Tıbbi biyoloji - Tıp Fakültesi

T.C.
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI
TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK LABORATUVARI
UYGULAMA KILAVUZU
ANTALYA
2017-2018
HAZIRLAYANLAR:
Prof. Dr. İbrahim KESER
Prof. Dr. Sibel BERKER KARAÜZÜM
Prof. Dr. Osman Nidai ÖZEŞ
Arş. Gör. Mükerrem Hale TAŞYÜREK
Arş. Gör. Elanur YILMAZ
Arş. Gör. Dr. Ceren HANGÜL
Prof. Dr. Salih ŞANLIOĞLU
Arş. Gör. Yunus Emre EKŞİ
Prof. Dr. Özgül ALPER
Arş. Gör. Habibe Sema ARSLAN
Prof. Dr. Fahri UÇAR
Prof. Dr. Ahter Dilşad ŞANLIOĞLU
Doç. Dr. Burçak YOLDAŞ ÇELİKTEN
Doç. Dr. Esra MANGUOĞLU
Arş. Gör. Gamze KOÇAK
Arş. Gör. Pınar BAHŞİ
Arş. Gör. Tuğba KARAMAN
MERCAN
Yrd. Doç. Dr. Sezin YAKUT UZUNER
Önemli Telefonlar:
Tıp Fakültesi Dekanlık
:249-6900
Teknik Destek
:6947
Anabilim Dalı Sekreterliği
:249-6970
Fakülte Güvenlik
:2747
Polis İmdat
:155
Yangın
:110
Ambulans
:112
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖNSÖZ
ii
LABORATUVAR YERLEŞİM DÜZENİ
iii
LABORATUVAR DÜZENİ VE GEREKLİ KOŞULLAR
iv
LABORATUVARDA UYULMASI GEREKEN KURALLAR
v
SİZİN İÇİN
vi
TAKVİM
viii
PRATİK 1:
HASTA HIKAYESI ALIMI VE DNA İZOLASYONU
1
PRATİK 2:
PZR UYGULAMALARI VE PZR İLE TANISI KONAN
HASTALIKLARIN RAPORLANDIRILMASI
9
PRATİK 3:
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ
19
PRATİK 4:
RFLP UYGULAMALARI VE RFLP İLE TANISI KONAN
HASTALIKLARIN RAPORLANDIRILMASI
27
PRATİK 5:
DNA DİZİ ANALİZİ VE DNA DİZİ ANALİZİ İLE TANISI
KONAN HASTALIKLARIN RAPORLANDIRILMASI
35
PRATİK 6:
MİKROSKOP KULLANMA BECERİSİNİN KAZANILMASI
44
PRATİK 7:
GEN KLONLAMA VE BAKTERİYE TRANSFORMASYON
54
PRATİK 8:
MİTOZ BÖLÜNME
64
PRATİK 9:
HİKAYE ALIMI, PEDİGRİ VE KROMOZOM ELDESİ I
70
PRATİK 10:
KROMOZOM ELDESİ II
75
PRATİK 11:
KROMOZOMLARIN BANTLANMASI VE TANIMLANMASI
78
PRATİK 12:
SİTOGENETİK BULGULARIN RAPORLANDIRILMASI
84
i
ÖNSÖZ
Sevgili Öğrenciler,
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Laboratuvar Uygulamaları (Pratikleri), diğer anabilim dalları ile
ortak kullanılan laboratuar mekanlarında gerçekleştirilecektir. Bu durum bize,
laboratuvarda yaşanabilecek her türlü kazaya açık olduğumuzu, bu nedenle en küçük
çalışma ilkesini ve güvenlik kuralını göz ardı etmememiz gerektiğini söylemektedir.
Pratikten Sorumlu Öğretim Üyesi ve Araştırma Görevlilerinin uyarılarına kesinlikle
uyulmalıdır. Laboratuvarda temel çalışma ilkeleri ve güvenlik kurallarının öğrenilmesinin
yanı sıra, her bir deney araç-gereci ve kimyasal maddenin güvenli şekilde nasıl
çalışılacağı konusunda bilgi gerekir. Bu bilgileri her pratikten sorumlu öğretim üyesi,
araştırma görevlisi hocalarınızdan edinebilecek ve bilgilere elinizdeki bu kılavuzdan
ulaşabileceksiniz.
Sağlıklı ve amacına uygun, sonuçlarının kalıcı ve geleceğe temel oluşturması bakımından
yararlı bir pratik çalışması yapabilmek; Öğretim Üyesi, Araştırma Görevlisi ve siz
öğrencilerin istekli, dikkatli ve titiz çalışmasına, uyumlu davranış ve tutumlarına bağlıdır.
Elinizde bulunan Tıbbi Biyoloji ve Genetik Laboratuvarı Uygulama Kılavuzundaki
kuralları ve bilgileri laboratuvara girmeden önce okumanız ve öğrenmeniz gerekmektedir.
Pratiklerin değerlendirmesi; öğrencinin her pratikteki tutum ve davranışı, laboratuar
ilkelerine uyup uymadığı, devamsızlıkları ve ilgili ders kurulu sonunda yapılan Pratik
Sınav notundan oluşacaktır. Bu yüzden, bugün multidisipliner biçimde baş döndürücü bir
hızla gelişen Tıbbi Biyoloji ve Genetik biliminde, teorik bilgilerin pratiklerle
pekiştirilmesi ve tartışılması, kalıcılığının sağlanması, yarınlarınıza yön vermesi
bakımından, büyük önem taşımaktadır.
Hepinize sağlıklı ve başarılı bir eğitim-öğretim dönemi diliyorum.
Saygılarımla,
Prof. Dr. İbrahim KESER
Tıbbi Biyoloji ve Genetik
Anabilim Dalı Başkanı
ii
LABORATUVAR YERLEŞİM DÜZENİ
iii
LABORATUVAR DÜZENİ VE GEREKLİ KOŞULLAR
1- Laboratuvar Altyapısı: Laboratuvarın kuruluş amacına göre bulunması gereken araçgereç ve cihaz altyapısı ve sarf malzemelerinden oluşur. Eğitim Laboratuvarı’mızda
başta mikroskoplar ve kapalı devre görüntülü sistem olmak üzere, değişen pratiklere
göre, santrifüj, su banyosu, PZR cihazı (Thermal Cycler), UV-Transillimunatör,
Elektroforez seti gibi hem elektrik hem kimyasal hem de fiziksel özellikli cihazlar ile
kan gibi biyolojik materyallerin zaman zaman yer alması,
2- Deney Hakkında Bilgi, Hazırlık ve İşlem Basamakları: Deneyle ilgili önceden bilgi
toplama, kılavuzu okuma ve varsa öğrenciye ait gerekli malzemeleri temin etme,
deneysel malzemelerin hazırlanması, deneyin işlem basamaklarının bilinmesi,
3- İyi Uygulama; Dikkat, Özen ve Temizlik: Deneyin başarılı olabilmesi için,
laboratvuara giriş yaptıktan sonra, laboratuvar çalışma ilkelerine ve yapılan uyarılara
uyulması, dikkatli ve özenli çalışılması, kendinizin ve arkadaşlarınızın riske
atılmaması, deneysel düzeneklerden zarar görmemek için temiz çalışılması,
4- Tartışma
ve
Raporlandırma:
Deney
sonuçlarının
ilgili
teorik
bilgilerle
değerlendirilmesi, harmanlanması, deneyin amacına ulaşıp ulaşmadığı, neden ve sonuç
ilişkisinin
tartışılması,
çıkan
sonucun
raporlandırılması
ve
kalıcı
bilgiye
dönüştürülmesi,
5- Bilginin Aktarılması: Edinilen bilimsel bilgilerin, gelecek kuşaklara aktarılması.
iv
LABORATUVARDA UYULMASI GEREKEN KURALLAR
1- Laboratuvara zamanında gelinmelidir.
2- Laboratuvara mutlaka önlükle girilmelidir.
3- Laboratuvara yiyecek ve içecek getirilmemelidir.
4- Laboratuvar saatini etkin geçirmek için, deney akışına ve zamanlarına uyulmalıdır.
5- Laboratuvarda not tutmak için kalem ve kağıt bulundurulmalıdır.
6- Laboratuvarda bulunan malzemeler deney dışı kullanılmamalı ve koklanmamalıdır.
7- Laboratuvarda dikkat dağıtıcı hareketler ve gürültü yapılmamalıdır.
8- Laboratuvarda izinsiz olarak elektrikli cihaz, araç-gereç ve kimyasal madde
kullanılmamalıdır.
9- Deney yapanlar mutlaka eldiven giymeli, gerekli durumlarda maske ve koruyucu
gözlük kullanmalıdırlar.
10- Laboratuvarda ortaya çıkan atıklar, uygun biçimde atık kaplarına atılmalıdır.
11- Laboratuvar çalışması bittikten sonra, laboratuar bir sonraki grup ve kendiniz için
temiz ve düzenli bırakılmalıdır.
v
SİZİN İÇİN
“Tıbbi Biyoloji ve Genetik Laboratuvarı Uygulama Kılavuzu”, Akdeniz
Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Dersi uygulamalarında yol
gösterici olarak hazırlanmıştır.
Laboratuvar; kelime olarak Latince “laborare”den (“çalışmak”tan) köken almakta
olup, bilimsel, teknik araştırma ve inceleme yapmak için gerekli araç, gereç ve
düzeneklerin bulunduğu, “toplam kalite standartları” ile çalışılan yer olarak
tanımlanmaktadır.
Laboratuvarlar genel olarak 3 grup altında toplanırlar;
Eğitim Laboratuvarları: Temel eğitim, lisans veya lisansüstü eğitim amaçlı
laboratuvarlardır. Şuan sizin bulunduğunuz laboratuvar buna en güzel örnektir.
Araştırma Laboratuvarları:
Bilim
Laboratuvarları:
Üniversitelerde ve
Enstitülerde bilimsel soruları
aydınlatmak için kurulan laboratuvarlar
Sanayi Laboratuvarları: Üretimde ilerleme sağlayacak laboratuvarlar olup, sanayi
ve üniversite işbirliği içinde çalışırlar.
3- Rutin Analiz ve Tetkik Laboratuvarları: İnsanların günlük yaşamda
karşılaştıkları sağlık sorunlarına klinik yaklaşımda destek olan, doğum öncesi ve
sonrası örneklerle verilerin elde edildiği laboratuvarlardır.
Bir bilimsel çalışmadan beklenen sonuçların elde edilmesi; probleme ilişkin
sorunun sorulması, dikkatli gözlem ve kontrollü deneyin yapılması, sonuçların
değerlendirilmesi ve bu sonuçların benzer çalışmalarla tartışılması esasına
dayanır.
Bu amaçla, laboratuvarlar; hem eğitim, hem araştırma hem de rutin analizlerin
bilimsel yöntemlerle yapıldığı uygulama alanlarıdır.
Çalışmalardan iyi ve kesin sonuç alınmasının en önemli koşulları, deney araç ve
vi
gereçlerinin eksiksiz olması, laboratuvarın temiz olması, yapılacak çalışma
hakkında
önceden
bilgi
edinilmesi
ve
çalışma
protokolünün
hazır
bulundurulmasıdır. “Aktif eğitim-aktif insan” ilişkisi çerçevesinde, laboratuvar
çalışmalarına hazırlanmak, ilgili konu hakkında önceden araştırma yapmak, grup
çalışmaları içinde ulaşılan sonuçları tartışmak, kişinin özgüvenini kazanmasına
katkıda bulunacak ve öncelikle kendisine, sonra da çevresine saygı duymasını
geliştirecektir.
Çalışmaya başlamadan önce ön bilgilerin dikkatlice okunması, kılavuzda
belirtilen yöntemlerin titizlikle izlenmesi, gözlemlerden çıkarılan sonuçların
kısaca not edilmesi ve çizimlerin yapılması gelecekte de bu bilgilerin
kullanılmasına olanak sağlayacaktır.
vii
TAKVİM
A GRUBU
B GRUBU
PRATİK
NO
TARİH
SAAT
TARİH
SAAT
1
23.10.2017.PZT
10:30-12:20
23.10.2017.PZT
13:30-15:20
2
24.10.2017.SALI
8:30-10:20
24.10.2017.SALI
15:30-17:20
3
25.10.2017.ÇRŞ
15:30-17:20
25.10.2017.ÇRŞ
10:30-12:20
4
30.10.2017.PZT
13:30-15:20
30.10.2017.PZT
10:30-12:20
5
31.10.2017.SALI
15:30-17:20
31.10.2017.SALI
13:30-15:20
01.11.2017.ÇRŞ
13:30-15:20
01.11.2017.ÇRŞ
13:30-15:20
03.11.2017.CUMA
14:30-17:20
03.11.2017.CUMA
14:30-17:20
6
08.11.2017.ÇRŞ
9:30-11:20
08.11.2017.ÇRŞ
13:30-15:20
7
20.11.2017.PZT
13:30-15:20
22.11.2017.ÇRŞ
13:30-15:20
8
27.11.2017.PZT
8:30-10:20
24.11.2017.CUMA
13:30-15:20
9
02.01.2018.SALI
10:30-12:20
02.01.2018.SALI
8:30-9:20
10
05.01.2018.CUMA
13:30-15:20
05.01.2018.CUMA
10:30-11:20
11
08.01.2018.PZT
13:30-15:20
09.01.2018.SALI
9:30-11:20
12
11.01.2018.PRŞ
8:30-10:20
11.01.2018.PRŞ
10:30-12:20
15.01.2018.ÇRŞ
13:30-15:20
15.01.2018.ÇRŞ
13:30-15:20
19.01.2018.CUMA
8:30-12:20
19.01.2018.CUMA
8:30-12:20
PRATİK
SINAV
TEORİK
SINAV
PRATİK
SINAV
TEORİK
SINAV
viii
PRATİK 1:
HASTA HİKAYESİ ALIMI VE DNA İZOLASYONU
A) DENEYİN AMACI:
Genetik temelli bir hastalık için klinik ön tanı ile başvuran hastadan bireysel ve
ailesel öykü almak ve periferal kandan genomik DNA izolasyonu gerçekleştirerek,
izole edilen DNA’yı agaroz jelde görüntülemek.
B) GEREKLİ MALZEMELER:
1. K3-EDTA’lı tüp
2. Genomik DNA izolasyon kiti
3. Mikropipet ve steril pipet uçları
4. Steril, DNaz içermeyen 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri
5. Mikrosantrifüj
6. Su banyosu (55°C)
7. Etanol (%96-100)
C) GENEL BİLGİLER:
Hasta hikayesi (anamnez), bir sağlık sorunu için başvuran hastanın kendisinden
veya sağlık kurumuna başvuran kişiden bireysel veya ailesel bilgi alınmasıdır.
Anamnez alırken, mevcut sorunun ve geçmiş hikayenin sorgulanmasına, varsa ön
tanının belirtilmesine dikkat edilmelidir. Hasta bilgileri ve klinik ön tanı, hastaya
uygulanan genetik testin seçimi ve uygulanan genetik testin sonucunun
yorumlanması ve genetik danışma verilmesi açısından önemlidir.
Son yıllarda hızla gelişmekte olan ve birçok hastalığın tanısında yararlanılan
moleküler genetik tekniklerin ilk aşaması, genomik DNA izolasyonudur. Kan
örneği almak ve kandan DNA izole etmek nispeten kolay olduğu için, genelde
periferal kan hücrelerinden DNA izolasyonu tercih edilmektedir. Bunun dışında
başka doku ya da hücrelerden de DNA izolasyonu yapmak mümkündür. Örneğin;
fibroblast, saç, kıl, kemik iliği, amniyosentez materyali, koryonik villus dokusu
gibi materyaller de kullanılmaktadır.
Periferik kandan genomik DNA elde etmek için kullanılan teknik dört aşamalıdır.
Birinci aşama; kanda sayısal olarak fazla bulunan ve çekirdek içermeyen
1
eritrositlerin parçalanarak ortamdan uzaklaştırılmasıdır. İkinci aşama; çekirdekli
lökositlerin parçalanması ve hücre içindeki proteinlerin sindirilmesidir. DNA,
nükleus içerisinde kromozomlar halinde sıkı paketlenmiş (Şekil 1) olarak
bulunduğu için, bu aşamada nüklear membran ve plazma membranı parçalanır,
kromozom paketi açılarak DNA’nın açığa çıkması sağlanır. Üçüncü aşama;
sindirilen membran, protein ve diğer hücre parçalarının uzaklaştırılması ve
DNA’nın alkol ile çöktürülmesidir. Dördüncü aşama ise, elde edilen DNA’nın
uygun bir solüsyon içerisinde (steril distile su, Tris-EDTA tamponu) çözülerek
saklanmasıdır. DNA, kısa süre içinde bir genetik testte kullanılacak ise +40C’de,
uzun süre saklanacak ise –200C’de veya –80 0C’de saklanmaktadır. Bu teknik
kullanılarak 10 ml periferik kan örneğinden yapılan DNA izolasyonu sonrasında
yaklaşık olarak 600 mikrogram DNA elde edilebilmektedir.
Şekil 1. Hücre, kromozomlar ve DNA
2
Genomik DNA izolasyonu yukarıda anlatıldığı gibi geleneksel yöntemlerle
yapılabildiği gibi, ticari olarak satılan “Genomik DNA İzolasyon Kiti”
kullanılarak da yapılabilmektedir. Genomik DNA izolasyon kiti, hızlı ve verimli
bir şekilde DNA izolasyonu yapılabilmesi için dizayn edilmiş ürünlerdir. Kit
kullanılarak çok az miktarlardaki biyolojik örneklerden yüksek miktarda ve
yüksek saflıkta DNA elde edilebilmektedir (Tablo 1).
Tablo 1. Genomik DNA izolasyon kiti kullanılarak DNA izolasyonu yapılabilen
örnekler ve miktarları
Kullanılacak örnek
Memeli hücresi ya da memeli
Kullanılacak örnek miktarı
5x106 hücre, ≤25 mg doku (dalak dokusu için
dokusu
≤10 mg)
Kan
Bakteri
≤200 µl
≤2 × 109 hücre
Maya
≤5 × 107 hücre
Buccal swab
Ağız içi mukozasına ucu pamuklu bir çubuğun
(swab) sürülmesi yoluyla alınan doku örneği
Parafine gömülmüş doku kesiti
1-8 doku kesiti (2-15 µm kalınlıkta, 20-50
mm2’lik yüzey alanı olan)
Tükürük
≤4 ml
Kağıt üzerindeki kan damlası
2–5 parça (2–3 mm büyüklüğe sahip)
Piyasada farklı firmalara ait birçok genomik DNA izolasyon kiti satılmaktadır. Bu
genomik DNA izolasyon kitlerinin uygulanış yöntemlerinde ufak farklılıklar olsa
da (kullanılacak solüsyon miktarı, santrifüj hızı ya da santrifüj süresi gibi),
temelde tüm kitler aynı “spin-kolon temelli santrifügasyon” prosedürünü
kullanmaktadır (Şekil 2, Tablo 2). Bu prosedüre göre öncelikle DNA’nın elde
edileceği hücreler sindirilerek “hücre lizatı” hazırlanır. Hazırlanan lizat kolondan
geçirilir ve DNA’nın kolona bağlanması sağlanırken, istenmeyen moleküller
yıkanarak kolondan uzaklaştırılır. En son olarak genomik DNA kolondan ayrılır
(elüe edilir) ve temiz bir tüpte toplanır.
3
Örnek üzerine Sindirim tamponu ve Proteinaz K
eklenerek hücre lizatının hazırlanması
Hücre lizatı üzerine Bağlama
Tamponu ve Etanolün eklenmesi
Hazırlanan karışımın kolondan
geçirilmesi
Yıkama Tamponu ile kolonun
yıkanması
Yıkama Tamponu ile kolonun
tekrar yıkanması
Ayrıştırma Tamponu ile DNA’nın
kolondan ayrılması
Şekil 2. Spin-kolon prensipli DNA izolasyon yöntemi
4
Tablo 2. Genel olarak genomik DNA İzolasyon Kiti’nin içinde yer alan
malzemeler
İçerik
Proteinaz K (20
Kullanım Amacı
Hücre sindirimi ve protein degredasyonu yapar.
mg/ml)
RNaz A (20 mg/ml)
RNA moleküllerini sindirir.
Sindirme Tamponu
Hücrelerin sindirimi sırasında protein degredasyonu yapar
(Digestion Buffer)
ve Proteinaz K enziminin aktivitesini artırmaya yardımcı
olur.
Bağlama Tamponu
Açığa çıkan DNA moleküllerinin silika membrana
(Binding Buffer)
bağlanmasını sağlar.
Yıkama Tamponu
Kolona bağlanmış olan DNA’yı kolondan ayırmadan,
(Wash Buffer)
diğer moleküllerin uzaklaştırılmasını sağlar.
Ayrıştırma Tamponu
Kolona bağlanmış olan DNA’yı kolondan ayırır. İçeriği;
(Elution Buffer)
10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 mM EDTA.
Spin kolon
DNA moleküllerinin bağlanabileceği silika membran
yapısına sahiptir.
Toplama tüpleri
Santrifüj sonrası kolondan süzülen sıvının toplanması için
kullanılır.
D) DENEYİN YAPILIŞI:
I. Aşama: Örnek hazırlama ve ön işlemler
DNA’nın elde edileceği biyolojik materyal temiz bir mikrosantrifüj tüpüne alınır ve
üzerine Sindirim Tamponu ve Proteinaz K eklenerek karıştırılır. Proteinaz K enziminin
aktivitesinin artması ve etkin bir şekilde protein degredasyonu yapabilmesi için karışım
kullanılan kitin protokolüne göre 55-700C sıcaklık aralığında 10-15 dakika süreyle
bekletilir. Elde edilen hücre lizatına RNaz A eklenerek oda sıcaklığında 2-5 dakika
tutulur. Daha sonra hücre lizatının üzerine Bağlama Tamponu ve Etanol (%96 ya da
%100) eklenerek ikinci aşamaya geçilir.
5
II. Aşama: DNA’nın kolona bağlanması
Kitin içerisinden çıkan kolon, toplama tüpünün içine yerleştirilir. Kolonun içine
bir önceki aşamada hazırlanan hücre lizatı eklenir ve 10.000 rpm hızda 1 dakika
santrifüj edilir. Bağlama Tamponu ve Etanol sayesinde hücre lizatı içinde bulunan
DNA, kolonun içindeki silika yapılı membrana bağlanır ve geri kalan sıvı
kolondan süzülerek alttaki toplama tüpünde toplanır. Santrifüj sonrası altta
toplanan bu sıvı atılır ve kolon temiz bir toplama tüpünün içine yerleştirilir.
III. Aşama: DNA’nın yıkanması
Kolonun içine Yıkama Tamponu eklenir ve 10.000 rpm hızda 1 dakika santrifüj
edilir. Böylece kolona bağlanmış olan DNA, diğer hücre parçalarından temizlenir.
Kolondan süzülerek altta toplanan sıvı atılır ve kolon temiz bir tüpe alınarak tekrar
yıkama işlemi yapılır.
IV. Aşama: DNA’nın toplanması
Kolon temiz bir tüpe alınır ve üzerine Ayrıştırma Tamponu (10 mM Tris-HCl, pH
9.0, 0.1 mM EDTA) eklenerek 1 dakika oda sıcaklığında tutulur ve en yüksek
devirde santrifüj edilir. Bu tampon sayesinde kolona bağlanmış olan DNA’nın
kolondan ayrılması sağlanır ve DNA kolondan süzülerek alttaki tüpte toplanır.
Elde edilen DNA kısa süreliğine +4°C’de, uzun süreliğine –20°C’de saklanabilir
ve daha sonraki deneylerde (elektroforez, RFLP, PZR, DNA dizi analizi vs.)
kullanılır.
Elde edilen DNA miktarının hesaplanması
DNA izolasyonu sonrasında elde edilen DNA’nın miktarı spektrofotometre cihazı
kullanılarak belirlenir. Bunun için DNA’nın 260 nm dalga boyundaki UV
absorbansı ölçülür ve aşağıda verilen formül ile DNA miktarı hesaplanır.
DNA (µg/ml) = A260 × 50 × sulandırma faktörü
= ?
A260/A280 = 1.8
= ?
6
Farklı örneklerde genomik DNA izolasyon kiti ile elde edilen yaklaşık DNA miktarları
Tablo 3’de verilmektedir.
Kullanılan Örnek
Kullanılan Örnek
Elde Edilen DNA
Miktarı
Miktarı
E.coli hücresi
2 × 109
10–30 µg
HeLa hücresi
5 × 106
20–40 µg
Kan
200 µl
3–10 µg
Fare karaciğer dokusu
25 mg
10–30 µg
Fare dalak dokusu
10 mg
10–40 µg
Tablo 3. Farklı örneklerde genomik DNA izolasyon kiti ile elde edilen yaklaşık DNA
miktarları
7
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz
8
PRATİK 2:
PZR UYGULAMALARI
RAPORLANDIRILMASI
VE
PZR
İLE
TANISI
KONAN
HASTALIKLARIN
A. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) (Polymerase Chain Reaction - PCR)
Polimeraz zincir reaksiyonu
(PZR); deneysel
ortamda çoğaltılmak
istenilen
herhangi bir DNA bölgesinin, çoğaltılmak istenilen bölgeye uygun olarak
hazırlanan oligonükleotid primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik tekrarlayan
reaksiyonlarla kopyalarının sentezlenmesine dayanan bir yöntemdir.PZR prensip
olarak, çift iplikli bir DNA’nın çoğaltılmak istenilen bölgenin her iki zincirine özgün
olarak düzenlenen iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına
dayanır. Öncelikle kalıp DNA molekülleri yüksek sıcaklıkta denatüre edilerek
tamamlayıcı kalıp DNA’nın iki zincirinin birbirinden ayrılması sağlanır. Sonra
primerlerin
tek
iplikli
DNA
molekülleri
üzerinde
kendilerine
tamamlayıcı
(komplementer) olan bölgelerle, primerlere özgün olarak belirlenen sıcaklıklarda
birleşmesi sağlanır. Primerlerin komplementer DNA dizilerine bağlanmasından sonra
DNA polimeraz enzimi, uygun tampon, MgCl2 ve dört çeşit deoksiribonükleotit
trifosfat (dNTP) varlığında, primerlerin serbest 3’OH uçlarından uygun sıcaklık
koşullarında uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni
DNA molekülü sentezlenmiş olur. Çoklu ısısal döngü ile aynı şekilde çok sayıda
kopya sentezlenmesi sağlanmış olur (Şekil 1).
Kopya Ürün
Döng
Sayısı (2n)
ü
Sayısı
0
1
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
7
128
8
256
9
512
10
1.024
20
1.048.576
30
1.073.741.824
Şekil 1. Polimeraz Zincir Reaksiyonunun basamakları.
9
PZR’ın temel bileşenleri:
a. Kalıp DNA olarak kullanılan ana DNA molekülü
b. DNA polimeraz enzimi
c. Primerler
d. dNTP
e. PZR Tamponu
f. MgCl2
a- Kalıp DNA: İlgili geni çoğaltılmak istenilen canlıdan elde edilen DNA
örneğidir.
b- DNA Polimeraz: DNA’nın çoğaltılması işleminde kullanılan ve primerlerin
3’OH gruplarına ortamda bulunan serbest dNTP’leri ekleyen enzimdir. PZR
reaksiyonu ısıya dayalı döngülerden oluşan bir enzimatik reaksiyon olduğu
için doğada yüksek ısıda yaşamına devam edebilen (termofil) bakterilerden
elde edilen enzimlerdir. Örneğin bir termofil bakteri olan Thermus
aquaticus’dan izole edilen ve yüksek sıcaklıklarda çalışabilen Taq DNA
polimeraz enzimi en sık kullanılan DNA polimeraz enzimlerinden biridir.
Bu enzim DNA’nın denatürayon sıcaklığı olan yüksek ısılarda (95˚C)
aktivitesini koruyabilmektedir. Standart bir reaksiyon için 1-2,5 ünite enzim
kullanılır. Enzimin standart aktivitesi, her bağlandığı primerin 3’OH ucuna
ortamda serbest bulunan dNTP’lerden dakikada ortalama 1000 baz ilavesidir.
c- Primerler: DNA’nın çoğaltılması için, kalıp DNA’ya komplementer
( tamamen
tamamlayıcı) olan primerlere gereksinim vardır. Primerler
laboratuvar ortamında yapay olarak sentezlenen dNTP’lerden oluşan nispeten
kısa zincirli, uzama işlemi için gerekli serbest 3`OH ucuna sahip DNA
molekülleridir ve ortalama 15-30 nükleotit uzunluğundadırlar.
Primer Tasarımı: Primer tasarımı yaparken çoğaltılması istenen DNA dizisi
üzerindeki spesifik bölgelerden yararlanılır. Bu bölgelere komplementer olan
primerler
dizayn
edilir.
Sentezlenen
primer
dizisinin
genomda
başka
bağlanabileceği bölgeler olup olmadığını da kontrol etmek gerekir. İstatiksel
olarak bir primerin ikinci bir benzer bağlanma bölgesinin olması çok düşük bir
olasılıktır. Ancak bu olasılık benzer yapıda protein veya tekrarlayan bölgelerin
varlığı sebebiyle beklenenden yüksek olabilmektedir.
10
Tasarım yapılırken mümkün olduğunca 4 bazın eşit sayıda kullanımına dikkat
edilmelidir. Primerlerin baz dizilenmesinde; Guanin, Sitozin (GC) miktarı ve
primerlerin yapışması için gerekli sıcaklık miktarı (Tm) arasında çok iyi bir
denge
kurmak
gerekir.
Bu
dengenin
sağlanamadığı
durumda
PZR
uygulamalarından başarı beklemek mümkün olmamaktadır. Tasarlanan primerin
son 4-7 bazının G veya C içeriğinin fazla olması özgün bağlanma olasılığını
arttırır.
Primer konsantrasyonunun 0,1-0,5 µM arasında olması sistemin iyi çalışması
için gereklidir. Yüksek primer konsantrasyonu primerlerin yanlış bağlanmasına ve
özgün olmayan DNA bantlarının üretilmesine sebep olur. Ayrıca primer-dimer
oluşumunu teşvik ederek elde edilecek ürünün az olmasına sebep olmaktadır.
d- dNTP (deoksiribonükleotit trifosfat) karışımı: Yüksek saflıkta ticari olarak
tek tek veya karışım halinde sağlanan dATP, dGTP, dTTP ve dCTP
molekülleridir. Normal koşullarda PZR 100-200 µM dNTP konsantrasyonu ile
gerçekleştirilir.
Optimal dNTP konsantrasyonu: MgCl2 konsantrasyonuna, reaksiyon koşullarına,
primer konsantrasyonuna, çoğaltılacak ürünün boyuna, PZR döngü sayısına
bağlıdır.
e- Tamponlar ve MgCl2: Enzime (DNA polimeraz) özgü tamponlar kullanılır
(Genellikle KCl ve Tris HCl içeren tamponlar). Çoğunlukla satın alınan
enzimle
birlikte
10X
konsantrasyonda
sağlanabilmektedir.
PZR
uygulamalarında genel olarak 10-50 mM arasında Tris-HCl tampon çözeltisi
(pH 8.3-8.8) kullanılır.
MgCl2’ün PZR’nun verimi üzerine etkisi: Mg+2 iyonları dNTP’ler ile
çözünebilir kompleksler oluşturur, polimeraz aktivitesini stimüle ederler ve
primer-kalıp etkileşimi sağlarlar.
Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu 1.0-3.0 mM arasındadır. Düşük
MgCl2
konsantrasyonu,
ürün
oluşumunda
azalmaya,
yüksek
MgCl2
konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. MgCl2 içeren
tamponlar kullanılıyorsa ayrıca MgCl2 kullanıma gerek yoktur.
11
PZR cihazları (Thermal Cycler)
PZR farklı sıcaklık derecelerini istenilen sürelerde otomatik olarak ayarlayabilen
özel aletlerde gerçekleştirilir. PZR cihazlarında, DNA’nın çoğaltılması tekrarlayan
ısısal döngü uygulanarak gerçekleşir (Şekil 2).
Şekil 2. PZR cihazı (Thermal cycler)
PZR Döngüleri:
İlk Denatürasyon
95oC
1- Denatürasyon
95oC
2- Primerlerin bağlanması
5-15 dakika
1-2 dakika
o
50-70 C
o
1-2 dakika
3- Zincirin uzaması
72 C
1-2 dakika
S o n Zincir Uzaması
72oC
7-10 dakika
20 - 45 döngü
1,2 ve 3 basamaklar 20 – 45 defa tekrarlayan döngüler şeklinde gerçekleştirilir.
Son zincir uzaması 72oC 7-10 dakika’dır ve eksik kalan olası boşlukların DNA
Polimeraz
enzimi
tarafından
doldurulmasına
12
olanak
sağlar.
Çoğaltılmış ürünlerin görüntülenmesi ve doğrulanması için çeşitli yöntemler
kullanılabilir. En sık kullanılanı agaroz jel elektroforezidir. Böylece çoğaltılmış
ürünün boyutu belirlenebilir.
PZR yönteminde çok küçük DNA miktarları bile çoğaltma (amplifikasyon)
için yeterli olduğundan, örnek hazırlanması sırasında yanlışlıkla karışabilen
yabancı DNA’dan dolayı (kontaminasyon) birçok yanlış DNA bandının elde
edilmesi mümkündür. Bu kontaminasyon pipetleme ve PZR örneklerinin
eklenmesi esnasında meydana gelebilir. Bu sebeple çalışırken çok dikkatli ve
özenli olmak gerekir.
PZR’de kontaminasyondan korunmak için alınabilecek çeşitli önlemler:
PZR çalışması, steril kabinde veya özel bir laboratuvarda yapılmalıdır.
Kullanılacak malzeme ve materyallerin, çözeltilerin steril edilmeleri ve steril
malzemelerin kullanılması gerekir. Araştırıcılar, kontaminasyonu engellemek
amacı ile eldiven, önlük, koruyucu gözlük vb kullanmalıdır.
PZR Optimizasyonu: PZR teknolojisinin gelişmesiyle çok farklı PZR
uygulamaları da ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, yeni başlatılacak bir PZR
uygulamasının düzenli ve başarılı bir şekilde çalışması için her laboratuarda
yeniden ayarlanması gerekmektedir. Eğer PZR şartları yeni PZR uygulaması
için
uygun
bir
şekilde
yeniden
ayarlanmazsa
bazı
problemlerle
karşılaşılabilmektedir.
Örneğin;
A) PZR’den beklenen miktarda ürün elde edilemeyebilir veya hiç ürün elde
edilemeyebilir.
B) Primerlerin yanlış bağlanmasından dolayı istenmeyen yanlış DNA bölgeleri
çoğaltılabilir.
C) Primer-dimer oluşumu ortaya çıkabilir ve bu oluşumlar çoğaltma işlemini
yavaşlatır.
13
ÖRNEK PZR YAPILIŞI
GEREKLİ MALZEMELER;

PZR Kimyasalları

Pipetler ve Pipet uçları (1 µl, 20 µl, 200 µl)

200 µl’lik PZR tüpü

Thermal Cycler
Hedef gen: Ailesel Akdeniz Ateşi (FMF) hastalığına sebep olan MEFV Genine
AMAÇ: Deney amacımız MEFV geninin 10 numaralı ekzonunun PZR ile çoğaltılması.
BASAMAKLAR
1- Ailesel Akdeniz Ateşi (FMF) hastalığına sebep olan MEFV Genine ait baz
dizisinin elde edilmesi.
Gene ait bilgiler internette bulunan çeşitli veri tabanlarından elde edilebilir. Burada
kullanılan gene ait genel bilgiler www.ensembl.org adresinden alınmıştır. Benzer bilgiler
UCSC, NIH gibi çeşitli biyoinformatik içerikli web sayfalarından elde edilebilir. Gerekli
bilgi internet üzerinden sürekli yenilenmekte ve gerekli değişiklikler yapılmaktadır. Bu
sebeple sürekli değişen verilerin varlığı, verinin büyüklüğü ve çeşitliliği de dikkate
alınarak çevrimiçi olarak ve ücretsiz sunulmaktadır.
14
2- MEFV Geni Ekzon 10 bölgesine uygun primerler hazırlanması.
Bu amaçla çeşitli internet sayfaları veya bu amaçla hazırlanmış programlar kullanılabilir.
İnternette bulunan program ile (http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html) uygun primerler
dizayn edilerek sentezi sağlanır.
CCTTAGCTCT CAGGCCCAGT GGCCTGTTTG CTTCCTCACT GGATGGAAGT
CGGGGGAGGA CAAGCTAGGA AGTGGGCAGA GTCTAACTGA GAACTCGCAC
ATCTCAGGCA AGGGCTGTGT CCGCTGTGCT TTGTGATACC TCTGTGTAAG
MEFV Geni İleri Primeri
CAACTTGGGT TTGCCATTCA GGGGGTTTTT
GGCCACCAGA CACGGCTGCG AGTCCCCGCT
CCAGTTGACG GTACCTGTGT GCGTGATTCC
TTCTGGGCAC CCCCAGGCCT CAGGCAGCCG
GCCAGGACTC CCATGAAAGG AAGAGCCCGG
CTGCCACAGT GTAAGCGCCA CCTGAAGCAG
GGATCACGAT GAGCCCATCT GCCTCATCTG
AAGGCCACCG GGTGCGCCCC ATTGAGGAGG
GGCACTCCCT GCCTGTGGGC TCTTCTCTGC
GCCTTACTTC
ATTCTTGGGC
AGGGGAGCTA
AGGTATGGCT
CCTTTGGCAA
ATTTTCCCAA
TGGAAATGGC
CAGGTTTATG
GAATCCAGAG
TTCAGCCATT
CAACTCTGGG
AAGAACACAA
TTGCTCAGAG
GCTCAGAGGA
CCTCCCTCCT
CCACTGCATG TCCCCAGGAA
GCCACGCCCA GGAAGGAGAC
TGCAGCTTCC CCGAGGCAGT
CTCACCTGGC TGCCCCCGGT
GAAGCCTAAG CCCCCAGCCC
GTCCAGCTGC TCTTCTGTGA
CAGTCTGAGT CAGGAGCACC
TCGCCCTGGA ACACAAGGTA
CAGGCACTTG GACACACTGG
MEFV geni Geri Primeri
TTGTTGGTGC
TATAAACCAG
ATCCAGGGGG
AGTGCCTCTC
CTTTCCTGAG
15
ATTAACCAGC
TCCAGCAAAG
AGCTGGCTTC
AGCTCTGCTG
CACCCCTCCC
450 baz
3- MEFV geni için PZR Kimyasal Protokolü:
PZR’da kullanılan malzemeler ve miktarları, kullanıma hazır ticari KİT’ler halinde veya
aşağıdaki örnekte olduğu gibi hazırlanabilmektedir.
1 örnek için kullanılacak miktar Son Konsantrasyon
10 x PZR Buffer
2.5 µl
1X
25mM MgCl2
2.0 µl
2.0 mM
dNTP karışımı
0.5 µl
200 µM
İleri Primer (10 uM)
1 µl
100 nM
Geri Primer (10 uM)
1 µl
100 nM
Taq Polimeraz (5U/ul)
0.2 µl
dH2O
16.8 µl
1U
DNA (50-100 ng/ul)
1 µl
--------------------------------------------------------------------------------------------------Toplam Miktar
25 µl
16
PZR ISISAL DÖNGÜ
950C 2 Dakika
950C 30 Saniye
580C 45 Saniye
35 döngü
720C 1 Dakika
720C 7 Dakika
+40C ∞
Şekil: MEFV geni için uygulanan PZR ısısal döngüsü örneği.
17
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
18
PRATİK 3:
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ
Elektroforez
Elektroforez, ortamın pH değerine göre (+) veya (-) olarak yüklenen biyomoleküllerin
bir elektrik alanının etkisiyle hareket etmesini sağlayan bir tekniktir. Bu yöntemde
biyomoleküllerin birbirinden ayrılması taşıdıkları elektriksel yüke, büyüklüklerine ve diğer
fiziksel özelliklerine göre gerçekleşir.
Birçok önemli biyolojik molekül (örn. aminoasitler, peptitler, proteinler, nükleotidler
ve nükleik asitler) iyonlaşabilen gruplara sahiptir ve tampon çözeltisinde elektriksel olarak
yüklü halde bulunurlar. Moleküllerin hareket etmesini sağlayan gücü jelin her iki tarafında
bulunan aktif elektrotlar sağlar. Net yükün özelliğine bağlı olarak, yüklü partiküller katoda
veya anoda doğru hareket eder. Elektriksel alanda pozitif yüklü moleküller (katyonlar)
katoda, negatif yüklü moleküller (anyonlar) ise anoda doğru ilerler (Şekil 1).
Şekil 1. Agaroz Jel Elektroforezi
Yüklü moleküllerin sabit voltajdaki hareketi, sadece yük ve sürtünmeye bağlı olarak
gerçekleşir. Jelde yürüyen lineer DNA parçaları veya küresel proteinler gibi benzer
konformasyonlardaki bileşiklere etkiyen yer çekimi kuvveti aynı olduğundan, bu moleküller
için yük ve kütle ayırt edici özelliklerdir. Elektrik alanı altında jelin porlarında hareket etmeye
zorlanan makromoleküllerin hareket oranları şu faktörlere bağlıdır:
19

Alanın gücü

Ortamın por büyüklüğü

Moleküllerin büyüklüğü ve şekli

Örneklerin göreceli hidrofobisitesi

Kullanılan tamponun iyonik kuvveti ve sıcaklığı.
Elektroforezin kullanım alanları arasında aşağıdakiler sıralanabilir:

İzolasyon işleminin başarılı olduğunun teyit edilmesi

Saflık kontrolü

Molekül kütlesinin belirlenmesi

Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalıkların moleküler tanısı
Günümüzde; yürütülecek örneğe ve amaca yönelik olarak yaygın olarak
kullanılan elektroforez çeşitleri aşağıda listelenmiştir:
1. Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz jel elektroforezi, genellikle nükleik asit moleküllerinin ayrımı,
tanımlanması ve saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan standart bir yöntemdir.
1.1. Agaroz
Agaroz, bir deniz yosunu türünden elde edilen, oda sıcaklığında jel halde
bulunan ve nükleik asitlerin geçebileceği büyüklükte porları olan kolloidal bir
polisakkarittir Toz formundadır. Agarozdan elde edilen jelin yapısındaki porlu ortam,
elektroforez sırasında bir nevi “moleküler elek” görevi görür; yüklenen örnekler,
kullanılan agarozun konsantrasyonuna bağlı olarak jel içinde farklı hızlarda hareket
eder. Nükleik asitlerin agaroz jelde ayrımı için genel olarak kullanılan agaroz
konsantrasyonları %0,3 ile %3 arasında değişir.
1.2. Yürütme tamponu
Belirli büyüklükteki bir DNA parçasının agaroz jeldeki elektroforetik
hareketliliği elektroforez tamponunun kompozisyonuna, iyonik gücüne ve agaroz
konsantrasyonuna göre değişir. Yaygın olarak kullanılan elektroforez tamponları TBE
(Tris-Borat-EDTA), TAE (Tris-Asetat-EDTA) ve TPE (Tris-Fosfat- EDTA)
solüsyonlarıdır ve genellikle konsantre solüsyonlar olarak hazırlanıp, oda sıcaklığında
20
saklanır. Bu tamponlar hem ortamın pH değerini stabil tutar, hem de içerdiği iyonlarla
iletkenliği sağlar. Farklı konsantrasyonlarda hazırlanan agaroz ve/veya tampon
solüsyonlar sayesinde 20 ila 50.000 baz çifti arasındaki büyüklüklere sahip DNA
parçalarını ayırmak mümkündür.
1.3. Marker DNA ve Uygulanan Elektrik Gücü
Elektroforez için belirli konsantrasyonda hazırlanan jelin kuyucuklarına
yüklenerek, belirli bir voltaj altında yürütülen örneklerin hareketi, yüklenen materyalin
molekül ağırlığına bağlıdır. Elektroforez sonunda elde edilen bantların molekül
ağırlıklarının
gözlenebilmesi
için,
jele
bir
‘marker’
(belirteç;
standart),
yüklenmelidir. Marker bir çeşit ölçüttür ve belirli sayıda, ağırlığı bilinen DNA
fragmentlerini içerir. Bu da elektroforez sonrasında, yüklenen örneğin hangi moleküler
ağırlıkta olduğunu görebilmemizi sağlar (Şekil 2). Marker genellikle jelin en sağ
ve/veya en sol yanındaki kuyucuklara yüklenir.
M S S S
Şekil 2. Agaroz jel elektroforezinde örneklerin ve marker’ın yürütmeden sonraki bant
görüntüleri (M=Marker, S= Jele yüklenen DNA örneği).
1.4. Yükleme tamponu
Elektroforeze tabi tutulacak örnekler, kuyucuklara yüklenmeden önce
genellikle su, sükroz/gliserol ve boyadan (örneğin ksilen siyanol, bromofenol mavi,
21
bromokresol yeşil vb.) oluşan bir ‘yükleme tamponu’ ile karıştırılır, daha sonra
kuyucuklara yüklenir. Yükleme tamponunun üç görevi vardır:
-
yüklenen örneğin yoğunluğunu arttırarak DNA’nın kuyuya eşit bir şekilde
çökmesini sağlamak,
-
yüklenen örneği renklendirerek yükleme işlemini basitleştirmek,
-
elektrik alanında belirli bir hızda hareket eden örneğin bu hareketini çıplak
gözle takip edebilmek.
1.5. Görüntüleme
Yürütülen
örneklerin
büyüklüğünün
ultraviyole
(UV)
ışık
veren
transilluminatör altında görüntülenebilmesi için, bu örneklerin Etidyum Bromür
(EtBr) ile hazırlanmış agaroz jel elektroforezine tabi tutulması gerekmektedir. (Şekil
3). EtBr, DNA’ya interkalasyon ile bağlanan ve UV altında floresan sinyal veren
katyonik ve mutajenik bir ajandır. İnterkalasyon, bir molekülün iki molekül (veya
grubun) arasına geri dönüşümlü şekilde yerleşmesidir. EtBr, DNA çift zincirinin
kısmen açılması ile bazların arasında aralanan bölgeye girerek DNA’ya bağlanır.
Şekil 3. Agaroz Jel Elektroforezi Aşamaları.
NOT !!!
Etidyum Bromür, güçlü bir mutajen/karsinojendir ve toksiktir. Etidyum Bromür
içeren jellere ve solüsyonlarla çalışırken mutlaka eldiven giyilmelidir.
22
2. Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
Elektroforez çeşitleri arasında yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem ise
Poliakrilamid Jel Elekteroforezi (PAGE)’ dir. Genellikle proteinlerin saflık kontrolü, molekül
ağırlıklarının
saptanması
ve
konsantrasyon
çeşitliliğinin
belirlenmesi
amacıyla
kullanılmaktadır. Ancak DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir.
Poliakrilamid jelin hazırlanmasında, sentetik bir madde olan akrilamid ile akrilamid
türevi olan N-N’-metilen bisakrilamid kullanılır. Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri jel
oluşumu sırasında polimerleşir. Bu reaksiyonda akrilamid molekülleri yan yana bağlanarak
düz zincirler oluştururken, bisakrilamid molekülleri iki akrilamid zinciri arasında çapraz
bağlanmalar oluştururur. Böylece ağımsı ve porlar içeren bir yapı meydana gelir. Akrilamid
miktarı ve akrilamid/bisakrilamid oranı ile molekül boyutu aralığı, jelin ayrıştırma
kapasitesini belirler. Düşük konsantrasyonda hazırlanan poliakrilamid jeller daha büyük
porlara sahiptir; dolayısıyla yüksek molekül ağırlığa sahip biyolojik moleküllerin analizi için
uygundur. Yüksek konsantrasyonlarda ise küçük porlar oluşur ve düşük molekül ağırlıklı
örneklerin ayrılmasında kullanılır (Şekil 4).
Şekil 4. Poliakrilamid jel elektroforezinde oluşan porlar ve moleküllerin hareketi.
3. Değişken Alanlı (Pulsed Field) Jel Elektroforezi (PFGE)
Değişken Alanlı Jel Elektroforezi (PFGE), büyük moleküllerin agaroz jelde
elektroforetik ayrıştırılması için geliştirilmiş bir yöntemdir. Bu yöntemde jele vuruşlu, dalgalı
ve dikey elektrik alanları uygulanır. Uygulanan akımın yönü belli aralıklarla değişir; böylece
moleküller yön değiştirerek daha kolay hareket ederler ve molekül ağırlıklarına göre
ayrışırlar. Küçük moleküller, uygulanan elektriksel alandaki değişikliklere daha çabuk uyum
sağlarlar, dolayısıyla daha hızlı hareket ederler. Geleneksel agaroz jel elektroforezinde, jelde
yürüme hızları hemen hemen aynı olan 20 kb’ den büyük DNA fragmentlerinin ayrıştırılması
güçtür. PFGE yöntemi ile, 20 kb ile 10 mb arasındaki DNA fragmentleri rahatlıkla
ayrıştırılabilir. Dolayısıyla, kromozomları jelde ayrı ayrı görebilmek mümkündür.
23
4. Kapiller (Kılcal) Elektroforez
Kapiller elektroforez, yüksek ayrım gücüne sahip elektroforez tekniklerindendir.
Küçük çaplı (25-75 µm) silika borular aracılığıyla gerçekleştirilir. Temel elektroforez
mantığına dayalı olarak çalışır, ancak farklı ekipman gerektirir. Geleneksel elektroforeze
kıyasla, analiz süresi daha kısadır, ayrım gücü daha fazladır, ve çok daha düşük hacimlerde
malzeme kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Moleküler genetikte sıklıkla kullanılan DNA dizi analizi, günümüzde yaygın olarak
kapiller elektroforez cihazları ile gerçekleştirilir. Örneğin Kistik Fibroz, müsküler distrofiler,
Konjenital Adrenal Hiperplazi gibi hastalıkların tanısında bu yöntemden sıklıkla yararlanılır.
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ DENEYİNİN YAPILIŞI
1.
%1’lik 150 ml agaroz çözeltisi için gerekli miktarda agaroz tartılıp TBE
tamponu kullanılarak bir erlen içerisinde hazırlanır.
2.
Örnek hafif çalkalanıp mikrodalga içerisine konulur ve berrak bir görüntü
oluşana kadar yüksek derecede ısıtılır. Kaynamaya başladıktan sonra
hazırlanan çözelti mikrodalgadan alınır.
3. Hazırlanan agaroz çözeltisinin sıcaklığı 50-60oC’ye gelene kadar erlen girdap
oluşturacak şekilde çalkalanarak soğutulur.
4. Jel, oda ısısına gelerek polimerleşmeden önce uygun miktarda EtBr eklenerek,
EtBr’nin çözeltinin her yerine eşit şekilde dağılması sağlanır.
5. Hazırlanan çözeltinin döküleceği jel tepsisi kasete yerleştirilir ve taraklar
takılır. Uygun sıcaklığa gelen EtBr’li agaroz çözeltisi bir köşeden, baloncuk
oluşturmayacak şekilde ve yavaşça dökülür. NOT: Döküm esnasında mutlaka
eldiven giyilmeli ve maske takılmalıdır !!!
6. Agarozun polimerleşmesi için jel tepsisi oda sıcaklığında 15 dk bekletilir.
7. Polimerleşmeden sonra, kuyuya zarar vermeyecek şekilde taraklar jel
tepsisinden yavaşça çıkarılır ve jel, yürütme tankına yerleştirilir.
8. Tank, jelin üstünü kaplayacak şekilde TBE ile doldurulur. Bu tamponun,
hazırlanan jel içerisindeki tampon ile aynı olmasına dikkat edilmelidir.
9. PCR ürünleri, uygun miktarda yükleme tamponu ile karıştırılır.
10. İlk ve/veya son kuyucukta marker olacak şekilde, yükleme tamponu ile
karıştırılmış örnekler sırasıyla kuyucuklara yüklenir.
11. Yürütme tankının kapağı, katot (siyah kablo) ve anot (kırmızı kablo) uçlarına
dikkat edilerek kapatılır.
24
12. Örnekler, 100-150 V arasında 15-20 dk kadar yürütülür. Örneklerin yürümesi
aralıklarla kontrol edilir.
13. Yürütme
işlemi
tamamlandıktan
sonra
jel,
tanktan
çıkarılır
ve
transillüminatörde görüntüleme gerçekleştirilir.
Yukarıda verilen agaroz jel elektroforezi sonucuna göre DNA bant büyüklüklerini
grubunuzda tartışınız.
25
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
26
PRATİK 4:
RFLP UYGULAMALARI VE RFLP İLE TANISI KONAN HASTALIKLARIN
RAPORLANDIRILMASI
1970’lerden bu yana moleküler genetik alanındaki gelişmeler, DNA analiz ve manipülasyon
tekniklerinin gelişmesi ve iyileştirilmesi ile sağlanmıştır. Bugün bilindiği şekliyle ‘Gen
Teknolojisi’nin bir çok pratik uygulaması mevcut olup hastalıkların teşhis ve tedavisinde yeni
metotlar geliştirilmiştir. Restriksiyon Enzimleri (Restriksiyon endonükleazlar), çift zincirli
DNA’yı özgün dizilerden tanıyıp, bu bölgelerden ya da yakındaki özgün bölgelerden
(restriksiyon bölgeleri) kesen bakteriyel enzimdir. Bu amaçla, çeşitli bakterilerden yaklaşık
400 restriksiyon enzimi türetilmiştir. Bunların isimleri genellikle kaynak organizmaların
isimlerinin kısaltılmış şekilleridir. Örneğin Eschericia coli R faktörü EcoRI enzimi;
Providencia stuarti’den PstI gibi.
Restriksiyon enzim tanıma bölgeleri, 4-8 nükleotid arasında değişebilmektedir. Bu bölgeler,
genelde palindromik (çift sarmalın her iki yönünde aynı okunan) dizilerden oluşmaktadır.
Restriksiyon enzim kesimi, DNA’da küt uç (blunt-end) ya da yapışkan uç (sticky-end)
oluşturabilir. Örnek olarak, küt uç bırakan bir enzimin (SmaI) ve yapışkan uç bırakan bir
enzimin (EcoRI) kesim bölgeleri aşağıda verilmiştir:
SmaI kesim bölgesi:
EcoRI kesim bölgesi:
Restriksiyon Fragman/Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP) analizi, restriksiyon
enzimlerinin sabit dizileri kesmesinden faydalanılarak geliştirilmiş bir tarama yöntemi olup
tıbbi genetik alanında rutin uygulamaları mevcuttur. Tek nükleotid değişimi sonucu gözlenen
hastalıkların tanısında, eğer bu nükleotid bir restriksiyon enziminin tanıma bölgesi içindeyse,
bütün genin dizilenmesi (sekanslanması) yerine RFLP analizi tercih edilebilir. Enzim kesim
bölgesinde, tek bir nükleotid bile mutasyona uğrasa, normalde o bölgeyi kesen enzim, artık
değişmiş olan diziyi kesemez. Dolayısıyla mutant ve yabanıl tip (mutasyona uğramamış)
DNA restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra elektroforezde yürütülünce farklı uzunlukta
bantlar gözlenir.
27
PZR-RFLP adı verilen metotta, öncelikle incelenecek olan gen bölgesi, uygun primerler
kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılır ve restriksiyon enzim kesimine
uygun miktarda DNA kopyası elde edilmiş olur. Ardından restriksiyon enzim kesimi
gerçekleştirilir ve ürünler jel elektroforezi ile yürütülür. Mutasyon taşımadığı (yabanıl tip
olduğu) bilinen bir DNA örneği de enzim kesimine uğratıldıktan sonra jel elektroforezinde
yürütülerek kontrol olarak kullanılmalıdır.
PZR-RFLP yöntemi, Şekil 1’de özetlenmiştir.
Şekil 1: PZR-RFLP yöntemi. PZR-RFLP yöntemi ile, öncelikle bireyden izole edilen DNA
taban olarak kullanılarak, uygun primerlerle sorgulanan gen bölgesi çoğaltılır. Ardından,
RFLP analizinde kullanılacak olan enzimle bu DNA kesilir ve agaroz jelde yürütülür. Elde
edilen bant paternine göre bireyin mutasyon taşıyıp taşımadığı saptanır.
RFLP ile Tanı Konan Bir Hastalık Modeli: Orak Hücreli Anemi
Orak hücreli anemi, eritrositlerin demir bağlamada kullandıkları protein olan hemoglobinin
beta zincirindeki bir mutasyondan kaynaklanır. Hemoglobin beta zincirinin altıncı aminoasidi
yabanıl tipte glutamik asit iken, bu hastalarda valin aminoasidine dönüşür. Bahsedilen
aminoasit değişimi, glutamik asidi kodlayan GAG dizisinin (6.kodon), nokta mutasyonu ile
valin aminoasidini kodlayan GTG’ye dönüşmesi ile oluşur. Glutamik asit proteine polar yan
zincir kazandırırken, bu aminoasit valine dönüştüğünde polar yan zincir kaybolduğu için
28
proteinin polimerleşmesi değişir. Bu mutasyon varlığında oluşan hemoglobin molekülüne
Hemoglobin-S adı verilir. Yabanıl tip hemoglobin bulunduğunda eritrositler basık kürecik
şeklinde iken, hemoglobin-S varlığında eritrositler orak şeklini alır. Şekil 2’de orak hücre
anemisi taşıyan bir hastanın kan yayması verilmiştir.
Şekil 2: Orak hücreli bir hastanın kan yayma görüntüsü. Resim, www.sicklecellanemia.org
sitesinden alıntıdır.
Tek nükleotid değişiminden kaynaklanan bu hastalığın tanısında, dizileme analizi
kullanılabileceği gibi, nispeten daha hesaplı bir yöntem olan RFLP testi de kullanılabilir.
RFLP ile Orak Hücreli Anemi tanısının konması için öncelikle uygun PZR primerleri ile beta
globülin geninin mutasyon içerip içermediği sorgulanan bölgesi çoğaltılmalıdır. Tanı
koyulmasını sağlayabilecek kesim enzimi, DdeI’dir.
DdeI, CTNAG dizisini tanıyıp kesebilir. Yabanıl tip beta globülin allelinde, CTGAG dizisi
bulunmaktadır. Bu dizi, DdeI kesim bölgesi ile uyumludur. Orak hücreli anemiye neden olan
mutasyon sonucunda ise bu dizi CTGTG dizisine dönüşür. Bu diziyi ise DdeI enzimi
kesemez. Genellikle PZR-RFLP analizinde kullanılan primerler ile 233 baz çifti uzunluğunda
fragman elde edilip, DdeI enzimi ile kesildiğinde 55 baz çifti ve 178 baz çifti uzunluğunda
fragmanlar ortaya çıkar (Şekil 3). Şekil 4’de verilen jel görüntüsünde hangi kuyucukların
normal (sağlıklı, homozigot), taşıyıcı (heterozigot) ve orak hücreli anemi hastası (homozigot
HbS) bireylerin PZR-RFLP ürünleri olduğunu belirleyiniz.
29
PZR-RFLP Deneyi İçin Gerekli Malzemeler:
-
200 ng PCR ürünü
-
Steril su
-
DdeI enzimi (su içerisinde ½ seyreltilmiş)
-
10X FastDigest Tamponu
-
Marker, DNA yükleme tamponu
-
2-20µl’lik mikropipetler ve pipet uçları
-
Ependorf tüpleri
-
370C su banyosu
-
Agaroz jel, yürütme tamponu ve yürütme tankı.
Deney Yöntemi
-
PZR ürününden, 200 ng toplam DNA’yı elde etmek için gerekli hacim hesaplanır. Bu
hacime göre, aşağıda hacimi verilen malzemeler de eklendiğinde toplam hacimi 30µl
yapacak steril su miktarı hesaplanır.
Kullanılacak Malzeme
Hacim
Steril su
3µl
10X Tampon
PCR ürünü
Enzim
2µl
Toplam
30µl
Hesaplanan miktarlarda malzeme, belirtilen hacimlerde ependorf tüpüne koyulur. Nazik bir
şekilde karıştırıldıktan sonra, 370C su banyosunda 5-15 dakika bekletilir.
-
Karışım agaroz jele yüklenip, yürütüldükten sonra transillüminatörde gözlemlenir.
30
Şekil 3. PZR ile çoğaltılan beta-globin geninin yabanıl tip (üstte) ve mutant (HbS, altta)
allelde DdeI muamelesi ile ortaya çıkan fragmanlar
Şekil 4. Kutu içerisinde verilen jel görüntüsünde kuyucukların üzerinde boş bırakılan
alanlara, bu kuyucuklara hangi örneğin yüklendiğini yazınız.
31
Ek 1: HBB geni
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
Adı Soyadı:
Kurum:
TC Kimlik No:
Başvuru No:
Doğum Tarihi:
Müracaat Tarihi:
Cinsiyeti:
Gönderen Birim: Yenidoğan Yoğun
Bakım
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Hizmet Adı: Postnatal dönemde HbS’in
Moleküler Analizi
Onaylayan:
HbSYapılan Test: Postnatal dönemde HbS’in moleküler analizi
Kullanılan Yöntem: PZR-RFLP
Sonuç: HBB geni 1.ekzon PCR amplifikasyonu
Yorum: Olgunun gDNA materyali üzerinde yapılan çalışma sonucunda, probandın HBB geninin
1.ekzonunda heterozigot p.Glu 6 Val / N [c.20A>T / +] değişimi gözlenmiştir. Aileye genetik
danışma verilmesi önerilmektedir.
Not: Bu analiz, DNA düzeyinde primerler ile belirlenen alan dışındaki sekonder
anomalileri ekarte etmemektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
32
İmza
Ek 2: HBB geni
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi
(Hastane)
Adı Soyadı:
Kurum:
TC Kimlik No:
Başvuru No:
Doğum Tarihi:
Müracaat Tarihi:
Cinsiyeti:
Gönderen Birim: Yenidoğan Yoğun
Bakım
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Hizmet Adı: Postnatal dönemde HbS’in
Moleküler Analizi
Onaylayan:
HbSYapılan Test: Postnatal dönemde HbS’in moleküler analizi
Kullanılan Yöntem: PZR-RFLP
Sonuç: HBB geni 1.ekzon PCR amplifikasyonu
Yorum: Olgunun gDNA materyali üzerinde yapılan çalışma sonucunda, probandın HBB geninin
1 nolu ekzonunda homozigot p.Glu 6 Val / p.Glu 6 Val değişimi gözlenmiştir. Aileye genetik
danışma verilmesi önerilmektedir.
Not: Bu analiz, DNA düzeyinde primerler ile belirlenen alan dışındaki sekonder
anomalileri ekarte etmemektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
33
İmza
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
34
PRATİK 5:
DNA DİZİ ANALİZİ VE DNA DİZİ ANALİZİ İLE TANISI KONAN
HASTALIKLARIN RAPORLANDIRILMASI
DENEYİN AMACI
DNA dizileme tekniğinin temelinin kavranarak DNA dizi analizi ile tanımlanan
hastalıkların raporlandırılmasının öğrenilmesidir.
PRATİK MALZEMELERİ
1. 200 μl’lik reaksiyon tüpü (ependorf)
2. Pipet
3. Pipet ucu (Tip)
4. Steril su
5. Tek yönlü primer
6. Big Dye Terminator Enzim (Applied Biosystem)
7. Big Dye Terminator Tampon solusyonu (Applied Biosystem)
8. Temizlenmiş PZR örneği (Kalıp DNA)
9. Thermal Cycler
10. DNA dizi analiz cihazı (Applied Biosystem Genetic Analyzer 3130)
GENEL BİLGİ
DNA dizi analizi, DNA molekülündeki nükleotidlerin sırasının belirlenerek DNA
zincirinin okunmasını sağlayan moleküler bir tekniktir.
1953’te Watson ve Crick tarafından DNA molekülünün yapısının ortaya
çıkarılmasından sonra çalışmalar DNA dizisinin analizine yoğunlaşmıştır. Bu
alanda temel gelişimi 1977 yılında birbirlerinden bağımsız olarak çalışan iki bilim
adamı Frederic Sanger “Zincir sonlandırma inhibitörleri ile DNA dizi analizi”
(Sanger metodu) ve Walter Gilbert “Kimyasal degradasyonla DNA dizi analizi”
(Maxam Gilbert metodu) başlıklı yayınlarıyla ortaya koymuşlardır. Her iki teknik
de
elektroforez
sonucu
DNA
fragmentlerinin
35
tek
zincir
düzeyinde
ayrımına dayanmakla beraber bazı farklılıklar göstermektedir.
Sanger’in dizi sonlandırma metodu dideoksi dizileme olarak da adlandırılmaktadır.
Bu teknik adından da anlaşılacağı üzere dideoksi nükleotidlerin (ddNTP)
kullanımına dayanmaktadır. ddNTP’lerde deoksinükleotid (dNTPs)’lerden farklı
olarak deoksiriboz şekerinin fosfodiester bağı yapımında kullanılan 3 numaralı
karbon atomunda hidroksil grubu yoktur (Şekil 1). Böylece atasal zincir kalıp
alınarak uzayan DNA dizisi, reaksiyona spesifik oranda konan deoksinükleotid
(dNTPs) ve ddNTP miktarına bağlı olarak ddNTP’nin uzayan DNA fragmentine
girdiği noktada sonlanır.
BAZ
BAZ
-OH
yok
Şekil 1. dNTP (deoksinükleotid) ve ddNTP’nin (dideoksinükleotid) moleküler
yapıları.
Biyomedikal gelişmeler ile Sanger’in dizi sonlandırma metodu, PZR tekniği ile
birleştirilerek otomatize DNA dizi analiz sistemleri geliştirilmiştir. Bu sistemlerde
dizileme
reaksiyonu
“cycle
sequencing
(döngüsel
dizileme)”
olarak
adlandırılmakta ve tüm reaksiyon bir tüpün içerisinde gerçekleşmektedir.
Cycle sequencing reaksiyonunda; PZR reaksiyonunda da olduğu gibi ön
denatürasyon, denatürasyon, primer bağlanması ve uzama basamakları mevcuttur.
Normal P Z R reaksiyonundan ayrılan en temel farklılıklar, reaksiyonda herbiri
farklı floresan işaretli ddNTP ve sadece tek yönlü bir primerin kullanılmasıdır.
(Şekil 2).
36
DNAKalıp
Zincir
dNTP’ler
Prim
er
Floresan
işaretli
ddNTP’ler
DNA Polimeraz
Şekil 2. Dizileme reaksiyonunun içeriği
Bu pratikte farklı floresan işaretli ddNTP’ler kullanılarak dizileme reaksiyonu
gerçekleştirilecektir. Reaksiyonun basamaklarından biri olan denatürasyon
aşamasında
kalıp DNA’nın iki zinciri birbirinden ayrılmaktadır. Primer
bağlanma aşamasında reaksiyon ortamına konan ileri veya geri primerler kalıp
DNA’ya bağlanmaktadır. Uzama basamağında ise reaksiyonda spesifik oranda
bulunan floresan işaretli ddNTP’ler ile dNTP’ ler yarış halinde DNA polimeraz
tarafından
primere eklenerek tek nükleotid uzunluk farkıyla yeni DNA
zincirleri oluşturulmaktadır. (Şekil 3)
Denatürasyon
Primer Bağlanma
Uzama
Enzim dNTP,işaretli
ddNTP
Ürün
Şekil 3. Dizileme reaksiyonunun basamakları
Dizileme reaksiyonundan sonra tüp içerisinde kullanılmayan ddNTP, dNTP ve
primer artıkları farklı kimyasal metodlarla (etanol, sephadex) ya da ticari kitler
aracılığıyla ortamdan uzaklaştırılır. Bu aşamada amaç sadece istenilen gen
bölgesine ait farklı boyutlardaki DNA dizilerinden oluşan saf bir reaksiyon ürünü
elde etmektir.
37
Elde edilen reaksiyon ürünü, kapiller elektroforez sistemiyle çalışan otomatize DNA
dizi analiz cihazına yüklenir (Şekil 4) Bu pratikte ABI (Applied Biosystem)
dizileme reaksiyonu kiti ve analiz cihazı kullanılacaktır. Cihazdaki kapillerin içinde
DNA zincirlerinin büyüklüğüne göre ayrılmasını sağlayan polimer bulunmaktadır.
Bir tampon aracılığıyla örnekler elektrik akımı ile bu polimerlerin içinde elektroforeze
tabi tutulur. Elektroforez sırasında DNA zincirleri büyüklüklerine göre ayrışırlar. Bu
geçiş sırasında kapillerin bir noktasında bulunan ve floresan ışınları algılayan
kamera, fragmentlerdeki floresan işaretli ddNTP’leri (son nükleotidi) algılayarak
cihazın yazılım sistemine aktarır. Yürütme sonunda her bir ddNTP ile sonlanan
DNA fragmenti farklı renkli pikler halinde sistem tarafından kaydedilir (Şekil 5).
Isıtıcı
alanı
(Oven)
Tampo
n alanı
Kapill
er
Dede
ktör
Polimer
alanı
(POP)
Örnek
alanı
Şekil 4. DNA dizi analizi cihazi iç görünümü.
(TRAY)
38
Şekil 5. DNA dizi analizi aşamaları
DENEYİN YAPILIŞI
1. Dizileme reaksiyonu aşağıda belirtildiği miktarlarda 200 μl’ lik PZR
tüpünde kurulur.
Reaksiyon için Gerekli Malzemeler
Steril distile su
ABI Big Dye Terminator 3.1 Tamponu
ABI Big Dye Terminator 3.1 Enzimi
Tek yönlü primer
Kalıp DNA
39
2. Reaksiyon thermal cycler (ısı döngüleyici) cihazına konur ve dizileme
programı başlatılır.
3. Program sonunda sekans ürünü temizlenir ve sekans cihazına yüklenir.
4. Elde edilen dizi, normal dizi ile karşılaştırılarak varsa değişimler saptanır.
DNA DİZİ ANALİZİ İLE TANISI KONAN HASTALIKLARA ÖRNEK:
AİLESEL AKDENİZ ATEŞİ (FMF) ( Familial Mediterranean Fever )
Ailesel akdeniz ateşi, otozomal resesif kalıtım gösteren otoinflamatuar bir
hastalıktır (Şekil 6). Hastalık 781 aminoasitten oluşan Pyrin proteinini kodlayan
MEFV geninde meydana gelen mutasyonlar sonucu oluşur. MEFV geni 16.
kromozomun kısa kolunda lokalize olan 10 ekzonlu bir gendir. Bu gen ağırlıklı
olarak makrofajlar, monositler, dendritik hücreler ve sinovyal fibroblastlarda
sentezlenir. Gen ürününün ana görevi, Interlökin-1 (IL-1) olgunlaşmasını sağlayan
Kaspaz-1
enzimini inhibe etmektir. IL-1 i s e
TNF-α gibi yangı (ateş,
inflamasyon) oluşturan bir sitokindir. Mutasyonlar sıklıkla 2, 3, 5 ve 10.
ekzonlarda görülmektedir. En yaygın görülen mutasyonlar R202Q, M694V,
M680I ve V726A mutasyonlarıdır (Şekil 7). Söz konusu mutasyonları
homozigot veya “Compound-heterozigot” olarak bulunduran bireylerde mutant
pyrin proteini, Kaspaz-1’i inhibe edemeyeceği için, inflamatuar IL-1 ve TNF-α
gibi i n f l a m a t u a r
sitokinlerin sentezi hızlanacağından hastalarda yaygın
inflamasyon ve tekrarlayan ateş gözlenir.
Şekil 6. Otozomal resesif kalıtım modeli
40
FMF tanısı DNA dizi analizi ile konmaktadır. Elde edilen dizi analizi sonuçları, Human
Genome Project (İnsan Genom Projesi) ile ortaya çıkarılmış normal gen dizisiyle
karşılaştırılarak değerlendirme yapılır.
41
MEFV Geni Ekzon 10F -Normal/Normal
MEFV Geni Ekzon 10F – M694V/M694V
MEFV Geni Ekzon 10F – M680I/Normal
MEFV Geni Ekzon 10R – M680I/Normal
MEFV Geni Ekzon 2R – R202Q/Normal
MEFV Geni Ekzon 10R –V726A/Normal
Şekil 7. FMF’ te yaygın olarak görülen mutasyonları içeren dizi analizi sonuçları örnekleri
42
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
KOMİTE SINAVINIZDA BAŞARILAR DİLERİZ!!!
43
PRATİK 6:
MİKROSKOP KULLANMA BECERİSİNİN KAZANILMASI
A) DENEYİN AMACI
Mikroskobun optik ve mekanik kısımlarının tanıtılması, mikroskop kullanırken
dikkat edilecek hususların belirtilmesi, hayvan ve bitki hücresi örneklerinin
incelenmesi.
B) GEREKLİ MALZEMELER
1-Mikroskop
2-Lam ve lamel
3-‘e’ harfi yazılı bir parça gazete kağıdı
4-Soğan
5-İki farklı renkte birer parça dikiş ipliği
6-Metilen mavisi
7-Kan yayma lamları
8-Kurutma kağıdı
9-Distile su
C) GENEL BİLGİLER
İnsan gözü 200-250 mikrometreden (μm) büyük olan nesneleri görebilir. Çoğu
mikroorganizmanın boyutu ise,
0,1-10 mikrometre (μm) arasında değişiklik
göstermektedir. Bu nedenle, mikroorganizmaları görmede ve bunlar hakkında
bilgi edinmede özel ve büyütücü aletler kullanma zorunluluğu vardır.
1 mm = 1 000 μm = 1 000 000 nm
Kullanılan ilk büyüteçlerin, büyütme kapasitelerinin 10 ile 20 kat arasında olduğu
bilinmektedir. Hollandalı bir gözlükçü olan, Zacharias Janssen 1590’ların sonunda
teleskopta bazı değişiklikler yaparak (2 veya daha fazla mercek kullanarak) objeleri
50 katın üzerinde büyütebilmeyi başarmıştır. Galileo’nun, occhiolino (küçük göz)
ismini verdiği alet için Giovanni Faber ilk defa mikroskop kelimesini kullanılmış
ve mikroskobun isim babası olmuştur. Mercek sisteminin, tersine çevrilmiş bir
teleskobun cisimleri büyütmek için kullanılabileceğini düşünen Kepler ve Robert
44
Hooke gibi bilim adamları ilerleyen yıllarda mikroskobun gelişmesine katkıda
bulunmuşlardır. Antonie Van Leeuwenhoek (1632-1723) yaptığı ve 275 kattan
daha fazla büyütebilen mikroskobu ile; tükürük, mantar, yaprak, su vb.,
maddeleri
inceleyerek,
bunlarda
bulunan
bakterileri
görmüş,
şekil ve
hareketlerini çizmiştir. Vakuol, sperm ve çizgili kas demetlerinin yapılarını da ilk
keşfeden bilim adamı olarak tarihe geçmiştir.
Bu tarihlerden sonra mikroskoplar daha da geliştirilmiş v e büyütme kapasiteleri
artırılmıştır. Günümüzde çeşitli amaçlar için yapılan mikroskoplar başlıca 7
bölümde incelenebilir.
1. Işık mikroskobu,
Örnek yüzeyinin çeşitli ayrıntılarının konumlarına göre, değişik açılarda
yansıtılan gelen ışık, yansıma açısına bağlı olarak mikroskobun merceklerinden
geçerek görüntüyü göze iletir. En yaygın kullanımı olan mikroskoptur.
2. Karanlık saha mikroskobu,
Boyanmamış ve canlı örneklerin incelenmesinde etkin olarak kullanılır. Bir
karanlık alan engelleyicisi yerleştirilen özel bir kondansör yardımı ile ışıklı bir
görüntü oluşturmaktadır.
3. Floresan mikroskobu,
Floresan ışıma özelliğine sahip moleküller ile işaretlenen örnekler incelenir. Bu
moleküllerin uyarılmasıyla ortaya çıkan ışıma, filtreler ile işlenerek, renk ve
kontrasta dönüştürülür. Floresan mikroskoplar, sitogenetik,parazitoloji ve
bakteriyoloji alanlarında önemli yer tutarlar.
4. Faz-kontrast mikroskobu,
Genellikle çalışılması zor olan boyanmamış, sıvı ortamdaki mikroorganizmaların
ve canlı hücrelerin morfolojisinin incelenmesinde kullanılmaktadır. Işık ya da
karanlık saha mikroskobu ile belirlenemeyen detayların incelenmesine fırsat tanır.
5. Konfokal mikroskop,
Floresan mikroskobun gelişmiş bir modelidir. Floresan boyalarla işaretlenmiş
moleküller, lazer tarafından taranır ve üç boyutlu görüntü elde edilir. Lazer
Taramalı Konfokal Mikroskop; kalın kesitli doku örnekleri, embriyolar gibi
küçük organizmalar ve bütün haldeki hücre örnekleri ile çalışma imkanı sağlar.
45
6. Diseksiyon mikroskobu
Bir stereo mikroskop türü olan diseksiyon mikroskopu normal göz ile ayırt
edilmesi zor olan makro yapıların daha net bir şekilde gözlemlenebilmesine
olanak sağlar. Stereo özelliği sayesinde incelenen yapı 3 boyutlu olarak
görüntülenir. Deney hayvanı çalışmalarında girişimsel uygulamalarda sıklıkla
kullanılır.
7. Elektron mikroskobu
Elektron Mikroskobu, organizmaların üç boyutlu ve daha detaylı bir şekilde
incelenmesine olanak veren yüksek enerjili elektronlar ile yüzeyin taranması
prensibiyle çalışır. Bu tip mikroskoplar, elektron enerjisine ve ölçüm aletinin
çalışma moduna göre, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), taramalı elektron
mikroskobu (SEM) gibi sınıflara ayrılır.
Pratik çalışmalarınız boyunca kullanacağınız mikroskop, bir mercekler sistemi ve
görünür ışık aracılığıyla küçük objelerin görüntülerinin büyütülmesine olanak
tanıyan binoküler ışık mikroskobudur. Mikroskop temel olarak iki kısımdan
oluşur (Şekil 1). Bunlar mercek sistemini kapsayan ‘optik kısım’ve optik
kısımları destekleyen ve çeşitli ayarlara olanak tanıyan ‘mekanik kısım’dır. Optik
ve mekanik kısımları oluşturan birimler aşağıda sıralanmıştır. Bu kısımlar Şekil
2’de mikroskop görüntüsü üzerinde de tanımlanmıştır.
46
Optik Kısım
Mekanik Kısım
Esas optik kısım
Oküler mercek
Mikroskop tüpü
Objektif mercek
Mikroskop kolu
(statif)
Aydınlatma
Sistemi
Mikroskop tablası
Kondansör
Mikroskop ayağı
Makrovida-Mikrovida
Diyafram
Şaryo
Işık Kaynağı
Şekil 1:Işık mikroskobunun kısımları
Işık mikroskobunda inceleme yapılırken, ışık kaynağından gelen ışık, mikroskop
tablasının altında bulunan kondansör mercek yardımıyla yoğunlaştırılarak
incelenen örneğe odaklanır. Örnek üzerine gönderilen ışık miktarı ile ilişkili olarak
kontrast ayarı, tablanın hemen altındaki diyafram aracılığıyla yapılabilir.
Örnekten geçen ışık objektif mercek tarafından toplanır ve mikroskop tüpünde
büyütülmüş ve net bir görüntü oluşur. Görüntü daha sonra ikinci bir büyütücü
mercekten (oküler mercek) geçer ve göze ulaşır. İncelenen örneklerdeki doğal
pigmentasyon veya boyalar ışığı farklı oranlarda absorbe eder ve objeleri
görebilmemizi sağlar. Mikroskobun, cismin görüntüsünü büyütme gücüne
mikroskobun “ayırım (resolüsyon) gücü” ya da “büyütme gücü” denir.
Mikroskobun büyütme gücü, objektif mercek büyütmesi ile oküler mercek
büyütmesinin çarpımı ile hesaplanabilir. Kullandığınız mikroskopların objektif
mercek büyütmeleri 4, 10, 20, 40, 100 kat olabilir. Bu rakamları merceklerin
üzerinde görebilirsiniz. Mikroskoplarınızın oküler merceklerine baktığınızda ise
genellikle 10 kat büyütme gücünde olduklarını görebilirsiniz.
Mikroskopların çoğunda bulunan objektif mercekleri genellikle parfokaldir (eş
odaklı). Yani,
bir objektif mercekle odaklanan görüntünün, diğer objektif
mercekler ile de aynı odak noktasında görüntülenmesi sağlanmış olur. Bu
yüzden en küçük objektif mercekte makrovida ile görüntünün bulunması
(odak ayarı), daha sonra mikrovida ile görüntünün netleştirilmesi gerekir.
47
Objektif mercek değiştirilerek görüntü büyütüldüğü zaman, görülebilecek olan
toplam saha küçülmüş olur. Bu nedenle, merceği değiştirdiğinizde eğer obje
merkezde değilse görüntüsünü kolaylıkla mikroskop sahasından kaybedebilirsiniz.
Ancak, objektif merceği değiştirmeden önce objeyi merkezde tutmayı alışkanlık
haline getirirseniz, incelemek istediğiniz alana ulaşmanız için büyük bir kolaylık
sağlamış olursunuz.
Şekil 2. Binoküler Işık Mikroskobu
48
Işık Mikroskobunun Kullanımı:
1.
Mikroskobun üzerinde bulunan kılıfı çıkarınız.
2.
Kullanıma başlamadan önce mikroskobun optik parçalarının sağlam, tozsuz
ve lekesiz olduğuna dikkat ediniz. Optik kısım üzerindeki toz ve leke kağıt
mendiller ile silinerek giderilir.
3.
Mikroskobunuzu yan kısımdaki düğmesinden açık konuma getirin.
4.
Lam üzerinde hazırlanan preparatın alt kısmı mikroskobun tablasının
ortasındaki boşluğa gelmek üzere yerleştirilir veya preparat tam bu boşluğa
gelecek şekilde ayarlanır. Eğer üzerinde lamel varsa lamelli kısmın üst tarafta
olması gerekir. Preparat kıskaç içine alınarak, tabla üzerinden kaymaması ve
pozisyonunun değişmemesi sağlanır.
5.
Preparat incelenirken bazı alanların yeniden incelenebilmesi amacı ile alanın
koordinatlarının kaydedilmesi gerekebilir. Bunun yapılabilmesi için lamın
hep aynı yönde yerleştirilmesi gerekir. Lamınızı numara veya hasta ismi sağda
olacak
şekilde
gerekmeyecektir,
yerleştiriniz.
Gireceğiniz
pratiklerde
koordinat
almanız
ancak preparatın doğru yerleştirme yönünün öğrenilmesi
gerekmektedir.
6.
Preparatınızı incelemeye geçmeden önce, oküler mercekleri gözünüze göre
ayarlamanız gerekecektir. Kullandığınız mikroskoplar, binoküler mikroskoplardır,
yani iki oküler mercekleri bulunur. Binoküler mikroskoplarda iki oküler mercek
arasındaki aralık göze göre ayarlanabilir. Bunun için iki gözünüzle bakarken, tek
ve büyük daire şeklinde bir görüntü alanı elde edinceye kadar okülerleri
birbirine yaklaştırınız veya uzaklaştırınız.
7.
Preparatınızın boyalı veya boyasız olmasına göre diyaframın ayarlanması
gerekir. Boyalı preparatlarda diyaframın açık olması gerekirken, boyasız
preparatlarda
kontrastın
artırılması
için
diyafram
kapalı
olmalıdır.
Ayarlamayı, objeyi en iyi gördüğünüz kontrast miktarına göre yapabilirsiniz.
8.
Preparatınızı tablaya yerleştirdikten sonra 4 veya 10 kat büyütmeli objektif
merceği obje üzerine getirerek makrovida yardımıyla odaklamaya geçebilirsiniz.
Makrovida ile ayarlama yapılırken en küçük büyütmeli objektifin aktif
durumda olmasına dikkat edilmelidir. Daha sonra mikrovidayla görüntüyü
netleştirebilirsiniz. Küçük büyütmeli objektiflerde mercek çapı daha geniş olduğu
49
için daha büyük bir alanı odaklayabilir. Bu alan daha ayrıntılı incelenmek
isteniyorsa daha büyük büyütme gücü olan objektifler kullanılabilir.
9.
Eğer 100 kat büyütmeli objektifi kullanacaksanız, bu objektifi mutlaka
immersiyon yağı ile kullanmanız gerekmektedir. Ancak bu yağın diğer objektiflere
bulaşmaması için daha küçük büyütmeli objektifler ile görüntü bulunduktan ve
odaklandıktan sonra immersiyon yağı damlatmadan önce küçük büyütmeli
objektifleri merkezden uzaklaştırınız. İmmersiyon yağı ışık ışınlarının obje üzerine
odaklanmasını ve daha net bir görüntü elde edilmesini sağlar. Preparatı daha
ayrıntılı incelemek için, istenen bölgeye preparatın konumunu değiştirmeden ve
preparatı mikroskoptan çıkarmadan bir damla immersiyon yağı damlatılması
yeterlidir. 100 kat büyütmeli objektifi immersiyon yağı olmadan kullanmayınız
ve bu objektif ile alan bulmayınız. Sadece 10 kat büyütmeli objektifle
netleştirdiğiniz ve yağ damlattığınız alanda inceleme yapınız. Bunun yanında,
100
kat büyütmeli objektif
ile
inceleme
yaparken asla
makrovidayı
kullanmayınız. 100 kat büyütmeli objektif mercekle işiniz bittikten sonra objektifi
merkezden uzaklaştırıp en küçük büyütmeli objektifi merkeze getiriniz.
10. İncelemeniz bitiğinde kıskaçları açarak preparatı tabladan alınız.
11. İnceleme sonunda mikroskop, kağıt mendillerle mercek sisteminden
başlayarak temizlenmelidir. Silme işlemi, en küçük objektiften en büyük objektife
doğru yapılmalıdır. İmmersiyon yağı bulaşan kısımlar çok az eter-alkol (veya
alkol) emdirilmiş kağıt mendillerle silinebilir. Daha sonra en küçük büyütmeli
objektifi merkeze yerleştiriniz.
12. Mikroskobun ışığını kapatınız.
13. Mikroskop kılıfını tekrar mikroskop üzerine geçiriniz.
50
MİKROSKOBUN KORUNMASI VE BAKIMI
Mikroskopların uzun ömürlü ve devamlı kullanılabilir bir durumda olabilmesi,
bunların bakım ve kullanımına bağlıdır. Bunun için;
1.
Mikroskop daima iki elle taşınmalıdır. Taşınırken bir elle mikroskop kolu
tutulurken diğer elle de mikroskop ayağının altından sıkıca tutulmalıdır.
Kesinlikle mercek sistemlerinden, vs. tutulmamalıdır.
2.
Mikroskobunuzu masaya koyduğunuzda aydınlatma tertibatında bulunan
kabloların mikroskobun ayağının altında kalıp ezilmemesine dikkat ediniz.
3.
Mikroskop ile çalışırken, o anda size gerekli olan araç ve gereç dışında hiçbir
şeyi mikroskop yakınında bulundurmayınız.
4.
Mikroskopta çalışma daima en az büyüten objektifle başlar. Onun için en az
büyüten objektif preparat üzerine getirilir.
Sonra makro vida saat yönü
istikametinde döndürülerek tabla aşağıya indirilir ve objektifin ucu lamele 3-5
mm kadar yaklaştırılır. Okülerden bakılırken tüp yani objektif yalnız yukarı
doğru hareket ettirilir, kesinlikle aşağı indirilmez. Çünkü preparat veya
objektifin ön merceği kırılabilir veya hasara uğrayabilir. Makro ve mikro
vidalar bir elle döndürülürken, diğer el de görüntünün x-y ekseninde hareketini
sağlayan şaryo üzerinde olmalıdır.
5.
Mikroskopların merceklerine elle
dokunulmamalıdır. Mercekleri kağıt
mendil ile temizleyiniz, merceğin herhangi bir zarar görmemesine her zaman
dikkat ediniz.
6.
Mikroskobun herhangi bir parçası diğer bir mikroskobun parçasıyla
değiştirilmemelidir.
7.
Çalışmalarınızın bitiminde, kullandığınız mikroskobu daima temizleyiniz ve
en küçük objektifi kullanım konumuna getiriniz. Mikroskobunuzu mutlaka kapalı
konumda bırakınız.
51
D) DENEYİN YAPILIŞI
1.
Üzerinde ‘e’ harfi bulunan kağıtları alınız. Bunu temiz bir lam üzerine
yerleştiriniz.
Preparatınızı
yerleştiriniz
daha
sonra
mikroskop
kullanımı
bölümünde ilgili aşamalarda anlatılan kuralları uygulayınız. En sonunda 4, 10 ve
40 kat büyütmeli objektif ile elde ettiğiniz görüntüyü çiziniz.
2.
İki farklı renkte birer parça dikiş ipliği alarak bunları bir lam üzerinde X
işareti yapacak şekilde birbiri üzerine koyunuz. Preparatınızı bu şekilde
hazırladıktan sonra mikroskop kullanımı bölümünde ilgili aşamalarda anlatılan
kuralları uygulayınız. En sonunda 4, 10 ve 40 kat büyütmeli objektifte
preparatınızı incelerken, mikrovida ile yavaş yavaş oynayınız ve gördüklerinizi
çiziniz.
3.
Bitki hücresine örnek olarak soğan (Allium cepa) epidermis hücresini
inceleyeceksiniz. Bunun için size verilen soğan bitkisinin toprak altı gövdesinin
etli yapraklarının dış kısmından bir parça zar alarak lamın üzerine yerleştiriniz.
Sonra lamınıza bir damla distile su damlatıp, lamelinizi hava kabarcığı
kalmayacak şekilde kapatınız. Preparatınızı diyafram kapalı şekilde inceledikten
sonra, metilen mavisi ile boyayarak tekrar inceleyiniz ve hücrelerin şeklini çiziniz.
4.
Hayvan hücrelerine örnek olarak yassı dil epitelini inceleyeceksiniz. Dilin
üzeri çok tabakalı yassı epitel hücreleri ile kaplıdır. Dilin epitel hücrelerini elde
etmek için tahta çubuğu dilinizin üzerine arkadan öne doğru hafifçe sürünüz. Bu
şekilde dil epitelinden alınan hücreler, bir miktar tükrük ile tahta çubuğun
kenarında toplanır. Bundan sonra tahta çubuğun ıslak tarafını lam üzerine
sürünüz ve üzerini lamel ile kapatınız. Hücreler saydam olduğundan, diyaframı
kapatarak
inceleyiniz.
sitoplazmasını
görmeye
Epitel
hücrelerini,
çalışınız.
hücrelerin
Hazırladığınız
bu
çekirdeklerini
preparatı
ve
boyasız
inceledikten sonra metilen mavisi ile boyayarak tekrar mikroskopta inceleyiniz.
Gördüklerinizi çiziniz.
Boyama işlemi: Boya bir taraftan lam ve lamel arasına pastör pipeti ile
damlatılırken, diğer taraftan kurutma kağıdı ile çekilerek boyama gerçekleştirilir.
5.
Örnek Olarak İnsan Kan Dokusunun İncelenmesi
İnsan kanı ile hazırlanmış ve Hematoksilen-Eozin ile boyanmış yayma
preparatları mikroskopta inceleyiniz.
52
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
53
PRATİK 7:
GEN KLONLAMA VE BAKTERİYE TRANSFORMASYON
Bir genin klonlanması veya çoğaltılması amacıyla, bir bakteriye aktarılması oldukça
yaygın olarak kullanılan bir işlemdir ve transformasyon olarak adlandırılır. Bu DNA
materyalini (geni) kabul etme yeteneğine sahip hücrelere de kompetan hücreler denir.
Bir çok bakteri türünde transformasyon işlemi doğal yollarla gerçekleşiyor olsa da, bilim
insanları bakteri hücrelerinin bu kompetan özelliklerini yapay olarak indükleyecek
çeşitli yollar geliştirmişlerdir.
Şekil 1. Transformasyonun( bakteri hücresine) şematik gösterimi
ISI İLE ŞOKLAMA METODU
Bakteriye transformasyon işlemi için kullanılan en yaygın yöntem ısı ile şoklama
metodudur. Temel prensip olarak, ani sıcaklık değişimi ile bakterinin plazma
membranında oluşturulacak porlar yardımıyla aktarılacak DNA’nın hücre içerisine
alınması hedeflenmektedir. Bu metodun haricinde, sıcaklık değişimi yerine elektrik
akımı kullanılarak gen aktarımının yapılabildiği elektroporasyon işlemiyle de
transformasyon işlemi gerçekleştirilebilir.
54
Isı ile Şoklama Metoduyla Transformasyon İşleminin Temel Prensipleri
Bakteriye transformasyon işlemlerinde en sık ve yaygın olarak kullanılan DNA plasmid
DNA’dır. Plasmidler, küçük, halkasal, çift-zincirli DNA yapısında olup, super-sarmal
oluşturarak boyutlarını küçültebilme yeteneğine sahiptir. Bu özellikleri yardımıyla
kolaylıkla hücre membranındaki porlardan geçebilirler.
Bir plazmidde önemli olan birkaç özellik vardır. Ticari olarak satılan plasmidler, çoklu
klonlama bölgeleri (multiple cloning sites-MCS) içerirler. Bu klonlama bölgeleri,
DNA’yı kesen restriksiyon endonükleazlar (restriksiyon enzimleri) tarafından
tanınan spesifik sekanslar içerir. Araştırmacının ilgilendiği DNA fragmentleri (genler),
bu spesifik sekansların yardımıyla çoklu klonlama bölgelerine aktarılabilirler.
Şekil 2. Plazmidlerin şematik gösterimi
Bunun için DNA fragmentinin ve plasmidin aynı endonükleazlar ile kesilmesi
gerekmektedir. Transformasyon işlemine başlamadan önce ilgilenilen gen bölgesi
plazmid vektörüne klonlanabileceği gibi, firmalar tarafından geliştirilen plazmidlere
hazır olarak klonlanmış genler ticari olarak tedarik edilerek de kullanılabilir.
Plasmidler ayrıca, hücrelere plasmiddeki replikasyonun nereden başlaması gerektiğine
dair bilgi veren, Replikasyon Orijini (ORI) içerirler. Replikasyon orijini ve Çoklu
Klonlama (Kesim) Bölgeleri’ne ek olarak, birçok plasmid, antibiyotik dirençlilik geni de
içerir. Bu gen sayesinde, bu plasmide sahip olan tüm hücreler o antibiyotiğe dirençli hale
gelir, böylece bu hücreler antibiyotik içeren besiyerinde selektif olarak yaşayabilirler.
55
Kompetan Hücreler, plasmidlerin aktarılacağı hücrelerdir. Moleküler biyoloji
araştırmalarında ve transformasyonda en yaygın kullanılan bakteri türü E. coli’dir. Bu
bakteriler bağırsaklarda da doğal olarak bulunur. Hücreler genel olarak kalsiyumca
zengin bir ortama maruz bırakılarak kompetan hale getirilirler. Kalsiyum iyonlarındaki
pozitif yükler, hem plasmidin hem de bakteri hücre duvarının negatif yüklerini nötralize
ederler ve elektrostatik çekim kuvvetini dağıtarak hücre duvarını zayıflatırlar. Hücreler
ani bir sıcaklık artışına, ısı şokuna maruz bırakılarak, hücrenin içi ve dışı arasında bir
basınç farkı yaratılır, böylece süper-sarmal DNA’nın geçebilmesi için porların oluşması
sağlanır. Sonrasında sıçaklığın düşürülmesiyle hücre duvarı eski haline döner. Plazmidi
alan hüceler, plasmid üzerinde hangi antibiyotik dirençlilik geni taşınıyorsa ancak o
antibiyotiği içeren agar petriler üzerinde üreyebilirler.
Kompetan Hücre Hazırlanması
Kompetan hücre yapımından önce transformasyonda kullanılan bakteriler dondurucuda
saklanır.
 Hücreler buz üzerinde çözdürülür.
 Antibiyotiksiz agarlı petriye yayılır ve bir gece 37 0C’de üremeye bırakılır.
 Aseptik teknik kullanılarak, agar petride gelişen kolonilerden biri seçilir ve 500
ml’lik kültürde gece boyu 37 0C, çalkalamalı inkübatörde çoğalmaya bırakılır.
 Çalkalamalı inkübatör, hem bakterinin dibe çökmesini engellemek hem de
besiyerindeki yararlı maddelerin besiyeri içinde yayılmasını sağlamak amacıyla
gereklidir.
 Hücreler çoğalırken, 0.1 M Kalsiyum Klorür ve %15 gliserol içeren 0.1 M
Kalsiyum Klorür solüsyonları hazırlanır, otoklavlanır ve soğutulur.
 Bakterilerin, büyüme eğrisinin log fazının ortalarında olup olmadıklarını
belirlemek amacıyla absorbans ölçümleri yapılır.
 Bakterilerin DNA’yı almaya hazır oldukları zaman büyüme eğrisinde log fazının
ortalarına denk gelen süredir.
 Bu faza ulaşan hücreler, buz üzerine alınır ve işlem süresince buz üzerinde
tutulur.
 Bakteri hücreleri 2 ayrı santrifüj tüpüne bölünür ve +4 C’de hızlıca döndürülür.
 Süpernatant uzaklaştırılır ve pellet yaklaşık olarak 100 ml 0.1 M soğuk kalsiyum
klorürde resüspanse edilir. Hücreler 30 dakika buz üzerinde inkübe edilir. Bu
56
basamak en az bir kez daha tekrar edilir. Bu santrifüj ve resüspansiyon işlemleri
genellikle hücrelerin yıkanması olarak da tanımlanır.
 Son yıkamadan sonra, hücreler 50 ml soğuk, %15 gliserol içeren 0.1 M kalsiyum
klorür solüsyonunda karıştırılır.
 Elde edilen bu hücreler kimyasal olarak kompetan hale getirilmiş hücrelerdir.
 50’şer µl olarak tüplere dağıtılır ve -80 0C’de saklanır.
Isı Şoku Reaksiyonu
Isı şoku ile transformasyona başlamadan önce, çalışma alanı temizlenir ve kullanılacak
bütün malzemeler sterilize edilir. Kompetan bakterinin üremesi için gerekli besinleri
içeren, yeterli miktarda sıvı ve agarlı besiyerleri hazırlanmalıdır. Bu maksatla tüm
solüsyonlar otoklavlanarak sterilize edilir. Kullanılmadan önce sıvı besiyerinin oda
sıcaklığına kadar soğuması beklenir. Agarlı besiyeri otoklavlandıktan sonra henüz sıvı
haldeyken 50-55 0C sıcaklığa kadar soğuması beklenir, bu sıcaklığa ulaştıktan sonra
gerekli antibiyotik besiyerine eklendikten sonra petrilere dökülüp katılaşması için oda
sıcaklığında soğumaya bırakılır. Bakteri ile çalışırken, steriliteyi korumak için her zaman
aseptik koşullar sağlanmalıdır. Aseptik teknikte genel olarak, malzemelerin
sterilizasyonu için ve bir konveksiyon akımı yaratarak hava kaynaklı kontaminantların
çalışma alanından uzak tutulması için Bunzen beki kullanılır.
 Isı şoku reaksiyonuna başlamadan hemen önce;
sıvı besiyeri oda sıcaklığına getirilir,
antibiyotik içeren LB agar petrileri 37 0C’ye ısıtılır,
su banyosu 42 0C ‘ye ayarlanır,
kompetan hücreler buz üzerinde çözdürülür.
 1ng/µl plasmid konsantrasyonunda, 1-5 µl plasmid soğuk olarak bakteri
hücrelerine eklenir, hafifçe karıştırılır, ve plasmid-hücre karışımı buz üzerinde 30
dakika bekletilir.
 Süre sonunda, plasmid-hücre karışımı 42 0C de su banyosunda 30 saniye süreyle
ısı şokuna maruz bırakılır.
 30 saniye sonunda tüp hemen buz üzerine alınır ve 450 µl sıvı besiyeri tüpe
eklenir.
 Tüpler 37 0C’de çalkalamalı inkübatörde, 225 rpm hızda 1 saat inkübe edilir.
57
 Uygun aseptik teknikler kullanılarak, 20-200 µl aralığında farklı hacimlerde
bakteri agar petrilere eklenir ve bakteriler agar üzerine yayılır.
 Petriler, bakterilerin kondensasyondan korunması amacıyla ters çevrilerek 37
0
C’de gece boyu inkübasyona bırakılır,
 Ertesi gün, plazmidi almış olan bakteriler koloni oluşturur.
 Oluşan koloniler, transformasyon etkinliğinin hesaplanması amacıyla sayılır.
 Transformasyon etkinliği başarılı transformant sayısının, petriye yayılmış toplam
DNA miktarına bölünmesi ile hesaplanır.
Transformasyon etkinliği = Başarılı transformant sayısı / g DNA
Bu etkinlik cfu (colony forming unit), koloni oluşturan ünite olarak tanımlanır.
DNA
miktarının
birimi
özellikle
belirtilmelidir.
Bazı
durumlarda,
transformasyon etkinliği yayılan transformant hacmi başına (cfu/ml) veya petri
başına (cfu/petri) olarak da tanımlanabilir.
 Daha sonra koloniler, ileri deneylerde kullanılmak amacıyla toplanır.
Alternatif bir yöntem olarak Elektroporasyon
Laboratuvar koşullarında yapay yollarla, yüksek voltajlı elektrik şoku uygulayarak
bakterilerin
hücre
membranlarında,
plasmid
DNA’ların
geçebileceği
porların
oluşturulması işlemine elektroporasyon denir.
Şekil 3. Elektroporasyon ile por oluşumu
Elektroporasyon işleminde elektroporatör adı verilen özel bir cihaz kullanılır. Bu
yöntem, ısı ile şoklama metoduna göre daha özel hazırlıklar gerektiren, daha pahalı ve
daha hassas bir yöntem olması dolayısıyla daha az tercih edilmektedir. Elektroporasyona
alternatif olan ısı şoku ile transformasyon tekniği genel olarak bakterilerin daha az
etkilendiği ve düşük tuz konsantrasyonuna ihtiyaç duyulmayan bir tekniktir. Ayrıca ısı
58
şoku ile transformasyon tekniği elektroporasyon işlemine göre çok daha ucuz bir
tekniktir. Bununla beraber, ısı şoku ile transformasyon tekniğinde transformasyon
etkinliği elektroporasyon işlemine oranla daha düşüktür ve daha uzun süren bir tekniktir.
Şekil 4. Elektroporatör
Ayrıca ısı şoku ile transformasyon tekniği sadece bakteriler, mayalar ve protoplastlara
uygulanabilirken elektroporasyon işlemi memeli hücrelerine de uygulanabilmektedir.
Bakteri Elektroporasyon İşlemi
Elektroporasyona hazırlanan E.coli hücreleri elektrokompetan hücreler olarak da
adlandırılır. Elektroporasyona başlamadan hemen önce, sıvı besiyeri oda sıcaklığına,
agar petriler 37˚C’ye getirilir.
 Elektroporasyonda kullanılacak küvetler ise buz üzerinde soğutulur.
 Elektrokompetan hücreler buz üzerinde çözdürülür.
 1-5 μl, 1ng/μl konsantrasyonda plasmid bakterilere eklenir. Hafifçe karıştırılır ve
karışım soğuk küvete alınır. Köpük oluşturulmamasına dikkat edilir.
 Elektroporatörün ayarları hücreler için uygun hale getirilir ve voltaj ayarlanır.
 Küvetin dışı silinerek kurutulur ve elektroporatöre yerleştirilir.
 Bir bip sesi duyulana kadar hücreler elektrik şokuna maruz bırakılır.
 Başarısız bir şoklama elektriksel yük boşalmasına sebep olur ve böyle bir durum
gerçekleşirse gözle görülür bir kıvılcım ve küçük bir patlama sesi duyulur. Bu
yük boşalması, arklama olarak tanımlanır ve kompetan hücrelerde veya DNA’da
çok fazla tuz konsantrasyonu olmasından dolayı oluşabilir.
 Transformasyonun başarısı, elektrik şokunun uygulanması ile voltajın geçişi
arasında geçen zaman sabiti not edilerek tahminlenebilir. Eğer reaksiyonda tuz
59
varsa ve elektroporasyon solüsyonu fazla iletkense, bu gecikme anında
gerçekleşir, yük boşalmasına neden olur ve hücrelerin çoğunun ölümü ile
sonuçlanır. Bakteriler için en iyi zaman sabiti 5-10 milisaniye arasındadır.
 Şoklamanın hemen ardından, küvet cihazdan alınır ve 1 ml besiyeri direkt olarak
hücrelere eklenir.
 Karışım bir tüpe yerleştirilir ve 37°C’de 1 saat boyunca, çalkalamalı inkübatörde
inkübe edilir.
 Daha sonra aseptik teknik kullanılarak 20-200 μl aralığında farklı hacimlerde
hücre, antibiyotik içeren agarlı petrilere yayılır.
 Petriler ters çevrilerek 37 °C’de gece boyu inkübe edilir.
 Plazmid ile transforme olmuş olan bakteriler koloni oluşturur.
 Oluşan koloniler sayılır ve transformasyon etkinliği hesaplanır.
İLGİLENİLEN GENİ İÇEREN PLAZMİDLERİ ALAN BAKTERİLERİN
SEÇİMİ İÇİN UYGULANILAN YÖNTEMLER
Antibiyotik Direnci
Aktarılmak istenilen plazmidin bakteriye başarılı olarak transforme edilip edilmediğinin
anlaşılması için, plazmidler üzerindeki antibiyotik dirençlilik genlerinden faydalanılır.
Kompetan hücre olarak kullanılan bakteri suşlarının herhangi bir antibiyotiğe karşı
dirençli olmaması gerekmektedir. İlgilenilen geni içeren plazmid üzerinde yer alan
antibiyotik dirençlilik geni, plazmidi alan bakterilerde bu antibiyotiğe karşı direnç
gelişmesine neden olacağından, başarılı transformantlar antibiyotik içeren selektif
besiyerinde
çoğalabilirken,
plazmidin
aktarılamadığı
hücreler
agar
üzerinde
gelişemeyecektir. Dolayısıyla agar üzerinde gelişen kolonilerden seçilen bakteriler ilgili
geni taşıyan plazmide sahip kolonilerdir. Bununla birlikte, bir plazmide laboratuvar
koşullarında çoklu kesim bölgelerinden faydalanılarak bir gen bölgesi yerleştirme
çalışması yapılıyorsa, her plazmide ilgili gen yerleştirilemeyebilir. Dolayısıyla
transformasyonda kullanılacak plazmid karışımı, ilgilenilen geni ve antibiyotik
dirençlilik genini taşıyan plazmidlerle birlikte sadece antibiyotiğe dirençlilik genini
içeren plazmidleri de içerecektir. Bu nedenle, antibiyotikli ortamda gelişen koloniler
sadece plazmidin başarılı bir şekilde bakteriye aktarıldığının göstergesidir. Asıl amaç,
ilgili geni içeren plazmidin aktarıldığı bakteri kolonisinin seçimini sağlamaktır. Bu
doğrultuda geliştirilen yaygın kullanılan yöntemlerden birisi Mavi Beyaz Tarama
60
yöntemidir.
Mavi Beyaz Tarama Yöntemi
Bu yöntemde kullanılacak plazmidler üzerindeki çoklu klonlama bölgesininin içerisine
beta galaktozidaz geni (LacZ) eklenmiştir. Bu gen, bakterilere laktozu parçalama
yeteneği kazandırmaktadır.
X-gal, renksiz, kromojen bir maddedir ve bir laktoz analoğudur. X-gal, -galaktozidaz
geni sentezlendiği zaman oluşan enzim ile parçalanır ve mavi renk oluşumu gözlenir.
Bu plazmidler kullanılarak yapılan gen klonlama ve transformasyon işlemleri
sonrasında, antibiyotik içeren besiyerine ekilen bakterilerde mavi ve beyaz koloniler
oluşur. Transformasyonun başarısız olduğu bakteriler antibiyotiğe karşı direnç
kazanamadığından agar üzerinde gelişemezler. Genin aktarılamadığı plazmidi alan
bakteriler ise agarda koloni oluşturacaklardır. Ancak bu bakterilerde, çoklu klonlama
bölgesinde bulunan beta galaktozidaz geninin bütünlüğü bozulmadığından, bu bakteriler
ortamda bulunan Xgal’ı parçalayarak mavi renk oluşumuna neden olur. Fakat ilgilenilen
genin çoklu klonlama bölgesine başarıyla yerleştirildiği plazmidlerde bu bölgedeki beta
galaktozidaz geninin bütünlüğü bozulduğundan bu plazmidleri taşıyan bakteriler laktozu
parçalama yeteneğinden yoksun kalır. Böylece herhangi bir renk oluşumu gözlenmez ve
koloniler beyaz görünür. İşlemler sonucunda agar üzerinde gelişen beyaz bakteri
kolonileri seçilerek istenilen geni taşıyan plazmidi alan bakteri kolonileri belirlenmiş
olur.
Şekil 5. Mavi-Beyaz Tarama Yöntemi
61
Uygulamalar
Çoğu transformasyon deneyinde, esas amaç, hedef geni taşıyan plazmidi alan bakterinin
bir an önce bölünerek yüksek hacimlerde ve miktarlarda plazmid üretmesini sağlamaktır.
Bakteriyel transformasyondan sonraki hedef, antibiyotik içeren besiyerinde yüksek
miktarda bakterinin üretilmesi ve plasmid saflaştırma işlemlerinin yapılmasıdır. Bu
işlem bakteriden plazmidin saf bir halde elde edilmesi için gereklidir. Bu amaçla
kullanılan çok çeşitli ticari kitler mevcuttur. Bazı durumlarda transformasyonun amacı
plasmid ile aktarılan genin kodladığı bir proteinin bakteri tarafından yüksek miktarda
üretilmesini sağlamak da olabilir. Yüksek miktarlarda elde edilen bu protein
saflaştırıldıktan sonra, kristalize edilerek ilgilenilen hedef proteinin yapısı tanımlanabilir.
Sonuç ve Özet
Transformasyon, bir hücrenin çevrede bulunan bir yabancı DNA’yı hücre içerisine
alması işlemidir. Doğada bulunan bazı özel bakteri tipleri transformasyonu
kendiliğinden gerçekleştirebilir. Moleküler biyolojik çalışmalarda, transformasyon
işlemi laboratuvar koşullarında yapay olarak, bakteriyel hücrelerin membranlarında
porlar yaratılması ile de gerçekleştirilebilir. Dış ortamdan yabancı DNA’yı hücre
içerisine alma yeteneğine sahip bakteri hücreleri kompetan hücreler olarak adlandırılır.
Isı şoku ile transformasyonda, kalsiyum klorür sayesinde kalsiyum açısından zengin bir
çevre oluşması sağlanır ve bu durum plasmid DNA ile bakteriyal hücre membranı
arasında var olan elektrostatik itme gücünü ortadan kaldırır. Sıcaklıkta gerçekleşen ani
bir artış ile bakterinin plazma membranında porlar oluşur ve plasmid DNA bakteri
hücresine girer. Farklı bir kompetan hücre tipi olan elektrokompetan hücreler de
laboratuvar şartlarında oluşturulabilir. Bu hücrelere elektrik akımı uygulanarak yapılan
elektroporasyon işlemi ile de bakteri hücrelerinin membranlarında DNA’nın
geçebileceği porlar yaratılarak transformasyon gerçekleştirilebilir.
Notlar the Journal of Visualized Experiments (JoVE) dergisindeki teknik bilgilere göre
hazırlanmıştır.
Kullanılan şekillerin kaynakları:
Şekil1. http://slideplayer.com/slide/9050687/27/images/44/Transforming+Plants+44.jpg(değistirilerek)
Şekil2. https://ka-perseus-images.s3.amazonaws.com/6ce673289a1608e8f6b63ed115bca6395536e508.png
(değiştirilerek)
Şekil3. http://www.bioelectrochemical-soc.org/img/electroporation-1.jpg (değiştirilerek)
Şekil4.http://www.biorad.com/webroot/web/images/lsr/products/gene_transfer_rnai/product_detail/global/
gene-pulser-mxcell-electroporation-system-detail.jpg
62
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
63
PRATİK 8:
MİTOZ BÖLÜNME
A) DENEYİN AMACI
Her canlının büyüme ve gelişmesi, hücrelerinin büyüme ve çoğalmasına bağlıdır.
Bu da çekirdeğin kendi benzerini meydana getirmesi ve sitoplazma bölünmesi
ile olur. Bu deneydeki amaç, çimlendirilmiş soğan kökünde ezme (squash) metodu
ile mitoz bölünmenin çeşitli evrelerini gözlemektir.
B) GEREKLİ MALZEMELER
1- Lam ve lamel
2- Asetokarmen
3-1adet çimlendirilmiş soğan
C) GENEL BİLGİLER
Mitoz, bir hücrenin kendisi ile aynı özellikleri taşıyan iki ayrı yavru hücreye
bölünmesidir. Hücre çekirdeği içerisinde bulunan genetik materyal çekirdek
zarının kaybolması ile birlikte kondense olup kromozom şeklini alır. Bu sırada
hücre zarının çeşitli yöntemlerle (hipotonik ortama koyma, ezme gibi) ortadan
kaldırılması kromozomların incelenebilmesine olanak sağlar. Bitki ve hayvanlarda
büyüme, gelişme, onarım gibi olayların hepsi hücrelerin mitoz bölünmesi ile
olmaktadır. Mitoz bölünme, hayvan ve bitki hücrelerinde evreleri ve temel
ilkeleri yönünden benzerlik gösterir. Mitoz bölünme, birbirini takip eden dört
ayrı ana aşamada incelenebilir.
Profaz: Erken profazda, her kromozom nükleer zar üzerinde özgül bir bölgeye
tutunur ve devam eden DNA sentezinin sonucu, çiftli bir yapı (kardeş kromatidler)
şeklinde görülür. Geç profazda, kromozomlar daha kalın ve kısa olacak şekilde
kalınlaşır (kromatin kondensasyonu) ve nükleer zar kaybolur (Şekil 1).
Şekil 1. Profaz
64
Metafaz: Mitotik iğ ince iplikler şeklinde görülür. Kromozomlar sentromerleri ile
iğ ipliklerine tutunmuş biçiminde ekvator düzleminde dizilirler (Şekil 2).
Şekil 2. Metafaz
Anafaz: Erken anafazda kromozomlar ortadan boyuna ikiye ayrılır ve her
kromozomun iki kromatidi zıt kutuplara göç eder (Şekil 3).
Şekil 3. Anafaz
Telofaz: Her kromozomun iki kromatidinin zıt kutuplara göç etmesi ve bir nükleer
zarın oluşmasıyla telofaz evresi başlar. En sonunda sitoplazma bölünür (sitokinez)
(Şekil 4).
Şekil 4. Telofaz
Bitki hücrelerinde ekvatoryal bölgede hücre plağı oluşur ve geç telofaz evresinde hücre
buradan bölünerek, yeni hücre zarı meydana gelir. Hayvan hücrelerinde ise ekvatoryal
bölgede önce dıştan içe doğru bir boğumlanma görülür. Daha sonra hücre, bu
boğumdan ikiye ayrılır.
65
İki mitoz bölünme arasındaki evrede metabolik ve sentezleme faaliyetleri devam eder.
Bu evre ‘metabolik evre’ veya ‘ interfaz evresi’ adını alır (Şekil 5). İnterfaz 3 evreden
oluşur;

G1 evresi: Metabolik açıdan hücrenin aktif olduğu bu evrede hücre gelişimi
devam eder. DNA sentezi için gerekli hazırlıkların ve senteze geçmeden önceki
kontrollerin yapıldığı evredir.

S evresi: DNA'nın kendini eşlediği evredir.

G2 evresi: DNA replikasyonu sonrası evresidir. Hücrenin mitoz için
gereken hazırlıkları ve kontrolleri bu evrede gerçekleştirilir.
Şekil 5. İnterfaz
İnterfazın ardından gerçekleşen çekirdek bölünmesi (karyokinez) ve sitoplazma
bölünmesi (sitokinez) aşamaları mitozu oluşturmaktadır. İnterfaz ve mitozdan oluşan
hücre döngüsü aşamaları Şekil 6’da görülmektedir.
Mitoz
Şekil 6. Hücre Döngüsü Aşamaları
66
Mitotik hücreler mikroskobik yöntemler kullanılarak ayırt edilebilir. Hücrenin
interfazın hangi evresinde (G1, S, G2) olduğu ise ancak biyokimyasal içeriğin
analizleri ile saptanabilir.
Bazı özel teknikleri kullanmaksızın kromozomların gözlenmesi genellikle mümkün
olmamaktadır. Kullanılabilecek en hızlı yöntem spontan olarak bölünen hücrelere
sahip
dokulardan
elde
edilecek
materyalin,
yapısını
koruyacak
şekilde
sabitlenmesinden sonra kromozomların gözlenmesine olanak verecek bir boya ile
boyanmasıdır. Bu işlemden sonra, ezme yöntemi ile zarı parçalanan hücrelerde
kromozomlar incelenebilir. Bunun dışında, uygun bir mitojenik uyaranla bölünmeleri
indüklenen hücrelerde mitoz bölünme, özel bazı kimyasallarla metafaz aşamasında
durdurulabilir. Bunu takiben uygulanan bazı yöntemler sonucunda kromozomlar
incelenebilir hale getirilebilmektedir. Ancak bunun izlenmesi için en azından hücrenin
döngüsü kadar bir sürenin geçmesi gerekmektedir.
Bu laboratuvar çalışmasında, diploid bir bitki olan soğanın (Allium cepa) spontan
hücre bölünmesi yüksek olan kök ucu (meristem) dokusunda mitozun çeşitli
evrelerinin görülmesi planlanmıştır.
D) DENEYİN YAPILIŞI
1.
Mitoz bölünmenin evrelerini görebilmek için, 4-5 gün suda bırakılarak
çimlendirilmiş soğan köklerinin ucundan 5-6 mm’lik parçalar kesilir.
2.
Kesilen soğan kökleri bir deney tüpü içerisine koyulur ve kök uçlarının
üzerini örtecek kadar asetokarmen boyası ilave edilir. Deney tüpü bir tahta maşa
ile tutularak 2-3 dakika kadar kaynatmadan, hafif alevde ısıtılır.
3.
Isıtılan kök uçları soğuduktan sonra, bir tanesi pens ile temiz bir lam üzerine
alınır. 1 veya 2 damla daha asetokarmen damlatılarak lamel ile kapatılır.
4.
Preparat iki parmak arasında sıkılarak, kökün parçalanıp hücrelerin
birbirinden ayrılması sağlanır. Lamelin kenarından taşan boya kurutma kağıdı ile
alınır.
5.
Preparat önce küçük büyütme (10X objektif) ile incelenir. Bölünme aşamaları
görüldüğü zaman büyük büyütmeye (40X objektif) geçilir.
67
Asetokarmen boyasının hazırlanışı:
45 ml Asetik asit, 55 ml saf su ve 3 gr toz karmen karıştırılır.
Asetokarmen boyası; karmen Dactylopius coccus böceğinde mevcut olan kırmızı bir
pigment olan cochinela’dan elde edilen doğal bir boyadır. Bu boya hücre çekirdeklerinin
boyanmasında kullanılır. Asetokarmen dibazik özelliği olan asidik bir boyadır. Asidik
pH’ta çözüldüğünde pozitif yük kazanır ve bazik özellik göstererek kromozomları boyar.
Karışımdaki asetik asit hücre fiksasyonu yaparken kromozom boylarının uzun kalmasını
ve daha kolay incelenmesini sağlar.
Mitoz bölünmenin süresi hücre çeşidine ve çevre koşullarına bağlıdır. Ayrıca her
hücrenin kendine özgü bir bölünme döngüsü vardır. Dolayısıyla komşu hücrelerin bile
birbirlerinden farklı evrelerde olduğu görülebilir. Diğer taraftan hücre döngüsünün
1/20 kadar süresi mitozun aktif bölünmesine, 19/20 kadar süresi ise interfaz süresine
aittir. O halde preparatınızda meristematik dokuların bulunduğu bölgede ancak her 20
hücreden biri mitoz bölünme geçirmektedir. Bunlardan evrelerin süresine uygun olarak
sırası ile en çok profaz, daha az telofaz, en az da metafaz ve anafaz evresindeki
hücrelerin görülmesi beklenir.
Mikroskopta gözlemiş olduğunuz mitozun farklı evrelerinin şekillerini gerekli bilgileri
kullanarak çiziniz ve ayrıca gözlemlerinizi not ediniz. Hazırladığınız preparat
incelenmeye uygun değilse yeni bir preparat hazırlayınız.
68
Gözlemlerinizi çizmek için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
69
PRATİK 9:
HİKAYE ALIMI, PEDİGRİ VE KROMOZOM ELDESİ-I
A) DENEYİN AMACI:
Bu pratikte öğrenilmesi amaçlanan başlıklar şu şekildedir:

Kromozom analizi yapılacak bir olgudan anamnez alınması,

Pedigri çizimi,

Periferik kandan, kısa süreli (72 saat) kültürasyon ile metafaz kromozomlarının
elde edilmesi.
ANAMNEZ (SOY VE ÖZGEÇMİŞ BİLGİSİ) ALINMASI
Çeşitli endikasyonlar (Spontan düşüklerin, mental retardasyonun ve çoklu konjenital
anomalilerin yanı sıra Turner sendromu, Klinefelter sendromu gibi sayısal cinsiyet
kromozom anomalileri ile ilişkili sendromlar veya Down sendromu, Edwards sendromu
gibi sayısal otozomal kromozom anomalileri ile ilişkili sendromlar) ile sitogenetik analiz
için gönderilen hastalardan, daha önce hazırlanmış uygun anamnez formları kullanılarak
hastaya dair bilgiler alınır. Endikasyonlara özgül anamnez formları pratik saatinde
tartışılacaktır.
PEDİGRİ (SOY AĞACI) ÇİZİMİ
Hastalardan anamnez alımı sırasında, aile öyküsü bulunan olguların pedigrisi çıkarılır.
Bu pedigri sayesinde, ailede görülen herhangi bir hastalığın kalıtsal ya da çevresel olup
olmadığını ve eğer hastalık kalıtsal ise, kalıtım şeklini belirlemek mümkündür.
Pedigri çizimine, ailede hastalığın ilk gözlendiği kişiden başlanır ve bu kişiye “indeks
olgu” veya “proband” denir. Aile ağacı çiziminde, erkekler kare (
çember (
) ve kadınlar
) şeklindeki simgelerle gösterilir. İlk kuşaktaki erkek sola, kadın sağa çizilir,
evlilikler kadın ve erkek arasına yatay bir çizgi (
akraba evliliği varsa bu durum, yatay iki çizgi (
) çekilerek belirtilir. Eğer
) ile gösterilir. Kardeşler
doğum sırasına göre, cinsiyetleri de belirtilerek soldan sağa doğru çizilir. Pedigri
çiziminde kullanılan simgeler Şekil 1.’de gösterilmiştir. İndeks olgu (proband) ve aynı
zamanda genetik danışmanlık verilen kişi pedigride bir ok ile gösterilir. Pedigrideki
70
kuşaklar, romen rakamlarıyla (I, II, III, IV gibi) ve kuşak içerisindeki bireyler de, her
kuşakta yeniden başlayacak şekilde, soldan sağa doğru rakamlarla (1, 2, 3 gibi) gösterilir
(Şekil 1).
Evlilik
Akraba evliliği
Bilinmeyen cinsiyet
Hasta birey
Taşıyıcı birey
Monozigotik/Dizigotik ?
/ indeks olgu)
(infertilite)
Birden fazla evlilik
Şekil 1. Pedigri çiziminde kullanılan simgeler (Tıbbi Biyoloji ve Genetik A.B.D.
tarafından modifiye edilmiştir.)
KROMOZOM ELDESİ-I
Sitogenetik; kromozomların morfolojilerini, işlevlerini ve fenotiple olan ilişkilerini
inceleyen genetik biliminin bir alt dalıdır. Sitogenetik analiz için kromozom eldesinde;
periferik kan, kemik iliği, amniyon sıvısı, koryonik villüs materyali, kord kanı, deri ve
benzeri solid doku örnekleri kullanılabilmektedir. Kromozomların elde edilmesinde,
uzun süreli (amniyon sıvısı, koryonik villüs materyali ve deri) ve kısa süreli (periferik
kan, kord kanı ve kemik iliği materyali) hücre kültürü yöntemleri uygulanmaktadır.
71
Laboratuvar çalışmamızda, periferik kandan kısa süreli hücre kültürü yöntemi ile
kromozom
eldesi
gerçekleştirilecektir.
Periferik
kandan
kromozom
eldesinde,
lenfositlerden özellikle T-lenfositlerin in vitro ortamda üretilmesi sağlanmaktadır.
1. Kan alınması ve saklanması: Periferik kandan kısa süreli lenfosit kültüründe,
heparinize (kanın pıhtılaşmasını engeller) edilmiş steril enjektörlere alınan 0.5-2 ml.
venöz kan kullanılır. Alınan kanlar ekim saatine kadar 370C’de, aynı gün ekim
yapılmayacak ise +40C’de saklanabilir.
2. Besiyeri hazırlanması ve ekim: Hastanın klinik ön tanısına göre farklı örnekler,
farklı besiyerleri içerisinde üretilirler.
a) Lenfosit Kültürü İçin Kullanılan Besi Ortamının İçeriği:
Ticari olarak satılan steril 100 ml’lik besi ortamına (RPMI 1640, MEM, Ham’s F10, Mc
Coy’s A, Med 199) – günümüzde kullanılan besiyeri RPMI 1640’dır - steril koşullar
altında aşağıdaki maddelerden belirtilen oranlarda eklenir:
20 ml. Fötal dana serumu*
1 ml. L-Glutamin**
0.1 ml. Penisilin-Streptomisin karışımı ***
* Kültür ortamını zenginleştirmek ve kültürden kromozom elde etme başarı oranını
arttırmak amacıyla fötal dana serumu besiyerine eklenmektedir. Hücre büyüme
faktörleri, adhezyon faktörleri, eser elementler, hormonlar, bağlanma proteinleri ve
vitaminleri içeren pek çok serum içerikleri bulunmaktadır.
** L-glutamin, kültür ortamında hücrelerin enerji üretimi ve protein sentezi için gerekli
olan esansiyel bir amino asittir.
*** Besiyeri ve besiyerine ilave edilen tüm kimyasallar sterildir. Ancak, besiyeri
hazırlanması sırasında, ekim tüplerine materyalin ekimi sırasında olabilecek veya
materyalden kaynaklanabilecek herhangi bir kontaminasyon riskinden dolayı, penisilinstreptomisin
karışımı
gibi
antibiyotikler,
profilaktik
amaçla
besiyerine
ilave
edilmektedir.
b) Kültür tüplerinin hazırlanması
1. Fötal dana serumu, L-Glutamin, Penisilin-Streptomisin eklenen besiyeri, 10 ml’lik
steril vidalı kapaklı tüplere 3 ml. olacak şekilde bölünür.
72
2. 3 ml besiyeri üzerine 75 μl Fitohemaglutinin*, 50 μl Lökosit Büyüme Solüsyonu
(Leukocyte Growth Supplement, LGS)** ve enjektör ile 15 damla Timidin*** eklenir.
* Periferde dolaşan lenfositler olgun hücre olduklarından, normal in vivo koşullarda
yaklaşık %1 oranında mitotik aktivite gösterirler. Bu nedenle, T-lenfositler için mitoz
uyarıcı etkisi olan fitohemaglutinin, besiyerine ilave edilir. Fitohemaglutinin, yeterince
bilinmeyen fakat immünolojik olduğu düşünülen bir mekanizmayla, in vitro koşullarda
T-hücrelerini uyararak, blast yani genç embriyolojik şekillerine dönüştürür ve mitotik
aktivitelerini % 8’e kadar yükseltir.
** Büyüme faktörlerince zengin LGS de T hücrelerin büyümelerini hızlandırarak
bölünme indekslerini arttırır.
*** Timidin ise bir baz analoğu olup, DNA zincirine girerek daha uzun boylu
kromozomlar elde edilmesini sağlar.
c) Ekim: 3 ml besiyeri bulunan steril kültür tüpüne 6-8 damla heparinize edilmiş
periferik kan damlatılır. Vidalı kapaklı tüpler kapatılır ve yavaşça karıştırılır. Tüpler yan
yatırılarak, 37°C’lik etüvde 72 saat inkübe edilir.
73
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
74
PRATİK 10:
KROMOZOM ELDESİ-II. AŞAMA
a) Kromozomların Elde Edilmesi (Harvest):
1. 68’inci saatte Timidin uzaklaştırılır.
Kültür tüpü, 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilir, dökelti (süpernatant) atılır,
çökelti (pelet) üzerine 3 ml hazır besiyeri eklenir. Kültür tüpü 37°C’deki etüve
geri konur.
2. 69,5’inci saatte, kültür tüpüne 50 μl CRA eklenir.
(CRA: Chromosome Resolution Additive; kromozom çözünürlüğü arttırıcı)
CRA, kromozomun sıkı paketlenmiş yapısındaki kimyasal bağları gevşeterek,
kromozomların daha uzun boylu olarak elde edilmesine yardımcı olur. CRA
eklendikten sonra kültür tüpü 37°C’deki etüve geri konur. (Not: CRA eklenmesi
her ne kadar kromozomların daha kolay incelenmesine olanak sağlasa da
kromozom eldesi için mutlaka kullanılması gereken bir ajan değildir.)
3. 71’inci saatte 100 μl metafaz bloke edici solüsyon eklenir.
Metafaz bloke edici solüsyon olarak MAS kullanılır (MAS: Metaphase Arresting
Solution; metafaz bloke edici solüsyon). MAS, kolçisin ve vinblastin sülfat
karışımıdır.
Kolçisin,
polimerizasyonunu
serbest
engellediğinden,
tübülinlere
mitotik
bağlanarak
bölünmeyi
mikrotübül
durdurmak
için
kullanılan bir kimyasaldır. İğ iplikçiklerini kırarak mitozu metafaz evresinde
durdurur. Böylelikle kromozomlar, en belirgin ve mikroskop altında görülebilir
halinde elde edilebilir. Vinblastin sülfat da mitozu engelleyen bir başka ajandır.
MAS eklendikten sonra kültür tüpü 37°C’deki etüve geri konur. Bazı durumlarda
MAS yerine sadece kolçisin kullanılarak da bu aşama gerçekleştirilebilmektedir.
4. Süre sonunda (72’inci saat) kültür tüpü 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilir.
5. Dökelti atılır. Çökelti elle karıştırılır.
6. Üzerine 6 ml. hipotonik solüsyonu (0.075 M KCl) vorteks ile karıştırılarak
eklenir.
37°C’deki etüvde 15 dakika inkübe edilir.
Hipotonik solüsyonu, eritrositlerin parçalanmasını ve metafaz evresindeki
lenfositlerin şişmesini sağlamak için kullanılmaktadır.
75
7. Süre sonunda tüp vorteks ile karıştırılırken 0.5 ml yeni hazırlanmış fiksatif
solüsyonu eklenir. Bu aşama ön-fiksasyon olarak adlandırılır. Fiksatif solüsyonu,
3:1 oranında metanol ve glasiyel asetik asit karışımından oluşmaktadır.
8. Tüp 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilir.
9. Dökelti atılır. Çökelti elle yavaşça karıştırılır.
10. Üzerine 5 ml fiksatif solüsyonu vortekslenerek ilave edilir.
Fiksatif solüsyonu, hücreleri fikse etmek, patlayan eritrositleri ve hemoglobini
uzaklaştırmak için kullanılmaktadır.
11. 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilir.
12. Fiksatif solüsyonu ile yıkama işlemi 3 kez tekrarlanır.
13. Üçüncü fiksatif solüsyonu eklenince, tüpler -20oC’de 10 dakika bekletilir.
14. Tüp 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilerek yayma için kullanılacak olan çökelti
elde edilir.
b) Yayma:
1. Santrifüj tüpünün dibinde çökelti üzerinde 0.5 ml. fiksatif kalacak şekilde üst
kısım atılır.
2. Çökelti iyice karıştırılır. Çökelti çok yoğun ise, 2:1 oranında metanol ve glasiyel
asetik asitten oluşan fiksatif solüsyonu ile seyreltilir (dilüe edilir). Uygun
şartlarda (ki bu şartlar ortalama olarak %45-50 oranında nem ve 25°C sıcaklıktır)
çökeltiden pastör pipeti yardımıyla bir damla alınarak nefesle yüzeyi
nemlendirilmiş lamlara (distile su içinde +4°C’de bekletilmiş) yayma yapılır.
3. Mikroskobun diyaframı kapatılarak 10X objektifte metafaz sıklığı ve kalitesi
kontrol edilir.
4. Yayma yapılan preparatlar, 37°C’de üç gün ya da 60°C’ de bir gece
yaşlandırılır.
76
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
77
PRATİK 11:
KROMOZOMLARIN TANIMLANMASI VE BANTLANMASI
GTG (G banding by Tripsin using Giemsa) Bantlama: GTG bantlama, kromozom
boyunca açık ve koyu bantlar meydana getirerek her bir kromozomun kendine özgü
tanınabilir bantlarını almasını sağlar ve böylece sayısal ve yapısal olarak
kromozomların incelenebilmesine olanak verir. Bu özelliklerinden dolayı sitogenetik
laboratuvarlarında en çok tercih edilen bantlama yöntemidir. Bu laboratuarda GTG
bantlama yöntemi gerçekleştirilecektir ve yöntemin uygulanabilmesi için gerekli
solüsyonlar aşağıda verilmektedir.
Tripsin Solüsyonu:
0.2 gr. Tripsin 100 ml KH2PO4 solüsyonu içerisinde çözülür.
Giemsa Boyası için kullanılan Sörensan Tamponu :
KH2PO4 ve Na2HPO4 solüsyonlarının farklı hacimdeki karışımları ile elde
edilir:
KH2PO4 solüsyonu: 9.08 gr KH2PO4, 1000 ml bdH2O (bidistile su
içerisinde çözülür, pH:7.00’ye ayarlanır.+4 °C’de saklanır.
Na2HPO4 solüsyonu: 11.88 gr Na2HPO4.12H2O, 1000ml bdH2O
içerisinde çözülür, pH:7.00’ye ayarlanır. +4°C’de saklanır.
57.1 ml KH2PO4 solüsyonu ve 47.9 ml Na2HPO4 solüsyonu ile toplam hacim
100 ml olacak şekilde Sörensan solüsyonu hazırlandıktan sonra karışımdan 4,5 ml alınıp
atılır ve 4,5 ml Giemsa boyası eklenerek % 4,5’ luk Giemsa solüsyonu hazırlanmış olur.
1. Yaşlandırılmış olan preparatlar, 32°C’de tutulan % 0.2’lik tripsin
solüsyonu ile 1-2 dakika muamele edilir. Süre sonunda preparatlar çeşme
suyundan geçirilir. Tripsin, kromozom paketlenmesinde görev alan
proteinleri yıkan bir proteazdır.
2. Preparatlar oda ısısında tutulan ve taze hazırlanan % 4,5’luk Giemsa
boyasında 5-6 dakika tutulur. Giemsa, tripsin muamelesi sonunda
kromozom üzerinde açığa çıkan A=T’ce zengin DNA bölgelerine daha
78
yüksek afinite ile bağlanarak bu bölgeleri daha koyu boyayan bir DNA
boyasıdır.
3. Boyadan çıkarılan preparatlar çeşme suyundan geçirilir. Kurutma kağıdı
arasında nazikçe kurutulur. Mikroskop altında 10X’de metafazlar
bulunduktan sonra, preperat üzerine 1 damla immersiyon yağı damlatılarak
100X’de kromozomların bant alıp almadığı kontrol edilir (Şekil 1a) ve
karyogramı hazırlanarak analiz edilir (Şekil 1b). 100X objektifte kontrol
edebilmek için preparatların üzerine immersiyon yağı damlatıldığından,
preparatların bu yağdan arınabilmesi için 15 dakika Ksilol içinde tutulması
gerekir.
Şekil 1a. GTG bantlama tekniği ile hazırlanmış
normal bir erkek bireye ait metafaz örneği
79
Şekil 1b. GTG bantlama tekniği ile hazırlanmış
normal bir erkek bireye ait karyogram örneği
Alternatif Yöntemler
1.CBG (C-bands by Barium hydroxide using Giemsa) Bantlama: CBG
yöntemi, GTG bantlama yöntemi uygulandıktan sonra yapısal anomali
görülen kromozomların ve markır kromozomların (yapısal olarak
tanımlanmış
hiçbir
kromozama
benzemeyen
henüz
tanımlanması
yapılmamış olan kromozom) değerlendirilmesinde, sentromerlerin ve Y
kromozomunun heteromorfik varyantlarının gösterilmesinde kullanılır.
CBG bantlama tekniği üç aşamalıdır:
I. aşama; 1N HCL (Asit) ile muamele); DNA omurgasına dokunmadan
pürin bazlarının uzaklaştırılması (Kısmi depürinizasyon)
II. aşama; Ba(OH)2: Baryum Hidroksit (Alkali) ile muamele; DNA’nın
denaturasyonu
III. aşama; 2xSSC ( sıcak tuz solüsyonu) ile muamele; Kromozomların
80
sentromer bölgeleri yüksek oranda heterokromatinizasyon gösterdiklerinden
ve bu bölgeler denaturasyona daha dayanıklı
işleminden sonra uygulanan Giemsa
olduğu için yıkama
boyama ile kromozomların
sentromerleri koyu renkte görülürler (Şekil 2).
Şekil 2. CBG bantlama tekniği uygulanmış metafaz örneği
2. NOR (Nucleolar Organizing Regions) Boyama : NOR boyama tekniği
ise
GTG
batlama
kromozomların
yöntemi
nükleolar
uygulandıktan
bölgelerinin
gümüş
sonra
akrosentrik
nitrat
kullanılarak
boyandığı bir tekniktir. Nükleolar bölgeler, akrosentrik kromozomların
kısa kollarında ‘ satellit’ olarak adlandırılan bölgeler olup ribozomal
RNA genlerini içeren bölgelerdir. Bu bölgelerde bulunan Ag(gümüş)
bağlama affinitesi yüksek proteinler sayesinde bu bölgeler koyu renkte
boyanırlar
(Şekil
3).
Nükleolar
bölgelerin
farklı
boyanma
özelliklerinden yararlanılarak, satellit yapısına özgü heteromorfizmler ve
markır kromozomların satellit içerip içermedikleri gösterilmektedir.
81
Şekil 3. NOR boyama tekniği uygulanmış metafaz örneği
Analiz sonucu hastanın karyotipi, Uluslarası Sitogenetik Terminolojisi’ne (ISCNInternational System for Human Cytogenetics Nomenclature) göre yazılarak rapor
hastaya verilir ve hekimine gönderilir. Raporun sonucuna göre hastaya ve yakınlarına
gerekli
genetik
danışmanlık
82
verilir.
Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.
83
PRATİK 12:
SİTOGENETİK BULGULARIN RAPORLANDIRILMASI
SİTOGENETİK RAPOR YAZIMI
Sitogenetik analiz sonucunda gözlenen bulgular rapor halinde hastalara verilmektedir.
Örnekler EKTE sunulmuştur. Raporlandırmalarda kullanılan kısaltmalar ISCN 2013
indeksine göre aşağıda belirtilmiştir.
p: kromozomun kısa kolu
q: kromozomun uzun kolu
ter: kromozomun terminal bölgesi
+ : artış gösteren kromozomun ön tarafına konulan işarettir.
mos: mosaisizm
del: delesyon
dup: duplikasyon
inv: inversiyon
i: izokromozom
r: ring(halka) kromozom
t: translokasyon
mar: markır kromozom
der: derivatif (başkalaşmış)
dic: disentrik
mat: maternal
pat: paternal
dn: de novo (kromozom değişikliğinin ilk gözlendiği durum)
84
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU
RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NASYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 47,-,+21
Sendromu: Down sendromu
Endikasyon: İkili testte risk
Yorum: : Dr. ............... tarafından gebeliğin16. haftasında uygulanan biyopsi ile
kazanılan 20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG
yöntemi ile metafazların analizi sonucunda Trizomi 21 gözlenmiştir.
Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon
ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom
anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
85
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
86
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU
RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NASYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 47,-,+18
Sendromu: Edwards sendromu
Endikasyon: Üçlü testte risk
Yorum: : Dr. ............... tarafından gebeliğin18. haftasında uygulanan biyopsi ile
kazanılan 20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG
yöntemi ile metafazların analizi sonucunda Trizomi 18 gözlenmiştir.
Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon
ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom
anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
87
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
88
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
DÜŞÜK MATERYALİ/GONAD BİYOPSİSİNDEN/ DİĞER DOKULARDAN
KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Düşük Materyali/Gonad
Biyopsisinden/DiğerDokulardan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NFEYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 47,XX,+13
Sendromu: Patau sendromu
Endikasyon: İntrauterin ex
İncelenen Materyal: Düşük Materyali
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda incelenen tüm hücrelerde
47,XX,+13 karyotipi gözlenmiştir.
Not: Anne tekrar hamile kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
89
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
90
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Tıbbi Genetik
(Diğer Branşlar)
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 50
Karyotipi: mos 47,XX,+21[10]/46,XX[40]
Sendromu: Mozaik Down sendromu
Endikasyon: Down sendromu?
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda incelenen 50 hücrenin
10’unda (%20 oranında) 47,XX,+21 karyotipi gözlenmiştir.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
91
İmza
47,XX,+21
92
46,XX
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
KORYON VİLLUS ÖRNEĞİNDEN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK
SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Koryon Villus Örneğinden
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
CVSYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 45,X
Sendromu: Turner sendromu
Endikasyon: USG’de anomali
Yorum: Dr. ......... tarafından gebeliğin 12. haftasında uygulanan biyopsi ile kazanılan
CVS (Koryonik villus örneği) örneği hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG
yöntemi ile metafazların analizi sonucunda tüm hücrelerde 45,X karyotipi
gözlenmiştir.
Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon
ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom
anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
93
İmza
94
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU
RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NASYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 47,XXX
Sendromu: Triple X sendromu
Endikasyon: İleri yaş
Yorum: Dr. ....... tarafından gebeliğin 18. haftasında uygulanan biyopsi ile kazanılan
20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG yöntemi ile
metafazların analizi sonucunda 47,XXX karyotipi gözlenmiştir.
Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon
ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom
anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
95
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
96
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU
RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NASYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 47,XXY
Sendromu: Klinefelter sendromu
Endikasyon: İleri yaş
Yorum: Dr. ....... tarafından gebeliğin 19. haftasında uygulanan biyopsi ile kazanılan
20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG yöntemi ile
metafazların analizi sonucunda 47,XXY karyotipi gözlenmiştir.
Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon
ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom
anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
97
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
98
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU
RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NASYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 47,XYY
Sendromu:
Endikasyon: İleri yaş
Yorum: : Dr. ............... tarafından gebeliğin17. haftasında uygulanan biyopsi ile
kazanılan 20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG
yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 47,XYY karyotipi gözlenmiştir.
Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon
ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom
anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
99
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
100
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 50
Karyotipi: mos 47,XXX[15] / 46,XX[35]
Sendromu: Mozaik Triple X sendromu
Endikasyon: IVF başarısızlığı
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda incelenen 50 hücrenin
15’inde (%30 oranında) 47,XXX karyotipi gözlenmiştir.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
101
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
46,XX
102
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
DÜŞÜK MATERYALİ/GONAD BİYOPSİSİNDEN/ DİĞER DOKULARDAN
KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Düşük materyali/gonad
biyopsisinden/ diğer dokulardan
kromozom analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NFEYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 69,XXY
Sendromu:
Endikasyon: İntrauterin ex
İncelenen Materyali: Düşük materyali
Yorum:. GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 69,XXY karyotipi
gözlenmiştir.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
103
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
104
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Yenidoğan Kliniği
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 46,XX,del(1)(q42.1) dn,inv(9)(p11q13) mat
Sendromu:
Endikasyon: Mental retardasyon
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 1 numaralı
kromozomlardan birinin uzun kolunun q42.1-qter bölgesinin delesyonu saptanmıştır.
Bu değişikliğinin orijininin belirlenmesi için anne ve babaya kromozom analizi
yapılmış ve karyotipleri normal olarak bulunmuştur.
Ayrıca olguda, 9 numaralı kromozomlardan birinin p11 ve q13 bölgelerinin işe
karıştığı perisentrik inversiyon gözlenmiştir. Bu bulgu literatürde heteromorfizm
olarak değerlendirilmekte ve normal kabul edilmektedir. Ebeveyinlerinden yapılan
kromozom analizinde de bu inversiyonun anne tarafından taşındığı tespit edilmiştir.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
105
İmza
106
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: TIBBİ GENETİK
(Diğer Branşlar)
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı:20
Karyotipi: 46,XY,dup(1)(q31.1q32.3) dn
Sendromu:
Endikasyon: MKA (Majör konjenital anomali),MR (Mental Retardasyon)
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların incelenmesi sonucunda 1 numaralı
kromozomlardan birinin uzun kolunda q31.3 ve q32.3 bölgesinin duplikasyonu
gözlenmiştir. Duplikasyon gözlenen 1 numaralı kromozomun orijinin belirlenebilmesi
için anne ve babadan kromozom analizi yapılmış ve ebeveynlerin kromozomal bir
anomali taşımadığı gözlenmiştir.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
107
İmza
108
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Ped. Endokrinoloji
Plk.
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG,CBG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 100
Karyotipi: mos 45,X[64]/46,X,idic(X)(p11.21)[36]
Sendromu: Varyant Turner sendromu
Endikasyon: Turner sendromu ?
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda %64 oranında 45,X ve
%36 oranında 46,X,idic(X) (çift sentromerli izokromozom) karyotipi saptanmıştır.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
109
İmza
45, X
46,X,idic(X)
110
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: TIBBİ GENETİK
(Diğer Branşlar)
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 46,X,r(X)(p22q28)
Sendromu:
Endikasyon: Gelişme geriliği
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda X kromozomlarından
birinin p22 ve q28 bölgelerinde meydana gelen iki kırık sonucu oluşan ring X
kromozomu gözlenmiştir.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
111
İmza
112
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Ped.Nöroloji
Polikliniği
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG, CBG, NOR
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 47,XY,+der(14)t(10;14)(p15;q13) mat
Sendromu:
Endikasyon: Hidrosefali
Yorum: GTG yöntemiyle metafazların analizi sonucunda değerlendirilen tüm
hücrelerde 47. Kromozom olarak bir markır kromozom gözlenmiştir. Olgunun
kromozomlarının NOR ve CBG yöntemleri ile incelenmesi sonucunda markır
kromozomun tek sentromerli ve satellitli olduğu belirlenmiştir. Annenin
kromozomlarının incelenmesi sonucunda 10 numaralı kromozomlardan birinin p15
bandı ile 14 numaralı kromozomlardan birinin q13 bölgelerinin işe karıştığı karşılıklı
translokasyon belirlenmiştir. Bu bulgu, çocukta gözlenen markır kromozomun
orijinin, annenin kromozomlarında meydana gelen translokasyon sonucu oluşan
derivatif 14 numaralı kromozom olduğunu ve olgunun 10 numaralı kromozomun
p15→pter bölgesi ve 14q13→pter bölgelerinin parsiyel trizomisine sahip olduğunu
göstermektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
113
İmza
çocuk
anne
114
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
KEMİK İLİĞİNDEN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Kemik İliği Kromozom
Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Hematoloji Birimi
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKİYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Direkt ve Kısa Süreli Doku Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 15
Karyotipi:46,XY,t(9;22)(q34:q11)[13] / 46,XY[2]
Endikasyon: Kronik Myeloid Lösemi
Yorum: Olgunun incelenen 15 metafazının 13’ünde %87 oranında t(9;22)
translokasyonu gözlenmiştir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
115
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
116
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDANKROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Pediatri Gen. Pol.
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG,CBG,NOR
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 47,XY,+mar
Sendromu:
Endikasyon: MKA
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda değerlendirilen hücrelerin
tümünde ilave bir markır kromozom gözlenmiştir.
Bu markır kromozomun CBG yöntemi ile tek sentromerli, NOR yöntemi ile de
satellitsiz olduğu belirlenmiştir. Markır kromozomunun orijininin saptanabilmesi için
FISH tekniği uygulanması gerekmektedir.
Not: Bu sonuç, submikroskobik koromozom aberasyonlarını, DNA’daki gen
defektlerini ve nadir mozaikliği dışlamamaktadır.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
117
İmza
118
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDANKROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Pediatrik Genetik
Polk.
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı:
Karyotipi: 45,XX,der(14;21)(q10;q10)
Sendromu:
Endikasyon: Anomalili çocuk öyküsü
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 45, XX karyotipi belirlenen
olguda, 14 ve 21 numaralı kromozomlardan birer tanesi arasında karşılıklı
translokasyon gözlenmiştir (14 ve 21 numaralı kromozomların kısa kollarında birer
kırık oluşmuş ve bu iki kromozom kırık noktalarından birleşerek yeni bir derivatif
kromozom oluşturmuştur). 14 ve 21 numaralı kromozomların kısa kollarının kaybı ile
oluşan bu derivatif kromozomdaki kayıplar genomik bir kayıp olarak
düşünülmemekte (akrosentrik diğer kromozomların kısa kollarında lokalizasyon
gösteren aynı genlerin sentezi nedeniyle) ve fetusta fenotipe yansıması
beklenilmemektedir.
Not: Anne gebe kaldığında genetik danışmanlık verilmesi önerilir.
Görevi
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
119
Adı-Soyadı
İmza
120
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Periferik Kandan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Pediatrik Genetik
Polk.
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKAYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı:
Karyotipi: 46,XX,der(14;21)(q10;q10) mat,+21
Sendromu: Robertsonyan Tipi Down Sendromu
Endikasyon: Down Sendromu?
Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda, 14 ve 21 numaralı
kromozomlardan birer tanesi arasında karşılıklı translokasyon gözlenmiştir (14 ve 21
numaralı kromozomların kısa kollarında birer kırık oluşmuş ve bu iki kromozom kırık
noktalarından birleşerek yeni bir derivatif kromozom oluşturmuştur). Olgunun
annesinde bulunan ve üzerinde 21 numaralı kromozomu da bulunduran derivatif
14’ün oğul döle geçmesiyle bu olguda toplam kromozom sayısı 46 olmasına rağmen 3
adet 21 numaralı kromozoma sahip olmasından dolayı olgu, translokasyon tipi Down
olarak değerlendirilmiştir.
Görevi
Adı-Soyadı
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
121
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
122
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU
RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti:
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan
Kromozom Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Kadın Hast. ve Doğ.
Polk.
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NASYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20
Karyotipi: 46,XY,inv(5)(p15.1q23.2) pat
Sendromu:
Endikasyon: Triple Testte Risk
Yorum: Dr. ................ tarafından gebeliğin 15. haftasında uygulanan biyopsi ile
kazanılan 20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG
yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 5 numaralı kromozomlardan birinde
perisentrik inversiyon (bu kromozomun kısa ve uzun kolunda birer kırık oluşarak
aradaki parçanın 180 derece dönüp aynı yere yapışması durumu) gözlenmiştir. Aynı
kromozom bulgusunun fetüsün babasında da gözlenmesi nedeniyle bu bulgunun
fenotipi etkilemeyeceği düşünülmektedir.
Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon
ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom
anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.
Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
123
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
124
T.C
AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ
Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)
KEMİK İLİĞİNDEN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU
Adı Soyadı:
TC Kimlik No:
Doğum Tarihi:
Cinsiyeti: Erkek
Dosya(Barkod):
İstem tarihi:
Hizmet Adı: Kemik İliği Kromozom
Analizi
Kurum:
Başvuru No:
Müracaat Tarihi:
Gönderen Birim: Hematoloji Polk.
Gönderen Doktor:
Onay Tarihi:
Onaylayan:
NKİYapılan Test: Kromozom Analizi
Kullanılan Yöntem: Direkt ve Kısa Süreli Doku Kültürü
Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG
Değerlendirilen Hücre Sayısı: 10
Karyotipi: //46,XX[10]
Endikasyon:
Yorum: : Olgunun incelenebilen 10 metafazında vericiye ait [46,XX] karyotip
gözlenmiştir.
Görevi
Adı-Soyadı
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr. Üye.
Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu
125
İmza
K-Q
TSE-ISO-EN
9000
126