mekanizmasının işareti olarak kullanılmaktadır (73). 1.2.5.1. Mayada Rekombinasyonel Telomer Devamlılığı 1.2.5.1.1. Telomeraz Aktivitesine Sahip Olmayan Mutant Maya Hücreleri Bu zamana kadar, üç maya türünün (S. cerevisiae, K. lactis ve S. pombe) telomeraz aktivitesine sahip olmayan mutantları oluşturulmuştur. K. lactis telomerik tekrarı prob olarak kullanılarak, telomeraz enziminin RNA altünitesini kodlayan TER1 geni tanımlanmıştır. TER1 geninin bazı bölümlerinin delesyonu telomer fonksiyonunu iki şekilde değiştirmektedir. İlkinde bazı mutantlar, kısmi telomeraz aktivitesini sürdürmekte ve telomerlerini normalden daha kısa halde kararlı tutabilmektedirler. TER1 geninin tamamını kaybeden ikinci grupta ise dereceli telomer kısalması görülmektedir. Bu grup hücrelerin telomerleri, 100 hücre bölünmesinde orijinal uzunluğunun %10’una ulaşmakta ve gittikçe artan sayıda hücre, bölünebilme yeteneğini kaybetmektedir (49). Telomeraz aktivitesi bulunmayan mutant maya hücrelerinde, ardışık hücre bölünmeleri sonucu dereceli olarak telomer kısalması ve kötüleşen büyüme fenotipleri (“senescence”) görülmekte, hücrelerin çoğu ölmektedir. “Senescence“ terimi maya ve memeli hücreleri için farklı anlamlarda kullanılmaktadır. Memeli hücrelerinde “senescence“ telomer kısalması ile başlayan hücre ölümü olmaksızın meydana gelen bir büyüme problemidir. Maya hücreleri için kullanıldığında ise, azalan büyüme oranı ve sonucunda telomerlerin kritik kısalığa gelmesine bağlı olarak gerçekleşen hücre ölümü anlamına gelmektedir. Ancak maksimum hücre ölümünün ardından, az sayıda, kısmi olarak düzelen büyüme özellikleri gösteren hücreler (Post-senescence survivors/PSS) görülmektedir. Uzamış telomerler bulunduran bu hücrelerin analizi sonucu kritik kısalığa gelen telomerlerin oluşturduğu DNA hasarı sinyalini bertaraf eden iki mekanizma ortaya xxiv çıkarılmıştır: Telomer füzyonu ve rekombinasyonel telomer devamlılığı. Uzamış telomerlerde tekrar başlangıçtaki dereceli telomer kısalması görülmekte ve bu iki işlem (rekombinasyonel telomer uzaması ve dereceli olarak telomerlerin kısalması) birbirini takip ederek bir döngü oluşturmaktadır (47,49,51). Ancak PSS hücrelerinde telomerler dereceli olarak değil tek bir adımda uzatılmakta ve bu işlem esnasında hücreler, çeşitli homolog rekombinasyon proteinlerinin (RAD 50p, RAD51p ve RAD 52p) fonksiyonuna ihtiyaç duymaktadırlar (77,78). S. pombe, her iki mekanizmayı da kullandığı halde, S. cerevisiae ve K. lactis türlerinde telomerazdan bağımsız telomer devamlılığı mekanizması rekombinasyona dayanmaktadır. Mayada rekombinasyonel telomer devamlılığı iki şekilde gerçekleşmektedir. Birincisi, diğer dizilerin amplifikasyonuna ilişkin bir veri olmadığı halde telomerik tekrar bölgelerinin uzamasıdır (Telomer başlıkkorumalı rekombinasyon/ Telomere cap-prevented recombination/CPR). TelomerCPR yolu ile senes fenotipi gösterdikten sonra hayatta kalan hücrelerdeki telomer uzunluğu, doğal tip maya hücrelerindekinden (250-500 bç) daha fazladır. İkincisi ise sadece S. cerevisiae’de görülmekte ve telomerik ve subtelomerik bölgeleri içeren büyük DNA bölümlerinin ardışık amplifikasyonu ile gerçekleşmektedir (48,78). Saccharomyces PSS hücrelerinin karakteristik özelliği olan oldukça uzun ve aynı zamanda uzunluk bakımından heterojen olan telomerlerin bu yapıları, telomeraz yokluğunda telomer devamlılığını sağlayan ölümsüz insan hücre kültürleri ve tümör hücrelerindeki telomerlere benzemektedir (78). 1.2.5.1.2. Rekombinasyonel Telomer Uzaması Modelleri İlk olarak mayalarda keşfedilen rekombinasyonel telomer uzaması, telomeraz enzimine gerek duymadan telomer devamlılığını sağlayan alternatif bir mekanizmanın varlığını göstermiştir. S. cerevisiae ve K. lactis organizmalarında telomeraz yokluğunda kısalan telomerik bölgelerin, rekombinasyon yoluyla devamlılığı sağlanabilmektedir. Aynı şekilde subtelomerik bölgeler de yayılmaktadır (48,49). Telomerik olmayan DNA uçları, homolog olmayan uç birleşmesi ya da rekombinasyon ile DNA onarım mekanizmalarını harekete geçirmektedir. Mayalarda bu onarım işlemi tercihen gen konversiyonu ile gerçekleşmektedir. Telomerik tekrar bölgelerinin çok kısalması ve kromozom ucunu yeterince koruyamaması gibi telomer fonksiyonunun kaybına neden olan bir durumun, telomerlerde rekombinasyon olayını tetikleyeceği düşünülmektedir. Telomerik bölgesi kısalmış kromozom uçları, DNA kırıklarını onaran proteinler tarafından işlenmekte ve rekombinasyon yoluna götürülmektedir (50,84). Bu da bölünmeye devam eden hücrelerde rekombinasyonun neden telomer devamlılığını sağlamakta yeterli olduğunu açıklamaktadır(48,49). Telomer devamlılığını sağlayan farklı rekombinasyon yolakları (RAD50, RAD51 , RAD52) tanımlanmıştır (16,42). Gen konversiyonu RAD52 geni kontrolünde ya da RAD52’den bağımsız homolog rekombinasyon ile gerçekleşmektedir. K. lactis hücrelerinde çembersel telomerik DNA’ların tetiklediği telomer uzamasının RAD52 geni kontrolünde gerçekleştiği saptanmıştır (55,79,87). K. lactis’te hücrede telomeraz aktivitesi bulunmasına rağmen, ALT benzeri bir telomer xxv yapısına yol açan rekombinasyon mekanizmasını kontrol eden STN1 geni tanımlanmıştır (33). Telomeraz aktivitesine sahip olmayan ve iki tip telomerik tekrar dizisi bulunduran mutant K. lactis hücrelerindeki telomer devamlılığı ise, çember şeklindeki DNA’nın kalıp olarak kullanıldığı gen konversiyonu ile açıklanmakta, telomerik çemberlerin rekombinasyon olayını tetikleyebileceği düşünülmektedir. Bu model, ALT hücrelerinin karakteristik özelliği olan uzun bir telomerin tek adımda oluşturulabilmesiyle ve telomerik bölgelerin heterojen tekrar dizilerinden oluşmasıyla da örtüşmektedir. Bu hücreler, rekombinasyonel telomer uzaması gerçekleştikten sonra, iki tip (doğal ve mutant) telomerik tekrar dizisi içeren bir telomerik yapıya sahip olmaktadırlar(33,49,56). “Roll and Spread Model” olarak adlandırılan bu mekanizma ile 100-400 nükleotitlik tek veya çift zincirli bir telomerik DNA çemberinin, rekombinasyonel telomer uzamasına yol açtığı belirlenmiştir (56,57). Tek zincirli çemberler, sadece guanince zengin telomerik dizilerden meydana gelmektedir ve “T-loop” oluşumuna benzeyen intratelomerik zincir invazyonunun tekrar ayrışmasıyla oluştuğu belirlenmiştir. Maya ve insan hücrelerinde gözlenen hızlı telomer delesyonunun (Rapid Telomere Deletion) ürünleri oldukları da düşünülmektedir (27,56) 1.2.5.2. Memeli Hücrelerinde Telomerazdan Bağımsız Telomer Devamlılığı İnsan hücrelerinin çoğunda, telomer devamlılığını sağlayacak bir mekanizmanın bulunmaması, hücrede replikasyonun durmasına neden olmaktadır (1). Ancak sınırsız büyüme özelliğine sahip insan hücrelerinin tümünde bazı telomer devamlılığı mekanizmaları bulunmaktadır. İnsan kanser hücrelerindeki telomer devamlılığı telomeraz varlığı ile açıklansa da, bazı kanser hücrelerinin ve ölümsüz hücre hatlarının telomeraz yokluğuna rağmen telomer devamlılığını sağlayabildikleri görülmüştür. Tümör kökenli hücre hatları ve tümör örneklerinin %5-10’unda alternatif telomer uzamasının göstergesi olarak, telomeraz yokluğunda telomer uzaması görülmüştür. Ölümsüz insan fibroblast hücrelerinin %30’unda telomeraz aktivitesi belirlenememesine rağmen normal insan hücrelerindeki gibi dereceli telomer kısalması da saptanmamıştır (34,51,58). İnsan hücrelerindeki alternatif telomer uzamasının mekanizması henüz bilinmemektedir. Maya ve insan ALT hücre kültürlerinden elde edilen verilerle, inter-telomerik ve intra-telomerik (T-loop oluşumu) homolog rekombinasyonun memeli telomerlerinin korunması ve uzamasında rol oynayabileceği (22,32), mayalardaki CPR mekanizması gibi, telomerler arasında karşılıklı olmayan rekombinasyonun telomerik uzamayı sağlayabileceği düşünülmektedir (14,26,51,75,839). Bazı insan hücre kültürlerinde ve ALT hücrelerinde, TER1-∆ mutant K. lactis hücrelerindekine benzer şekilde “Roll and Spread Model”i destekleyen ekstrakromozomal telomerik çembersel DNA molekülleri saptanmıştır ve bu da çembersel DNA kalıplı gen konversiyonunu akla getirmektedir (14,51,57,79). İnsan ALT hücre kültüründe, yüksek sıklıkta telomerik dizilerin karşılıklı değişimi ile karakterize bir alternatif telomer uzaması mekanizması saptanmıştır. Telomerik dizi değişimleri, hücrede telomeraz aktif hale getirildiğinde de devam etmektedir. Bu değişimler sadece telomerik bölgede gerçekleşmekte, kromatidin iç bölümlerinde görülen kardeş kromatit dizi değişimleri ile arasında bir korelasyon bulunmamaktadır (40). xxvi 1.2.6. Alternatif Telomer Uzaması ve Kanser Normal somatik hücrelerin aksine, tümör hücreleri telomeraz ya da alternatif bir mekanizma ile tümör oluşumunun anahtar basamağı olan telomer devamlılığını sağlayabilmektedir (88). Normal somatik hücreler, “senes” olmadan önce sınırlı kez bölünebilirler. Ancak tümör gelişimi için, hücrelerin proliferasyon sınırını aşıp ölümsüz hale gelerek, olağan sınırdan daha fazla kere bölünebilmeleri gerekmektedir. Ölümsüz hücre hatlarının tamamında telomer devamlılığı mekanizması bulunduğundan, ölümsüzlük ile telomer devamlılığı bağlantılı durumlardır (66). Telomerleri kritik derecede kısalmış bir hücre şu üç sondan biriyle karşılaşmaktadır: 1) Hücre çoğalmasının durması (“senescence”), 2) Apoptozis, 3) Hücre çoğalmasının devam etmesi ve hücrede genomik kararsızlık. Normal somatik hücrelerde dereceli telomer kısalması sonucu gelişen “senescence” fenotipinin, pre-neoplastik hücrelerin replikasyon potansiyelini sınırlamadan sorumlu, tümör baskılayıcı bir mekanizma olarak görev yaptığı, böylece hücrede onkogen bir aktivasyona neden olabilecek mutasyonların devam ettirilmesine engel olduğu düşünülmektedir (74). Bazı tümör olgularında, normal bir hücrenin tümör hücresine dönüşmesi evresinde, hücrede meydana gelen telomer kısalması, uç-uca kromozom füzyonuna neden olmakta, kromozomun yeniden düzenlenmesi de, tümör gelişiminin karakteristik özelliği olan genomik kararsızlıkta rol oynamaktadır. Bu genomik kararsızlık, telomerik dizilerdeki rekombinasyon oranı üzerinde etkili telomer bağlanma proteinlerinin mutasyonu ya da anormalliklerine bağlı olarak, telomer uzunluğunda meydana gelen hızlı değişimlerden de kaynaklanmaktadır. p53’ün fonksiyonunu yerine getiremediği durumlarda da genomik olarak kararsız hücreler hayatta kalabilmekte ve telomer füzyonu sonucu malign fenotipler için tehlikeli bir potansiyel oluşturmaktadırlar (30,35,54). Telomerlerin replikasyon yeteneklerini tekrar kazanmalarının, tümör gelişiminde kritik bir basamak olduğu düşünülmektedir. Mayalarla yapılan çalışmalar da tümör gelişiminin erken evrelerinde, telomer uzunluğunun kontrolünün kritik önemi olduğunu göstermektedir (87). ALT mekanizması tümör kökenli hücre hatlarında ve primer tümörlerde de gözlenmiştir. Ancak, %10 oranındaki telomeraz-negatif tümör olgularının tamamında (Tümör olgularının %90’ında telomeraz aktivitesi saptanmıştır (34), ALT mekanizmasının karakteristik telomer morfolojisi görülmemektedir. Bu nedenle telomeraz ve ALT mekanizmalarından bağımsız başka mekanizmaların da varolma ihtimali göz ardı edilmemelidir (73). Bazı telomeraz-pozitif tümör olgularında, telomeraz aktivitesi ve ALT mekanizmasının bir arada varolduğuna işaret eden uzatılmış ve heterojen yapıda telomerler saptanmıştır (73). Tümör tiplerinin, ALT aktivitesi bakımından gösterdikleri özellikler henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da, astrositoma ve osteosarkoma olgularında, ALT mekanizmasının kullanıldığı bilinmektedir (31,67). Tümörün tipine göre ALT mekanizmasının prognostik önemi de değişmektedir. İnsan tümör hücrelerindeki ALT mekanizması, normal memeli somatik hücrelerindeki telomer homeostazının düzenlenemeyen şekli olarak nitelendirilebilir (53). xxvii ALT mekanizmasının moleküler temelinin anlaşılması, tümör tanısı ve tedavisi için önemlidir (53). Aynı derecede önemli olan bir başka soru ise ALT mekanizmasının normal somatik hücrelerde nasıl baskılandığıdır. Bu hücrelerde telomer devamlılığının sağlanamamasından da anlaşılabileceği gibi, normal hücreler ALT mekanizmasını baskılayabilmektedirler (68). İnsan kanser olgularının çoğunda telomeraz aktivitesi ile onkojenite arasında korelasyon bulunmaktadır (43). Ancak insan kanser hücrelerinde telomer devamlılığı mekanizması olarak ALT, telomerazdan daha az kullanılan bir mekanizma olmasına rağmen, ALT mekanizmasının anlaşılması kritik öneme sahiptir (49). Çünkü telomeraz pozitif tümörlerin tedavisi için telomeraz inhibitörlerinin kullanımı, telomer devamlılığı için ALT’ı kullanan altklonların ortaya çıkması için seçici bir baskı oluşturmaktadır. Bu yüzden başarılı bir antikanser tedavi telomeraz ve ALT inhibitörlerinin kombinasyonundan oluşmalıdır (58,67,68,70). İnsan ALT hücre kültürü telomerleri ile, maya PSS hücrelerindeki telomerlerin tekrar dizilerinin ardışık yapısı bakımından benzerlik saptanmıştır. Bu nedenle ALT mekanizmasının aydınlatılması için yapılan çalışmalarda, maya modellerinin yol gösterici olacağı düşünülmektedir (46). BÖLÜM II GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. KULLANILAN KİMYASAL MADDELER 1. Maya ekstresi (Yeast extract) (AppliChem) 2. NaCl (AppliChem) 3. Tripton (Sigma) 4. Pepton (Merck) 5. Dekstroz (AppliChem) 6. Agar (AppliChem) 7. Zimolaz (Zymolase) (Sigma) 8. Trizma baz (Sigma) 9. EDTA.2H2O (AppliChem) 10. NaOH (Sigma) 11. Triptofan (Sigma) xxviii 12. Histidin (AppliChem) 13. Urasil (AppliChem) 14. Adenin (AppliChem) 15. Lösin (Sigma) 16. Maya Nitrojen Bazı (Yeast Nitrogen Base)(Sigma) (Amonyum Sülfatlı, Aminoasitsiz) 17. Drop-out Mix (Sigma) 18. Sorbitol (AppliChem) 19. β-Merkapto Etanol (Sigma) 20. Sodyum dodesil sülfat (SDS) (AppliChem) 21. Potasyum asetat (AppliChem) 22. Asetik Asit (Atabay) 23. Etanol (J. T. Baker) 24. Tris.Cl (Sigma) 25. Amonyum Asetat (AppliChem) 26. EcoRI restriksiyon enzimi (Fermantas) 27. AccI restriksiyon enzimi (Roche) 28. BclI restriksiyon enzimi (Fermantas) 29. RNase (Roche) 30. Agaroz (Prona) 31. 100 bp, 200 bp, 1000 bp DNA markörleri (Fermantas) 32. Etidyum Bromür (Sigma) 33. HCl (Carlo-Erba) 34. Sodyum sitrat (Sigma) 35. Whatmann filtreleri (Amersham) 36. Naylon membran (Amersham) 2.2. KULLANILAN CİHAZ VE ALETLER 1. Mikroskop (Novex) 2. Elektroforez güç kaynağı (Thermo) 3. Elektroforez tankı (Thermo-EC) 4. Görüntüleme sistemi (Vilber Lourmat) 5. Bilgisayar (HP) xxix 6. Ultra santrifüj (Hettich) 7. Etüv (Nüve) 8. Otoklav (Hirayama) 9. Manyetik Karıştırıcı (Velp) 10. Çalkalayıcılı inkübatör (Gerhardt) 11. Isı bloku (Lab-Line) 12. pH metre (Ino-Lab) 13. Vorteks (Ika) 14. Hassas terazi (Sartorious) 15. Mikrodalga fırın (Ariston) 16. Derin Dondurucu (-80°C) (Nuaire) 17. Derin Dondurucu (-20°C) (Beko) 18. Mikropipet (Thermo) 2.3. KULLANILAN BESİYERİ VE ÇÖZELTİLER (72) 1. Yeast Pepton Dekstroz (YPD): Maya Ekstresi 10g Pepton 20g Dekstroz 20g Agar 20g dH2O (distile su) ile 1000 mL’ye tamamlandı. 2. Yeast Pepton Dekstroz Sıvı(YPD sıvı): Maya Ekstresi 10g Pepton 20g Dekstroz 20g dH2O ile 1000 mL’ye tamamlandı. 3. -His ve -Ura Besiyerleri: Adenin, Lösin ve Urasil stok çözeltileri 100x, Triptofan ve Histidin stok çözeltileri 500x oranında hazırlandı ve membran filtre ile sterilize edildi. 1) 500 x Trp: 500 mg Trp, 50 mL dH2O 2) 500 x His: 500 mg His, 50 mL dH2O 3) 100 x Ura: 100 mg Ura, 50 mL dH2O 4) 100 x Ade: 100 mg Ade, 50 mL dH2O 5) 100 x Leu: 100 mg Leu, 50 mL dH2O 6) %20 Dekstroz: 50 gr dekstroz, 250 mL dH2O xxx Çözelti A: 6,7 g Yeast Nitrogen Base (Amonyum sülfatlı, aminoasitsiz) 20 g Agar 1 mL 5N NaOH 1 g Drop-out Mix dH2O ile 1000 mL’ye tamamlanır. (pH: 6,0) 121ºC’de 30' otoklav sterilizasyonuna tabi tutulup soğuyunca çözeltiye 100 mL %20’lik dekstroz çözeltisi ilave edildi. -Ura ve -His plakları için Çöz. A üzerine aşağıdaki çözeltiler ilave edildi. -Ura Plak: 10 mL 100 x Leu 2 mL 500 x Trp 2 mL 500 x His 10 mL 100 x Ade -His Plak: 10 mL 100 x Leu 2 mL 500 x Trp 10 mL 100 x Ura 10 mL 100 x Ade xxxi Son plak konsantrasyonları: Trp:20 mg/L, His:20 mg/L, Ura:20 mg/L, Ade:20 mg/L. 4. SEB: 91,9 g Sorbitol 100 mL 0,5 M EDTA 0,5 mL β-Merkapto etanol dH2O ile 500 mL’ye tamamlandı. 5. Zimolaz/SEB: 2 mg zimolaz 6 mL SEB içinde çözündürüldü. 6. EDS: 25 mL 0,5 M EDTA (pH :8,0) 2,5 mL %20’lik SDS 6,025 µl 5 M NaOH Vf : 500 mL 7. 5 M Potasyum Asetat Çözeltisi: 122,75 g potasyum asetat 200 ml dH2O pH:7,5 dH2O ile 250 mL’ye tamamlandı. 8. TE: 10mM Tris.Cl (pH:8,0) 1 mM EDTA (pH :8,0) 9. 10 M NH4OAc Çözeltisi: 770 g Amonyum asetat dH2O ile 1000 mL’ye tamamlandı. 10. 0,5 x TBE: 0,045 M Tris-borate 5,4 g Tris-base 0,001 M EDTA 2,75 borik asit 2 mL 0,5 M EDTA 800 mL dH2O, dH2O ile 1000 mL’ye tamamlandı. 11. 0,2 N HCl Çözeltisi: %36,5’lik HCl 1:50 oranında distile su ile seyreltildi. 12. 0,5 N NaOH/ 1,5 M NaCl : 600 mL 5 M NaCl 200 mL 5 N NaOH 1200 mL dH2O 13. 1 M Tris (pH:7,5) / 1,5 M NaCl: 225 mL 5 M NaCl 500 mL 1,5 M Tris (pH:7,5) dH2O ile 750 mL’ye tamamlandı. 14.20xSSC: 175,3 g NaCl 88,2 g Sodyum sitrat 800 mL dH2O pH :7,0 dH2O ile 1000 mL’ye tamamlandı. xxxii 2.4. LABORATUAR ÇALIŞMALARI 2.4.1. Çalışma Düzeneği Acc ve Bcl telomerik tekrarlarının konstrüksiyonu ve bunların K. lactis hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. K. lactis hücrelerinde TER1’in kaybından sonra Acc ya da Bcl ile işaretli bir telomer taşıyan TER1-∆ kökenlerinin fenotipik büyümeleri ışık mikroskobu altında takip edilerek kaydedilmiştir. Fenotipik değerlendirme sonucu seçilen K. lactis kolonilerinden genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Genomik DNA’lara EcoRI ve EcoRI+AccI veya EcoRI+BclI ile restriksiyonel kesim yapılmıştır. Bu restriksiyonel fragmanlar %1’lik agaroz jel elektroforezi ile ayrıştırılıp etidyum bromür (5 µg/ml) ile boyandıktan sonra görüntülenmiş ve Southern Blot yöntemi ile naylon membrana transfer edilmiştir. Membranlar, 32 P işaretli KL1-25 telomerik oligo probu ile hibridizasyona tabi tutulmak üzere projemizde işbirliği yapılan taraf olarak yer alan Georgia Üniversitesi Genetik Bölümüne Dr. Michael J. McEachern’in laboratuarına gönderilmiştir. Daha sonra 6. pasajda seçilerek DNA izolasyonu yapılmış olan koloniler ve bu kolonilerin 1. ve 2. kuşak ebeveynleri, HIS ve URA genlerini taşıyıp taşımadıkları bakımından – His ve –Ura besiyerlerinde analiz edilmişlerdir. Çalışmanın temel basamaklarını gösteren şema Şekil 1’de verilmiştir. xxxiii Şekil 1: Telomerik tekrarların dağılımını belirlemek için Acc tekrarı taşıyan telomerlere sahip K. lactis suşlarının oluşturulması ve kullanılması: Subtelomerik bölge, URA3 geni(STU) ve 11,5 bç Acc telomerik tekrarı taşıyan 1,2 kb’lik lineer DNA parçası kullanılarak Acc telomerik tekrarları ter1-∆ suşuna yerleştirilir Şekil 1: Çalışmanın temel basamakları 2.4.2. Maya Kökenleri Kullanılan tüm K. lactis kökenleri 7B520’nin türevleridir (85). TER1 (pJR31) taşıyan plazmid, HIS3 geni taşıyan pKL316’nın türevidir (71). 2.4.3. Mutant Telomerik Tekrar Taşıyan K. lactis Hücrelerinin Oluşturulması ve Transformasyonu Acc ve Bcl mutant telomerik tekrarların oluşturulması ve bunların K. lactis hücrelerine transformasyonu danışmanım Prof. Dr. Zeki Topçu tarafından, projemizde işbirliği yapılan taraf olarak yer alan Georgia Üniversitesi Genetik Bölümünde Dr. Michael J. McEachern’in laboratuarında gerçekleştirilmiştir. HIS3 TER1 plasmidi taşıyan TER1-∆ K. lactis hücreleri ~11,5 telomerik tekrar taşıyan URA3 ile işaretlenmiş telomerik fragmentlerle transforme edilir. İşlemin deneysel basamaklari şekil 2’de verilmiştir. Acc transformantları WA2, A2 ve A4, Bcl transformantı B3 olarak adlandırılmıştır. Acc mutasyonu, Rap1 bağlanma dizisinde xxxiv Acc restriksiyonel tanıma bölgesi oluşturan 25 bç’lik telomerik tekrardaki tek baz değişimidir. Hızlı ve önemli derecede telomer uzamasına neden olduğu bilinmektedir. Bcl mutasyonunun ise etkisiz olduğu gösterilmiştir (81,82). K. lactis doğal telomerik tekrarları ile Acc ve Bcl mutant tekrarları tablo 2’de gösterilmiştir. Tablo 2: Doğal, Acc ve Bcl mutant telomerik tekrar dizileri Doğal telomerik tekrar Acc mutant telomerik tekrar Bcl mutant telomerik tekrar TTTGATTAGGTATGTGGTGTACGGA TTTGATTAGGTATGTGGTATACGGA TTTGATCAGGTATGTGGTGTACGGA xxxv Şekil 2: Mutant Telomerik Tekrar Taşıyan K. lactis Hücrelerinin Oluşturulması ve Transformasyonu 2.4.4. Fenotipik Değerlendirme xxxvi Fenotipik değerlendirme TER1’in kaybından sonra Acc ya da Bcl ile işaretli bir telomer taşıyan TER1-∆ kökenlerinin fenotipik büyümeleri ışık mikroskobu altında skorlanarak gerçekleştirilmiştir. Bunun için K. lactis hücreleri zengin besiyeri ortamına (YPD) pasajlanarak 30°C’de 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Büyüme skorları, 48 saatte bir yapılan pasajlamalar sonucunda kolonilerin ortalama büyüklük ve görünüşüne göre 4-0 aralığında 0,5’lik değişim gösteren değerlerle verilmiştir. “4” büyüme skoru doğal tip hücrelerden ayırt edilemeyecek bir büyümeye işaret ederken “1” skoru küçük, kötü görünümlü kolonileri ve tipik olarak zengin besiyerindeki 6 seri pasajlama sonrasında yüksek hücre ölümünü gösterir (48). Şekil 3 ’de koloni fenotiplerinin tipik skorları gösterilmiştir. xxxvii A B C D A: Fenotip Değeri 4, B: Fenotip Değeri 3, C: Fenotip Değeri 2, D: Fenotip Değeri <1, E: Senes fenotipi gösteren transformantlar arasından tekrar replikasyon yeteneği kazanarak referans değerindekine yakın fenotip özelliği gösteren transformant E Şekil 3: K. lactis transformantlarının fenotiplerinin tipik skorları 2.4.5. K. lactis Genomik DNA İzolasyonu (72) xxxviii 1. Hücreler 1,5 ml YPD içerisinde yaklaşık 12 saat süresince çoğaltılır. 2. 2 dakika santrifüjlenip besiyeri uzaklaştırılır. 3. 180 µl Zimolaz/SEB içerisinde vortekslenir. (2 mg zimolaz/6 ml SEB) 4. 37°C’ de 30 dak inkübe edilir. 5. 13000 rpm’de 5 dak santrifüjlenir, süpernatan uzaklaştırılır. 6. 150 µl EDS içerisinde süspansiyom haline getirilir. 7. 65°C’ de 15 dak inkübe edilir. 8. 15 µl 5M KOAc eklenir, tüp altüst edilerek karıştırılır, buz üzerinde 60 dak bekletilir. 9. 13000 rpm’de 5 dak santrifüjlenir berrak süpernatan yeni bir tüpe transfer edilir. 10. 200 µl Et-OH eklenir, 2000 rpm’de 1 dak santrifüjlenir, Et-OH uzaklaştırılır. 11. Oluşan DNA presipitasyonu 100 µl TE’de çözülür. 12. 34 µl NH4OAc (10 M) eklenir, buz üzerinde 20 dak bekletilir.13000 rpm’de 5 dak santrifüjlenir. (NH4OAc proteinleri çöktürür.) 13. Süpernatan yeni bir tüpe transfer edilir, 150 µl Et-OH eklenerek 2000 rpm’de 1 dak santrifüjlenir. 14. +4°C’ deki %70’lik Et-OH ile yıkanır. 15. Buharlaştırılan tüp içeriği 30 µl TE’de saklanır. 2.4.6. Telomerik DNA Analizleri (72) Rekombinasyon sonucu mutant telomerik tekrarları kazanmış olan kolonilerin genomik DNA’larının AccI ya da BclI restriksiyon enzimlerinin özgül tanıma bölgesini taşıdıkları bilinmektedir. Acc transformantlarının genomik DNA’larının EcoRI ve EcoRI+AccI ile, Bcl transformantlarının genomik DNA’larının EcoRI ve EcoRI+BclI ile restriksiyonel analizleri gerçekleştirilmiştir. Her DNA örneğinin restriksiyonel analizi için uygun olan miktar, A ve B tüplerinin her birine konmuş (x µl) ve üzerine (12-x) µl dH2O eklenmiştir. 1. EcoRI Reaksiyonu: 1 reaksiyon için tüpe xxxix 1,5 µl 10 x EcoRI buffer 1 µl EcoRI 0,2 µl RNase 0,3 µl dH2O Æ 3 µl/tüp Æ 37°C’de 2 saat inkübasyon 2. (AccI + EcoRI) Reaksiyonu: 1 reaksiyon için tüpe a. 1,5 µl 10 x EcoRI buffer 1 µl EcoRI 0,2 µl RNase 0,3 µl dH2O Æ 3 µl/tüp Æ 37°C’de 2 saat inkübasyon b. 1 µl Buffer A 1 µl AccI 8 µl dH2O Æ 10 µl/tüp Æ 37°C’de 2 saat inkübasyon 3. (BclI + EcoRI) Reaksiyonu: 1 reaksiyon için tüpe a. 2 µl 10 x EcoRI buffer 1 µl EcoRI 0,2 µl RNase 4,8 µl dH2O Æ 8 µl/tüp Æ 37°C’de 2 saat inkübasyon b. 1,25 µl 10 x G buffer 1 µl BclI 2,75 µl dH2O Æ 5 µl/tüp Æ 37°C’de 2 saat inkübasyon Bu restriksiyonel fragmanlar %1’lik agaroz jelde yürütülüp etidyum bromür (5 µg/ml) ile boyandıktan sonra görüntülenmiştir. 2.4.7. Southern Blot xl Restriksiyonel kesimin ardından, rekombinasyon aracılığıyla URA3 işaretli telomerik tekrarları kazanmış kolonilerin belirlenmesi amacıyla, Southern Blot yöntemi ile DNA fragmanları jelden naylon membrana aşağıdaki şekilde transfer edilmiştir (17,72). 1) 0,2 N HCl Æ 10 dakika (Depürinasyon) 2) 0,5 N NaOH/ 1,5 M NaCl Æ 1 saat (Denatürasyon) 3) Distile su Æ 1-2 dakika 4) 1 M Tris (pH:7,5) / 1,5 M NaCl Æ 30 dakika (Nötralizasyon) 5) 2 x SSC Æ 5 dakika (Adaptasyon) 6) 10 x SSC/0,5 N NaOH Æ 12-16 saat (Transfer) Membranlar 32 P işaretli KL1-25 telomerik oligo probu ile hibridizasyona tabi tutulmak üzere projemizde işbirliği yapılan taraf olarak yer alan Georgia Üniversitesi Genetik Bölümüne Dr. Michael J. McEachern’in laboratuarına gönderilmiştir. KL1-25 oligonükleotit probu: ACGGATTTGATTAGGTATGTGGTGT 2.4.8. K. lactis Transformantlarının -His ve -Ura Besiyerlerinde Analizleri K. lactis transformantlarından 6. pasajda seçilerek DNA izolasyonu yapılmış olan koloniler ve bu kolonilerin 1. ve 2. kuşak ebeveynleri, HIS ve URA genlerini taşıyıp taşımadıkları bakımından analiz edilmişlerdir. Bunun için K. lactis hücreleri His (histidin içermeyen) ve –Ura (urasil içermeyen) besiyerlerine pasajlanmış, 30°C’de 48 saat inkübasyonun ardından –His besiyerinde üreyen koloniler HIS genini taşıdıkları için His+, -Ura besiyerinde üreyen koloniler URA genini taşıdıkları için Ura+ olarak kaydedilmiştir. xli BÖLÜM III BULGULAR Fenotip özellikleri takip edilen ve DNA izolasyonu yapılan koloni sayıları Tablo 3’de görülmektedir. Tablo 3: Fenotip özellikleri takip edilen ve DNA izolasyonu yapılan koloni sayıları Transformant Acc Bcl N1 N2 1. Psj 2. Psj 3. Psj 4. Psj 5. Psj 6. Psj 1. Psj 2. Psj 6. Psj 6 2 12 4 24 8 48 16 96 22 185 44 6 2 12 4 27 4 N1: Takip Edilen Koloni Sayısı N2: DNA İzolasyonu Yapılan Koloni Sayısı K. lactis kolonilerinin morfolojik fenotip değerlendirmeleri zengin besiyeri ortamında 48 saatte bir yapılan pasajlamalar sonucunda kolonilerin ortalama büyüklük ve görünüşüne göre ışık mikroskobu altında skorlanarak yapılmıştır. Transformantların zamana göre fenotip değişimleri Tablo 4’de görülmektedir. Şekil 4’de ve Şekil 5’te transformantların zamana göre fenotip değişimleri grafik halinde görülmektedir. Telomeraz RNA genini (TER1) taşıyan plazmid kaybedildiği zaman, Acc ya da Bcl telomerlerinden birini taşıyan transformantların alt klonlarının seri pasajlaması sonucunda dereceli telomer kısalması ve replikasyonun durması şeklinde açıklanabilecek senes fenotipi görülmüştür. xlii Tablo 4: Transformantların zamana göre fenotip değişimleri 1. Pasaj 2. Pasaj Transformant n *Skor n *Skor 2 4 4 3 WA2 2 4 4 3,25 A2 2 4 4 3,75 A4 2 4 4 3,38 B3 n: Koloni sayısı *: 4 üzerinden 1. Pasaj 2. Pasaj Transformant n *Skor n *Skor 6 4 12 3,33 Acc 2 4 4 3,38 Bcl n: Koloni sayısı 3. Pasaj n *Skor 8 2,75 8 3,13 8 3,25 8 3,25 4. Pasaj n *Skor 16 2,94 16 2,16 16 3,03 16 2,25 5. Pasaj n *Skor 32 2,5 32 1,61 32 2,53 22 2 6. Pasaj n *Skor 54 2,24 69 2,12 62 2,19 44 2,17 3. Pasaj n *Skor 24 3,04 8 3,25 4. Pasaj n *Skor 48 2,71 16 2,25 5. Pasaj 6. Pasaj n *Skor n *Skor 96 2,21 185 2,18 22 2 44 2,17 *: 4 üzerinden Fenotip Değişimi 5 4,5 4 Fenotip Değeri 3,5 3 WA2 A2 2,5 A4 B3 2 1,5 1 0,5 0 1. Pasaj 2. Pasaj 3. Pasaj 4. Pasaj 5. Pasaj 6. Pasaj Pasaj Numarası Şekil 4: WA2, A2,A4,B3 Transformantlarının zamana göre fenotip değişimleri xliii Fenotip Değişimi 5 4,5 Fenotip Değişimi 4 3,5 3 Acc 2,5 Bcl 2 1,5 1 0,5 0 1. Pasaj 2. Pasaj 3. Pasaj 4. Pasaj 5. Pasaj 6. Pasaj Pasaj Numarası Şekil 5: Acc ve Bcl transformantlarının zamana göre fenotip değişimleri Daha ayrıntılı bir inceleme için senes koloniler hafif ve şiddetli olarak alt gruplara ayrılmışlardır. Hafif senes koloniler fenotipik skorlama sırasında 2,5 ya da 2,0’ye ulaşanlar, şiddetli senes koloniler 1,5 ya da 1,0’e ulaşanlardır. Tablo 5, Tablo 6 ve Şekil 6, her iki transformant için bu senes skorlarına ulaşan koloni sayısını göstermekte ve Acc’ye göre daha fazla sayıda Bcl transformantının senes fenotipi gösterdiği görülmektedir. Tablo 5’de görüldüğü gibi 2,5 ve 2,0 skorlarına, WA2 transformantının sırasıyla %85 ve %76’sı, A2 transformantının sırasıyla %97 ve %91’i, A4 transformantının sırasıyla %87 ve %71’i, B3 transformantının sırasıyla %95 ve %93’ü ulaşmışlardır. 1,5 ve 1,0 skorlarına, WA2 transformantının sırasıyla %41 ve %19’u, A2 transformantının sırasıyla %83 ve %52’si, A4 transformantının sırasıyla %37 ve %8’i, B3 transformantının sırasıyla %82 ve %52si ulaşmışlardır. Acc transformantlarının sırasıyla %90 ve %80’i , Bcl transformantlarının sırasıyla %95 ve %93’ü hafif senes skorlarına ulaşmışken şiddetli senes transformantlar gözönüne alındığında oranlar oldukça farklılık göstermektedir. Acc transformantının sadece %55 ve %28’i sırasıyla 1,5 ve 1,0’e inerken Bcl’nin %82 ve %52’si aynı fenotipik skorlara inmiştir. Tablo 5: WA2, A2,A4,B3 transformantları için hafif ve şiddetli senes fenotipi gösteren koloni sayıları, T: Transformant. xliv T WA2 A2 A4 B3 T WA2 A2 A4 B3 T WA2 A2 A4 B3 T WA2 A2 A4 B3 Takip Edilen Koloni Sayısı 54 69 62 44 Takip Edilen Koloni Sayısı 54 69 62 44 Takip Edilen Koloni Sayısı 54 69 62 44 Takip Edilen Koloni Sayısı 54 69 62 44 Büyüme Özelliği Oranı Senes Nonsenes 46 8 67 2 54 8 42 2 Büyüme Özelliği Oranı Senes Nonsenes 41 13 63 6 44 18 41 3 Büyüme Özelliği Oranı Senes Nonsenes 22 32 57 12 23 39 36 8 Büyüme Özelliği Oranı Senes Nonsenes 10 44 36 33 5 57 23 21 Büyüme Özelliği Oranı Senes(%) Nonsenes(%) 85 15 97 3 87 13 95 5 Büyüme Özelliği Oranı Senes(%) Nonsenes(%) 76 24 91 9 71 29 93 7 Büyüme Özelliği Oranı Senes(%) Nonsenes(%) 41 59 83 17 37 63 82 18 Büyüme Özelliği Oranı Senes(%) Nonsenes(%) 19 81 52 48 8 92 52 48 Sınır: 2,5 Sınır: 2,0 Sınır: 1,5 Sınır: 1,0 Tablo 6: Acc ve Bcl transformantları için hafif ve şiddetli senes fenotipi gösteren koloni sayıları, T: Transformant. xlv T Acc Bcl T Acc Bcl T Acc Bcl T Acc Bcl Takip Edilen Koloni Sayısı 185 44 Takip Edilen Koloni Sayısı 185 44 Takip Edilen Koloni Sayısı 185 44 Takip Edilen Koloni Sayısı 185 44 Büyüme Özelliği Oranı Senes Nonsenes 167 18 42 2 Büyüme Özelliği Oranı Senes Nonsenes 148 37 41 3 Büyüme Özelliği Oranı Senes Nonsenes 102 83 36 8 Büyüme Özelliği Oranı Senes Nonsenes 51 134 23 21 Büyüme Özelliği Oranı Senes(%) Nonsenes(%) 90 10 95 5 Büyüme Özelliği Oranı Senes(%) Nonsenes(%) 80 20 93 7 Büyüme Özelliği Oranı Senes(%) Nonsenes(%) 55 45 82 18 Büyüme Özelliği Oranı Senes(%) Nonsenes(%) 28 72 52 48 Sınır: 2,5 Sınır: 2,0 Sınır: 1,5 Sınır: 1,0 Senes-Nonsenes 100 10 90 5 7 20 18 45 80 70 48 72 Acc Nonsenes Acc Senes Bcl Nonsenes Bcl Senes 60 Koloni Yüzdesi 50 90 40 95 93 80 82 55 30 20 52 28 10 0 2,5 2,0 1,5 1,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Fenotipik Sınır Şekil 6: Acc ve Bcl transformantlarının senes fenotip gösterme yüzdeleri xlvi Seçilen transformantlardan DNA izolasyonları yapılarak telomerik restiksiyonel fragmanların analizi (EcoRI ve EcoRI+AccI ya da EcoRI ve EcoRI+BclI) gerçekleştirilmiştir. Bu fragmanlarla yapılan %1’lik agaroz jel elektroforezi sonucu elde edilen jel fotoğrafları Şekil 7’de görülmektedir. 1. ve 2. kuşak altklonlar M - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + M M - + - + - + - + - + - + M A Şekil 7: Acc ve Bcl transformantlarının jel fotoğrafları: A: WA2 transformantı, B: A2 transformantı, C: A4 transformantı (üst sıra), B3 transformantı (alt sıra). Transformantların 1. ve 2. kuşak altklonları fotoğrafta işaretlenmiştir. Diğer kuyucuklar 6 seri pasajlama sonrasında gösterdikleri fenotip özelliklerine göre seçilen altklonların restriksiyonel analizlerini göstermektedir. xlvii 1. ve 2. kuşak altklonlar M - + - + - + - + M - + - + - + - + - + - + - + - + - + M - + - + - + - + - + M B xlviii 1. ve 2. kuşak altklonlar M - + - + - + - + M - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + C xlix - + M - + - +M Restriksiyonel kesim sonucu oluşan DNA fragmanları, Southern Blot yöntemi ile naylon membrana transfer edilmiştir. Georgia Üniversitesi’nde 32P işaretli KLl-25 telomerik oligo probu ile gerçekleştirilen hibridizasyon işleminin ardından elde edilen fotoğraflar Şekil 8’de görülmektedir. 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 A Şekil 8: 32P işaretli KLl-25 telomerik oligo probu ile gerçekleştirilen hibridizasyon işleminin ardından elde edilen fotoğraflar. A: WA2 transformantı, B: A2 transformantı, C: A4 transformantı (üst sıra), B3 transformantı (alt sıra). “☻” işareti mutant telomerik tekrarların yayıldığı altklonları göstermektedir. l 1 3 5 7 9 11 13 B li 15 17 19 1 3 5 7 9 11 13 C lii 15 17 19 Tablo 7’de mutant telomerik tekrarların yayılım gösterdiği altklonlar tablo halinde özetlenmiş ve analiz edilen 24 altklondan 9 tanesinde (~%38) mutant telomerik tekrarların yayıldığı belirlenmiştir. Tablo 7: Mutant telomerik tekrarların rekombinasyonel dağılım özellikleri T WA2 A2 A4 TOPLAM 6. PasajdaAnaliz Edilen Koloni Sayısı 10 11 3 24 MTT MTT(%) 3 5 1 9 30 45 33 38 T: Transformant MTT:Mutant Telomerik Tekrarların yayılım gösterdiği altklon sayısı DNA izolasyonu yapılan K. lactis transformantlarının histidin veya urasil içermeyen besiyeri ortamına pasajlanmaları sonucu belirlenen His+ ve Ura+ transformant sayıları Tablo 8’de görülmektedir. Beklendiği gibi tüm transformantlar 1. kuşakta her iki geni de taşımaktadırlar. WA2 transformantının 2. kuşakta analiz edilen 4 altklonundan 2 tanesinin HIS genini kaybettiği, 6. kuşakta analiz edilen 12 koloniden sadece 1 tanesinin HIS geni, 6 tanesini de URA geni taşıdığı görülmektedir. A2 transformantının 2. kuşakta da HIS ve URA genlerini koruduğu, ancak 6. kuşakta analiz edilen 12 koloniden hiçbirinin HIS geni taşımadığı, 2 tanesinin URA geni taşıdığı belirlenmiştir. A4 transformantının 2. kuşak altklonlarının tamamının HIS genini kaybettiği ancak URA genini koruduğu, 6. kuşakta ise sadece 1 koloninin URA geni taşıdığı görülmektedir. B3 transformantının 2. kuşak altklonlarının tamamının HIS ve URA genlerini koruduğu, 6 kuşakta ise tamamının her iki geni de kaybettiği görülmektedir. liii Tablo 8: His+ ve Ura+ transformant sayıları Transformant WA2 (Parental) WA2 (2. Pasaj) WA2 (6. Pasaj) A2 (Parental) A2 (2. Pasaj) A2 (6. Pasaj) A4 (Parental) A4 (2. Pasaj) A4 (6. Pasaj) B3 (Parental) B3 (2. Pasaj) B3 (6. Pasaj) Analiz Edilen Koloni Sayısı 2 4 12 2 4 12 2 4 3 2 4 4 His+ Sayısı Ura+ Sayısı 2 2 1 2 4 0 2 0 0 2 4 0 2 4 6 2 4 2 2 4 1 2 4 0 liv BÖLÜM IV TARTIŞMA “Roll and Spread Model” modeli, tek bir telomerik tekrarın, telomeraz aktivitesine sahip olmayan mutant K. lactis hücrelerinde uzatılmış telomerlere sahip PSS hücreler oluşturabileceğini öne sürmektedir (56). Çalışmamızda, bu model ile uyum gösteren sonuçlar ortaya çıkmıştır. Çalışmamızda deneylerin başarıya ulaşma ölçütleri aşağıdaki gibidir: • Transforme olmuş K. lactis hücrelerinin, gerçekleştirilen transformasyonla seçici besiyerlerinde gösterdikleri büyüme arasındaki tutarlılık. • Pasajlanan, telomeraz enziminden yoksun K. lactis hücrelerinin mikroskobik fenotipleri ile telomer uzunluğu arasındaki korelasyonun tutarlı olması. • Telomer devamlılığının rekombinasyon işlemi ile gerçekleştiğini açıklayabilmek için, izleyici gen olarak kullanılan URA3 geninin varlığının seçici besiyerlerinde pasajlama ile belirlenmesi. Seri pasajlamalar sonucunda, hücrelerde HIS3TER1 plasmidinin kaybıyla dereceli telomer kısalması ve bunun fenotipik yansıması olarak kötüleşen koloni fenotipleri görülmüş, bazı kolonilerde URA3 işaretli mutant telomerik tekrarların rekombinasyon yoluyla yayılmasının ardından tekrar iyileşen koloni fenotipleri saptanmıştır (Şekil 4 ve 5). lv Şekil 7’de alınan görüntüler, DNA izolasyonlarının başarılı bir şekilde gerçekleştirildiğini göstermekte ancak alınan DNA bandlarının transformasyonda kullanılan mutant telomerik fragmanlara ait olup olmadıkları hakkında bir fikir vermemektedir. DNA bantlarının hangilerinin mutant telomerik tekrarlara ait olduğunu anlamak amacıyla, Şekil 8’de sonuçları görülen Southern Blot ve KL-125 telomerik oligo probu ile hibridizasyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. KL-125 probu ile alınan membran görüntüleri, telomerik bölgeye ait DNA bandlarının varlığını göstermesinin yanı sıra diğer bir önemli bulguyu daha sağlamaktadır. “Gereç ve Yöntem” bölümünde ayrıntılı olarak tanımlandığı gibi yapılan tek ve çift restriksiyonel enzim analizleri mutant telomerik tekrarların dağılımlarını göstermektedir. Tablo 7’de rekombinasyonel dağılım verileri analiz edilen 24 altklondan 9 tanesinde (~%38) mutant telomerik tekrarların yayıldığı belirlenmiştir. Bu oran Bcl transformantları için yaklaşık %10 dur (80). Transformantların oluşturulması esnasında orijinal telomerik tekrar üzerindeki farklı mutasyonlar, telomerik uzama mekanizmasında farklı etkiler yaratabileceğinden telomerik proteinlerin bağlanma bölgelerindeki değişikliklerin olasılıkla farklı sonuçlar doğurması- mutant telomerik tekrarların yayılım oranı da Acc ve Bcl transformantları arasında farklılık göstermektedir (50). Bunun dışında telomerik dizinin boyca önemi de bu iki mutant arasındaki farklı dağılım oranının bir nedeni olabilir. Sonuç olarak Bcl mutasyonunun fenotip üzerinde etkisiz, Acc mutasyonun da hızlı ve önemli derecede telomer uzamasına neden olduğu bilindiğinden, Acc transformantlarında elde ettiğimiz %38’lik mutant telomerik takrar dağılımı sonucunun, Topcu z ve ark (80) tarafından Bcl transformantlarında saptanan %10’luk dağılım sonucu ile benzer olması beklenmemektedir. lvi Şekil 8’de hibridizasyon fotoğraflarından da anlaşılacağı gibi, rekombinasyon sonucu farklı kolonilerin telomerleri ya da aynı koloninin farklı telomerleri arasında telomer uzamasının oranında farklılık olabilir. Bu durum, tek bir mutant telomerik tekrar diğer telomerler arasında yayılım gösterirken, rekombinasyon işleminin rasgele gerçekleşiyor olmasının doğal bir sonucudur. DNA izolasyonu yapılan K. lactis transformantlarının HIS ve URA genlerini taşıyıp taşımadıklarının saptanması için histidin veya urasil içermeyen besiyeri ortamına pasajlanmaları sonucu Tablo 8’deki veriler elde edilmiştir. Beklendiği gibi tüm transformantlar 1. kuşakta her iki geni de taşımaktadırlar. TER1 geni ile aynı plazmitte yer alan HIS geninin sonraki pasajlamalarda kaybının saptanması o altklonun TER1 genini de kaybettiğini ve telomeraz aktivitesine sahip olmadığını göstermektedir. Transforme edilen mutant telomerik tekrarların subtelomerik bölgesine yerleştirilmiş URA3 geni ise mutant telomerik tekrarların dağılımının işareti olduğundan, seri pasajlamalar sonucunda URA3 geninin dağılımı DNA rekombinasyon hızının bir ölçüsüdür. WA2 transformantının 6. kuşakta analiz edilen 12 koloniden sadece 1 tanesinin HIS geni, 6 tanesini de URA geni taşıdığı görülmektedir. A2 transformantının 6. kuşakta analiz edilen 12 koloniden hiçbirinin HIS geni taşımadığı, 2 tanesinin URA geni taşıdığı belirlenmiştir. A4 transformantının 6. kuşakta analiz edilen 3 koloniden hiçbirinin HIS geni taşımadığı, sadece 1 koloninin URA geni taşıdığı görülmektedir. Kanser prognozunda telomerik uzamanın öneminin fark edilmesiyle birlikte, antikanser tedavi stratejisinde, telomer ve telomeraz umut vaat edici ilaç hedefleri olarak gündeme gelmiştir. Bu stratejiler, tümör hücrelerinin büyük çoğunluğunda belirlenen telomeraz aktivitesi nedeniyle, tümör spesifik immünoterapi, telomeraz hedefli tümör spesifik gen terapisi, telomerazın RNA bileşenini ya da katalitik alt lvii ünitesini hedef alan ilaç molekülleri, telomer-telomeraz kompleksi içinde yer alan telomerik proteinleri hedefleyen ilaç moleküllerinin tasarım çalışmaları gibi, çoğunlukla telomerazın aktivitesini inhibe etmeye yöneliktir (61,62,70). Ancak bu stratejilerin tümör hücrelerinin %10-15’inde görülen ALT mekanizması üzerinde etkisiz olması, bazı tümörlerin sadece tek mekanizmayı hedefleyen stratejilere direnç geliştirebilme ihtimalini ve ek tedavi stratejilerinin gerekliliğini ortaya çıkarmaktadır (61,62,69). Telomeraz aktivitesi ve ALT mekanizmalarını birlikte kullanan heterojen tümörlerde telomeraz inhibitörlerinin kullanımının, tedavide yaratabileceği iki problem dikkat çekmektedir. Birincisi, telomeraz inhibitörü ALT mekanizması üzerinde etkisiz olacağından tedavi %100 başarılı olmayacaktır. İkincisi ise, telomeraz aktivitesinin inhibe edilmesinin, ALT mekanizmasını kullanan tümör hücreleri üzerinde seçici bir avantaj sağlayabileceği teorisidir (58,69). Buna ilişkin yapılan iki çalışmada DNA hatalı eşleşme onarım (Mismatch Repair) mekanizmasına sahip olmayan kolon kanseri hücrelerinde telomeraz aktivitesi inhibisyonu sonucunda ALT mekanizmasının karakteristik telomer yapısına sahip olmayan telomer uzaması gerçekleştiği ve telomeraz enziminin yeniden aktive olduğu saptanmıştır. Bunun nedeni, bu hücrelerin ALT mekanizması için gerekli bazı DNA onarım proteinlerinden yoksun olmalarıyla açıklanmıştır (2). Telomeraz pozitif ölümsüz insan fibroblast hücreleriyle gerçekleştirilen bir diğer çalışmada da telomeraz inhibisyonu sonucunda benzer sonuçlar alınmış ayrıca APB’lerin (“ALTassociated Promyelocytic leukemia (PML) Bodies (APBs)”) eksprese edilmediği saptanmıştır (24). Bazı telomeraz negatif insan tümör hücrelerinde ise, ALT aktivitesinin uzun ve heterojen telomer yapısı ve APB’ler gibi karakteristik özelliklerine sahip olmayan telomer uzamasının belirlenmesi, birden fazla ALT lviii mekanizmasının olabileceğini ve bilinen ALT işaretlerinin mekanizmanın tanımlanması için yeterli olmayabileceğini akla getirmektedir (13,39). Daha önce tanımlanmış olan insan ALT hücrelerindeki telomer yapısı Tip II S. cerevisiae PSS hücrelerine (yalnızca telomerik tekrar dizilerinden oluşan) benzer yapıda olduğu halde Marciniak ve ark. tarafından insan ALT hücre hattıyla yapılan bir çalışmada, Tip I PSS hücrelerinin telomer yapılarına benzer yapıda (telomerik tekrarlara ve subtelomerik Y’ elemanına sahip olan) telomer dizileri saptanmıştır. Bu hücrelerin, telomerik rekombinasyona ilişkin işaretler taşıdığı halde APB elemanlarına sahip olmadığı belirlenmiştir (46). Başarılı bir telomer hedefli antikanser tedavi için, telomeraz ve ALT inhibitörlerinin kombine kullanımı en uygun strateji olacaktır. Bu nedenle ALT mekanizmasındaki moleküler bileşenlerin karekterizasyonu, ilaç hedefi olarak yeni ALT inhibitörlerinin tanımlanması açısından oldukça önemlidir. Ayrıca her iki telomer uzaması mekanizmasının da hedefi telomerler olduğundan, iki mekanizmada da yer alan proteinlerin tanımlanarak ilaç hedefi olarak gündeme gelmesi ve iki mekanizmanın tek bir molekülle inhibe edilmesi de mümkündür (58,61,68). Telomeraz inhibitörlerinin uzun süreli kullanımının, kök hücreler, germinal hücreler, kütanöz hücreler, immün ve hematopoietik sistem hücreleri gibi yüksek proliferasyon gösteren hücreler üzerinde toksik bir etki oluşturacağı öngörülmektedir (61). Ancak kanser hücreleri normal hücrelerden daha hızlı çoğaldığı ve bunun sonucu olarak da daha kısa telomerlere sahip olduğu için, anti-telomeraz stratejinin öncelikli hedefi olacaktır (62). Kanser hücrelerinde telomer uzaması mekanizmalarının moleküler temelinin anlaşılması kadar önemli olan bir nokta ise normal hücrelerde bu mekanizmaların nasıl baskılandığının anlaşılmasıdır (68). Normal hücrelerin telomer devamlılığını lix sağlayamamalarından da anlaşılacağı üzere ALT mekanizmasının somatik hücrelerde baskılandığı gösterilmiştir (63). Ancak bazı telomeraz-pozitif hücreler de ALT mekanizmasını baskılayabilmektedirler. ALT hücre hattı ve telomeraz-pozitif hücre hattının füzyonu sonucunda, telomer devamlılığını sağlayabilen ancak karakteristik ALT telomerik yapısına sahip olmayan hibritler meydana gelmiştir (63,68). lx BÖLÜM V SONUÇ VE ÖNERİLER Çalışmamızda “Roll and Spread Model”de de öne sürüldüğü şekilde tek bir mutant telomerik tekrarın telomeraz aktivitesine sahip olmayan mutant bir K. lactis’te rekombinasyon yoluyla telomer uzamasına neden olabileceği saptanmıştır. Telomerler ve insan hastalıkları arasındaki bağlantının anlaşılması için, telomer fonksiyon kaybının, hücre büyümesini bloke etmek ve hücrelerin bu sorunun üstesinden gelebilmek amacıyla kullandıkları mekanizmaların anlaşılması gerekmektedir. Tümör hücrelerinin telomerik dizileri koruma yetenekleri, anti-kanser ilaç geliştirme çalışmaları için önemli bir hedeftir ve insan somatik hücrelerinde telomerik kısalma tümör-baskılayıcı adaptasyon olarak değerlendirilmelidir. Başarılı bir telomer hedefli antikanser tedavi için, telomeraz ve ALT inhibitörlerinin kombine kullanımı en uygun strateji olacaktır. Bu nedenle ALT mekanizmasındaki moleküler bileşenlerin karekterizasyonu, ilaç hedefi olarak yeni ALT inhibitörlerinin tanımlanması açısından oldukça önemlidir. Ayrıca her iki telomer uzaması mekanizmasının da hedefi telomerler olduğundan, iki mekanizmada da yer alan proteinlerin tanımlanarak ilaç hedefi olarak gündeme gelmesi ve iki mekanizmanın tek bir molekülle inhibe edilmesi de mümkündür (58,61,68). Kanser hücrelerinde telomer uzaması mekanizmalarının moleküler temelinin anlaşılması kadar önemli olan bir nokta ise normal hücrelerde bu mekanizmaların lxi nasıl baskılandığının anlaşılmasıdır (68). ALT inhibitörleri geliştirilebilmesi için baskılanma mekanizmalarının bileşenleri de, yeni hedefler olacaktır. lxii BÖLÜM VI ÖZET Telomerler ökaryotik kromozom uçlarında bulunan, DNA ve proteinden oluşan yapılardır. Kanser ve insan eşey hücreleri de dahil olmak üzere ölümsüz ökaryotik hücrelerde telomer devamlılığı telomeraz enzimi ile sağlanır. Ancak telomer boylarının devamlılığının sağlanmasında telomeraz enzimi dışında “Alternatif Telomer Uzaması” olarak adlandırılan başka mekanizmaların da var olduğu düşünülmekte, ancak bu mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Çalışmamız, insan telomerik yapılarına benzerliği ile bilinen Kluyveromyces lactis modeliyle telomerazdan bağımsız telomer devamlılığını ve bunun farmasötik önemini araştırmayı amaçlamıştır. Telomer, telomeraz ve bu enzimin etkileşimde bulunduğu telomerik proteinler, umut verici antikarsinojenik ilaç hedefleri olarak değerlendirildiğinden, sonuçlarımız, alternatif telomer uzaması mekanizmalarının, antikanser tedavi stratejilerinin hedefi olarak kullanılması konusunda yeni tartışmalar açacaktır. lxiii ABSTRACT Telomeres are the DNA-protein complexes found at the ends of eukaryotic chromosomes. Most immortal cells, including cancer cells and human germinal cells maintain the telomeric length by the enzyme, telomerase. However, the telomeric length maintenance is also thought to be carried out by the pathways called “Alternative Lengthening of Telomeres /ALT” other than telomerase but little is known about the mechanism of these alternative pathways. This thesis aimed to study telomerase-independent telomere maintenance pathway and its pharmaceutical significance using the yeast Kluyveromyces lactis, as a model organism, with considerable similarity to human telomeres. Because of the telomere, telomerase and a number of telomerase-interacting proteins are currently considered as the potential targets of anticancer drugs, our results will trigger new discussions in relation to employment of these alternative telomere maintenence mechanisms as the targets of anti-cancer therapy strategies. lxiv BÖLÜM VII KAYNAKLAR 1. Baur, J. A., Y. Zou, ve ark. (2001). "Telomere position effect in human cells." Science 292(5524): 2075-7. 2. Bechter, O. E., Y. Zou, ve ark. (2004). "Telomeric recombination in mismatch repair deficient human colon cancer cells after telomerase inhibition." Cancer Res 64(10): 3444-51. 3. Blackburn, E. H. (1990). "Telomeres and their synthesis." Science 249(4968): 489-90. 4. Blackburn, E. H. (1990). "Telomeres: structure and synthesis." J Biol Chem 265(11): 5919-21. 5. Blackburn, E. H. (1991). "Structure and function of telomeres." Nature 350(6319): 569-73. 6. Blackburn, E. H. (1991). "Telomeres." Trends Biochem Sci 16(10): 378-81. 7. Blackburn, E. H. (1994). "Telomeres: no end in sight." Cell 77(5): 621-3. 8. Blackburn, E. H. (2000). "Telomere states and cell fates." Nature 408(6808): 53-6. 9. Blackburn, E. H. (2001). "Switching and signaling at the telomere." Cell 106(6): 661-73. 10. Blackburn, E. H. (2005). "Telomeres and telomerase: their mechanisms of action and the effects of altering their functions." FEBS Lett 579(4): 859-62. lxv 11. Blackburn, E. H. and J. G. Gall (1978). "A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena." J Mol Biol 120(1): 33-53. 12. Bryan, T. M., A. Englezou, ve ark. (1995). "Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity." Embo J 14(17): 4240-8. 13. Cerone, M. A., C. Autexier, ve ark. (2005). "A human cell line that maintains telomeres in the absence of telomerase and of key markers of ALT." Oncogene 24(53): 7893-901. 14. Cesare, A. J. and J. D. Griffith (2004). "Telomeric DNA in ALT cells is characterized by free telomeric circles and heterogeneous t-loops." Mol Cell Biol 24(22): 9948-57. 15. Chan, S. R. and E. H. Blackburn (2004). "Telomeres and telomerase." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 359(1441): 109-21. 16. Chen, Q., A. Ijpma, ve ark. (2001). "Two survivor pathways that allow growth in the absence of telomerase are generated by distinct telomere recombination events." Mol Cell Biol 21(5): 1819-27. 17. Church, G. M. and W. Gilbert (1984). "Genomic sequencing." Proc Natl Acad Sci U S A 81(7): 1991-5. 18. Colgin, L. M. and R. R. Reddel (1999). "Telomere maintenance mechanisms and cellular immortalization." Curr Opin Genet Dev 9(1): 97-103. 19. Collins, K. and J. R. Mitchell (2002). "Telomerase in the human organism." Oncogene 21(4): 564-79. 20. de Bruin, D., S. M. Kantrow, ve ark. (2000). "Telomere folding is required for the stable maintenance of telomere position effects in yeast." Mol Cell Biol 20(21): 7991-8000. lxvi 21. Dubrana, K., S. Perrod, ve ark. (2001). "Turning telomeres off and on." Curr Opin Cell Biol 13(3): 281-9. 22. Dunham, M. A., A. A. Neumann, ve ark. (2000). "Telomere maintenance by recombination in human cells." Nat Genet 26(4): 447-50. 23. Evans, S. K., A. A. Bertuch, ve ark. (1999). "Telomeres and telomerase: at the end, it all comes together." Trends Cell Biol 9(8): 329-31. 24. Fasching, C. L., K. Bower, ve ark. (2005). "Telomerase-independent telomere length maintenance in the absence of alternative lengthening of telomeresassociated promyelocytic leukemia bodies." Cancer Res 65(7): 2722-9. 25. Greider, C. W. and E. H. Blackburn (1996). "Telomeres, telomerase and cancer." Sci Am 274(2): 92-7. 26. Griffith, J. D., L. Comeau, ve ark. (1999). "Mammalian telomeres end in a large duplex loop." Cell 97(4): 503-14. 27. Groff-Vindman, C., A. J. Cesare, ve ark. (2005). "Recombination at long mutant telomeres produces tiny single- and double-stranded telomeric circles." Mol Cell Biol 25(11): 4406-12. 28. Grunstein, M. (1997). "Molecular model for telomeric heterochromatin in yeast." Curr Opin Cell Biol 9(3): 383-7. 29. Harley, C. B., A. B. Futcher, ve ark. (1990). "Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts." Nature 345(6274): 458-60. 30. Hastie, N. D., M. Dempster, ve ark. (1990). "Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing." Nature 346(6287): 866-8 31. Henson, J. D., J. A. Hannay, ve ark. (2005). "A robust assay for alternative lengthening of telomeres in tumors shows the significance of alternative lxvii lengthening of telomeres in sarcomas and astrocytomas." Clin Cancer Res 11(1): 217-25. 32. Henson, J. D., A. A. Neumann, ve ark. (2002). "Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells." Oncogene 21(4): 598-610. 33. Iyer, S., A. D. Chadha, ve ark. (2005). "A mutation in the STN1 gene triggers an alternative lengthening of telomere-like runaway recombinational telomere elongation and rapid deletion in yeast." Mol Cell Biol 25(18): 8064-73. 34. Kim, N. W., M. A. Piatyszek, ve ark. (1994). "Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer." Science 266(5193): 2011-5. 35. Kim Sh, S. H., P. Kaminker, ve ark. (2002). "Telomeres, aging and cancer: in search of a happy ending." Oncogene 21(4): 503-11. 36. Klugs W. S., Cummings M. R., Genetik, Palme yayıncılık, Ankara, 2003, 338-339. 37. Konig, P. and D. Rhodes (1997). "Recognition of telomeric DNA." Trends Biochem Sci 22(2): 43-7. 38. Krauskopf, A. and E. H. Blackburn (1998). "Rap1 protein regulates telomere turnover in yeast." Proc Natl Acad Sci U S A 95(21): 12486-91. 39. Kumakura, S., T. W. Tsutsui, ve ark. (2005). "Reversible conversion of immortal human cells from telomerase-positive to telomerase-negative cells." Cancer Res 65(7): 2778-86. 40. Londono-Vallejo, J. A., H. Der-Sarkissian, ve ark. (2004). "Alternative lengthening of telomeres is characterized by high rates of telomeric exchange." Cancer Res 64(7): 2324-7. lxviii 41. Lundblad, V. (2000). "Telomeres: a tale of ends." Nature 403(6766): 149, 151. 42. Lundblad, V. (2002). "Telomere maintenance without telomerase." Oncogene 21(4): 522-31. 43. Lundblad, V. (2003). “Taking the measure” Nature 423(6943):926-7. 44. Lundblad, V. (2003). "Telomere replication: an Est fest." Curr Biol 13(11): R439-41. 45. Lundblad, V. and E. H. Blackburn (1993). "An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues est1- senescence." Cell 73(2): 347-60. 46. Marciniak, R. A., D. Cavazos, ve ark. (2005). "A novel telomere structure in a human alternative lengthening of telomeres cell line." Cancer Res 65(7): 2730-7. 47. McEachern, M. J. and E. H. Blackburn (1995). "Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations." Nature 376(6539): 403-9. 48. McEachern, M. J., Blackburn, E. H., (1996). “Cap-prevented recombination between terminal telomeric repeat arrays (telomere CPR) maintains telomeres in Kluyveromyces lactis lacking telomerase” Genes Dev. 10:1822-34. 49. McEachern, M. J. and J. E. Haber (2006). "Break-induced replication and recombinational telomere elongation in yeast." Annu Rev Biochem 75: 11135. 50. McEachern, M. J. and S. Iyer (2001). "Short telomeres in yeast are highly recombinogenic." Mol Cell 7(4): 695-704. 51. McEachern, M. J., A. Krauskopf, ve ark. (2000). "Telomeres and their control." Annu Rev Genet 34: 331-358. lxix 52. McEachern, M. J., D. H. Underwood, ve ark. (2002). "Dynamics of telomeric DNA turnover in yeast." Genetics 160(1): 63-73. 53. Muntoni, A., Reddel, R.R. (2005). “The first molecular details of ALT in human tumor cells.” Human Molecular Genetics 14(2):191-6. 54. Murnane, J. P., L. Sabatier, ve ark. (1994). "Telomere dynamics in an immortal human cell line." Embo J 13(20): 4953-62. 55. Nakamura, T. M., J. P. Cooper, ve ark. (1998). "Two modes of survival of fission yeast without telomerase." Science 282(5388): 493-6. 56. Natarajan, S., C. Groff-Vindman, ve ark. (2003). "Factors influencing the recombinational expansion and spread of telomeric tandem arrays in Kluyveromyces lactis." Eukaryot Cell 2(5): 1115-27. 57. Natarajan, S. and M. J. McEachern (2002). "Recombinational telomere elongation promoted by DNA circles." Mol Cell Biol 22(13): 4512-21. 58. Neumann, A. A. and R. R. Reddel (2002). "Telomere maintenance and cancer -- look, no telomerase." Nat Rev Cancer 2(11): 879-84. 59. Nickles, K. and M. J. McEachern (2004). "Characterization of Kluyveromyces lactis subtelomeric sequences including a distal element with strong purine/pyrimidine strand bias." Yeast 21(10): 813-30. 60. Nugent, C. I. and V. Lundblad (1998). "The telomerase reverse transcriptase: components and regulation." Genes Dev 12(8): 1073-85. 61. Olaussen, K. A., K. Dubrana, ve ark. (2006). "Telomeres and telomerase as targets for anticancer drug development." Crit Rev Oncol Hematol 57(3): 191-214. lxx 62. Pendino, F., I. Tarkanyi, ve ark. (2006). "Telomeres and telomerase: Pharmacological targets for new anticancer strategies?" Curr Cancer Drug Targets 6(2): 147-80. 63. Perrem, K., T. M. Bryan, ve ark. (1999). "Repression of an alternative mechanism for lengthening of telomeres in somatic cell hybrids." Oncogene 18(22): 3383-90. 64. Prescott, J. and E. H. Blackburn (1997). "Functionally interacting telomerase RNAs in the yeast telomerase complex." Genes Dev 11(21): 2790-800. 65. Price, C., (2001). “How many proteins does it take to maintain a telomere?” Trends in Genetics 17(8):437-8. 66. Reddel, R. R. (2000). "The role of senescence and immortalization in carcinogenesis." Carcinogenesis 21(3): 477-84. 67. Reddel, R. R. (2003). "Alternative lengthening of telomeres, telomerase, and cancer." Cancer Lett 194(2): 155-62. 68. Reddel, R.R., Bryan, T.M., ve ark. (2001). “Alternative lengthening of telomeres in human cells.” Radiation Research 155:194-200. 69. Reddel, R.R., Bryan T.M.., (2003). "Alternative lengthening of telomeres: dangerous road less travelled.” The Lancet 361:1840-1. 70. Rezler, E. M., D. J. Bearss, ve ark. (2002). "Telomeres and telomerases as drug targets." Curr Opin Pharmacol 2(4): 415-23. 71. Roy, J., T. B. Fulton, ve ark. (1998). "Specific telomerase RNA residues distant from the template are essential for telomerase function." Genes Dev 12(20): 3286-300. 72. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989). “Molecular Cloning” 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. lxxi 73. Scheel, C. and C. Poremba (2002). "Telomere lengthening in telomerasenegative cells: the ends are coming together." Virchows Arch 440(6): 573-82. 74. Stewart, S. A. and R. A. Weinberg (2002). "Senescence: does it all happen at the ends?" Oncogene 21(4): 627-30. 75. Tarsounas, M. and S. C. West (2005). "Recombination at mammalian telomeres: an alternative mechanism for telomere protection and elongation." Cell Cycle 4(5): 672-4. 76. Teixeira, M. T. and E. Gilson (2005). "Telomere maintenance, function and evolution: the yeast paradigm." Chromosome Res 13(5): 535-48. 77. Teng, S. C., J. Chang, ve ark. (2000). "Telomerase-independent lengthening of yeast telomeres occurs by an abrupt Rad50p-dependent, Rif-inhibited recombinational process." Mol Cell 6(4): 947-52. 78. Teng, S. C. and V. A. Zakian (1999). "Telomere-telomere recombination is an efficient bypass pathway for telomere maintenance in Saccharomyces cerevisiae." Mol Cell Biol 19(12): 8083-93. 79. Tomaska, L., M. J. McEachern, ve ark. (2004). "Alternatives to telomerase: keeping linear chromosomes via telomeric circles." FEBS Lett 567(1): 142-6. 80. Topcu, Z., K. Nickles, ve ark. (2005). "Abrupt disruption of capping and a single source for recombinationally elongated telomeres in Kluyveromyces lactis." Proc Natl Acad Sci U S A 102(9): 3348-53. 81. Underwood, D. H., C. Carroll, ve ark. (2004). "Genetic dissection of the Kluyveromyces lactis telomere and evidence for telomere capping defects in TER1 mutants with long telomeres." Eukaryot Cell 3(2): 369-84. lxxii 82. Underwood, D. H. and M. J. McEachern (2001). "Totally mutant telomeres: single-step mutagenesis of tandem repeat DNA sequences." Biotechniques 30(5): 934-5, 938. 83. Wang, R. C., A. Smogorzewska, ve ark. (2004). "Homologous recombination generates T-loop-sized deletions at human telomeres." Cell 119(3): 355-68. 84. Wang, S. S. and V. A. Zakian (1990). "Telomere-telomere recombination provides an express pathway for telomere acquisition." Nature 345(6274): 456-8. 85. Wray, L. V., Jr., M. M. Witte, ve ark. (1987). "Characterization of a positive regulatory gene, LAC9, that controls induction of the lactose-galactose regulon of Kluyveromyces lactis: structural and functional relationships to GAL4 of Saccharomyces cerevisiae." Mol Cell Biol 7(3): 1111-21. 86. Zakian, V. A. (1995). "Telomeres: beginning to understand the end." Science 270(5242): 1601-7. 87. Zakian, V. A. (1996). "Telomere functions: lessons from yeast." Trends Cell Biol 6(1): 29-33. 88. Zakian, V. A. (1997). "Life and cancer without telomerase." Cell 91(1): 1-3. lxxiii ÖZGEÇMİŞ 1997 yılında Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi’nde lisans eğitimime başladım ve 2001 yılında mezun oldum. 2002-2004 yılları arasında aynı fakültede Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’nda yüksek lisans eğitimimi tamamladım. 2004 yılında alan değiştirerek aynı fakültede Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı’nda tekrar yüksek lisans eğitimime başladım ve 2004 yılından beri Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı’nda araştırma görevlisi olarak görev yapmaktayım. lxxiv
