ÖZEL EGE LİSESİ KANSERDEN DEĞİL, GEÇ KALMAKTAN KORK
advertisement
ÖZEL EGE LİSESİ KANSERDEN DEĞİL, GEÇ KALMAKTAN KORK HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Berna AKDENİZ Leyla AL MASOUD DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Dr. Onur AKPINAR İZMİR 2017 İÇİNDEKİLER Sayfa 1. GİRİŞ….……………………………………………………………………….. 1 1.1 Kanser Nedir?................................................................................................ 1 1.2 Dünya’da En Sık Görülen Kanser Türleri…………………………………. 2 1.2.1 Akciğer Kanseri………………………………………………………. 2 1.2.2 Meme Kanseri………………………………………………………… 4 1.2.3 Prostat Kanseri………………………………………………………... 5 1.3 Kanser Teşhisi……………………………………………………………… 6 1.4 Kanser Teşhisinde Mikroakışkan Yaklaşımların Kullanılması……………. 8 1.5 Projenin Amacı……………………………………………………………... 11 2. YÖNTEM…………………………………………………………………….... 11 2.1 Materyal……………………………………………………………………. 12 2.2 Hücre Kültür Şartları……………………………………………………….. 12 2.3 Mikroakışkan Temelli Çiplerin Fabrikasyonu……………………………... 13 2.4 Mikroakışkan Çiplerin Yüzey Kimyasının Oluşturulması…………………. 14 2.5 Kanser Hücre Hatlarının Mikroakışkan Çiplerde Analiz Edilmesi………… 15 3. BULGULAR…………………………………………………………………… 15 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA……………………………………………….. 19 5. ÖNERİLER……………………………………………………………………. 20 KAYNAKLAR.…………………………………………………………………... 20 1. GİRİŞ 1.1 Kanser Nedir? Çok hücreli canlılarda, hücrenin bölünerek büyümesi çok sıkı kontrol altında gerçekleşir. Hücre, iç ve dış sinyallerle uyarılınca bölünür. Bu kontrol, bölünmenin doğru dokuda ya da organda gerçekleştiğini garantiye alır. Bazı dokularda, örneğin kemik iliği, deri ve mide içzarında hücreler sürekli bölünür ve ölen hücrelerin yerini alır. Fakat bazı diğer dokularda, örneğin sinir hücresinde, mitoz bölünme nadir görülür ve kaybedilen hücreler yenilenemez. Kanser kavramı, büyümesi kontrol edilemeyen hücrelerin sebep olduğu hastalıkları temsil eder. Kanser hücreleri, kontrol sinyallerine yanıt vermez ve büyümeleri kontrol altına alınamaz. Tümör hücreleri iyi huylu ya da kötü huylu olabilir. Bununla birlikte, günümüzde kanser kavramı kötücül hücre olarak bilinmektedir (Ahmed ve ark., 2007). Kanser vücudun herhangi bir yerinde ortaya çıkabilir hatta vücudun 100’ü aşkın farklı bölgesinde saptanabilmiştir. Bazı bölgelerde kanserin yayılması diğerlerine göre daha yatkındır. Bilinen en yaygın kanser türleri akciğer, meme, prostat, mide ve deridir. Bazı kanserler, yaşlılarda gençlere nazaran daha sık rastlanır. Bazı kanser tipleriyse sadece çocuklarda görülür. Kanserler genellikle bulundukları dokuya ve kökenine göre sınıflandırılırlar. Bir kanser türü epitel hücreden türevlenen karsinom, kas, kemik ve kıkırdak gibi mezodermal bir kökenden türevlenen sarkom adını alır. Lösemi kavramı, kemik iliğindeki kanda rastlanan tek tip bir hücreyi tanımlamakta kullanılır. Lenfoma da lenf bezleri gibi lenfomik bir dokudan türeyen bir kanseri temsil eder (Lyons, 2007). Bazı kanser türleri belli bir cinsiyete özgüdür. En belirgin örnek; rahim ağzı kanseri sadece kadınlarda, prostat ve testis kanseri ise yalnızca erkeklerde görülmesidir. Bunun yanında akciğer kanseri hem kadınlarda hem erkeklerde görülür (Ahmed ve ark., 2007). Dünyada, erkeklerde ilk üç sırada bulunan kanser türü, prostat, akciğer ve kolon iken, Türkiye’de bu sıralama akciğer, prostat ve mesane şeklinde olmaktadır (Şekil 1). Şekil 1. Dünya Sağlık Örgütüne göre dünyada (A) ve Türkiye’ de (B) kanserin insidans ve mortalite oranları (GLOBOCAN, 2012). -1- Erkeklerde akciğer kanseri insidansı Türkiye’de yüz binde yaklaşık 69’larda, dünya ortalaması ise yüz binde 30-35’lerde, Avrupa Birliği ortalaması ise 100.000’de 48’lerdedir. Bu şekilde kanser artış hızının devam etmesi durumunda, Dünya nüfusunun artışına ve nüfustaki yaşlanmaya bağlı olarak 2025 yılında toplam 19,3 milyon yeni kanser vakası olacağı belirtilmiştir. Gerek kanser vakalarının (%56,8) gerekse de kanserden kaynaklanan ölümlerin (%64,9) yarısından fazlasının az gelişmiş ülkelerde olduğu gösterilmiştir (T.C. Sağlık Bakanlığı, 2016) (Şekil 2). Şekil 2. Amerika Birleşik Devletleri’nde cinsiyete göre kanser dağılım gösteren on kanser tipi (Siegel ve ark., 2013). 1.2 Dünya’da En Sık Görülen Kanser Türleri Hem Dünya Sağlık Örgütü (WHO) hem de Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kanser Daire Başkanlığı’na göre Dünya’da ve Türkiye’de en sık görülen ve en çok ölüme sebep olan kanser türleri sırasıyla akciğer, meme ve prostat kanserleridir (GLOBOCAN, 2012; T.C. Sağlık Bakanlığı, 2016). 1.2.1 Akciğer Kanseri Akciğerler, göğüs boşluğumuzda bulunan, nefes alıp verirken oksijenin dokulara alınmasını ve karbondioksitin dışarı atılmasını sağlayan solunum sisteminde görevli temel organlardır. Akciğerler süngerimsi yapıda ve koni şeklinde bir çift organdır ve ''lob'' adı verilen bölümlerden oluşmaktadır. Sol akciğer 2, sağ akciğer ise 3 lobdan oluşmaktadır. Akciğerler, solunum işlevini yapısında bulunan bronş ve bronşcuk olarak adlandırılan hava kesecikleri sayesinde gerçekleştirmektedir (Stanson, 2008). Akciğer kanseri, trakeobronşiyal ağaç ve alveollerdeki olgun epitel hücrelere farklılaşma yeteneğine sahip hücrelerin, heterojen bir neoplazm grubu oluşturması ile oluşur (Rom ve ark. 2000). Akciğer kanseri erkeklerde ölüme en çok neden olan kanser olmakla birlikte, kanserlerin %60’ını oluşturmaktadır. Bayanlarda akciğer kanseri, meme kanserinden sonra en çok görülen kanser tipidir. 65 yaştan sonra ölüm oranı yaklaşık %75’ e çıkmaktadır. Sigara içiciliği ve pasif içicilik, akciğer kanseri vakalarının %90’ının sebebidir. Buna ek olarak, radyoaktif bir gaz olan radon ve mineral asbest gibi kimyasallara maruz kalmak akciğer kanseri riskini beş kat oranda arttırmaktadır (Ahmed ve ark., 2007). Ülkemizde akciğer kanseri tüm kanserler içinde erkeklerde birinci sırada, kadınlarda dördüncü sıradadır (T.C. Sağlık Bakanlığı, 2016) (Şekil 3). -2- Şekil 3. Akciğer dokusunda kanser varlığının şematik gösterimi (Ahmed ve ark., 2007). Akciğer karsinogenezinde önemli genetik olaylar; onkogenlerin mutasyonel aktivasyonu, tümör baskılayıcı genlerin aktivasyon kaybı, hücre döngüsü regülasyonunda görev alan genlerde ortaya çıkan değişiklikler, DNA onarımında görev alan genlerde ortaya çıkan değişiklikler ve büyüme faktörleri ile reseptörlerine ilişkin değişikliklerdir. DNA hasarının oluşumu, kimyasal karsinogenezin ilk aşamasıdır. Genetik hasarın temelinde, mutasyonlar ve delesyonlar yatar. Mutasyonlar, kalıtım molekülünde oluşan ve kuşaktan kuşağa aktarılan kalıcı değişikliklerdir. Mutasyonlar büyüklüğüne göre (nokta ve gen), nedenine göre (kendiliğinden ya da uyarılmış), etkilenen doku tipine göre (vücut) ve genetik şifrenin anlamlılığı gibi birçok özelliğe göre sınıflandırılabilir (Köktürk ve ark., 2003). Akciğer kanseri iki ana gruba ayrılır. Küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) ve küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC). Akciğer kanseri vakalarının %20’sini küçük hücreli akciğer kanseri oluşturur. Akciğer kanseri hücrelerinde çekirdek oranı sitoplazma oranına göre daha fazladır. Küçük hücreli olmayan akciğer kanserleri üç gruba ayrılır. Skuamoz hücreli kanser, adenokarsinom ve büyük hücreli karsinomlardır. Skuamoz hücreli karsinomalar solunum dokularında bulunan epitel hücrelerinden gelişirler ve akciğer kanserlerinin % 35’inden sorumludurlar. Adenokarsinomlar solunum dokularında bulunan mukus salgılayan hücrelerden gelişirler ve akciğer kanserlerinin %27’sinden sorumludurlar. Son olarak, büyük hücreli karsinoma ise diğer hücre formları ile karşılaştırılırsa daha büyük hücrelerden oluşur ve toplam akciğer kanserlerinin %10’unu oluştururlar (Ahmed ve ark., 2007). Akciğer kanseri genellikle ilk evrelerde semptom göstermez ve hastalığın belirtisi görülmeye başlandığında akciğer kanseri ilerlemiş olur. Bazı hastalarda belirti gözlenmez ve sadece göğüsün rutin olarak çekilen X-ışını filmleri ile teşhis edilebilir. Bazı semptomlar; sürekli ve şiddetli öksürük, nefes darlığı, bronşit ve pnömokok gibi tekrar eden göğüs enfeksiyonları ile belirtilerini göstermektedir. Eğer bu gibi belirtiler gözleniyorsa, pozitron emisyon tomografisi (PET) ile kanser aşamalandırılmalıdır. Diğer testler göğsün muayenesini içerir. Bu işlemler, boynun üst tarafına küçük bir kesik açılıp endoskopi yapılmasıyla saptanır. Buna ek olarak; biyopsi, CT tarayıcı ve X-ışını eşliğinde, akciğere ince uçlu iğne sokularak yapılabilir. Küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde birincil tümör T1–T4’e kadar sınıflandırılmıştır. T1; 3 cm’ den küçük ve ana bronşlara sıçramadığını, T2; 3 cm’ den büyük ve ana bronşlara sıçradığını, T3; herhangi bir boyutta ve göğüs kafesi, diafram, göğüs zarı ve perikardiyum ve ana bronşlarda yer aldığını, T4; herhangi bir boyutta olup kalp, trake veya özofagus gibi farklı dokulara sıçradığını ifade eder. Bölgesel lenf nodları N0’dan N3’e kadar sınıflandırılmaktadır. N0, herhangi bir bölgesel lenf nodül metastazı içermez. N1 ve N2 -3- sırasıyla aynı bölgedeki ya da zıt yöndeki tümörlerin metastazını içermektedir (Ahmed ve ark., 2007). 1.2.2 Meme Kanseri Meme dokusu; epiteliyal parankim, kas, bağ ve yağ doku, kan damarları, lenf ve sinir sisteminden oluşmaktadır. Epiteliyal parankim, alveolun kanalcıklarının birleşerek oluşturduğu lobüllerden ve her biri ayrı bir kanal ile meme ucuna açılan 20 veya daha fazla lobdan oluşur (Masso-Welch, 2000). Meme kanseri, lobülleri ya da süt kanallarını oluşturan hücrelerin kontrolsüz çoğalmaları ve vücuttaki diğer dokulara yayılarak çoğalmaya devam etmeleriyle gelişir. Süt kanallarından kaynaklanan kansere duktal karsinom, lobüllerden kaynaklanan kansere ise lobüler karsinom adı verilmektedir (Dimri ve ark., 2005) (Şeki4). Meme kanseri, süt bezlerinde ya da meme ucuna süt ileten kanallarda gelişir. Meme kanserinin semptomlarına memede oluşan ağrısız bir yumru oluşması, meme şekli ve boyutunun değişmesi, meme ucunun pozisyonunu değişmesi, göğüs akıntısı olması, meme ucu çevresinde egzamaya bağlı kızarıklık oluşması ve koltuk altında yumru oluşması örnek verilebilir (Ahmed ve ark., 2007). Şekil 4. Meme dokusunda kanser varlığının şematik gösterimi (Ahmed ve ark., 2007). Meme kanseri hem genetik hem epigenetik mekanizmalardaki bozukluklardan kaynaklanır. Bu bozuklukta hem ekzojen hem endojen kaynaklı iç ve dış çevresel faktörler rol oynadığı gibi, atalarından kalıtılan bozuk genler de rol alır. Meme kanserinin hem kalıtsal (ailesel) hem de sporadik tipleri mevcuttur. Birincil veya ikincil derece akrabalarında birden fazla kişide meme kanseri görülen ve diğer kanserlerin metastaz yapması sonucu (sekonder) oluşmamış olan meme kanserleri kalıtsal (ailesel) meme kanserleri olarak tanımlanır. Meme kanserlerinin %5-10’unda meme kanserine yatkınlık genlerinde mutasyonlar görülmektedir. Bu genlerden BRCA1, BRCA2, PTEN, TP53, LKB1/STK11 ve CDH1 yüksek risk genleri, CHEK2, TGF-β1, CASP8 ve ATM ise düşük risk genleri olarak kabul edilmektedir. BRCA1 ve BRCA2 genlerindeki mutasyonlar kalıtsal meme kanserlerinin üçte birinden sorumludur (Beckmann ve ark.,1997). Meme kanseri, dünya çapında kadınlarda en sık görülen (%23) kanser tipidir ve kansere bağlı ölümlere bakıldığında akciğer kanserinin ardından ikinci sırada yer alır. 2008 yılında, dünyada yaklaşık 1.38 milyon kadına meme kanseri tanısı konulduğu ve bu hastaların üçte birinin (460.000 kişi) öldüğü bilinmektedir (Giuliano, 2009). Göğüs kanseri Amerika ve İngiltere’de kadınlarda en çok görülen kanser olmakla birlikte en çok ölümle sonuçlanan -4- ikinci kanser türüdür (Ahmed ve ark., 2007). Türkiye’deki en güncel meme kanseri istatistiği 2016 yılında Sağlık Bakanlığı tarafından yapılmıştır ve bu istatistiklere göre meme kanseri %45.90’lık oranla ülkemiz kadınları arasında en yaygın görülen kanser tipidir. Meme kanserinin görülme sıklığı, son yıllarda giderek artmıştır (T.C. Sağlık Bakanlığı, 2016). Meme kanserine yakalanma riskleri şunlardır; artan yaş, çocuğa sahip olamama, erken adet görülmesi ya da geç menopoza girilmesi, hormon tedavisi, kilolu ya da obez olmak, doğum kontrol hapı alınması ve düzenli alkol tüketimi (Ahmed ve ark., 2007). Günümüzde sıklıkla teşhis yöntemi olarak kullanılan mamografi, X-ray ışınlarını kullanarak potansiyel tümörün yerini tespit eder. Mamografi aynı zamanda kanseri görüntülemek için de kullanılır. Yumru aynı zamanda ultrason ile gözlenebilir ya da yumrunun kan akışını resimleyen Renkli Doppler ultrason (Color Doppler ulrasound) ile de incelenir. Yumrudan ince iğne yöntemiyle alınan hücre örneğinin mikroskobik incelenmesi de yararlı olabilir. Buna ek olarak, genel anesteziyle alınan yumru, patolojik incelemeye gönderilebilir. Meme kanserinin aşamalandırma sistemi iki istilacı, dört istilacı olmayan olmak üzere gruplara ayrılır. in situ’ daki lobüler karsinoma kanser hücreleri meme loblarında meydana geldiği zaman lobüler karsinoma gerçekleşir. 2 cm’den kısa ve henüz lenf nodüllerine sıçramadıysa 1. aşama, eğer 2 – 5 cm arasındaysa ve lenf nodüllerine sıçradıysa 2. aşama, eğer 5 cm’i aşmışsa ve kas ve deriye sıçramışsa 3. aşama, eğer herhangi bir boyuttaysa ve metastaz gerçekleşmişse 4. aşamadadır. Tümör hücreleri ayrıca FISH ya da immünohistokimyasal yollarla östrojen reseptörünün veya hücre yüzeyindeki HER2 molekülünün yakalanmasıyla teşhis edilebilir. Bu iki proteinden birinin yakalanması, tedaviye başlanması gerektiğini ifade eder. Östrojen reseptörlerine sahip hücreler normal östrojen hücresi elde etmek için bölünebilir ve hormon terapisi uygulanabilir. HER2, insan epidermal büyüme reseptörü olarak kullanılabilir. HER2’de pozitif çıkan meme kanseri hücreleri, doğal olarak meydana gelen insan büyüme faktörü (EGFR) hücrelerini oluşturmak için uyarır (Ahmed ve ark., 2007). 1.2.3 Prostat Kanseri Prostat, sadece erkeklerde bulunan ve seminal sıvının bir kısmını üretmek ile görevli tübulo-alveolar bir bezdir. Rektumun (kalın bağırsağın son kısmı) önünde ve mesanenin altında yerleşmiştir. İdrar akımını sağlayan üretra (idrar yolu) ile çevrilmiştir. Prostat bezi, mesane fonksiyonunu kontrol etmek için; sinirlerin, kan damarlarının ve kasların yakınında lokalize olmuştur. Prostatın büyüklüğü, yaş ile değişiklik göstermektedir. Daha genç erkeklerde sağlıklı bir prostat bezi, ceviz büyüklüğündedir. Prostat, yetişkinlerde genellikle aynı büyüklükte kalır ve hormonlara bağlı olarak yavaş bir büyüme gösterir. Yaşlı erkeklerde, prostat boyutu daha büyük olabilmektedir. Androjen olarak adlandırılan erkek hormonu prostatın büyümesine katkı sağlamaktadır. Prostat aşırı büyüdüğü zaman üretraya baskı yaparak idrarın mesaneden akımını yavaşlatır ya da durdurur (American Cancer Society, 2016a) (Şekil 5). Prostat kanseri özellikle elli yaş üzeri erkekleri etkileyen bir hastalıktır. Tümör, uzun süre belirti göstermediğinden, çoğu prostat kanseri teşhis edilemez. Yıllık teşhis edilememe oranı, İngiltere’de yaklaşık 30.000 iken Amerika’da ise bunun yarısı kadardır (Ahmed ve ark., 2007). Türkiye’deki en güncel prostat kanseri istatistiği 2016 yılında Sağlık Bakanlığı tarafından yapılmıştır ve bu istatistiklere göre prostat kanseri %36,40’lık oranla ülkemizde erkekler arasında en yaygın görülen ikinci kanser tipidir. (T.C. Sağlık Bakanlığı, 2016). -5- Şekil 5. Prostat bezinin normal görünümünün (A), prostat bezinin rektal muayenesinin (B) şematik gösterimi (Ahmed ve ark., 2007). Prostat kanseri genellikle yavaş büyürken, az oranda tümörler daha hızlı büyür ve daha çabuk metastaza uğrar. Prostat kanseri olma riski yakın akrabaların prostat kanseri geçmişine bağlı olarak artar. Genellikle prostat kanserinin belirtileri tümör küçükken gözlenmez. Ancak tümör büyüdükçe idrara çıkarken yanma ve zorluk, daha sık idrara çıkma (özellikle geceleri) gibi sorunlar gözlenir. Aynı zamanda idrarda kan da gözlenebilir. Eğer kanser hücreleri kemiğe yayılmışsa, belde ve pelviste acı meydana gelebilir. Prostat kanseri semptomları gösteren bir hastaya rektal muayenesi uygun görülür (Şekil 5). Bu muayene sırasında el yordamıyla rektum incelenir ve prostat hissedilmeye çalışılır. Genişlemiş bir prostat, yuvarlak ve yumuşak ise iyi huylu tümör olma olasılığı daha yüksektir. Bununla birlikte, prostat tümörü et bezinin daha sert ve yumru yumru hissedilmesine neden olur. PSA testi için de kan örneği alınır. PSA testinde prostat spesifik antijeni ölçülür. 50 yaşındaki erkeklerde 2,8 ng cm-3 iken, 70 yaş ve üzerindeki erkeklerde bu oran 5,3 ng cm-3’tür. 10 ng cm-3’ten fazla olan erkekler için daha gelişmiş testler yapılmalıdır. Prostat kanseri genellikle Gleason sistemine göre kanserin büyüme düzenini ve dağılımını derecelendirir. Bu derecelendirmede, T1; prostat bezindeki tümör çok küçük ve rektal muayenede tümör saptanamıyor, T2; tümör muayene ile saptanabilecek kadar büyük ancak sadece prostatta yer alıyor, T3/4; tümör mesane gibi çevrelerindeki dokulara yayılmış, Metastatik kanser; tümör lenf nodülleri, kemik veya vücudun diğer uzak bölgelerine sıçramış demektir (Ahmed ve ark., 2007). 1.3 Kanser Teşhisi Kanserin ölüm oranı oldukça yüksektir. Dahası, hastalar ve aileleri üzerindeki yıkıcı etkileri, büyük ekonomik maliyetleri göz ardı edilemez. Erken teşhis kavramı kısaca tümörleri erkenden, tedavi edilemez hale gelmeden önce bulma olarak tanımlanan ve kanser araştırmacılarının uzun yıllar dikkatini çeken bir konudur. Ancak günümüze kadar sadece birkaç erken teşhis denemeleri başarılı olmuştur. Son günlerde, genomik ve proteomik alanlarındaki büyük ilerlemeler kullanışlı tarama testlerinin yaygın şekilde erken teşhiste kullanılmasına olanak sağlamaktadır (Etzioni ve ark., 2003). İleri düzeydeki kanserler için geliştirmiş tedavilerin başarı oranı düşüktür. Bu alanda yapılan binlerce araştırma ve harcamaya rağmen alınan sonuçlar pek de istenilen düzeyde olmamakla birlikte yetersizdir. Tanısı konulan kanserler genelde hep ileri düzeyde teşhis edildiğinden yapılan araştırmalar çoğunlukla tedavi etkinliğini arttırmaya yöneliktir. İleri seviyede teşhis konulan hastalarda, çok az derecede kurtulma gözlemlenmiştir. Bu nedenle kanserin erken teşhisinin sağlanması, hastanın yaşama şansını büyük ölçüde arttırmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü, kanser hastalığının kontrolüne doğru bir yaklaşım için çeşitli kriterler belirlemiştir. İlk olarak, hastalığın yaygın olması ve ölüm oranının (morbidite ve mortalite) yüksek olması gerekir. İkincisi, görüntüleme testleri, hastalığı erken evresinde doğru bir -6- şekilde tespit edebilmelidir. Üçüncü olarak, görüntüleme testleri klasik teşhis yöntemleri ile de desteklenerek tedaviye başlanmalıdır (Etzioni ve ark., 2003). Tümör yeterince büyüyünce diğer dokuları istila ederek acıya, ateşe ve kanamaya sebep olur. Bu belirtiler ilk başta ciddi görünmediği için hasta doktora danışmadan aylarca hastalığın geçmesini bekleyebilir. Bu yanlış anlaşılmalar nedeniyle oluşan gecikmeler kanserin büyümesine ve hatta metastaz denilen mekanizma ile başka organlara yayılmasıyla tedavinin zorlaşmasına neden olur (Lyons, 2007). Akciğer kanseri dünyadaki en yaygın kanser türlerinden biri olup klasik belirtileri arasında sürekli öksürük, göğüs ağrısı, nefes darlığı, açıklanamayan kilo kaybı, ses kısıklığı ve bronşit gibi diğer akciğer hastalıkları ile karıştırılabilecek belirtilere sahiptir. Bu sebeple her belirti zararsız gibi görünmektedir ve genellikle endişe yaratmamaktadır. Çoğu zaman, yukarıdaki gibi belirtiler yalnızca bir günlük ağrı olarak göz ardı edilir. Dahası, bu belirtiler genellikle akciğer kanserinin erken evrelerinde kendini göstermez. Bunun yerine, çoğu akciğer kanseri, hastalığın ilerleyen aşamalarında tedaviyi daha sorunlu hale getirir ve sonuç olarak akciğer kanserinin sağkalım oranını önemli ölçüde düşürür. Amerikan Kanser Derneği, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) için beş yıllık sağkalım oranlarının geç dönemde teşhis edilenlere göre önemli derecede yüksek olduğunu bildirmiştir (Lung Cancer Foundation of America, 2016). Eğer doktor muayene ve testler sırasında şüpheli bir bulguya rastlarsa daha detaylı incelemeler için uzmanlara yönlendirir. Bu uzmanlar, biyopsi, endoskopi ve sitoloji denilen yöntemler kullanır. Bu yöntemler arasında biyopsi, küçük bir dokunun mikroskop altında incelenmesi için hastadan alınmasıdır. Eğer fiziksel muayenede ya da diğer testlerde şüpheli bir bulguya rastlanırsa doktor ilgili dokunun kanser olup olmadığını anlamak için biyopsiyi önerir. Biyopsi bazen ultrason, manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı görüntüleme gibi görüntüleme testleri yardımıyla yapılabilir. Ara sıra doku incelemek için cerrahi müdahale de gerekebilir. Hastaya uygulanacak biyopsi türü, kanserin bulunabileceği muhtemel dokuya göre değişir. Test sonuçlarının alınması için geçen süre, hastanın olduğu biyopsiye ve teşhis edilmesi için gereken test sayısına bağlıdır. Analizler doğrultusunda bir patolog, alınan dokuda tümör olup olmadığına karar verir. Tümör iyi ya da kötü huylu olabilir. Kötü huylu tümör, vücudun diğer bölümlerine yayılabilir. Patolog, tümörün tipinin belirlenmesini sağlar. Komplike olmayan sonuçlar 2-3 gün içerisinde alınabilirken, komplike sonuçlar daha fazla test gerektirdiği için 7-10 gün arasında alınmaktadır (Lyons, 2007). Biyopsi dışında rutin görüntüleme, kanseri erken tespit etmemizi sağlayabilir. Bu da tedavinin geç teşhis edilen hastalara göre daha başarılı olacağını gösterir. Örneğin; mamogram adı verilen bir X-ışını prosedürü memedeki kanser veya kanser olmayan anormallikleri saptayabilir. Mamogramda meme iki tabakanın arasına sıkıştırılır. Daha sonra üstten ve yanlardan X-ışını filmi çekilir. Memedeki bu anormallik basitçe bir kist, iyi huylu bir tümör ya da kanser olabilir. Eğer bir anormallik gözlenirse doktor, daha detaylı testlerin yapılmasını uygun görür. Kırk yaş ve üstündeki kadınlar, her bir ya da iki yılda bir mamogram çektirmelidir. Meme kanseri erken aşamalarda teşhis edildiği zaman hastaların %97’sinin en az beş yıl daha fazla yaşadığı görülür. Tümörlü dokular daha yoğun olduklarından dolayı X-ışınlarını daha çok absorplarlar ve böylece X-ışını filminde daha açık renkte görülürler. Bilgisayarlı tomografi gibi yeni X-ışını teknikleri kanseri standart X-ışını tekniklerine göre daha iyi teşhis eder (Lyons, 2007). 1928’de Cornell Üniversitesinden George Papanicolaou serviks kanserinin, serviksten hücreler alıp incelenerek teşhis edilebileceğini keşfetmiştir. 1940’ larda Pap testi (adı Papanicolaou’dan alınmıştır) medikal kullanıma sunulmuş ve düzenli olarak yapılan bir kanser testi haline gelmiştir. Doktorlar aynı zamanda düzenli olarak kolon ve rektum -7- muayenesi yaparlar. Rektal bir muayenede doktor eldiven giyerek şüpheli kısımları hissedebilmek için rektumun içine parmağını yerleştirir. Bu süreçte rektumun sadece belirli bir kısmı muayene edilir. Elli yaşının üstündeki hastalar için daha detaylı bir muayene yöntemi olan ve direk rektum ile kolonu incelemeye yarayan kolonoskopi yöntemi kullanılır. Polip denilen ve kanserli olmayan urlar bu prosedürde ileride kanser riski yaratmaması için önceden alınır. Görüntüleme prosedürlerinin dışında, doktorlar tarafından yapılan düzenli fiziksel muayeneler de kanseri tespit edebilir. Doktor gözüyle ve eliyle kanser belirtilerini kontrol eder. Bunun için ağıza, boğaza, tiroid bezine, lenf düğümlerine, deriye, pelvise, prostata, testislere ve rektuma bakabilir. Fiziksel muaynenin dışında kan testi de istenir. Örnek olarak; kan sayımı, metabolik testler, karaciğer, böbrek ve tiroit işleyişini ölçen testler verilebilir (Lyons, 2007). Tümör markırları, kanser veya vücutta kansere ya da iyi huylu tümörlere tepki gösteren maddelerden yola çıkarılarak hazırlanan maddelerdir. Çoğu markır normal hücrelerden üretilebildiği gibi, kanser hücrelerinden de üretilebilir; ancak bu kanser hücresi ilerlemiş bir seviyede olmalıdır. Bu maddeler kanser hastalarının kanında, idrarında, dışkısında, tümörlü dokusunda ya da başka dokularında ve vücut sıvılarında bulunabilir. Çoğu tümör markır protein yapılıdır. Fakat son zamanlarda gen ve DNA yapısındaki değişiklikler de tümör markır olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bazı markırlar sadece tek bir kanser türüne özgüyken, bazı markırlara birden çok kanser türünde rastlanabilir (American Cancer Society, 2016b). Örneğin meme kanseri için ALDH1, CD24, CD44, CD90, CD133, HER2; prostat için ALDH1, CD44, CD133, CD166, PSA; akciğer için ALDH1, CD90, CD117, CD133, CD44 ve PD-L1; melonoma için ALDH1, CD20, CD44, CD133, CD271; kolon kanseri için CD44, CD24, CD166, LGR5 markırları kullanılabilir. (Medema, 2013). Roche tarafından geliştirilen Cobas 6000 isimli cihaz rutin biyokimya testleri ile birlikte hormon ve belirli kanser markırlarını da analiz edebilmektedir. Örnek olarak, CA 15.3 isimli kanser markırı meme kanserini saptamada kullanılmasına rağmen meme kanseri yanında diğer durumlarda (siroz, yumurtalık ve meme kanserinin iyi huylu tümörleri) da bu markırın seviyesinde yükselme gözlenmektedir. Benzer şekilde, CA 19.9 gastrik, pankreatik ve mide kanserlerini göstermekle birlikte vücutta normalde gözlemlenen gastrit, göğüs ağrısı veya gaz gibi durumlarda da artmaktadır. Diğer bir kanser markırı olan CA 125, kadınlarda üreme sistemindeki uterus, fallopi tüpleri ve ovaryum gibi kanserleri ile ilişkilendirilmekle birlikte pankreas, akciğer, meme ve kolon kanserlerinde de CA 125 seviyesi artmaktadır. Bu testler ortalama 1-8 saat arasında analiz edilmektedir (Roche Diagnostic, 2015). Roche Cobas 6000 cihazı günlük sağlık taramalarında işlevsel görünse de direkt olarak kanserli ve kansersiz hücreyi ayıramaması ve kanserli hücrelere spesifik olmaması bu cihazın dezavantajıdır. Bu tarama programlarının tanıtımı ve yaygın kullanımı, düzenli bir sağlık programının parçası olarak kullanılmasına ve kanserin erken teşhisine dolayısıyla da kanser ölüm oranlarının azalmasına olanak sağlayacaktır (Lung Cancer Founfadation of America, 2016). 1.4 Kanser Teşhisinde Mikroakışkan Yaklaşımların Kullanılması Mikroakışkanlar, 1 µl–1000 µl arasındaki mikrokanallarda mikrolitre hacimleri işlenmesidir. Bu tür bir rejimde, molekül konsantrasyonları iyi kontrol edildiğinden sıvı akışı kesinlikle katmanlıdır. Mikroakışkan teknoloji, 1990'ların başında biyolojik bir araç olarak biyoteknolojiye girmiştir. O günden bu yana, minyatürize edilmiş platformlar içinde test edilen malzemenin manipülasyonu için iyi bilinen bu disiplinlerarası teknoloji hızla gelişmektedir (Zhang ve Nagrath, 2013). Mikroakışkanların azalan numune boyutu ve reaktif tüketimi, kısa işleme süreleri, gelişmiş hassasiyet, gerçek zamanlı analiz ve otomasyon gibi kendine özgü birçok avantajı vardır. Yaşam bilimlerinde mikroakışkan tekniklerin -8- uygulanmasına yönelik motivasyonlardan biri, elektronik devrelerde gerçekleştirilen yoğun deneysel süreçleri otomatikleştirmektir (Zhang ve Nagrath, 2013; Wen ve ark., 2014; Chiriacò ve ark., 2016). Biyolojik mikroakışkan cihazlar şimdi yeni ve alışılmamış yollarla kanseri araştırmak için kullanılabilmektedir (Zhang ve Nagrath, 2013). Heterojenik popülasyonlardan spesifik hücrelerin yakalanması, izolasyonu ve saflaştırışması; mikroakışkan sistemler, hücre spesifik genomik/proteomik analizleri klonal ve popülasyon çalışmaları ile kanser ve kök hücre çalışmalarındaki hücre temelli teşhisleri içeren çok çeşitli bilim alanlarındaki ilerlemeleri sağlamıştır. Örneğin, kandan CD4+ hücrelerinin izolasyonu biyolojik ve farmasötik araştırmaları için HIV takibinde yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Bu yöntemler karışık hücre popülasyonlarından hücreleri güçlü bir şekilde ayıklamalarına rağmen kompleks, maaliyetli ve uzman personele ihtiyacı olması nedeniyle hasta yatağından tedaviye (point-of-care) uygun olmamaktadırlar (Gurkan ve ark., 2011). Ayrıca, 1 ml tam kan örneği milyarlarca kırmızı kan hücresi, milyonlarca beyaz kan hücresi, binlerce hematopoetik kök hücre ve sadece onlarca ifade edilebilecek dolaşımdaki tümör hücrelerini barındırmaktadır (Mittal ve ark., 2012). Antikorlar özellikle kanser terapisindeki gibi insan terapötiklerinin geniş sınıfını oluşturmaktadır. Tümörlerle ilişkili hücre yüzey antijenlerinin tanılanması ve onkolojide antikor hedefleme için uygunluklarının onaylanması hem in vitro hem de in vivo anti-tümör aktivitelerin taranmasında önemli yer teşkil etmektedir. Potansiyel olarak antijenlerin önemli sınıfları onkolojide antikor hedeflenmesi için uygun olmakla birlikte hücre dışı matriks proteinleri, yüzey proteinler gibi çeşitli hedeflere yönelebilirler. Tümör veya tömör ile ilişkili olmayan hücreler gibi hedef tanılanması için biyolojik materyalin kazanılması dört ana aşamadan ilkini oluşturmaktadır. İkinci aşama, hedef tanılanması olup DNA, mRNA, protein ve antikor reaktivitesi gibi bu dört seviyeden birinde tümör ve normal hücreler arasındaki farkı tanımlayı kapsamaktadır. Üçüncü ana aktivite hedefin geçerliliği olup normal ve tümör dokularında antijenin ekspresyonunu profillemek için reaktifler olarak antikorların üretilmesini gerektirir. Dördüncü ana aşama istenen anti-tümör aktiviteleri için antikor panellerinin in vitro ve in vivo taranmasını sağlamalıdır (Carter ve ark., 2004). Geleneksel olarak, kanser teşhisi, tümör dokularının örneklenmesine veya dolaylı proteinlerin nicelenmesine bağlıdır. Çoğu zaman, bu geleneksel örnekleme yaklaşımları, doku hasarına, sınırlı erişime, güvenilir örnekleri almaya ve yüksek düzeyde hasta rahatsızlığına yol açmaktadır. Proteomik ve genomik araştırmalar, kan ve tükürük gibi vücut sıvıları içinde aday kanser biyolojik belirteçlerinin bir listesini tespit etmesine rağmen, hızlı, non-invazif tanı için hala bakım cihazlarının eksikliği bulunmaktadır. Geleneksel hücre kültür teknikleriyle karşılaştırıldığında mikroakışkanlar, konsantrasyon gradyentlerini, hücre dışı matris bileşenlerini ve hücre-hücre etkileşimlerini tam olarak kontrol ederek hücresel çevreye daha iyi bir yaklaşım sunar (Zhang ve Nagrath, 2013). Mikroakışkan teknolojisinin kanser araştırması üzerindeki etkisini göstermek için dört ayrı alan tanımlanmıştır. Birincisi, CTC'lerin izolasyonuna, immünoafinite dayalı, boyuta dayalı ve manyetik tabanlı ayırma yöntemleri uygulanmıştır. İkincisi, moleküler teşhis yoluyla tümör hücrelerinin tespiti veya karakterizasyonu, tek hücreli RT-qPCR, damlacık esaslı DNA mutasyon dizilerinden protein bulgulama analizlerine genişletilebilir. Üçüncüsü, tümör biyolojisi çok hücreli sfero oluşumu gibi mikrokanallarda tümör hücresi göçü ve hücre kültürlenmesini anlamaya odaklanmasıdır. Dördüncüsü, kan proteini ölçümü, ilaç kaynaklı apoptoz ve bir ilaç test platformu çalışmak için tek hücreli diziler de dahil olmak üzere yüksek verimli tarama sayılabilmektedir (Zhang ve Nagrath, 2013; Zeliadt, 2014) (Şekil 6). -9- Şekil 6. Kanser araştırmalarında mikroakışkan teknolojilerin rolü (Zhang ve Nagrath, 2013) Bilim insanları son yıllarda dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) metastazda önemli bir rol oynadığına inanıyorlar. CTC'ler, rutin kan alımı ile elde edilebilir; bu işlem, bir tümör biyopsisinden daha kolay ve daha az invaziv bir prosedür olduğundan tekrar etmeye müsaittir. Birçok bilim insanı, hücrelerin erken bir aşamada kanser ve metastazları saptamak için kullanılabileceğinden umutludur. CTC'ler doktorlara zamanla bireysel bir tümörün moleküler imza planlamasına, tümörün terapiye olan yanıtını izlemesine ve kişisel terapilerin geliştirilmesi için hedeflerin belirlenmesine yardımcı olabilir (Zeliadt, 2014). Mikroakışkan sistemlerde yakalanan hücreler üzerine yapılan genomik çalışmalar temel olarak büyük yüzey/hacim oranından dolayı kanaldaki genomik materyalin kaybını engellemiştir. Yakalanan canlı hücrelerin geri alınması, akış yönünde bu sınırlamayı ortadan kaldırabilir. Dahası, yakalanmış canlı hücrelerin salınımı ile izole edilen hücrelerde klonal ve popülasyon çalışmalarına fırsat yaratmaktadır (Gurkan ve ark., 2011). CellSearch (Janssen Diagnostics) isimli ticari mikroakışkan ürün EpCAM proteini (epitel hücre adezyon molekülü) bağlanan bir antikor kullanarak kandan hücrelerin yakalanmasına olanak sağlamıştır. Bu ürün, anti-EpCAM antikorları ile kaplı manyetik partiküller kullanılarak kanda dolaşımdaki tümör hücrelerini (CTC) izole etmektedir. Bununla birlikte, anti-EpCAM antikoru metastatik meme, kolorektal ve prostat kanserlerindeki hücre yüzey reseptörleri ile birleşmesi nedeniyle kan gibi genel dokulardan kanser tipini belirlemesi dezavantajdır (Miller ve ark., 2010). Hou ve arkadaşları (2013) tarafından geliştirilen ve spiral kanallara sahip mikroakışkan çip, kandan 10-20 µm çapındaki CTC’leri izole etmektedir. Cihaza bir kan örneği pompalanır ve hücreler yüksek hızda kanaldan akarken, ortaya çıkan atalet ve santrifüj - 10 - kuvvetleri arasındaki etkileşim, kırmızı ve beyaz kan hücrelerini de içeren daha küçük hücrelerin dış duvar boyunca akmasına neden olurken, CTC'ler ve daha büyük beyaz kan hücreleri de dahil olmak üzere daha büyük hücreler iç duvar boyunca akar. Çipin çıkışında kanal ikiye bölünür ve dış duvar boyunca ilerleyen hücreler bir atık kabına akarken, iç duvarın yakınındaki hücreler daha fazla analiz için bir toplama odasına girer. Bununla birlikte, bütün kanser hücrelerinin boyutunun büyük olmaması sebebiyle (örn., küçük hücreli akciğer kanser hücreleri) bütün kanser hücrelerinin yakalanmasında uygulanamaz. Bir diğer mikroakışkan kullanılarak kanser hücrelerini yakalama yaklaşımında, araştırmacılar önce bir kan örneğini, beyaz kan hücrelerinin yüzeyi üzerinde bir proteine bağlayan antikor kaplı manyetik mikro boncuklarla karıştırıyorlar. Daha sonra, numuneyi üç odalı mikroakışkan aygıtlarına pompalar: birinci bölme, kırmızı kan hücreleri ve trombositleri içeren bir kan örneğinin en küçük bileşenlerinin atık çıkışına doğru akmasına neden olan bir dizi mikropost içerir; ikinci bölmede, geri kalan hücreler tek bir dosyaya dizilir ve cihazın üçüncü bölmesine girer; burada, bir mıknatıs, bir mikroboncuğa bağlı beyaz kan hücrelerini bir toplama odasına doğru yönlendirir. Geri kalan hücreler (CTC dahil) üçüncü bir toplama odasına akar. Bu yöntemin dezavantajı, yakalanan CTC’lerin %100 saf olmamasıdır (Ozkumur ve ark., 2013). 1.5 Projenin Amacı Kanser, günümüzde en fazla görülen, teşhisi ve tedavisi en zor olan hastalıklardan biridir. Kansere yakalanan insan sayısı ve ölüm oranları her geçen gün artmaktadır. Kanser, çoğu zaman metastaz ilerledikten ve diğer dokulara yayılıp belirtileri ortaya çıktıktan sonra teşhis edilebilmektedir. Maalesef metastaza uğradıktan sonraki aşamalarda tanısı koyulan kanser, tedavi edilmesi açısından geç kalınmıştır. Bu sebeple kanserin erken teşhisi, tedavi edilebilmesi için atılacak en önemli adımdır. Biyopsi, tomografi, mamografi ve MRI gibi günümüzde kullanılmakta olan geleneksel tanı yöntemleri her ne kadar kanser teşhisinde önemli bir rol oynasa da tanı konulma süreci uzun sürebilir ve konulan tanı yanlış olabilir. Bununla birlikte bu yöntemler spesifik kanser türlerini teşhis etmekte oldukça yetersizdir. Günümüzde mikroakışkan yöntemiyle kanser teşhisi adına birçok çalışma yapılsa da istenilen sonuçları henüz sağlayamamakta olup geliştirilmeye açıktır. Bu projede, Dünya’ da ve Türkiye’ de en çok görülen ve ölüme yol açan ilk üç kanser çeşidi olan meme, akciğer ve prostat kanserlerinin hızlı, doğru ve mikroakışkan yaklaşımla yakalanması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda geliştirilen mikroakışkan tanı çipi iki aşamalı olarak çalışmaktadır. İlk aşama, kanserli hücrelerde ifadesi artan CD44 ve CD90 hücre yüzey proteinlerini yakalamayı sağlayan ve bu sayede kanserli hücre ile normal hücreyi ayıran düzenektir. İkinci aşama ise yukarıda belirtilen üç kanser hücre hattına spesifik hücre yüzey reseptörlerinin (akciğer kanseri için PD-L1, meme kanseri için HER2, prostat kanseri için PSA) yakalamayı sağlayan ve bu sayede kansere spesifik olarak teşhisine olanak sağlayan düzenektir. Sonuç olarak, toplumda en yaygın görülen bu kanser tiplerinin güvenilir, yüksek doğrulukla, hızlı ve ekonomik bir mikroakışkan çip tasarlanarak kanser hastalarının erken teşhisinin sağlanması ve dolayısıyla erken tedaviye başlanılarak bu hastaların sağkalım oranlarının yükseltilmesi hedeflenmiştir. 2. YÖNTEM Projemizde deney planımız 3 aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada, kanser hücrelerini yakalayacak olan mikroakışkan çipi tasarlamak için PMMA, DSA ve cam malzemelerini lazer kesici ile oluşturduk. İkinci aşamada, dizayn edilen çipin hedeflenen kanseri yakalaması için cam malzemenin yüzey kimyası protein G temelli kansere özgü antikorlar ile değiştirilerek ilk aşamada üretilen PMMA ve DSA ile birleştirerek iki farklı çip ürettik. Son aşamada ise - 11 - mikroakışkan temelli çiplerin kanserin erken teşhisinde kullanılması araştırılmıştır: akciğer, meme ve prostat kanser hücrelerinin üretilen ilk çiple kanserli hücre olup olmadığı ikinci çiple ise spesifik olarak hangi kansere ait olduğunun saptanması hedeflenmiştir. 2.1 Materyal Bu projede, RPMI 1640 (Gibco 11875-093), DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Lonza (İsviçre), Fetal Bovin Serum (FBS) Sigma (ABD), Penisilin ve Streptomisin, esansiyel olmayan aminoasitler ve Tripsin-EDTA Biological Industries (İsrail) kanserli hücre hatlarının büyütülmesinde; Phosphate Buffer Saline (tuzlu fosfat tamponu=PBS) (14190-136, Gibco Utah, USA) kanser hücrelerinin seyreltilmesinde ve mikroakışkan çiplerin yıkanmasında; Poli-metil metakrilat (PMMA) (McMaster-Carr, Atlanta, GA), double-sided adhesive film (çift taraflı bant=DSA) (3M, Scotch Plains, NJ, USA) mikroakışkan çip fabrikasyonunda; (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane (3-MPS) (175617, Sigma-Aldrich, St Louis, USA), 4-Maleimido butyric acid N-hydroxysuccinimide ester (GMBS) (63175, SigmaAldrich, St Louis, USA), Etanol (Merck, Darmstadt, Germany), Protein G (Thermo Fisher Scientific, 21193, Pierce, USA), CD44 antikoru (Santa Cruz Biotechnology, sc-7297, CA, USA), CD90 antikoru (Miltenyi Biotec, CA, USA), PD-L1 (programmed cell death protein 1) antikoru (Cell Signaling Technology, E1L3N, MA, USA), HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) antikoru (Cell Signaling Technology, 29D8, MA, USA), PSA (prostat spesifik antikor) antikoru (Abcam, ab76113, MA, USA), Bovine serum albümin (SigmaAldrich, A2153, Milan, Italy) mikroakışkan çipin yüzey kimyasının oluşturulmasında ve kanser hücrelerine özgü antikorların bağlanmasında kullanılmıştır. Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) örneği olarak A549 (ATCC® CCL185™) insan akciğer epitel karsinoma hücre hattı, prostat kanseri örneği olarak LNCaP (ATCC® CRL-1740™) insan prostat karsinom hücre hattı ve meme kanseri örneği olarak MCF7 (ATCC® HTB-22™) insan meme bezi adenokarsinom hücre hattı Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Bölümü’nden temin edilmiştir. Küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) örneği olarak H69 (ATCC® HTB-119™) insan akciğer karsinoma hücre hattı ile H69AR (ATCC® CRL-11351™) insan akciğer karsinom hücre hattı ve bir diğer meme kanseri örneği olarak SK-BR-3 (ATCC® HTB-30™) insan meme bezi adenokarsinom hücre hattı Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi İzmir Genom ve Biyotıp Merkezi’nden temin edilmiştir. 2.2 Hücre Kültür Şartları A549, H69, H69AR akciğer kanser hücre hatları ve LNCaP prostat kanseri hücre hattı, % 1 L-Glutamin, 100 U/ml penisilin/streptomisin ve % 10 inaktif fetal sığır serum (FBS) içeren RPMI–1640 besiyerinde; MCF7 ve SK-BR-3 meme kanseri hücre hatları, 1% penisilin/streptomisin, % 10 inaktif fetal sığır serum (FBS), 10ug/ml insülin içeren DMEM besiyerinde 37°C‘ de, % 5 CO2‘ li inkübatörde çoğaltılmıştır. Kültüre edilen hücrelerin canlılıklarını ve sayılarını takip etmek amacıyla Tripan mavisi boyası testi kullanılmıştır. Buna göre, 50 μl hücre ile 50 μl boya karıştırılarak, ışık mikroskobu altında hücrelerin canlılıkları ve sayıları Neubauer lam kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu amaçla, Neubauer lamında bulunan 4x4‘ lük karelerden oluşmuş 4 alandaki hücreler sayılmıştır. Tripan mavisi boyası testi gereğince boyayı içine alıp mavi renkte boyanan hücreler ölü, boyayı içine almayanlar ise canlı olarak değerlendirilmiştir. Canlı hücre toplamının ortalaması alınıp 20.000 ile çarpılmasıyla, ml başına düşen canlı hücre sayısı saptanmıştır. Aynı işlem ölü hücreler için de gerçekleştirildiğinde, ml başına düşen ölü hücre sayısı belirlenmiştir. Hücre canlılığı ise, toplam hücre sayısının canlı hücrelere % oranıyla belirlenmiştir. - 12 - Mikroakışkan çip denemelerinde kullanılmak üzere hücre hatlarının sayıları belirlendikten sonra PBS (tuzlu fosfat tamponu) tamponunda uygun seyreltmelerde 104, 103, 102 hücre/ml olacak şekilde ayarlanmıştır. 2.3 Mikroakışkan Temelli Çiplerin Fabrikasyonu Spesifik olarak erken kanser teşhisi için iki mikroakışkan çip tasarlanmıştır. Birinci mikroakışkan çip, kanserli hücrelerde ifadesi artan CD44 ve CD90 hücre yüzey proteinlerini yakalamayı sağlayan ve bu sayede kanserli hücre ile normal hücreyi ayıran platformdur. İkinci mikroakışkan çip ise yukarıda belirtilen üç kanser hücre hattına spesifik hücre yüzey reseptörlerini (akciğer kanseri için PD-L1, meme kanseri için HER2, prostat kanseri için PSA) yakalamayı sağlar ve bu sayede kansere spesifik olarak teşhisine olanak tanır. Her iki mikroakışkan çip 24 mm x 60 mm boyutlarında olup birinci mikroakışkan çip, yan yana duran 10 µl hacime sahip iki adet S-şekilde kıvrımlı mikrokanallara sahipken ikinci mikroakışkan çip, yan yana duran 7 µl hacime sahip üç adet S-şekilde kıvrımlı mikrokanallara sahiptir. Her iki mikroakışkan çip 3 adet S’nin birbirini takip etmesinden oluşur ve kanalın uzunluğu 152 mm, kanalın genişliği 1 mm ve derinliği 50 µm olacak şekilde dizayn edilmiştir. 3,175 mm kalınlığa sahip Poli-metil metakrilat (PMMA) (McMaster-Carr, Atlanta, GA) ve 50 µm kalınlığında çift tarafı yapışkan film (DSA) (3M, Scotch Plains, NJ) lazer kesici (Universal VersaLaser VLS 2.30, Scottsdale, AZ) ile CorelDraw vektörel çizim programı ile çizilen tasarım kesilerek PMMA ve DSA birleştirilmiştir. PMMA üzerine kanal giriş çıkışlarına 0,65 mm çapında delikler açılarak mikropipet uçlarının girmesine olanak sağlanmıştır (Zhang ve ark., 2011; Wang ve ark., 2012). Şekil 7’ de CorelDraw’da çizilen mikroakışkan temelli çiplerin tasarımı görülmektedir. Şekil 7. Kansere spesifik olan mikroakışkan çiplerin teknik çizimleri. I: birinci mikroakışkan çipin sırasıyla üstten görünümü (A), PMMA (B) ve DSA (C) kesim noktaları. II: ikinci mikroakışkan çipin sırasıyla üstten görünümü (A), PMMA (B) ve DSA (C) kesim noktaları. Cam ile birleştirilmeden önce yüzey kimyasının tutunabilmesi için camlar 0,1 Torr basınç altında 100 W oksijen plazmada 3 dakika bekletilmiş ve sırasıyla taban camı-DSAPMMA olacak şekilde birleştirme işlemi gerçekleştirilmiştir (Lim ve Lee, 2004; Wang ve ark., 2012) (Şekil 8). - 13 - Şekil 8. Plazma işleminin aşamaları. A: cam malzemenin plazma cihazına yerleştirilmesi. B: yerleştirilmiş cam malzemeler. C: plazma cihazında işlemin gerçekleşmesi. D: Plazma işlemine uğrayan taban camının DSA ve PMMA ile birleştirilmesi. 2.4 Mikroakışkan Çiplerin Yüzey Kimyasının Oluşturulması Yüzey kimyasının hazırlanmasında ilk olarak kanalların içerisine 200 mM etanol içerisinde çözülmüş 100 µl (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane (3-MPS) (175617, SigmaAldrich), doldurularak 30 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmıştır. Sonrasında 100 µl 2 mM 4-Maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester (GMBS) (63175, SigmaAldrich) ile kanallar doldurulup 35 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Sonrasında 100 µl etanol ve arkasından 100 µl Phosphate Buffer Saline (PBS) (14190-136, GIBCO) ile üç kez mikrokanallar yıkanmıştır (Zhang ve ark., 2011; Wang ve ark., 2012). Sonrasında her iki mikroakışkan çipin ilgili kanallara antikor sabitlemeyi sağlamak amacı ile birinci mikroakışkan çip 10 µl, ikinci mikroakışkan çip 7 µl 100 µg/ml Protein G (21193, Pierce, Thermo Fisher Scientific) ile kaplanmıştır. Arkasından tüm mikrokanallar üç kez 30 µl PBS ile yıkanmıştır. Daha sonra, ilgili her mikrokanala üretici tarafından önerilmiş 1/50 oranında seyreltilmiş 10 µl CD44, CD90, PD-L1, HER2 ve PSA antikorları pipetlenmiş ve 1 saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmıştır. Yüzeyde kalan açık Protein G’ ler 30 µl PBS ile yıkanmıştır. Daha sonra 10 µl %1 Bovine serum albumin (BSA) (A2153, SigmaAldrich) nötralize edilmiş ve son olarak 30 µl PBS ile ikinci kez yıkanmıştır (Zhang ve ark., 2011; Wang ve ark., 2012). Şekil 9’da iki mikroakışkan çipin yüzey kimyasının oluşturulmasının basamakları görülmektedir. Şekil 9. Kansere spesifik mikroakışkan çiplerin yüzey kimyasının değiştirilme basamakları görülmektedir. A: plazma işlemi sonucunda fabrikasyonu yapılan mikroakışkan çipler. B: 3-MPS uygulaması. C: GMBS uygulanması. D ve E: PBS ile yıkama. F ve G: Protein G uygulanması H: antikorların yüklenmesi. I: BSA ile nötralizasyon. J: Kansere spesifik mikroakışkan çipler. - 14 - 2.5 Kanser Hücre Hatlarının Mikroakışkan Çiplerde Analiz Edilmesi Mikroakışkan çip üzerinde akciğer, meme ve prostat kanser hücre hatlarının analizi için daha önceden uygun sıvı besiyerinde büyütülmüş ve PBS tamponunda son konsantrasyonu koloni sayısı 104, 103, 102 hücre/ml olacak şekilde ayarlanmıştır. Her hücre hattı iki mikroakışkan çipin bütün kanallarında üç tekrarlı olarak çalışılmıştır. Daha sonra, mikroakışkan çiplerin hücre yakalamasını denemek için birinci mikroakışkan çipe 10 µl, ikinci mikroakışkan çipe 7 µl akciğer, meme ve prostat kanser hücre hatları örneği fonksiyonel olan çipin mikrokanallarına nazik bir şekilde pipetlenmiş ve 15 dakika 37 °C’ de inkübe edilmiştir. İnkübasyonu takiben, mikrokanallar 30 µl PBS tamponu ile yıkanmıştır (Zhang ve ark., 2011; Wang ve ark., 2012). Yıkama işleminden sonra, mikroakışkan çip tarafından yakalanan hücreler mikroskop (Leica DM 750 microscope (Leica Microsystems Heidelberg, Mannheim, Germany)) ile görüntüsü alınmıştır. Şekil 10’ da farklı kanser hücrelerinin mikroakışkan çiplerde yakalanma aşamaları gösterilmiştir. Şekil 10. Kanser hücrelerinin Neubauer lamda sayımı ve mikroakışkan çiplerde denemesi. A: kültüre edilmiş MCF-7 hücresi. B: Neubauer lamda hücre sayımı. C: H69 hücresinin mikroakışkan çipe uygulanması. D: İnkübasyon sonunda mikroakışkan çiplerin mikroskopta incelenmesi. 3. BULGULAR Bu projede, günümüzde en fazla görülme ve ölüm oranına sahip olan akciğer, meme ve prostat kanserlerinin erken teşhisine imkan sağlayacak mikroakışkan temelle çalışan kansere spesifik iki mikroakışkan çip tasarlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda; PMMA, DSA ve cam malzemeler tercih edilmiştir. Çipin temel parçalarını oluşturan bu üç malzeme de şeffaf olması ve işlem sonucunda örneklerin mikroskop altında incelenmesine olanak sağladığından tercih edilmiştir. Mikroakışkan çip tasarlandıktan sonra sistemde sıvı akışının düzgün olup olmadığı ve sistemin sıvı kaçırıp kaçırmadığı bütün mikrokanallara Orange G boyası eklenerek incelenmiştir. Deneme sonucunda, mikrokanalların sıvı kaçırmadığı ve eklenen sıvının kanallardan belirtilen yolu takip ettiği görülmüştür (Şekil 11). Sıvı akışkanlığı denemelerinden sonra, birinci mikroakışkan çipin her iki kanalının hacmi 10 µl iken ikinci mikroakışkan çipin her üç kanalının hacmi 7 µl olduğu bulunmuştur. Şekil 11. Orange G boyası eklenen mikroakışkan çiplerin görünümü. - 15 - Daha sonra, mikroakışkan çiplerin yüzey kimyası değiştirilerek montajı gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan mikroakışkan çiplerin hedeflenen kanser hücrelerini tutabilmesi için sırasıyla çipin alt parçası olan camın yüzey kimyası plazma uygulaması ile değiştirilmiştir. Ardından altta cam, ortada mikrokanalları taşıyan ve alt ve üst parçaların yapışmasını sağlayan DSA, en üstte PMMA bulunacak şekilde her iki mikroakışkan çip monte edilmiştir. Montajı tamamlanan çipler, değişen yüzey kimyasından faydalanılarak her kanalın spesifik bir antikora özgü olabilmesi için sırasıyla; 3-MPS, GMBS ve Protein G ile pipetlenmiş ve her bir mikrokanala ilgili antikorlar pipetlenerek mikrokanallar kanser hücrelerine spesifik hale getirilmiştir. Şekil 12’de montajı ve yüzey kimya modifikasyonu tamamlanmış mikroakışkan çipler görülmektedir. Şekil 12. Montajı ve yüzey kimya modifikasyonu tamamlanmış mikroakışkan çipler. Geliştirilen iki mikroakışkan çip toplamda beş antikor bağlı olup yukarıda bahsedilen farklı kanser hücre hatları çoğaltıldıktan sonra mikroakışkan çiplerde denenmiştir. Bunun için her hücre hattı uygun seyreltmelere getirildikten sonra bütün mikrokanallarda denenmiştir. Bütün hücreler mikrokanallarda 37 °C’ de 15 dakika inkübe edilip PBS ile yıkandıktan sonra hücrelerin tutunup tutunmadıkları mikroskop altında incelenmiştir. Küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) örneği olan H69 (ATCC® HTB-119™) insan akciğer karsinoma hücre hattı, birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra CD90 antikorunu içeren mikrokanalda kuvvetli bir şekilde tutunmuşken, CD44 antikorunu içeren mikrokanalda sadece birkaç hücrenin tutunduğu gözlemlenmiştir. H69 hücreleri ikinci mikroakışkan çipte PD-L1, HER2 ve PSA antikorunu içeren mikrokanallarda tutunmadığı gözlemlenmiştir. Bir diğer küçük hücreli akciğer kanseri örneği olan H69AR (ATCC® CRL-11351™) insan akciğer karsinom hücre hattı birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra hem CD44 hem de CD90 mikrokanallarında çok miktarda tutundukları gözlemlenmiştir. H69AR hücreleri, H69’a benzer şekilde ikinci mikroakışkan çipte her üç mikrokanalda da bulunmadığı saptanmıştır. Her iki hücre konsantrasyonu 104, 103, 102 hücre/ml olduğunda mikroçipin hücreleri tuttuğu görülmüştür. Şekil 13’ te H69 hücrelerinin ve Şekil 14’te H69AR hücrelerinin mikrokanallardaki mikroskop altındaki görüntüleri verilmektedir. Şekil 13. H69 hücrelerinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki mikroskop görüntüleri. - 16 - Şekil 14. H69AR hücrelerinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki mikroskop görüntüleri. Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) örneği olarak A549 (ATCC® CCL185™) insan akciğer epitel karsinoma hücre hattı, birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra CD90 antikorunu içeren mikrokanalda kuvvetli bir şekilde tutunmuşken, CD44 antikorunu içeren mikrokanalda tutunmadığı gözlemlenmiştir. A549 hücreleri ikinci mikroakışkan çipte PD-L1 mikrokanalında yakalanmışken, HER2 ve PSA antikorunu içeren mikrokanallarda yakalanmadığı gözlemlenmiştir. Hücre konsantrasyonu 104, 103, 102 hücre/ml olduğunda mikroçipin hücreleri tuttuğu görülmüştür. Şekil 15’te A549 hücresinin mikrokanallardaki görüntüleri verilmektedir. Şekil 15. A549 hücresinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki mikroskop görüntüleri. Meme kanseri örneği olarak MCF7 (ATCC® HTB-22™) insan meme bezi adenokarsinom hücre hattı, birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra CD44 ve CD90 antikorunu içeren mikrokanallarda yakalandığı gözlemlenmiştir. MCF7 hücreleri ikinci mikroakışkan çipte HER2 mikrokanalında kuvvetli bir şekilde yakalanmışken, PD-L1 ve PSA antikorunu içeren mikrokanallarda yakalanmadığı gözlemlenmiştir. Bir diğer meme kanseri örneği olarak SK-BR-3 (ATCC® HTB-30™) hücre hattında da aynı bulgulara ulaşılmıştır. Her iki hücre konsantrasyonu 104, 103, 102 hücre/ml olduğunda mikroakışkan çipin hücreleri tuttuğu görülmüştür. Şekil 16’da MCF7 hücrelerinin ve Şekil 17’de SK-BR-3 hücrelerinin mikrokanallardaki mikroskop altındaki görüntüleri verilmektedir. Şekil 16. MCF7 hücresinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki mikroskop görüntüleri. - 17 - Şekil 17. SK-BR-3 hücresinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki mikroskop görüntüleri. Prostat kanseri örneği olarak LNCaP (ATCC® CRL-1740™) insan prostat karsinom hücre hattı, birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra CD44 antikorunu içeren mikrokanalda yakalanmışken, CD90 antikorunu içeren mikrokanalda yakalanmadığı gözlemlenmiştir. LNCaP hücreleri ikinci mikroakışkan çipte PSA mikrokanalında güçlü bir şekilde yakalanmışken, HER2 ve PD-L1 antikorunu içeren mikrokanallarda yakalanmadığı gözlemlenmiştir. Hücre konsantrasyonu 104, 103, 102 hücre/ml olduğunda mikroçipin hücreleri tuttuğu görülmüştür. Şekil 18’de LNCaP hücresinin mikrokanallardaki görüntüleri bulunmaktadır. Şekil 18. LNCaP hücresinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki mikroskop görüntüleri. Tüm hücre hatlarının iki mikroakışkan çipteki sonuçları Çizelge 1’de özetlenmiştir. Çizelge 1. Mikroakışkan çiplerde yakalanan kanser hücreleri. Prostat kanser hattı Meme kanser hatları Akciğer kanser hatları Hücreler Birinci mikroakışkan çip İkinci mikroakışkan çip CD44 CD90 PD-L1 HER2 PSA H69 z ++ - - - H69AR ++ ++ - - - A549 - ++ + - - MCF7 + + - ++ - SK-BR-3 + + - ++ - LNCaP + - - - ++ -: tutunmamış, z: zayıf, +: tutunmuş, ++: kuvvetli tutunmuş. - 18 - 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Biyomedikal alanda heterojenik popülasyondan spesifik hücrelerin yakalanması, izole edilmesi ve saflaştırılması; genomik, proteomik ve popülasyon çalışmalarında oldukça önemlidir. Hücre temelli teşhise olanak sağlayan mikroakışkan sistemler geliştirilmeye açık bir alandır (Gurkan ve ark., 2011). Bu projede, günümüzde en fazla görülme ve ölüm oranına sahip olan akciğer, meme ve prostat kanserlerinin güvenilir ve erken teşhisine imkan sağlayacak mikroakışkan temelle çalışan kansere spesifik iki mikroakışkan çip tasarlanmıştır. Günümüzde kullanılan kanser teşhis yöntemlerinin cevabı uzun sürdüğünden doktor ve hasta için zaman kaybına yol açar. Kanser gibi erken teşhisin hayati önem taşıdığı hastalıklarda, teşhis süresinin uzun olması oldukça büyük bir dezavantajdır. Kanserin heterojenik yapısı, çoğu zaman inceleyen uzmanı yanlış yönlendirip yanlış tanı konulmasına sebep olabilir. Bu nedenle kanserin doğru teşhisi ve aşamalandırılması hastanın iyileşme ve sağkalım sürecini büyük oranda etkiler. Buna ek olarak, cihaz kullanılan tanı yöntemleri, kansere spesifik olmamakla birlikte maliyeti yüksektir. Bu sebeplerden dolayı, yanlış teşhisi en aza indiren, 15 dakika gibi kısa bir sürede kansere spesifik sonuç veren ve uzmanlara kolaylık sağlayan iki adet mikroakışkan çip üretilerek bu sorunların önüne geçilmiştir. Ürettiğimiz mikroakışkan temelli kanser teşhis yöntemi yüzey antijenleriyle antikor uyumuna dayanmaktadır. Birinci mikroakışkan çipte, hücre hattında kanserli hücre olup olmadığını anlamak için, normal hücrelerin yüzeyinde çok az veya hiç ifade edilmeyen ancak birçok kanser türünde ifade edilen hücre yüzey proteinlerine bağlanan CD44 ve CD90 antikorları kullanılmıştır (Medema, 2013; American Cancer Society, 2016b; Leon ve ark., 2016). CD44 glikoprotein yapısında olup; hücre membranında çoğalma, farklılaşma, göç ve angiogeneziz gibi çok hücreli canlılarda görev alan çok fonksiyonlu bir yüzey antijenidir. CD90 antijeni özellikle lökosit hücreleri başta olmak üzere hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimlerinde ifade edilen hücre yüzey glikoproteinidir (Leon ve ark., 2016). Bu özelliklerinden dolayı birinci mikroakışkan çipte, normal hücrelerden kanserli hücreleri ayırt etmede tercih edilmiştir. İlk mikroakışkan çipte saptadığımız olası kanser hücrelerinin, hastanın en sık görülen kanser türlerinden hangisine yakalandığını belirlemek için ikinci mikroakışkan çipte denenmiştir. PD-L1 (Programlanmış ölüm-ligand 1) 40 kDa bir transmembran protein olup ve bağışıklık sistemi baskılandığında akciğer kanser hücrelerinde ifadesi artan bir yüzey proteinidir (Kerr ve Nicolson, 2016). HER2 (insan epidermal büyüme faktör reseptörü 2), meme kanser hücrelerinin metastatik tiplerinde bol miktarda ifade edilmektedir (Kim ve ark., 2017). Son olarak, PSA (prostat spesifik antijen), prostat kanserine özgü bir organik antijen olup epitelinden türeyen hücrenin yüzeyinde bulunan bir serin proteaz glikoproteindir (Balk ve ark., 2003). Dolayısıyla ikinci mikroakışkan çipte kanser spesifikliğini arttırmak için literatür özenle taranmış ve akciğer kanseri için PD-L1, meme kanseri için HER2, prostat kanseri için PSA antikorları tercih edilmiştir. Birinci mikroakışkan çipte bulunan CD44 mikrokanalının H69AR, MCF7, SK-BR-3 ve LNCaP hücrelerini; CD90 mikrokanalının H69, H69AR, A549, MCF7 ve SK-BR-3 hücrelerini yakalaması literatürle benzer sonuçlar vermiştir. Dolayısıyla ilk mikroakışkan çip akciğer, meme ve prostat kanseri için tarama testi niteliğinde olmuştur. İkinci mikroakışkan çipte bulunan PD-L1 mikrokanalının sadece A549 akciğer kanser hücrelerini; HER2 mikrokanalının MCF7 ve SK-BR-3 meme kanser hücrelerini; PSA mikrokanalının sadece LNCaP prostat kanser hücrelerini yakaladığı bulunmuştur. Bu sonuçlara dayanarak, ilk mikroakışkan çipte saptanan hücrenin hangi yaygın kanser hücresi olduğu ikinci çip ile doğrulanmıştır. Ayrıca PD-L1 mikrokanalında küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücresi yakalanırken (A549); küçük hücreli akciğer kanser (H69 ve H69AR) - 19 - hücreleri yakalanmaması akciğer kanserinin iki büyük tipinin ayırt edilmesine de olanak sağlamıştır. Sonuç olarak etkili, kullanımı kolay, maliyeti düşük, hızlı ve kansere spesifik, tıpta yeni nesil teşhise olanak sağlayacak bir yaklaşım sunulmuştur. 5. ÖNERİLER Yukarıdaki özelliklerinden dolayı bu projede geliştirilen mikroakışkan çipler, sadece bu araştırmada olduğu gibi hücre hatlarında değil heterojen hücre popülasyonlarının bulunduğu kan veya spesifik doku örneklerinde de denemelerde kullanılabilir. Ancak bu proje kapsamında TÜBİTAK proje rehberinde belirtilen sebeplerden dolayı heterojen biyolojik örneklerle çalışılamamıştır. Proje kapsamında mikroakışkan çiplerin yüzey modifikasyonu sonucunda istenilen hedef hücre doğrultusunda kullanılan antikorlar değiştirilerek diğer kanser türlerine de uygulanabileceği düşünülmektedir. Aynı zamanda herhangi bir kanserin alt tipini belirlemede PD-L1 antikorunun bulunduğu mikrokanal örneğinde olduğu gibi uygun antikorlar seçilerek kanser alt tiplerinin sınıflandırılması da yapılabilir. Projede mikroakışkan çip, kanser hücrelerinin yakalanmasına olanak sağlayacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Ancak yakalanan hücrelerin genetik ve moleküler biyolojik özelliklerinin ileriki araştırmalarda kullanılması için hücrelerin izolasyonu elzemdir. Bu sebeple mikroakışkan çipin yüzey modifikasyonunda Protein G aşamasından önce farklı sıcaklık ya da pH ile kolayca ayrılmasını sağlayacak linkerlar yapıya eklenerek yakalanan hücrelerin izolasyonuna olanak sağlanabilir. Bu proje kapsamında gerçekleştirilen mikroakışkan çipler sadece kanser hücrelerinin değil, dolaşım sistemi ile saptanması çok zor olan sirküle tümör kök hücrelerinin (CTC) de yakalanmasında kullanılabilir. KAYNAKLAR Ahmed N., Dawson M., Smith C. ve Wood E. (2007), Cancer. Biology of Disease, sayfa 475-514. American Cancer Society, (2016a), What is prostate cancer?, Erişim Tarihi: 28.11.2016, http://www.cancer.org/cancer/prostatecancer/%20detailedguide/prostate-cancerwhat-is-prostate-cancer American Cancer Society, (2016b), How are laboratory tests used in cancer medicine?, Erişim Tarihi: 28.11.2016, https://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosisstaging/understanding-lab-tests-fact-sheet Balk, S.P., Ko, Y.J., Bubley, G.J. (2003), Biology of prostate-spesific antigen. Journal of Clinical Oncology, 21(2): 383-391. Beckmann, M.W., Niederacher, D., Schnurch, H.G., Gusterson, B.A., Bender, H.G. (1997). Multistep carcinogenesis of breast cancer and tumor heterogeneity. Journal of Molecular Medicine, Vol. 75, pp. 429-439. Carter, P., Smith, L., Ryan, M. (2004), Identification and validation of cell surface antigens for antibody targeting in oncology. Endocrine-Related Cancer. 11: 659–687. Chiriacò, M.S., Primiceri, E., De Feo, F., Montanaro, A., Monteduro, A.G., Tinelli, A., Megha, M., Carati, D., Maruccio, G. (2016), Simultaneous detection of multiple lower genital tract pathogens by an impedimetric immunochip, Biosensors and Bioelectronics, 79: 9-14. - 20 - Dimri, G., Band, H., Band, V. (2005), Mammary epithelial cell transformation: insights from cell culture and mouse models, Breast Cancer Research, 7: 171-179. Dünya Sağlık Örgütü, (2015), Kanser, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/. Erişim Tarihi: 21.11.2016, Etzioni, R., Urban, N., Ramsey, S., McIntosh, M., Schwartz, S., Reid, B., Radich, J., Anderson, G., Hartwell, L. (2003), The case for early detection. Nature Review Cancer, 3(4): 243-252. Giuliano, A.,E., 2009. Breast disorders. Current Medical Diagnosis & Treatment. 48th ed. McGraw-Hill Companies, Inc. USA, sayfa 630-654. GLOBOCAN, (2012), 2012 yılında dünya çapında kanser insidans ve mortalite oranları, Erişim Tarihi: 21.11.2016, http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx Gurkan, U.A., Anand, T., Tas, H., Elkan, D., Akay, A., Keles, H.O., Demirci, U. (2011), Controlled viable release of selectively captured label-free cells in microchannels. Lab on a Chip, 11: 3979-3989. Hou, H.W., Warkiani, M.E., Khoo, B.L., Li, Z.R., Soo, R.A., Tan, D.S.-W., Lim, W.T., Han, J., Bhagat, A.A.S., Lim, C.T. (2013), Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Nature Scientific Report, 3:1259, 1-8. Kerr, K.M., Nicolson, M.C. (2016), Non-Small Cell Lung Cancer, PD-L1, and the Pathologist. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 140: 249-254. Kim, J., Pareja, F., Weigelt, B., Reis-Filho, J.S. (2017), Prediction of Trastumab Benefit in HER2-Positive Breast Cancers: is it in the Intrinsic Subtype?. Journal of the National Cancer Institute. 109(2): djw218. Köktürk N, Öztürk C, Kırısoglu CE. (2003), Akciğer kanseri moleküler biyolojisi. Solunum Dergisi, 5: 127-138., Leon, G., MacDonagh, L., Finn, S.P., Cuffe, S., Barr, M.P. (2016), Cancer stem cells in drug resistant lung cancer: Targetting cell surface markers and signaling pathways. Pharmacology Therory,158:71-90 Lim, K.-B., Lee, D.-C. (2004), Surface modification of glass and glass fibres by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis, 36: 254–258. Pharmacology and Therapeutics, 158: 71 – 90. Lung Cancer Founfadation of America, (2016), Is early diagnosis important? Erişim Tarihi: 25.11.2016, http://lcfamerica.org/lung-cancer-info/detection/is-early-diagnosisimportant/ Lyons, L. (2007), The Biology of the Cancer: Diagnosis and Treatment of Cancer, sayfa 11 – 42. Masso-Welch, P.A., Darcy, K.M., Stangle-Castor, N.C., Ip, M.M. (2000), A Developmental Atlas of Rat Mammary Gland Histology. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, 5(2): 165 – 185. Medema, J.P. (2013), Cancer stem cells: the challenges ahead. Nature Cell Biology, 15(4):338-344. Miller, M.C., Doyle, G.V., Terstappen, L.W.M.M. (2010), Significance of Circulating Tumor Cells Detected by the CellSearch System in Patients with Metastatic Breast Colorectal and Prostate Cancer. Journal of Oncology, - 21 - Mittal, S., Wong, I.Y., Deen, W.M., Toner, M. (2012), Antibody-functionalized fluidpermeable surfaces for rolling cell capture at high flow rates. Biophysical Journal, 102: 721730. Ozkumur, E., Shah, A.M., Ciciliano, J.C., Emmink, B.L., Miyamoto, D.T., Brachtel, E., Yu, M., Chen, P., Morgan, B., Trautwein, J., Kimura, A., Sengupta, S., Stott, S.L., Karabacak, N.M., Barber, T.A., Walsh, J.R., Smith, K., Spuhler, P.S., Sullivan, J.P., Lee, R.J., Ting, D.T., Luo, X., Shaw, A.T., Bardia, A., Sequist, L.V., Louis, D.N., Maheswaran, S., Kapur, R., Haber, D.A., Toner, M. (2013), Inertial Focusing for Tumor Antigen–Dependent and –Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine, 5: 179, 179ra47. Roche Diagnostic, (2015), Products and Solutions, Erişim Tarihi: 05.12.2016 http://www.cobas.com/content/dam/cobas_com/pdf/lists/Products-Solutions-2015interactive.pdf Rom, W.N., Hay, J.G., Lee, T.C., Jiang, Y., Tchou-Wong, K.M. (2000), Molecular and genetic aspects of lung cancer. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 161: 1355-1367. Sağlık Bakanlığı, (2016), Türkiye Kanser İstatistikleri. Erişim Tarihi: 05.12.2016 http://kanser.gov.tr/daire-faaliyetleri/kanser-istatistikleri.html Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. (2013), Cancer Statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 63: 11–30. Stanton, editors, Bruce M. Koeppen, Bruce A. (2008). Berne & Levy physiology (6th ed.). Philadelphia, PA: Mosby/Elsevier. pp. 418–422. ISBN 978-0-323-04582-7. Wang, S., Inci, F., Chaunzwa, T.L., Ramanujam, A., Vasudevan, A., Subramanian, S., Chi Fai Ip, A., Sridharan, B., Gurkan, U.A., Demirci, U. (2012), Portable microfluidic chip for detection of Escherichia coli in produce and blood, International Journal of Nanomedicine, 7, sayfa 2591 – 2600. Wen, X.X., Xu, B.L., Wang, W.X., Liang, G.T., Chen, B., Yang, Y.M., Liu, D.Y. (2014), Rapid identification of multiple bacteria on a microfluidic chip, Chinese Journal of Analytical Chemistry, 42, 6 sayfa 791 – 798. Zeliadt, N. (2014), Capturing Cancer Cells on the Move: Three approaches for isolating and characterizing rare tumor cells circulating in the bloodstream Erişim Tarihi: 04.12.2016 http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/39503/title/CapturingCancer-Cells-on-the-Move/ Zhang, X., Khimji, I., Gurkan, U.A., Safaee, H., Catalano, P.N., Keles, H.O., Kayaalp, E., Demirci, U. (2011), Lensless imaging for simultaneous microfluidic sperm monitoring and sorting, Lab on a Chip, 7,11, sayfa 2535 – 2540. Zhang, Z., ve Nagrath, S. (2013), Microfluidic and cancer: are we there yet?, Biomedical Microdevices, 15: 595–609. - 22 -
