kolorektal kanserli olgularda oksidatif stresin araştırılması

T.C.
TRAKYA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
BİYOKİMYA ANABİLİM DALI
Tez Yöneticisi
Doç. Dr. Sevgi ESKİOCAK
KOLOREKTAL KANSERLİ OLGULARDA
OKSİDATİF STRESİN ARAŞTIRILMASI
(Uzmanlık Tezi)
Dr. Sabriye KAYA
EDİRNE-2010
TEŞEKKÜR
Uzmanlık
eğitimim
süresince
bilgi
ve
tecrübeleriyle bana yol gösteren, yönlendiren, tez
çalışmamda çok değerli katkıları olan Biyokimya
Anabilim Dalı öğretim üyesi ve danışmanım sayın Doç.
Dr. Sevgi ESKİOCAK başta olmak üzere Anabilim dalı
başkanımız sayın Prof. Dr. Erol ÇAKIR’a, sayın Prof.
Dr. Selma SÜER GÖKMEN’e, sayın. Doç. Dr. Hakan
ERBAŞ’a, Fakültemiz İç Hastalıkları Anabilim Dalı,
Gastroenteroloji Bilim Dalı öğretim üyeleri Prof. Dr. H.
Ahmet TEZEL’e, Doç. Dr. Ali Rıza SOYLU’ya, Yrd.
Doç. Dr. Hasan ÜMİT’e, Özel Ekol Hastanesi
Gastroenteroloji Uzmanı Dr. Sedat ÖZDEMİR’e ve
Genel Cerrahi Uzmanı Dr. Zeliha TÜRKYILMAZ’a,
çalışmamızı destekleyen Trakya Üniversitesi Bilimsel
Araştırma Projeleri’ne ve tüm çalışma arkadaşlarıma
teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER
GİRİŞ VE AMAÇ............................................................................................ 1
GENEL BİLGİLER ........................................................................................ 4
SERBEST RADİKALLER ....................................................................................... 4
ANTİOKSİDAN SİSTEMLER ................................................................................ 20
KOLOREKTAL KANSER ....................................................................................... 21
KANSER VE OKSİDATİF STRES ......................................................................... 23
GEREÇ VE YÖNTEMLER ........................................................................... 28
BULGULAR .................................................................................................... 34
TARTIŞMA ..................................................................................................... 42
SONUÇLAR..................................................................................................... 50
ÖZET ................................................................................................................ 52
SUMMARY ...................................................................................................... 54
KAYNAKLAR ................................................................................................. 56
EKLER
SİMGE VE KISALTMALAR
ADA
: Adenozin deaminaz
AP-1
: Aktivatör protein-1
BH4
: Tetrahidrobiopterin
cGMP
: Siklik guanozin monofosfat
COX-2
: Siklooksijenaz-2
DNA
: Deoksiribonükleik asit
EDRF
: Endotelden kaynaklanan gevşetici faktör
ELISA
: Enzyme Linked Immunosorbent Assay
eNOS
: Endotelyal nitrik oksit sentaz
ETZ
: Elektron transfer zinciri
FAD
: Flavin adenin dinükleotid
FMN
: Flavin adenin mononükleotid
GPx
: Glutatyon peroksidaz
GR
: Glutatyon redüktaz
GSH
: Glutatyon
H•
: Hidrojen radikali
HOCl
: Hipokloröz asit
HO2•
: Hidro peroksil radikali
HOX
: Hipohalöz asit
HPLC
: Yüksek performanslı sıvı kromatografi
IL-1
: İnterlökin-1
iNOS
: Uyarılabilir nitrik oksit sentaz
KAT
: Katalaz
L
•
: Lipid radikali
LO•
: Lipid alkoksil radikali
LOO•
: Lipid peroksil radikali
LOOH
: Lipid hidroperoksit
MDA
: Malondialdehid
M1dG
: Malondialdehid deoksiguanozin
MMP
: Matriks metalloproteinaz
MPO
: Miyeloperoksidaz
NAD
: Nikotinamid adenin dinükleotid
NADH
: Nikotinamid adenin dinükleotid (indirgenmiş)
NADPH
: Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (indirgenmiş)
NFκB
: Nükleer faktör kappa B
NO•
: Nitrik oksit
NO2
: Nitrojen dioksit
NOS
: Nitrik oksit sentaz
nNOS
: Nöronal nitrik oksit sentaz
NOx
: Nitrojen oksit
NOX
: NADPH oksidaz
NSAİ
: Nonsteroid antiinflamatuar ilaç
NT
: Nitrotirozin
O3
: Ozon
O2•⎯
: Süperoksit anyon radikali
1
O2
: Singlet Oksijen
•
OH
: Hidroksil radikali
ONOO-
: Peroksinitrit
PMNL
: Polimorfo nükleer lökosit
PTEN
: Fosataz ve tensin homoloğu
R•
: Serbest radikal
RNT
: Reaktif nitrojen türevi
RO•
: Alkoksil radikali
ROO•
: Serbest oksijen radikali
ROT
: Reaktif Oksijen Türevi
SCN¯
: Tiyosiyanat
SH
: Tiyol
SOD
: Süperoksit dismutaz
TBA
: Tiobarbitürik asit
TNF-α
: Tümör nekrozis faktör-α
XDH
: Ksantin dehidrojenaz
XOD
: Ksantin oksidaz
GİRİŞ VE AMAÇ
Kolorektal kanser günümüzde en sık görülen kanserler arasında üçüncü sırada yer
almaktadır. Erkeklerde yaygınlık bakımından prostat kanserinden sonra ikinci sırada;
kadınlarda ise meme ve serviks kanserinden sonra üçüncü sırada yer almaktadır (1).
Ülkemizde de sindirim sistemi kanserleri arasında mide kanserinin başta geldiği ve
bunu kolon kanserinin izlediği kabul edilmektedir. Ancak son yıllarda yurdumuzda kolon
kanserlerinde belirgin bir artış olduğu kabul edilmektedir. Sağlık bakanlığının verilerine göre
bu oran giderek artmaktadır (2).
Gastrointestinal kanal, özellikle kolonda sürekli olarak reaktif oksijen türleri (ROT)
üretilmektedir. Oksidatif stres, doku veya hücrede oluşan ROT’un konsantrasyonunun
antioksidan kapasiteyi aşması olarak tanımlanır. Oksidanlar belirli düzeyin üzerine çıkar veya
antioksidanlar yetersiz olursa yani denge bozulursa söz konusu oksidan moleküller
organizmanın yapı elemanları olan protein, lipid, karbonhidrat, nükleik asitler ve yararlı
enzimleri bozarak zararlı etkilere yol açarlar. Oksidatif stres, geri dönüşümlü ya da
dönüşümsüz hücre hasarına yol açar. Oksidatif stres akut ya da kronik olabilir.
İskemi-reperfüzyonda, akut inflamasyonda ve hiperokside kısa süreli bir oksidatif stres
varken, kronik inflamasyonda uzun süreli bir oksidatif stres vardır. Bu uzun süreli oksidatif
stresin kanser gelişiminde rol oynadığı ileri sürülmektedir (3). Çoğu hastalıklarda ROT
düzeyinin artışı hastalığın sebebi değildir, primer bozukluğa ikincil olarak oluşurlar ve
ardından patogenezde yer alırlar (4). Kolorektal kanser gelişiminde, mukozadaki oksidatif
stresin önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Kolon lümenindeki ROT direkt genotoksik
etkileri yanında fekal mutajen oluşmasına yol açarlar (3).
1
Lipid peroksidasyonu bir tür oksidatif doku hasarı olup çoklu doymamış yağ asitlerini
ve kolesterolü etkilemektedir. Hidrojen peroksit (H2O2) ve süperoksit radikallerine (O2•⎯)
maruz kalan hücrelerin membranlarında hasarlanma, hücre organellerinin kaybı ve sitozolik
aldehid ve peroksit ürünlerinin oluşumu gözlenir. Malondialdehid (MDA) oluşumu lipid
peroksidasyonunun iyi bir göstergesidir. Kolorektal kanserlerde malign dokuda çevre sağlam
dokuya göre MDA düzeylerinde %111’lere varan artışlar bildirilmiştir (5). Skrzydlewska ve
ark. (6) kolorektal kanserli hastaların çevre sağlam dokuya göre tümör dokularında katalaz
(KAT) düzeyi azalırken; MDA, süperoksid dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPX) ve
glutatyon (GSH) düzeyinin arttığını, tümöral evre ilerledikçe GSH’ın azaldığını
bildirmişlerdir.
Nitrik oksit (NO•) oldukça reaktif bir serbest radikaldir. Yarı ömrü sadece bir kaç
saniyedir ve kolayca süperoksit gibi serbest radikallerle birleşir. Biyolojik sistemlerde hızla
nitrit ve nitrata parçalanır (7,8).
Nitrik oksit çok kısa yarı ömrü ve reaktivitesi nedeniyle lokal bir haberci olarak etki
eder, sinyal iletimi, apoptozis gibi birçok biyolojik olayda rol oynar. Apoptozis gibi koruyucu
mekanizmaların bozulduğu karsinogeneziste NO• önemli rol oynamaktadır. Fonksiyonel p53
geni taşımayan HT-29 kolon kanseri hücrelerinde NO• konsantrasyonunun artması ile
mitokondrial süperoksit anyon radikallerini toplayarak apopitozu inhibe ettiği bildirilmiştir
(9). Nitrik oksit'in, süper oksit radikali (O2•⎯) ile in vivo reaksiyonu sonucu oluşan bir türev
olan peroksinitrit (ONOO⎯) proteinlerdeki tirozin kalıntılarını nitratlayarak nitrotirozin (NT)
oluşturur.
Lökositlerdeki solunum patlaması ROT oluşumu için önemli kaynaklardan birini
oluşturmaktadır. Aşırı lökosit aktivasyonu ROT oluşumunun artmasına ve doku hasarının
oluşumuna yol açabilir. Literatürde kolon kanseri olgularında lökosit aktivasyonunun
göstergesi olan miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesinin çalışıldığı çok az çalışma mevcuttur.
Literatürde lipid peroksidasyon ürünleri, NO• ile kolorektal kanserler arasındaki
ilişkiyi inceleyen çalışmalar mevcuttur. NT ile kolorektal kanser arasındaki ilişkiyi inceleyen
tek çalışmaya rastlanmıştır. Kolorektal kanserde ROT artışına yol açan nedenler, kolon
dokusunda lipidler üzerine oluşturduğu etkiler konusunda halen yanıtlanmamış sorular
bulunmaktadır.
Bu çalışmamızda önemli sağlık sorunu olan, yaşam kalitesini düşüren, iş-güç kaybına
yol açan kolorektal kanserde oksidatif ve nitrozatif stresi incelemeyi, lökosit aktivasyonu ile
ilişkisini ortaya koymayı amaçladık. Bunu değerlendirmek amacıyla kolorektal kanser tanısı
2
almış olan hastaların plazmalarında NT, NO• ve MPO, serumlarında MDA analizlerini
yapmayı hedefledik.
3
GENEL BİLGİLER
SERBEST RADİKALLER
Atomlar, nötron ve protondan oluşan pozitif yüklü bir çekirdekle, çekirdeğin
çevresinde bulunan negatif yüklü elektronlardan oluşmaktadır. Enerji düzeylerine göre belirli
bir düzende yerleşen elektronlar, orbital adı verilen yörüngelerde hareket etmektedirler. Her
orbitalde yerleşik iki elektron, birbirine zıt yönde kendi ekseni etrafında dönmektedir.
Orbitallerden birine veya ikisine ters dönüşlü bir veya ters dönüşlü iki elektron yerleşmesi ile
radikal oluşmaktadır. Serbest radikaller, atomik veya moleküler yapılarında bir veya daha
fazla sayıda eşlenmemiş tek elektron içeren kararsız moleküllerdir. Bu tek elektron çiftlenme
eğiliminde olduğundan, serbest radikaller ileri derecede reaktiftir (10).
Bir serbest radikalin dış yörüngesinde çiftlenmemiş bir tek elektronun varlığı
geleneksel olarak üzerine bir nokta konularak (R•) gösterilir. En basit serbest radikal hidrojen
radikali (H•) yani hidrojen atomu olup bir proton ve bir adet çiftlenmemiş elektron içerir (10).
Radikaller başlıca 2 yolla oluşur;
1) Homolitik bölünme: Kovalent bağlı bir molekülün, her bir parçasındaki ortak
elektronlardan birisinin homolitik bölünmesi sonucunda ortaklanmamış elektronlar taşıyan
molekül veya atomlar meydana gelir. Yüksek ısı, ultraviyole ışını ve iyonize edici radyasyon
kovalent bağın ayrılması için gerekli enerjiyi sağlayabilir.
X:Y
X• + Y•
2) Normal bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi: Biyolojik sistemlerde serbest
radikaller en çok bu yolla meydana gelir (10).
A + e⎯
A•¯
Oksijen ortamda sürekli bulunan ve elektron ilgisi yüksek olan bir element olduğu için
4
aerobik organizmalarda bu radikaller daha çok oksijen radikalleri şeklinde kendini gösterir
(10).
Radikaller diğer moleküller ile çeşitli şekillerde reaksiyona girerler. İki radikal
karşılaştığında paylaşılmamış elektronlarını birleştirirler ve kovalent bir bağ oluştururlar. Bir
radikal paylaşılmamış elektronunu radikal olmayan bir moleküle verebilir, diğer bir
molekülden alabilir veya radikal olmayan bir moleküle bağlanabilir. Bu reaksiyonlardan
hangisi olursa olsun radikal olmayan bir molekül sonuçta radikale dönüşür. Serbest radikaller
aerobik hücre metabolizmasının bir ürünü olarak sürekli üretildiği gibi dış etkenlerin etkisiyle
de meydana gelebilir. Oluşan radikallerin zararlı etkileri antioksidan savunma mekanizmaları
ile engellenerek etkisizleştirilir. Serbest radikallerin oluşum hızı ile etkisizleştirilme hızı dengede
olduğu sürece, organizma serbest radikallerden etkilenmemektedir. Ancak, savunma azalır veya
serbest radikallerin oluşum hızı, sistemin savunma gücünü aşarsa denge bozulur. Serbest
radikaller hücre yapı ve fonksiyonlarında önemli değişikliklere neden olurlar ve hastalıkların
patogenezinde rol oynarlar.
Serbest Radikal Türleri
Serbest radikalleri, oksijen merkezli ve oksijen merkezli olmayan serbest radikaller
olmak üzere iki sınıfa ayırmak mümkündür. Reaktif oksijen türleri terimi, sadece radikaller
için değil, hidrojen peroksit (H2O2), hipokloröz asit (HOCl), ozon (O3) gibi radikal olmayan
oksijen türleri için de kullanılır. Reaktif türler terimi ise reaktif nitrojen, klor, brom, sülfür
merkezli türler için de kullanılan geniş bir terimdir (Tablo 1).
1) Süperoksit anyon radikali (O2•⎯) : Süperoksit anyon radikalinin önemli kaynağı,
mitokondriyal elektron transport zinciri (ETZ)’dir. Süperoksit anyon radikali ayrıca
inflamatuar hücrelerin yüzeylerinde bulunan NADPH oksidaz (NOX) sistemi ile de
oluşturulur. Hem çevresel etkenler, hem de organizmalardaki enzimatik ve enzimatik olmayan
tepkimelerle en çok ve en kolay oluşan oksijen radikali süperoksit radikalidir. Süperoksit
radikali, moleküler oksijene bir elektron eklenmesi ile oluşur. Yarılanma ömrü çok kısa olup,
oksidan etkisi zayıf fakat redüktan etkisi çok güçlüdür. Serbest radikal olmasına rağmen hasar
oluşturucu bir tür değildir. Asıl önemi; hidrojen peroksidin kaynağı ve geçiş metal iyonlarının
indirgeyicisi olmasıdır. Ayrıca NO• ile reaksiyona girerek peroksinitriti oluşturur (Şekil 1).
Süperoksit, düşük pH’da daha reaktif olan perhidroksil radikaline (HO2•) protonlanır, fakat
fizyolojik pH’da bu form çok azdır. Süperoksit radikali oksijenin neden olduğu toksisitede
önemli bir rol oynar. Süperoksit, oluştuktan sonra tiyol grupları ile reaksiyon verebilir. Bu ise
5
ya GSH tüketilmesine sebep olarak hücreyi ileri bir oksidatif strese sokar veya enzim ve diğer
hücresel proteinler üzerindeki tiyol grupları ile reaksiyon vererek onları inaktive eder.
Tablo 1. Serbest radikal ve radikal olmayan reaktif türler (10)
Serbest radikaller
Radikal olmayanlar
Reaktif oksijen türleri (ROT)
Süperoksit (O2•⎯)
Hidroksil (•OH)
Hidroperoksil (HO2•)
Karbonat (CO3•⎯)
Peroksil (RO2•)
Alkoksil (RO•)
Karbon dioksit (CO2•⎯)
Singlet oksijen (O2 1Σg+)
Reaktif oksijen türleri (ROT)
Hidrojen peroksit (H2O2)
Hipokloröz asit (HOCl)
Hipobromöz asit (HOBr)
Ozon (O3)
Singlet oksijen (O2 1∆g)
Organik peroksit (ROOH)
Peroksinitrit (ONOO⎯)
Peroksinitrat (O2NOO⎯)
Peroksinitröz asit (ONOOH)
Nitrozoperoksikarbonat (ONOOCO2⎯)
Peroksomonokarbonat (HOOCO2⎯)
Reaktif klorin türleri (RCT)
Atomik klorin (Cl•)
Reaktif klorin türleri (RCT)
Hipokloröz asit (HOOCl)
Nitril klorit (NO2Cl)
Kloraminler
Klor gazı (Cl2)
Klorin dioksit (ClO2)
Reaktif bromin türleri (RBT)
Atomik bromin (Br•)
Reaktif bromin türleri (RBT)
Hipobromöz asit (HOBr)
Brom gazı (Br2)
Reaktif nitrojen türleri (RNT)
Nitrik oksit (NO•)
Nitrojen dioksit (NO2•)
Nitrat (NO3•)
Reaktif nitrojen türleri (RNT)
Nitröz asit (HNO2)
Nitroksil anyonu (NO⎯)
Nitrozil katyonu (NO+)
Dinitrojen tetraoksit (N2O4)
Dinitrojen trioksit (N2O3)
Peroksinitrit (ONOO⎯)
Peroksinitrat (O2NOO⎯)
Peroksinitröz asit (ONOOH)
Nitronyum katyonu (NO2+)
Alkil peroksinitrit (ROONO)
Alkil peroksinitrat (RO2ONO)
Nitril klorid (NO2Cl)
Peroksiasetil nitrat (CH3C(O)OONO2)
6
Süperoksit, aynı zamanda Haber-Weiss reaksiyonu gibi oksidatif strese neden olabilen
önemli reaksiyonları da başlatabilir (11,12).
2) Hidrojen peroksit (H2O2) : Elektronlar çiftlenmiş olduğu için serbest radikal
değildir, fakat son derece güçlü bir oksitleyici ajandır. Süperoksidin dismutasyon reaksiyonu
ile ya da oksijenin direkt olarak indirgenmesi sonucu oluşur. Hidrojen peroksit, geçiş metal
iyonlarının
varlığında
hidroksil
radikallerini
oluşturabilmektedir
(Şekil
1).
Metal
katalizörlerin yokluğunda ise hidrojen peroksit KAT ve GPx enzimleri ile kolaylıkla
uzaklaştırılır ve zararsız hale getirilir (13,14).
NOS
O2
e¯
IL-8
NADP+
NADPH+H+
O2
NO˙
L-sitrüllin
L-arginin
Adezyon
molekülleri
TNF-α
LH
H2O2
NFkB
Fe2+
O2
(+)
O2•⎯
Fe3+
Tirozin
Nitrotirozin
O2•⎯+2H+
SOD
ONOO¯
˙OH+OH¯
O2
O2
H2O2
2H2O
H2O2
˙OH+OH
KAT
Glukoz-6-P
L˙
Fe3+
Fe2+
X¯ +H2O2
LH
LOO˙
L˙
2GSH
NADPH + H+
2 XOH
G6PD
6-P-glukonolakton
NADP+
GR
GPx
LOOH
MPO
2OH¯
GSSG
İzoprostan
Diğer
ürünler
Fe3+
LO˙ + OH¯
2H2O
LPO
Fe2+
MDA
Şekil 1. Süperoksit radikalleri ve hidrojen peroksidin reaksiyonları
G6PD: Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz, GPx: Glutatyon peroksidaz, GR: Glutatyon redüktaz, GSH: Glutatyon,
GSSG: Okside glutatyon, IL-8: İnterlökin-8, KAT: Katalaz, LH: Lipid, MDA: Malondialdehid, MPO:
Miyeloperoksidaz, NFkB: Nükleer faktör kappa B, NOS: Nitrik oksit sentaz, SOD: Süperoksit dismutaz, TNF-α:
Tümör nekrozis faktör-alfa.
3) Hidroksil radikali (•OH) : En reaktif oksijen radikalidir. Tüm biyolojik
substratlarla reaksiyona girebilen, hücre membranlarındaki doymamış yağ asitleri, hücre
içinde ve membranındaki proteinler, karbonhidratlar, deoksiribonükleik asit (DNA) zincirleri
7
gibi önemli komponentlerin yapı ve fonksiyonlarını bozabilen aktif yapıdadır (13,15).
Hidroksil radikali, Fenton ve Haber-Weiss reaksiyonları ile üretilebilir.
H2O2 + Fe2+
H2O2 + O2•⎯
Fe3+ + •OH+ OH¯
•
OH + OH¯ + O2
(Fenton reaksiyonu)
(Haber-Weiss reaksiyonu)
Ayrıca X-ışınları veya γ-ışınları gibi iyonize edici radyasyona maruz kalınması
sonucunda hücre ana bileşenlerinden su molekülünün parçalanması ile de H• ve •OH oluşabilir
(10,13,15).
4) Hidroperoksil radikali (HO2•) : Süperoksit radikalinin protonlanmasıyla oluşur ve
süperoksitten daha reaktiftir (10).
O2•⎯ + H+
HO2•
5) Singlet oksijen (1O2) : Oksijen molekülünün enerji alması ile moleküler oksijenin
daha reaktif bir türü olan singlet oksijenler oluşur. Delta (O2 1∆g) ve sigma (O2 1Σg+) olmak
üzere iki tipi vardır. Delta tipinde daha fazla enerji vardır ve daha reaktiftir. Singlet oksijen bir
radikal olmayıp, sıklıkla serbest oksijen radikalleri ile birlikte anılan reaktif oksijen türüdür.
Serbest radikal reaksiyonlarıyla üretilebilir. Singlet oksijen’in vücutta deri ve retina gibi gün
ışığına maruz kalan bölgelerinde fotosensitizasyon reaksiyonu ile sıkça oluştuğu tespit
edilmiştir. Bu bölgelerde çok fazla doymamış yağ asitleri bulunduğundan singlet oksijen bu
lipidlerle hızla reaksiyona girerek harabiyet oluşturabilir. Singlet oksijenler, triptofan,
metiyonin, sistein veya histidin gibi aminoasitlerle reaksiyona girerek önemli biyolojik
hasarlar oluşturabilir (10,15).
6) Hipokloröz asit (HOCI) : Hipokloröz asit de radikal olmadığı halde ROT arasında
değerlendirilmektedir. Hipokloröz asit, fagositik hücrelerce bakterilerin öldürülmesinde
önemli rol oynar. Aktive olan polimorfo nükleer lökositler (PMNL) süperoksit üretir. Bu
serbest radikal üretimi, fagositer hücrelerin bakterileri öldürmesinde çok önemlidir. Solunum
patlaması sırasında oluşan süperoksit moleküllerinden, SOD etkisi ile hidrojen peroksit
üretilir. Özellikle nötrofillerin içerdikleri MPO enzimi, hidrojen peroksidi klorür iyonuyla
birleştirerek güçlü bir antibakteriyel oksidan olan HOCl’e dönüştürür (Şekil 2) (10).
7) Karbon merkezli radikaller: Hidroksil radikali yağ asitleri başta olmak üzere,
nükleik asitler, karbonhidratlar ve proteinler gibi biyomolekülerden bir proton çıkarıp karbon
8
merkezli organik radikallerin oluşmasına neden olur. Karbon merkezli radikaller hızlı bir
şekilde O2 molekülü ile reaksiyona girerek, ilgili peroksil radikallerini (ROO•) oluştururlar.
Bu peroksil radikali lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonunu başlatan radikal olup çok uzun
ömürlüdür. Geçiş metal iyonlarının varlığında hidroperoksil radikalinden bir oksijen atomu
çıkması sonucu alkoksil radikali (RO•) oluşur. Alkoksil radikalleri de biyomoleküllerden
proton çıkararak karbon merkezli radikal oluşmasına yol açar (10,15).
H2O2
H2O
1
HOCl
O2 + Clֿ
(Hipokloröz asit)
MPO
eֿ
O2
O2.-
Fe+2
O2
O2•ˉ
H+
Fe+3
•
H2O2
OH
H2O
SOD
Şekil 2 . Hipokloröz asit oluşumu
MPO: Miyeloperoksidaz, SOD: Süperoksit dismutaz.
8) Nitrik oksit (NO•) : Nitrik oksit, bağışıklık sisteminin düzenlenmesi, düz kasların
gevşemesi, vazodilatasyon ve nörotransmisyonu içeren çeşitli fizyolojik süreçlerde görev alan
önemli bir sinyal molekülü olmakla birlikte aynı zamanda çok reaktif bir radikaldir. Nitrik
oksit molekülünde eşleşmemiş elektron bulunması nedeniyle serbest radikaldir.
1980’lerde Furchgott ve Zawadski (16) izole arter preparatlarında, asetilkolinle
oluşturdukları gevşemenin, endotele bağımlı olduğunu göstermişlerdir. Damar gevşemesinde
yer alan bu maddeye endotelden kaynaklanan gevşetici faktör (EDRF) adı verilmiştir. Ignarro
ve ark. (17) ile Palmer ve ark. (18) ayrı ayrı yaptıkları çalışmalarda damar endotelinden izole
ettikleri EDRF’nin aslında NO• olduğunu tespit etmişlerdir.
Nitrik oksit, L–argininden sitrülin oluşumu sırasında, L–argininin guanidin nitrojen
grubunun 5 elektron oksidasyonuyla oluşur (Şekil 3). Bu reaksiyon NOS enzimi tarafından
katalize edilir. Nitrik oksit sentazların; endotelyal (eNOS), nöronal (nNOS) ve uyarılabilir
(iNOS) olmak üzere genetik olarak üç izoformu tespit edilmiştir. Bunlardan eNOS ve nNOS
yapısallardır ve bulundukları dokularda düşük miktarda NO• üreterek vasküler tonusun
ayarlanması, sinaptik şekillenme ve sinirsel iletinin düzenlenmesinde rol alırken; fagositik
9
hücrelerde bulunan iNOS uyarıldıktan sonra NO• sentezini arttırarak hücre aracılı immün
cevapta rol alır. Nöronal ve epitelyal NOS izoenzimleri NO• üretimi için Ca+2-kalmodulin
kompleksine bağımlıdır, iNOS ise bağımsızdır. Reaksiyon için ortamda oksijen ve
nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH), flavin adenin dinükleotid (FAD), flavin
mononükleotid (FMN), tetrahidrobiopterin (BH4) ve kalmodulin bulunması gerekir (7,8).
O
NH2+
CH2
NH
CH2
C
CH2
C
NH2
2O2
CH2
CH
NH
NH2
CH2
NO
NOS
CH2
NH3+
NADPH
COOֿ
FAD
FMN
Hem
BH4
CH
NADP+
NH3+
COOֿ
Ca-kalmodulin
L-sitrüllin
L-arginin
Şekil 3. Nitrik oksit (NO•) sentezi (7)
BH4: Tetrahidrobiopterin, FAD: Flavin adenin dinükleotid, FMN: Flavin adenin mononükleotid, NADP+:
Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (yükseltgenmiş), NADPH: Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat
(indirgenmiş), NO:Nitrik oksit, NOS: Nitrik oksit sentaz.
Renksiz ve son derece toksik bir gaz olan NO•’in yarı ömrü çok kısadır. Düşük
konsantrasyonlarda toksik değildir ve çok önemli fizyolojik işlevlerin gerçekleşmesinde rol
oynar.
Organik çözücülerde çözünürlüğü yüksek olan NO• biyolojik membranlardan kolayca
diffüze olabilir. Nitrik oksit bir kez sentezlendikten sonra hızla hedef dokulara yayılır, hücre
içinde çözünür guanilat siklaz enzimini aktive eder ve siklik guanozin monofosfat (cGMP)
miktarını arttırarak düz kas gevşemesi, vasküler tonüs, kan akımlarının düzenlenmesi,
adhezyon ve agregasyonun azalmasında rol oynar. Ayrıca mikroorganizmaların mitokondrial
hem proteinlerindeki demir ile reaksiyona girip ölmelerine yol açarak savunma sisteminde de
rol oynar. Nitrik oksit, kardiyovasküler sistem, sinir sistemi ve immünolojik sistemde birçok
fizyolojik ve patolojik mekanizmaların düzenlenmesinde çok önemli hücreiçi ve hücrelerarası
sinyal taşıyan bir moleküldür. Normal fizyolojik koşullarda NO• konsantrasyonları 100-500
10
nM düzeylerinde iken; endotoksin, α-interferon, IL-1, TNF-α gibi ajanlarla iNOS’un
tetiklenmesi sonucunda düzeyleri yaklaşık on kat artar (7,10). İnflamasyon gelişmesinde;
nitrojenin reaktif metabolitlerinin artmış üretiminin patofizyolojik bir rolü vardır. İnsanlardaki
inflamatuar barsak hastalıklarının patogenezinde de NO•’in rol oynadığı bildirilmiştir (8).
Oksijen varlığında, kolayca bir dizi nitrojen oksitlerine (NOx) dönüşebilir. Nitrik oksit ve
tekrar NO•’e dönüşebilen nitrojen oksitler (NO2, N2O3, N2O4 vb) güçlü nitrozile edici
ajanlardır ve primer ile sekonder aminleri nitrözilleyerek, nitrozaminleri oluştururlar.
Nitrozaminler;
potansiyel
karsinojenik
maddelerdir.
Çünkü
bu
bileşikler
DNA’da
nitrozilasyon, deaminasyon yapabilir ve alkil nükleofillerin oluşumuna neden olabilirler.
Serbest Oksijen Radikallerinin Kaynakları
Serbest radikaller organizmada normal olarak meydana gelen oksidasyon ve
redüksiyon reaksiyonları sırasında oluştuğu gibi çeşitli dış kaynaklı etkilerle de oluşabilir.
Hücre organellerinin her biri farklı miktarda radikal oluşumuna sebep olurlar. Bunların yanı
sıra radyasyon, stres ve ksenobiyotikler aktive olmuş fagositler de serbest radikal üretimini
arttırırlar. Sitokrom P450, sitokrom b5, ksantin oksidaz, triptofan dioksijenaz, lipooksijenaz,
prostaglandin sentetaz enzimlerinin reaksiyonları sırasında, hemoglobin, flavoproteinler, lipid
peroksidasyonunda, oksidatif stres yapan iskemi, travma ve intoksikasyon gibi durumlarda,
elektron transfer zinciri reaksiyonlarında, tiyol, hidrokinon, katekolamin, flavin ve antibiyotik
gibi moleküllerin otooksidasyonu sırasında hücresel serbest radikaller oluşur (10,19). Serbest
radikal oluşturan kaynaklar endojen ve ekzojen olmak üzere iki gruba ayrılabilir.
Endojen serbest radikal üretim kaynakları: Normal olarak metabolizmada, bazı
biyokimyasal olayların çeşitli basamaklarında serbest radikaller oluşmaktadır. Her ne kadar
serbest radikal yapısına sahip maddelerin organizmaya zarar verme potansiyelleri varsa da,
bazı metabolik olayların ilerleyebilmesi için bunların oluşması kaçınılmazdır.
1. Mitokondriyal elektron transport sistemi: Mitokondrideki enerji metabolizması
sırasında oksijen kullanılırken, süperoksit üretimi olabilir. Buradaki radikal üretiminin nedeni
NADH dehidrogenaz ve koenzim Q gibi elektron taşıyıcılardan oksijen molekülüne elektron
kaçağının olmasıdır. Fizyolojik olarak reaktif oksijen türlerinin temel kaynağı normal oksijen
metabolizmasıdır. Dolayısıyla fizyolojik koşullar altında mitokondriyal elektron transport
sistemi serbest radikal üretiminin en önemli kısmını oluşturmaktadır (10,15,20).
2. Endoplazmik retikulum ve nükleer membran elektron taşıma sistemleri:
11
Endoplazmik retikulum ve nükleer membrandaki serbest radikal üretimi, membrana bağlı
sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır. Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda
üretilen serbest radikaller organellerin içine girebilir, sitozolik reaksiyonlara katılabilir.
Endoplazmik retikulum membranına bağlı sitokrom P450 komplekslerinin ayrışması H2O2 ve
diğer peroksit ara ürünlerinin oluşmasına neden olmaktadır. Nükleer membranda oluşan
serbest radikaller özellikle DNA’da hasar oluştururlar (10).
3. Redoks döngüsü: Ksenobiyotiklerden serbest radikal oluşumu sadece mikrozomal
reaksiyonlarla olmamaktadır. Menadion, parakuat, dikuat, nitrofurantoin gibi bileşikler
alternatif bir redoks döngüsüne girerler. Bu bileşikler, ilave bir çiftlenmemiş elektron
kazanma eğilimindedirler. Bu ajanlardan oluşan radikaller, kolayca oksijenle oksitlenir ve
süperoksit radikalini oluştururlar. Oluşan ksenobiyotik ve süperoksit radikalleri hücreiçi
ferritin depolarından demiri serbest hale getirirler. Sitozole salınan demir, serbest radikaller
arasında en reaktif olan ve dolayısıyla daha yıkıcı olan •OH gibi ikincil radikallerin oluştuğu
Fenton reaksiyonunda katalitik rol oynar (10).
4) Araşidonik asit metabolizması: Plazma membranına bağlı siklooksijenaz ve
lipoksijenaz
enzimleri
prostaglandin
ve
lökotrien
biyosentezi
için
araşidonik
asidin
oksidasyonunu katalizledikleri sırada karbon ve oksijen merkezli serbest radikaller açığa
çıkmaktadır. Oluşan serbest radikaller, enzimlerin kendileri ve diğer hücre komponentleri ile
reaksiyona girme yeteneğindedir (10,13).
5)
Otooksidasyon:
Çözünebilir
özelliği
olan
ve
nötral
sıvı
ortamda
oksidasyon-redüksiyon reaksiyonlarına girebilen hücre bileşenlerinden pek çoğu hücreiçi
olarak serbest radikalleri açığa çıkarabilirler. Koenzimler, hemoglobin, miyoglobin,
indirgenmiş sitokrom c indirgenmiş ferrodoksinler, askorbik asit, tiyoller, flavinler,
hidrokinonlar, tetrahidropterinler ve katekolaminler gibi bileşiklerin otooksidasyonu ile O2
indirgenirken O2•⎯ oluşmaktadır (10).
6) Oksidan enzimlerin reaksiyonları: Aerobik organizmalarda oksijenin katıldığı
birçok reaksiyonda oksijenin tek elektron indirgenmesiyle süperoksit anyonu meydana
gelebilir. Glikojen oksidaz, ksantin oksidaz, NADPH oksidaz, NADH oksidaz, diamin
oksidaz, ürat oksidaz gibi enzimler bunlardan bazılarıdır. Üzerinde en çok çalışılan enzim
ksantin oksidaz (XOD) aslında ksantin dehidrogenaz (XDH) olarak sentezlenmekte ve bu
12
şekilde dokularda yaygın olarak bulunmaktadır. Bu enzim elektronlarını moleküler oksijene
değil nikotinamid adenin dinükleotid (NAD)’ye verir ve süperoksit anyon radikali
oluşturmaz. Fakat XDH’ın sülfidril gruplarının oksidasyonu ya da sınırlı proteolizi ile oksidaz
formuna
dönüşebilir.
Ksantin
oksidaz
moleküler
oksijeni
kullanarak
H2O2
ve
O2•⎯oluşturmaktadır (20).
7) Fagositoz: Fagositik hücreler, mikroorganizmaları öldürücü fonksiyonlarını
mikroorganizmaların hücre içine alınıp sindirildiği fagositoz olayı ile gerçekleştirirler.
Fagositoz, serbest radikal oluşumunun sorumlu olduğu oksidatif mekanizmalar ve çoğu
fagositik hücrenin granüllerinden salınan sitokinlerin rol aldığı oksidatif olmayan
mekanizmaların birlikte çalıştığı biyokimyasal bir süreçtir. Fagositik hücrelerin aktivasyonu,
çeşitli hücre dışı uyaranlar aracılığıyla meydana gelir. Sonuçta fagozom membranında
lokalize NADPH oksidaz aracılığıyla solunum patlaması adı verilen, oksijen tüketiminin hızla
arttığı ve süperoksit radikalinin oluştuğu bir süreç gerçekleşir. Aktive olan nötrofiller,
monositler, makrofajlar ve eozinofiller O2•⎯ üretirler. Solunum patlaması sırasında oluşan O2•⎯
molekülünden SOD aktivitesi ile H2O2 oluşur. Fagositik hücrelerin primer granüllerinden
degranülasyon ile fagozom içine bırakılan MPO enzimi aktivitesi ile hipokloröz asit
oluşturulur (Şekil 4).
NADPH
Oksidaz
kompleksi
NADPH2+
Bakteri
O2
2e¯
2O2
2O2˙¯
Cl‫־‬
HOCl
H2O2
H+
2H+
NADP+ + 2H+
Proton
kanalı
Şekil 4. Fagozom içinde gerçekleşen süperoksit radikalleri reaksiyonları (21)
Miyeloperoksidaz,
polimorf
nükleuslu
lökositler
ve
monositlerin
azurofilik
granüllerinde lokalize olmuş lizozomal bir hemoproteindir. Total nötrofil proteinin % 2-5'ini
oluşturmaktadır. MPO sentezi kemik iliğindeki myeloid farklılaşma sırasında oluşur. Bu
farklılaşma granülositlerin dolaşıma katılmasından hemen önce son bulur. Enzim, nötrofil ve
monositlerin primer granüllerinde bulunabilmesine rağmen makrofajlarda ya çok az bulunur
13
veya hiç bulunmaz.
Miyeloperoksidaz ilk kez 1941 yılında saflaştırılmıştır. Özgül olmayan peroksidaz
aktivitesi gösteren enzimin geniş bir substrat aralığı vardır. MPO herbiri 60 kilodalton
ağırlığında iki ağır ve herbiri 15 kilodalton ağırlığında olan iki hafif olmak üzere 4 alt
üniteden oluşmaktadır. Hem molekülü, proteindeki glutamat ve aspartat kalıntılarına kovalent
olarak iki ester bağıyla bağlanmıştır (10).
Temel durumda MPO ferrik (Fe III) durumda bulunur. Fagositoz sırasında ise bileşik I,
bileşik II ve bileşik III olmak üzere üç farklı formu oluşur. Hidrojen peroksit varlığında
MPO’nun hem grubu okside olarak reaktif ferril radikalini oluşturur. Bu ara bileşiğe ''Bileşik
1'' denir. Miyeloperoksidazın primer katalitik formu; bileşik I'dir. Bileşik I; Cl¯, Br¯, I¯ gibi
halojenürleri ve tiyosiyanat (SCN¯) gibi psödohalojenürleri kolayca indirgeyerek hipohalöz
asidleri (HOX) oluşturur. Halojenürlerin ve tiyosiyonatın normal plazma düzeylerinde Cl¯
tercih edilen bir substrattır ve HOCl oluşur. Aşırı miktarda H2O2 varlığında bileşik I
halojenürleri okside etmekte inaktif olan bileşik II'ye dönüşürken H2O ve O2 açıga çıkar.
Bileşik II; O2•⎯ ve askorbat varlığında doğal MPO formuna dönüşür. Süperoksit anyonu doğal
MPO'nun bileşik III formuna dönüşmesine yol açabilir. Bileşik III stabil değildir, tekrar doğal
MPO formuna dönüşür. Bu dönüşüm askorbat varlığında daha hızlıdır (Şekil 5).
Bileşik III
O2•⎯
MPO
H2O2
Bileşik I
2H2O2
HOCl
-
O2•⎯, askorbat
Cl +H+
H2 O + O2
Bileşik II
Şekil 5. Miyeloperoksidaz kompleks enzim reaksiyonları (22)
MPO: Miyeloperoksidaz.
Miyeloperoksidaz aracılıklı etkiler: Nitrojen dioksit ya direkt olarak MPO tarafından
ya da MPO’nun ürünü olan HOCl tarafından okside olur. Bu reaksiyonlar sonucunda oluşan
reaktif nitrojen türleri proteinlerdeki tirozin kalıntılarını nitratlar. Bileşik I formundaki MPO
ayrıca proteinlerdeki tirozin kalıntılarına da etki ederek ditirozin çapraz bağları oluşumuna yol
açabilir. Miyeloperoksidaz aktivitesi ile oluşan HOCl biyomoleküllerde oksidasyon,
klorinasyon yapar, 1O2 oluşumuna yol açar (Şekil 6) (22,23).
14
NO2ֿ
Tirozin
MPO+H2O2
Reaktif
nitrojen
arabileşikleri
Ditirozin çapraz
bağları
Tirozil
radikali
Tirozin peroksit
OClֿ
Oksidasyon
Clֿ
HOCl
Klorinasyon
OH
Cl2
1
O2
H2O2
O3
Şekil 6. Miyeloperoksidaz aracılıklı etkiler (22)
MPO: Miyeloperoksidaz.
Ekzojen serbest radikal üretim kaynakları: Serbest radikaller, ekzojen nedenlerle
de oluşabilir. Radyasyon, barbütiratlar, ksenobiotikler, metal iyonları en önemli ekzojen
serbest radikal üretim kaynakları olarak bilinirler (19).
Serbest Radikallerin Vücuttaki Etkileri
Organizma, tüm anabolik ve katabolik reaksiyonlar esnasında ve sonrasında, sürekli
bir oluşum halindeki serbest radikal reaksiyonları ile oksidanlara maruz kalırken, bir yandan
da endojen antioksidanlar adı verilen moleküller tarafından etkisizleştirme süreci içindedir.
Serbest radikaller, belirli düzeylerde kaldıkları sürece, organizmanın yabancı
maddelere ve infeksiyöz ajanlara karşı savunmasında rol alan önemli molekülerdir. Ancak
belirli düzeyin üzerinde oluşurlar ve/veya antioksidanlar yetersiz kalırsa serbest radikaller
hücresel yapıları etkileyerek hücre hasarına yol açarlar (Şekil 7) (13).
Normal metabolizma sırasında ya da patolojik yolla ortaya çıkan serbest radikaller,
hücre ve dokularda birçok zarara yol açmaktadır. Bu zararlar şöyle sıralanabilir:
a) Tiyollere bağımlı enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının bozulması, hücre ortamının
tiyol/disülfit oranının değişmesi.
b) Protein ve lipidlerde kovalent bağlantılar oluşturması.
c) Zar proteinlerinin tahribi, taşıma sistemlerinin bozulması.
d) Proteinlerin tahrip olması ve protein döngüsünün artması.
e) Enzim aktivitelerinde değişiklikler.
15
Şekil 7. Serbest radikallerin neden olduğu hücre hasarı (24)
DER: Degranule endoplazmik retikulum, PER: Peroksizom, DNA: Deoksiribo nükleik asit.
f) Kollajen ve elastin gibi uzun ömürlü proteinlerdeki oksido-redüksiyon olaylarının
bozularak kapillerlerde aterofibrotik değişiklerin oluşması.
g) Lipid metabolizmasında değişiklikler.
h) Lipid peroksidasyonu, zar yapısı ve fonksiyonunun değişmesi.
i) Steroid ve yaşlılık pigmenti denilen bazı maddelerin birikimi.
j) Mukopolisakkaritlerin yıkımı.
k) Nükleotid yapılı koenzimlerin yıkımı.
l) Deoksiribonükleik asidin tahrip olması (10,19).
Lipidlere etkisi: Reaktif oksijen türleri, plazma ve organel membranlarında lipid
peroksidasyonuna neden olurlar. Hidroksil radikali membran lipidleri ile çift bağ yapar,
böylece lipid-radikal etkileşimi ile zincirleme reaksiyon sonucu MDA, dien konjugatları gibi
pek çok lipid peroksidasyon ürünü oluşur. Membran lipidlerinin okside olması ile bu
membranların fiziksel ve kimyasal özellikleri değişir, iyon geçirgenliği bozulur. Böylece
organel ve hücre hasarı ortaya çıkar, eritrositlerde hemoliz görülür.
Lipid peroksidasyonu, çoklu doymamış yağ asitlerinin zincirleme bir radikal
reaksiyonudur ve üç aşamadan oluşur (Şekil 8).
Başlama safhası: Reaktif oksijen moleküllerinden •OH, RO•, ROO• ve 1O2 molekülleri
lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonlarını başlatabilir. Süperoksit ve H2O2 lipid
peroksidasyonunu başlatamaz ama geçiş metallari varığında •OH radikali oluşturarak lipid
16
peroksidasyonunun başlamasına yol açabilirler. Reaktif oksijen molekülü çoklu doymamış
yağ asidindeki peşpeşe gelen çift bağlar arasındaki metilen grubundan bir proton kopararak
karbon merkezli bir lipid radikali (L•) oluşturur (10,19).
Araşidonik asit
-H+
İzofuran
Lipid radikali (L˙)
Dien konjugatı
O2
Lipid peroksil radikali
(LOO˙)
RH
Yüksek O2
R˙
Monosiklik peroksit
Lipid hidroperoksit
(LOOH)
Düşük O2 varlığında molekül içi proton
çıkarılması
O2 ile reaksiyon
ve indirgenme
Bisiklik endoperoksit
O2 , hidroliz
F2 izoprostan
+ Diğer
ürünler
MDA
Şekil 8. Çoklu doymamış yağ asidlerinin peroksidasyonu (10)
MDA: Malondialdehid, RH: Lipid, R˙: Lipid radikali.
İlerleme safhası: Lipid radikali kararsız bir moleküldür. Molekül içi düzenlenme ile
dien konjugatı oluşturur. Dien konjugatının O2 ile reaksiyona girmesi ile lipid peroksil
radikali (LOO•) oluşur. Lipid peroksil radikali kolesterolün oksidasyonunda, membran
proteinlerine atakta, singlet oksijenin oluşumunda rol alır. Lipid peroksil radikali kendinde
bulunan başka bir çift bağa atak yaparak siklik peroksitlerin oluşumuna yol açabilir. Lipid
peroksil radikali başka lipidlerden proton kopararak lipid hidroperokside (LOOH)
dönüşürken; atak yaptığı lipid, radikal haline geldiği için yeni bir zincir reaksiyonunu
başlatmış olur. Lipid hidroperoksit fizyolojik koşullarda oldukça stabil bir moleküldür, ama
geçiş metal iyonlarının varlığında bozunur. Bu reaksiyon sonunda reaktif olan lipid alkoksil
17
radikali (LO•) ve hidroksil iyonu (OH¯) oluşur. Lipid alkoksil radikali çoklu doymamış yağ
asitleri ve peroksitlerden proton koparabilir. Bu reaksiyonlar sonucunda yeni karbon merkezli
radikaller oluşur ve lipid peroksidasyon zincir reaksiyonunun ilerlemesine yol açar. Lipid
alkoksil radikali bazen kendi zinciri üzerine atak yapar ve epoksi radikal oluşmasına yol açar.
Lipid alkoksil radikali β–parçalanma reaksiyonuyla aldehidler ile etan veya pentan radikaline
parçalanır. Etan ve pentan radikalleri başka bir yağ asidine atak yaparak yeni bir lipid radikali
oluştururken etan ve pentan gazlarına dönüşür. ω3 çoklu doymamış yağ asitlerinden etan, ω6
yağ asitlerinden ise pentan açığa çıkar.
Sonlanma safhası: Zincir reaksiyonu; iki lipid radikali birbiriyle etkileşene dek sürer.
Sonlanma basamağında lipid çapraz bağları (LL) ve siklik endoperoksitler (LOOL) oluşur.
Antioksidan moleküllerin bir kısmı da zincir reaksiyonunu sonlandırabilir. Lipid
peroksidasyonu sırasında karbon bağlarının kopması ile aldehid yapısında yıkım ürünleri
ortaya çıkmaktadır. Bu sitotoksik metabolitler MDA gibi alkaneller ve 4-hidroksinonenal gibi
hidroksialkanellerdir. Malondialdehid lipid peroksidasyonunun son ürünüdür. Reaktif
aldehidler ortaya çıktıkları bölgeden uzağa diffüze olabildikleri için uzak bölgelerde de doku
hasarına sebep olabilirler.
Oksidatif hasarın in vivo göstergesi olarak en çok kullanılan belirteç MDA’dır.
Malondialdehidin hücre membranlarının geçirgenliğini arttırdığı, membranların iyon
alışverişine etki ederek hücreiçi iyon dengesini bozduğu, enzim aktivitelerinin bozulmasına,
DNA’nın yapısında kırılmalara ve baz değişimlerine neden olduğu bildirilmektedir (10).
Malondialdehid, en çok linoleik asit, araşidonik asit, dokosahekzaenoik asit gibi ikiden
fazla çift bağı olan doymamış yağ asitlerinin peroksidasyonu ile oluşur, fakat bazen
eikozonoidlerin enzimatik metabolizması sırasında da ortaya çıkabilir. Malondialdehid, pH
değişikliğine bağlı olarak değişik izoformlarda olabilir (Şekil 9). Fizyolojik pH’da serbest
formda bulunan MDA birçok amino grubuna düşük reaktivite gösteren enolat anyonu
formuna dönüşür. Düşük pH’da ise reaktivite artar ve MDA proteinlere atak yapar, özellikle
lizin kalıntıları olmak üzere birçok kalıntıda modifikasyonlarla sonuçlanan molekül içi ve
moleküller arası çapraz bağlar oluşur:
H
H
Protein-N
C
H
Protein-NH
O=C
+
Protein-NH
O=C
CH2
CH
Protein-N = C
H
H
Moleküller arası çapraz bağlar
18
Malondialdehid, DNA bazlarıyla da etkileşir ve mutajenik lezyonların ortaya
çıkmasına neden olur.
Malondialdehid, memeli dokularında hızlıca metabolize olur. Aldehid dehidrogenezlar
ile malonik semialdehide okside olur, dekarboksilazlar ile asetaldehide, ardından aldehid
dehidrogenazlar ile asetata dönüşerek metabolize olur (10).
–
Enol
Keto
Enolat anyonu
Siklik form
+MDA
+MDA
-H2O
+MDA
-H2O
Şekil 9. Sulu çözeltilerdeki malondialdehid formları (10)
MDA: Malondialdehid.
Serbest radikallerin DNA’ya etkileri: Serbest radikallerin nükleer ve mitokondrial
DNA ile tepkimesi sonucunda baz modifikasyonları, baz delesyonları, zincir kırılmaları
gerçekleşebilmektedir. DNA’nın harabiyeti genellikle mutasyonların ortaya çıkmasına neden
olur. Mitokondrial DNA'da meydana gelen mutasyonlar sonucunda hücrenin enerji durumu
etkilenir. Sonuçta serbest radikaller; kanser oluşumu, yaşlanma ve hücre ölümünde rol
oynamaktadır.
Proteinlere etkisi: Proteinlerin içerdikleri aminoasitlerin oksidasyona duyarlılıkları
farklı olmakla birlikte sistein, tirozin, triptofan, histidin, metionin ve lizin kalıntılarının
hassasiyetinin yüksek olduğu kabul edilmektedir. Süperoksit radikalinin bu aminoasitlerle
yavaş bir reaksiyon verdiği ancak •OH, H2O2, HOCl’lerin daha hızlı oksidan etki gösterdikleri
tespit edilmiştir. Bu nedenle, mikrosirkülasyonda oluşan ROT, proteinlerde, enzimlerde
modifikasyona ve hücre fonksiyonlarında değişime neden olur. Proteinlerde serbest radikal
etkisiyle protein tiyol gruplarının oksidasyonu, disülfit bağlarının indirgenmesi, ileri protein
19
oksidasyon ürünleri, protein karbonil ve nitrotirozin oluşur (25,26).
Nitrik oksit'in, O2•⎯ ile in vivo reaksiyonu sonucu oluşan sitotoksik bir türev olan
peroksinitrit proteinlerdeki tirozin kalıntılarının orto pozisyonunda nitrasyonu ile NT
oluşumuna yol açar (Şekil 10).
Tirozinin
geri
dönüşümsüz
olarak
nitrasyonu,
tirozinin
fosforillenmiş
ve
fosforillenmemiş formlarının birbirine dönüşümünü engelleyerek, enzim aktivitesinin ve
sinyal ileti mekanizmalarının düzenlenmesini etkiler.
Peroksinitrit
Tirozin
Nitrotirozin
Şekil 10. Nitrotirozin oluşumu (27)
Nitrotirozin’in, ONOO- oksidasyonunun kararlı son ürünü olması nedeniyle NT
ölçümünün NO• bağımlı in vivo hasarın tespitinde kullanışlı bir belirteç olduğu
bildirilmektedir (27).
Memeli hücrelerinde okside proteinlerin tamir mekanizmaları sınırlı olduğu için
hidroliz edilerek ortamdan uzaklaştırılması gereklidir. Okside olmuş proteinlerin proteozom
kompleksi tarafından parçalandığı gösterilmiştir. Okside olmuş proteinler 20S çekirdek
proteozomu içinde ATP ve ubikitinden bağımsız yollarla parçalanmaktadır. Oksidatif modifiye
proteinlerdeki okside aminoasitler uzaklaştırılır ya da ATP sentezinde karbon kaynağı olarak
kullanılır. Oksidatif streste güçlü oksidanlara maruz kalınmasıyla hücrelerdeki proteolitik
kapasite yetersiz kalabilir. Bazı durumlarda okside proteinler uygun bir şekilde yıkıma
gidemez, diğer yapılarla çapraz bağlar ve geniş hidrofobik bağlar yaparlar. Hasarlı
proteinlerin birikimi sonucu hücre normal fonksiyonlarını yerine getiremez ve hücre ölümü ya
da nekrozu gerçekleşir (26).
ANTİOKSİDAN SİSTEMLER
Doğrudan etki ile oksidanları inaktif hale getiren maddelere "antioksidan" adı
verilmektedir. Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek, ROT’lerini
temizleyerek veya geçiş metal iyonlarını bağlayarak lipid peroksidasyonunu inhibe ederler.
20
Genel olarak enzimatik antioksidanlar hücre içinde, enzimatik olmayan antioksidanlar ise
hücre dışında daha fazla etkilidir. Ancak bir tripeptid olan GSH hücre içinde güçlü
antioksidandır (24).
Antioksidanların oksidan moleküllere karşı etki tipleri şunlardır:
Toplayıcı etki; Yeni radikal oluşumunu engelleme ve oluşmuş olan radikalleri daha az
zararlı hale getirme,
Bastırıcı etki; Oksidanlarla etkileşip onlara bir hidrojen atomu aktararak aktivitelerini
söndürme ve inaktif hale getirme,
Zincir kırıcı etki; Zincirleme olarak devam eden tepkimeleri belirli yerlerinden kırarak
oksidan etkiyi durdurma,
Onarıcı etki; Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın tamiri ve temizlenmesi.
Antioksidanlar çeşitli kriterlere göre sınıflandırılabilirler:
Yapılarına göre;
a) Enzimler
b) Enzim olmayan proteinler, küçük moleküller
-Geçiş metal iyonlarını bağlayan proteinler (Hb, serüloplazmin, ferritin).
-Düşük molekül ağırlıklı bileşikler (bilüribin, ürik asit)
Kaynaklarına göre;
a) Endojen antioksidanlar
b) Ekzojen antioksidanlar (vitamin A, vitamin E, vitamin C)
Çözünürlüklerine göre;
a) Suda çözünenler
b) Lipidde çözünenler
Yerleşimine göre;
a) Hücreiçi sıvısında bulunanlar
b) Hücre dışı sıvılarında bulunanlar
KOLOREKTAL KANSER
Amerika Birleşik Devletleri’nde kolorektal kanser; erkeklerde prostat ve akciğer,
kadınlarda meme ve akciğer kanserlerinden sonra üçüncü sıklıkta görülen kanserdir.
Kolorektal kanserinden ölüm tüm kanser nedeniyle ölümlerin %10’unu oluşturmaktadır
(1,28). Amerika’da 2008 yılında 148810 yeni vaka bildirilmiş ve bunların 4996’ı ölümle
sonuçlanmıştır (29).
Kolorektal kanser görülme oranları dünyanın değişik coğrafi bölgelerinde farklılık
göstermektedir. Gelişmiş ülkelerde sık görülmektedir. Kuzey Amerika ve Avrupa’daki birçok
21
ülkede görülme sıklığı Afrika ve Asya’daki gelişmekte olan ve/veya az gelişmiş bölgelerden
on kat daha fazladır (1,28,30). Kuzey Amerika’da, Yeni Zellenda’da, Avustralya’da ve Batı
Avrupa’da sık görülmektedir. Bu coğrafi farklılıkların; genetik yatkınlık yanında, diyetsel ve
çevresel faktörlerin etkisiyle oluştuğu kabul edilmektedir. Kolorektal kanserden etkilenme
açısından cinsler arasında fark görülmemekle birlikte görülme sıklığının erkeklerde %9.4,
kadınlarda %10.1 olduğu bildirilmektedir (31).
Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı verilerine göre 2005 yılındaki kolon kanseri
insidansı; erkeklerde %8.69, rektum kanseri insidansı %4.51’dir. Kadınlarda ise insidans;
kolon kanserinde %6.31'dir (2).
Kolorektal kanser sıklığı 20-39 yaşlar arasında son derecede düşüktür, 40-50 yaş
arasında önemli oranlarda artmaya başlar. Kolorektal kanserlerde tanı yaşı ortalama 62'dir.
Ancak, kolorektal kanserler için risk 50-75 yaş arasında değişir. Yaş ilerledikçe risk oranı
yükselir.
Kolorektal kanserde tümöral barsak bölgesinin cerrahi olarak çıkarılmasından sonra 5
yıllık yaşam oranı %40-60 arasında değişmektedir. Tümör yinelenmesinin %71'i ilk 2 yıl
içinde, %91’i ise 5 yıl içinde olmaktadır (30).
Primer kolorektal kanserlerin %95’ini adenokarsinomlar oluşturur. Kolorektal
kanserlerinin yaklaşık %30’u rektumda, %25’i sigmoidde, %5-10’u inen kolonda, %10-15’i
transvers kolonda, %25’i de çıkan kolon-çekumda yerleşmektedir (32).
Risk Faktörleri
1) Diyet: Proteinden ve yağdan zengin beslenmek kolorektal kanser açısından risk
faktörüdür.
2) İleri yaş: Kolorektal kanser ileri yaş hastalığı olup kişinin 50 yaş ve üzerinde
olması orta derecede risk faktörüdür.
3) Aile öyküsü: Birinci derece yakın akrabalarında kolorektal kanser hikayesi olan
kişilerde kolorektal kanser gelişme riski normal bireylere göre artmıştır.
4) Alışkanlıklar: Sigara ve alkol kullanımı kolorektal kanser riskini arttırmaktadır.
5) Diğer faktörler: Diabetes Mellitus, safra kesesi ameliyatı, inflamatuar barsak
hastalıkları olan bireylerde kolorektal kanser sağlıklı bireylere göre daha sık
görülmektedir. Özellikle inflamatuar barsak hastalığı olan bireylerde inflamatuar
süreç karsinogenez patogenezinde rol oynamaktadır.
Koruyucu Faktörler
22
1) Diyet
-Yüksek lif içerikli beslenme
-Kalsiyum alımı
-Folik asit alımı
2) Fiziksel aktivite
3) İlaçlar
-Nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar
-Hormon replasman tedavisi
-Statinler
Klinik Bulgular
Kolorektal kanserin bulguları farklı ve özgül değildir. En sık görülen bulgular, rektal
kanama, dışkılama alışkanlığında değişme ve karın ağrısıdır. Bulguların dikkat çekici olup
olmaması veya tipi, tümörün yeri ve boyutu ile ilişkilidir. Kolorektal kanser yıllarca bulgu
vermeyebilir.
Çekum ve sağ kolondaki kanserler genelde halsizlik, yorgunluk ve demir eksikliği
anemisi ile kendilerini gösterirler. Sol taraftaki lezyonlar ise, gizli kanama, dışkılama
alışkanlığının değişimi ya da sol alt kadranda kramp şeklinde ağrı gibi şikayetlere neden
olurlar. Postmenopozal bir kadın ya da erişkin bir erkekte demir eksikliği anemisi oluşursa
kolorektal kanserden kuşkulanılarak gerekli araştırmalar yapılmalıdır (28,30,33).
Kolorektal kanserde daha az sıklıkla görülen bulgular kilo kaybı ve ateştir. Ancak kilo
kaybı hiçbir zaman kolorektal kanserin tek belirtisi değildir.
Kolorektal kanserli hastaların önemli bir kısmı barsak tıkanması ve perforasyonu
nedeniyle hastaneye başvurabilir.
Hastaların yaklaşık %5’inde primer tümör sessiz kalabilir ve hastalarda kemik ağrıları,
sarılık, patolojik kırıklar, nörolojik bulgular, tromboflebitler ve deri nodülleri gibi metastaz
bulguları görülebilir. Sigmoid kolon ve inen kolon tümörlerinde mesaneye, transvers kolon
tümörlerinde mideye, rektum tümörlerinde üretra veya vajene fistül gelişimi görülebilir
(30,33,34).
KANSER VE OKSİDATİF STRES
Kanser gelişimi karmaşık ve çoklu adımlar içeren bir süreçtir. Kimyasalların kanser
oluşumunu uyarmasında iki mekanizma öne sürülmektedir. Birincisi direkt olarak genomik
DNA üzerine hasarlayıcı etkiler göstererek mutajenik değişikliklere yol açarlar ve hedef
23
hücrede neoplastik dönüşümün artmasına neden olurlar. Diğer bir mekanizma ise hücre
çoğalması ve hücre ölümü arasındaki dengenin hücre çoğalması lehine bozulmasıdır. Genetik
hasara yol açmayan kanserojenler hücre çoğalması ve ölümünün düzenlenmesi üzerine etki
gösterirler. En önemli etkileri gen ifadesi ve hücre büyüme parametrelerinde meydana
getirdikleri değişikliklerdir (35). Fizyolojik süreçte yaşlanmış, fonksiyonunu yitirmiş, fazla
üretilmiş, düzensiz gelişmiş veya genetik olarak hasarlı hücreler güvenli bir şekilde ortadan
kaldırılırlar. Genetik olarak kontrol edilen bu programlı hücre ölümüne apopitoz adı verilir.
Apopitoz hücre döngüsü boyunca yapım-yıkım dengesinin sürdürülmesini sağlar. Hasarlı
DNA da apopitoz yolu ile ortadan kaldırılır. Hücrenin DNA’sında meydana gelen mutasyonlar
kanser oluşumuna neden olabilecekleri için bu hasarlı hücrelerin apopitoz yolu ile ortadan
kaldırılmaları büyük önem taşımaktadır. Protoonkogenlerin aktive olması ve/veya tümör
baskılayıcı genlerin inaktif olması kanser gelişiminde rol oynar. p53 tümör oluşumunu
önleyen transkripsiyon faktörüdür. Hasara uğrayan hücrede bölünmenin durmasını ve
apopitozun uyarılmasını sağlar. p53 genleri hasarlı ise hücreler hasarlı DNA’lar ile hücre
döngüsüne girerler.
Organizmada serbest radikallerin oluşum hızı ile bunların ortadan kaldırılma hızı bir
denge içerisindedir ve bu durum "oksidatif denge" olarak adlandırılır. Oksidatif denge
sağlandığı sürece organizma, serbest radikallerden etkilenmemektedir. Radikallerin oluşum
hızında artma ya da ortadan kaldırılma hızında bir düşme, bu dengenin bozulmasına neden
olur. Serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma mekanizması arasındaki ciddi
dengesizlik "oksidatif stres" olarak adlandırılır. Serbest radikaller çeşitli makro moleküllerle
reaksiyona girerler ve sonunda pek çok farklı ürünler oluşturarak hasara neden olurlar. Reaktif
türlerin ana hedefi DNA olması nedeniyle yaşlanma ve kanserle ilişkilidir. Reaktif oksijen
türleri; tek veya çift zincir DNA kırıklarına, pürin ve pirimidinlerde modifikasyonlara,
deoksiriboz-fosfat iskeletinde hasara, DNA-protein ve DNA-DNA çapraz bağlantılarına neden
olabilirler. DNA hasarı, transkripsiyonun uyarılması ve durması, sinyal yollarının uyarılması,
replikasyon hataları ve genomik dengesizlik ile sonuçlanır. Bütün bunlar da karsinogenez ile
ilişkilidir (36).
Oksidatif baz modifikasyonları mutasyon ile sonuçlanabilir. Singlet oksijen guanini
kolayca oksitleyebilir. Hidroksil radikali pürin, pirimidin bazlarına ve deoksiriboz iskeletine
hasar verir. Peroksinitrit ve NO•; DNA hasarı yapabilirler. Peroksinitritin guanin bazı ile
reaksiyona girerek 8-nitroguanin oluşturması sonucunda G:C, T:A ile yer değiştirebilir.
DNA’da bu lezyonun stabilitesi kısa sürelidir, ancak RNA’da uzundur. 8-nitroguanin ile
karsinogenez süreci arasındaki bağlantı tam olarak bilinmemektedir. Reaktif klorin türleri de
24
DNA’da değişikliklere yol açabilmektedir. DNA hasarını tamir mekanizmaların etkinliğinde
azalma, düzenleyici enzim aktivitesinde değişiklik, hücre çoğalmasının uyarılması, apoptozun
baskılanması ile de karsinogenezin ilerlemesinde rol oynar (10,37).
Bunlara ek olarak mitokondrial DNA’nın oksidatif hasarı karsinogenez sürecinin de
içinde bulunduğu çeşitli hastalıklarda önemli rol oynayabilir.
Reaktif Türler ve Hücre Proliferasyonu
Reaktif türlerin tipi ve düzeyi, ne kadar süreyle maruz kalındığı, bunları ortadan
kaldıracak antioksidan savunma düzeyi ve oksidatif hasarı düzeltecek olan tamir
mekanizmasının aktivitesine bağlı olarak hücre çoğalması etkilenir. Bunun sonucunda hücre
çoğalmasında artış, hücre döngüsünde durma, yaşlılık, apoptozis ve nekroz görülebilir.
Reaktif türler kanserin başlaması ve ilerlemesi aşamalarına katılır ve böylece bunların
etkisiyle hücre döngüsü, gen ifadesi, doğrudan veya dolaylı DNA hasarı, apoptozis ve diğer
hücre ölümü tipleri görülür (38).
p53 proteini ve reaktif türler: Tümör baskılayıcı gen ürünü olan p53 proteini hücre
bölünmesini durduran transkripsiyon faktörüdür. p53 ve ROT’leri birbirleri ile ilişkilidir.
Normal seviyedeki p53; MnSOD, GPx gibi antioksidan enzimleri kodlayan genlerin
transkripsiyonunu attırarak antioksidan savunmada rol oynar. Reaktif oksijen türleri de p53
aktivitesini arttırarak zarar görmüş hücrenin apopitozunda rol oynar. Ayrıca yüksek seviyede
p53 aktivitesi ROT üretiminin artışına yol açabilir (10,19).
Apopitozisin Reaktif Türler ile Düzenlenmesi
Reaktif türler normal hücrelerde apopitozisin ilerlemesine neden olur (10). Bazen
kaspazların oksidatif inaktivasyonu gerçekleşebilir. Bazı hücrelerde artmış O2•⎯ seviyesi
sitozolik pH’ın da yükselmesine neden olur ki bu durumda kaspaz aktivitesi engellenir. Buna
karşın H2O2 sadece DNA’ya saldırarak değil; mitokondri hasarı ve sitozolik pH’ı düşürerek de
apopitozisi ilerletebilir. Süperoksit radikali ve H2O2’in hücre pH’ı üzerindeki etkileri hücre
membranında bulunan Na+/H+_ATPaz aktivitesini değiştirmelerinden kaynaklanabilir (10,39).
Diğer yönden ROT’leri tümör baskılayıcı gen olan fosfataz ve tensin homoloğu (PTEN)
inaktive ederek protein kinaz B sinyal molekülü (Akt) yolunun aktivasyonunu arttırırlar ve
hücrenin hayatta kalmasını sağlarlar (40).
Metastaz ve Reaktif Türler
25
Reaktif türler invazyon ve metastazla ilişkilidir. Hücre yüzeyi morfolojisinin
değişmesi, hücre içi iletişim, hücre hareketi ve damar geçirgenliğinin artması metastazın
kolaylaşmasını sağlar. Ayrıca ekstraselüler matriks, tümör hücreleri ve fagositler özellikle
makrofajlar tarafından salınan matriks metalloproteinazlarca (MMP) bozulur. Reaktif türler
MMP’i aktifleştirir (10).
Oksidatif Stres, Hücre Sinyal İletimi ve Kanser
Hücreler birbirleriyle iletişim halindedir ve ekstraselüler uyaranlara karşı cevap
verirler. Bu biyolojik mekanizmaya sinyal iletimi denir. Sinyal iletimi hücre dışarısındaki
çeşitli fonksiyonel elementlerin hücre içine geçişi ile bilginin sağlanması sürecidir. ROT,
hücre hasarına yol açmakla birlikte aslında hücre içindeki sinyal iletiminin ve
düzenlenmesinin bazı safhalarında önemli fizyolojik rol oynarlar. ROT’nin ikincil
habercilerin
fonksiyonlarında
önemli
rolü
vardır.
Ayrıca
sitozolik
kalsiyum
konsantrasyonunun düzenlenmesi, protein fosforilasyonunun düzenlenmesi ve NF-KB ve
AP-1 faktör ailesi gibi bazı transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonunda rol alır (35,41,42).
Kronik İnflamasyon ve Kanser
Biyolojik, kimyasal ve fiziksel faktörlerle uyarılan kronik inflamasyon, insanlarda
değişik türlerdeki kanserlerin artışıyla ilişkilidir. Kronik inflamasyon hücresel dengede
düzensizliklere, normal hücrelerde büyüme ve maligniteye ilerleyişin başlamasına, değişik
türlerde DNA hasar ürünleri oluşmasına, DNA onarım mekanizmalarının yetersizliğine,
proinflamatuar sitokinlerin artışına ve hasarlanmış hücrelerin apopitozis hızında azalmaya
neden olmaktadır (43). İnflamasyon sürecinde fagosit membranında bulunan NOX; süperoksit
oluşumunu sağlayan önemli bir kaynaktır. Tümöral farklılaşmayla bağlı olarak NOX
düzeyinin arttığı düşünülmektedir. Fakat bununla ilgili bilgiler hala netleşmemiştir (10).
Ayrıca birçok çalışmada MPO enziminin de kanser gelişiminde rolü olduğu görülmektedir.
MPO, uyarılmış olan nötrofillerden salındıktan sonra reaktif türlerin oluşumuna yol açmasının
dışında prokarsinojenlerin karsinojen formuna dönüşmesinde rol oynamaktadır. Bu yolla da
kanser gelişimine katkıda bulunmaktadır.
Kolorektal Kanser ve Oksidatif Stres
Kolonda lümen mukozası sürekli reaktif oksijen türlerinin etkisine maruz kalmaktadır.
Bu maruziyet okside gıda artıklarından, yüksek düzeyde demir iyonlarından, oksidanlardan,
toksinlerden, bakterilerden ve safra asitlerinden kaynaklanmaktadır (44).
26
Lipid peroksidasyon ürünlerinden MDA’nın karsinogeneziste anahtar rol aynadığı
bilinmektedir. Nayak ve ark. (45) kolorektal kanserli hastalarda yaptıkları çalışmada lipid
peroksidasyonunu yansıtan MDA seviyelerini kontrol grubuna göre yüksek bulmuşlardır.
Leung ve ark. (46) cerrahi şansı olmayan olguların cerrahi olarak tedavi edilebilenlere göre
plazma antioksidan düzeylerinin düşük, MDA düzeyinin ise yüksek olduğunu bildirmişlerdir.
İleri evre tümör olgularının cerrahi şansını kaçırması nedeniyle lipid peroksidasyonunun
tümör evresiyle birlikte artmış olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Rainis ve ark. (44) kolorektal
kanserli hastalarda yaptıkları çalışmada kolonik tümör dokusuyla sağlam kolonik dokuda
MDA ve lipid peroksid düzeylerine bakmışlar ve tümör dokusundaki seviyelerinin sağlam
dokuya göre yüksek olduğunu görmüşlerdir. Aynı çalışmada kolon dokusunda lökosit
enzimleri olan MPO ve adenozin deaminaz (ADA) düzeylerine bakmışlar ve MPO düzeyinin
kolon dokusunda sağlam dokuya göre iki katına çıktığını, ADA düzeylerinde de artış
olduğunu göstermişlerdir.
27
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Bu çalışma; Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Yerel Etik Kurul onayı alınarak (Ek 1)
Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı araştırma laboratuvarında
gerçekleştirildi.
HASTALARIN BELİRLENMESİ
Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilim Dalı ve Özel Ekol Hastanesi
Gastroenteroloji kliniğinde izlenen kolorektal kanser tanısı alan hastalar (n=21) ile sağlıklı
kişiler (n=21) kontrol grubu olarak çalışmaya dahil edildi.
Tanı konmuş diyabet, başka bir kanser, kronik böbrek yetmezliği, kronik inflamatuar
hastalığı (kronik inflamatuar barsak hastalığı) olan hastalar, son bir hafta içinde; vitamin (A, E
ve C vitaminleri), demir bağlayıcıları (Desferroksamin), ksantin oksidaz inhibitörleri
(Allopurinol), trimetazidin, N-asetil sistein içeren ilaçlar (Asist), karnitin, probukol,
anjiotensin dönüştürücü enzim inhibitörleri, kortizon, asetil salisilik asit, nonsteroid
antiinflamatuarlar gibi oksidan stresi etkileyen ilaçları kullananlar, alkol ve sigara kullananlar
ve çalışmaya dahil olmak istemeyenler çalışma dışında bırakıldı. Çalışma kapsamına alınacak
her bireye ''Bilgilendirilmiş gönüllü olur formu'' (Ek 2) okunarak bilgilendirildi, çalışmaya
katılan kişi tarafından imzalanan formun bir kopyası katılımcıya verildi.
KAN ÖRNEKLERİNİN ALINMASI VE SAKLANMASI
Kontrol grubundan ve kolorektal kanserli hastalardan 12 saatlik açlıktan sonra sabah
alınan venöz kan örnekleri biyokimya (antikoagülansız, düz) ve heparinli tüplere konarak
Biyokimya Anabilim Dalı Laboratuvarı’na getirildi. 3000 rpm’de, 10 dk santrifüj edilip
28
plazma ve serumları ayrılarak çalışma gününe kadar –80 ºC’de saklandı.
KULLANILAN MALZEMELER
Kimyasal Maddeler
Asetik asit (CH3COOH)
(Sigma Aldrich GmbH, Seelze-Almanya)
Bakır sülfat (CuSO4.5H2O)
(Pancreac Monplet, madrid-İspanya)
Glisin (H2NCH2COOH)
(Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Hidroklorik asit (HCl)
(Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Kadmiyum granül
(Sigma Aldrich GmbH, Seelze-Almanya)
MPO elisa kiti
(Hycult biotechnology)
n-Butanol (CH4H10O)
(Sigma Aldrich GmbH, Seelze-Almanya)
N-Naftiletilendiamin dihidroklorür
(Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
(C10H7NHCH2CH2NH2HCl)
NT elisa kiti
(Hycult biotechnology)
Piridin (C5H5N)
(Sigma Aldrich GmbH, Seelze-Almanya)
Potasyum nitrat (KNO3)
(Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Sodyum hidroksit (NaOH)
(Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Sodyum tetra borat (Na2B4O7. 10 H2O)
(Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Sülfonilamid (C6H8N2O2S)
(Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Tiyobarbitürik asid (C4H4N2O2S)
(Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Diğer Alet ve Cam Malzemeler
Cam malzemeler :
Deney tüpleri, balon jojeler, beherler vd.
Distile su cihazı :
Nüve, Almanya
Elektronik tartı :
Sartorius AG, Almanya
Etüv :
Memmert 400, Almanya
Manyetik karıştırıcı :
Ikamag RH-Staufen, Almanya
Otomatik pipetler :
Eppendorf, Socorex, Microlit
pH metre :
Inolab pH level 1 WTW, Almanya
Soğutmalı santrifüj :
Hettich Universal 30RF, Almanya
Spektrofotometre :
Shimadzu UV-1700A, Japonya
Vorteks :
Velp Scientificia, Almanya
Sallantılı su banyosu
GFL 1083, Almanya
29
BİYOKİMYASAL ÖLÇÜMLER
Miyeloperoksidaz Tayini
Plazma örneklerinde MPO seviyesi tayini, hycult biotechnology marka, HK324 no'lu
kit kullanılarak çift sandviç ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) yöntemi ile
ölçüldü. Tüm örneklerde çalışmalar iki kez tekrarlandı. 0, 0.4, 1.0, 2.6, 6.4, 16, 40 ve 100
ng/mL standart çözeltileri ile kalibrasyon eğrisi hazırlandı (Şekil 11). Regresyon analizi ile
kalibrasyon eğrisinin denklemi bulundu, bu denklem kullanılarak plazma örneklerindeki MPO
düzeyleri hesaplandı.
Miyeloperoksidaz kalibrasyon eğrisinin denklemi:
y = 1.03951148 + 0.01727115x
2,50
Absorbans
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
1 0
,
E
5
1
10
Miyeloperoksidaz (ng/mL)
Şekil 11. Miyeloperoksidaz standart grafiği
30
100
Nitrotirozin Tayini
Plazma örneklerinde NT seviyesi tayini, hycult biotechnology marka, HK501 no'lu kit
kullanılarak çift sandviç ELISA yöntemi ile ölçüldü. Tüm örneklerde çalışmalar iki kez
tekrarlandı. 0.0, 2.1, 6.2, 18.5, 55.6, 166.7, 500 ve 1500 nM standart çözeltileri ile kalibrasyon
eğirisi hazırlandı (Şekil 12). Regresyon analizi ile kalibrasyon eğrisinin denklemi bulundu, bu
denklem kullanılarak plazma örneklerindeki NT düzeyleri hesaplandı.
Nitrotirozin kalibrasyon eğrisinin denklemi:
y = 0.5016967 + 0.00012148x
0,25
Absorbans
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
1,00
10,00
100,00
1000,00
10000,00
Nitrotirozin (nM)
Şekil 12. Nitrotirozin standart grafiği
Nitrik Oksit Tayini
Cortas ve ark. (47) tanımladıkları metoda göre spektrofotometrik olarak yapıldı.
Plazmada nitratın nitrite dönüşümü kadmiyum granülleriyle sağlandıktan sonra nitrik oksit
seviyeleri Griess ayıracı kullanılarak saptandı. Tüm örneklerde çalışmalar iki kez tekrarlandı.
10 mM KNO3 stok standart 10 mM sodyum borat içinde hazırlandı. Stok standarttan 25, 50,
100 ve 200 μmol/L konsantrasyonlarında olmak üzere çalışma standartları hazırlanarak ikişer
31
kez çalışılarak kalibrasyon eğrisi hazırlandı (Şekil 13). Regresyon analizi ile kalibrasyon
eğrisinin denklemi bulundu, bu denklem kullanılarak plazma örneklerindeki NO düzeyleri
hesaplandı.
Nitrik oksit kalibrasyon eğrisinin denklemi:
y = 0.00645652 + 0.00144713x
0,35
0,30
Absorbans
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0
50
100
150
200
KNO3 (uM)
Şekil 13. Nitrik oksit standart grafiği
Malondialdehid Ölçümü
Prensip: Deneyin prensibi çoklu doymamış yağ asitlerinin peroksidasyonu ile oluşan
son ürünlerden biri olan MDA’nın sıcak ortamda TBA ile oluşturduğu bileşiğin pembe-kırmızı
renginin 532 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır (48).
Deney: 200 µl serum üzerine %20’lik asetik asid ve %0.8’lik TBA eklendi. Tüpler
kaynar su banyosunda 60 dakika bekletildikten sonra soğutularak üzerlerine n-butanol/piridin
karışımı eklendi. Tüpler 1700xg’de 10 dakika santrifüj edilerek, butanol/piridin fazı
32
ayrıldıktan sonra butanol/piridin körüne karşı 532 nm dalga boyunda spektrofotometrede
ölçüldü.
Tüm örneklerde çalışma ikişer kez tekrarlandı. Malondialdehitin 532 nm'deki molar
absorptivitesi kullanılarak serumdaki MDA değerleri hesaplandı, sonuçlar nmol/mL olarak
ifade edildi.
İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME
Verilerin istatistiksel değerlendirilmesi için Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi
Dekanlığı Bilgi İşlem Dairesi’nde bulunan Minitab Release 13 (Lisans no:WCP 1331.00197)
paket programı kullanıldı. Her bir grupta verilerin parametrik varsayımları yerine getirip
getirmediğini incelemek için normal dağılıma uygunluk ve varyansların homojenliği testleri
yapıldı. İki grup arasındaki farklılıklar; Mann-Whitney U testi ile değerlendirildi. İki grubun
yaş ortalamalarının karşılaştırılması Student’s t testi ile değerlendirildi. İki grubun cinsiyet
dağılımlarının karşılaştırılması Ki kare testi ile değerlendirildi. Korelasyon analizi için
Spearman testi kullanıldı. Elde edilen değerler ortalama±standart sapma (Ort±SD) olarak
ifade edildi ve p<0.05’in altındaki farklılıklar anlamlı olarak değerlendirildi.
33
BULGULAR
Çalışmaya alınan olguların yaş ortalaması kolorektal kanser grubunda 60.52 yıl,
kontrol grubunda 60.29 yıl olup istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (Tablo 2).
Tablo 2. Çalışmaya katılan olguların yaş ortalamaları dağılımları
Yaş (yıl) *
Gruplar
Ort±SD
Kontrol (n=21)
60.29±13.67
Kolorektal kanser (n=21)
60.52±13.80
*: Student-t testi ile değerlendirme.
Kolorektal kanser grubunda 18 erkek, 3 kadın; kontrol grubunda da 18 erkek 3 kadın
çalışmaya katılmış olup gruplar arasında cinsiyet dağılımı açısından anlamlı bir fark
saptanmamıştır (Tablo 3).
Tablo 3. Çalışmaya katılan olguların cinsiyet dağılımları
Cinsiyet χ
Gruplar
χ
Erkek
Kadın
Kontrol (n=21)
18
3
Kolorektal kanser (n=21)
18
3
: Ki kare testi ile değerlendirme.
34
Kolorektal kanser grubunda plazma MPO düzeyi 64.70 ng/mL iken kontrol grubunda
51.02 ng/mL olarak saptandı. Kolorektal kanser grubunun plazma MPO düzeyi kontrol grubuna
göre istatistiksel olarak anlamlı (p<0.01) yüksek olduğu görüldü (Tablo 4, Şekil 14).
Tablo 4. Kontrol ve kolorektal kanser gruplarının plazma miyeloperoksidaz
düzeyleri (Ort±SD)
Gruplar
Plazma MPO
(ng/mL)§
Kontrol (n=21)
51.02±20.93
Kolerektal kanser (n=21)
64.70±19.79**
§
: Mann-Whitney U testi ile değerlendirmede;
**: p<0.01.
MPO: Miyeloperoksidaz.
Miyeloperoksidaz
(ng/mL)
100.00
80.00
64.70
**
51.02
60.00
40.00
20.00
0.00
Kontrol
Şekil 14. Plazma miyeloperoksidaz düzeyleri
**: p<0.01.
35
Kolorektal Kanser
Kolorektal kanser grubunda plazma NT düzeyi 155.56 nM iken kontrol grubunda 110.95
nM olduğu ve kolorektal kanser grubunda gözlenen plazma NT düzeyindeki yükselişin kontrol
grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı (p<0.01) olduğu saptandı (Tablo 5, Şekil 15).
Tablo 5. Kontrol ve kolorektal kanser gruplarının plazma nitrotirozin düzeyleri
(Ort±SD)
Gruplar
Plazma NT
(nM)§
Kontrol (n=19)
Kolorektal kanser
110.95±50.17
(n=21)
155.56±21.91 **
§
: Mann-Whitney U testi ile değerlendirmede;
**: p<0.01.
NT: Nitrotirozin.
Nitrotirozin
(nM)
250
155.56 **
200
110.95
150
100
50
0
Kontrol
Şekil 15. Plazma nitrotirozin düzeyi
**: p<0.01.
36
Kolorektal Kanser
Plazma NO• düzeyi kontrol grubunda 18.79 µM iken; kolorektal kanser grubundaki
olgularda 27.48 µM olduğu saptandı. Plazma NO• düzeyinde kontrol grubuna göre kolorektal
kanser grubunda görülen artışın istatistiksel olarak anlamlı (p<0.01) olduğu görüldü (Tablo 6,
Şekil 16).
Tablo 6. Kontrol ve kolorektal kanser gruplarının plazma nitrik oksit düzeyi
(Ort±SD)
Kontrol
Gruplar
Plazma NO•
(µM)§
(n=21)
18.79±5.76
Kolorektal kanser
(n=21)
27.49±10.53 **
§
: Mann-Whitney U testi ile değerlendirmede;
**: p<0.01.
NO•: Nitrik oksit.
27.49 **
40
Nitrik oksit
(µM)
18.79
30
20
10
0
Kontrol
Kolorektal Kanser
Şekil 16. Plazma nitrik oksit düzeyleri
**: p<0.01.
Serumdaki MDA düzeyinin kolorektal kanser grubunda 1.76 nmol/mL olduğu ve kontrol
grubuna göre anlamlı derecede arttığı (p<0.05) görülmüştür (Tablo 7, Şekil 17).
37
Tablo 7. Kontrol ve kolorektal kanser gruplarının serum malondialdehid
düzeyleri (Ort±SD)
Gruplar
Kontrol
Serum MDA
(nmol/mL)§
(n=20)
0.96±0.47
Kolorektal kanser (n=21)
1.76±1.26 *
§: Mann-Whitney U testi ile değerlendirmede;
*: p<0.05.
MDA: Malondialdehid.
1.76 *
Malondialdehid
(nmol/mL)
2.5
2.0
0.96
1.5
1.0
0.5
0.0
Kontrol
Kolorektal Kanser
Şekil 17. Serum malondialdehid düzeyleri
*: p<0.05.
Olguların tümü ele alındığında plazma NO• ve NT düzeyleri arasında pozitif bir ilişki (r =
0.504, p<0.001) olduğu, diğer parametreler arasında ise korelasyon olmadığı görüldü (Şekil 18).
Gruplar ayrı ayrı incelendiğinde kontrol grubundaki parametreler arasında herhangi bir
ilişki bulunmazken; kolorektal kanserli olguların plazma NO• düzeyleri ile plazma NT düzeyleri
arasında pozitif ilişki (r = 0.569, p<0.01) olduğu görüldü (Şekil 19).
38
Olguların tümü
200,00
Nitrotirozin (nM)
150,00
100,00
50,00
r = 0.504, <0.001
R Sq Linear = 0,145
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
Nitrik oksit (uM)
Şekil 18. Tüm olgularda plazma nitrik oksit ve plazma nitrotirozin düzeyleri
arasındaki ilişki
Kolorektal kanser grubu
200,00
Nitrotirozin (nM)
180,00
160,00
140,00
r = 0.569, p<0.01
120,00
R Sq Linear = 0,144
100,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
Nitrik oksit (uM)
Şekil 19. Kolorektal kanserli hastalarda plazma nitrik oksit ve plazma
nitrotirozin düzeyleri arasındaki ilişki
39
Kolorektal kanser grubunda yer alan her bir olgunun demografik özellikleri ile ölçülen
parametrelerin düzeyleri Tablo 8’de görülmektedir.
Tablo 8. Kolorektal kanser grubundaki olguların demografik özelikleri, serum
malondialdehid, plazma miyeloperoksidaz, nitrik oksit ve nitrotirozin
düzeyleri
Sıra No
Olgu
Cinsiyet
Yaş
(yıl)
1
M. D
E
76
2
H. B
E
71
3
H. A
E
71
4
S. U
K
31
5
R. Ç
E
55
6
R.S.M
E
55
7
M. Ö
E
61
8
M. L
E
38
9
H. M
E
59
10
H. P
E
56
11
Y. R
E
71
12
H. B
E
54
13
Y. Ş
E
74
14
İ. S
E
55
15
A. Ö
E
72
16
F. B
E
63
17
H. Y
E
72
18
M. Ö
E
51
19
H. D
K
64
20
E. Ö
E
37
21
P. I
K
85
MDA
(nmol/mL)
MPO
(ng/mL)
NT
(nM)
1.44
65.17
164.35
26.15
0.62
10.86
141.54
23.53
0.87
81.73
171.95
27.74
1.35
60.59
167.80
23.18
0.43
65.11
195.44
34.06
1.15
72.35
161.58
28.44
0.91
73.21
154.67
37.56
5.58
70.09
160.20
20.73
1.44
80.63
138.09
19.32
0.72
74.84
129.80
22.13
1.59
81.55
198.90
31.25
1.87
76.92
154.67
31.95
0.87
59.32
169.87
29.85
2.16
57.87
126.34
22.13
1.83
8.37
178.17
34.51
4.33
75.53
133.94
20.02
2.40
76.28
155.36
16.52
2.07
66.61
113.90
16.96
1.15
69.16
131.87
19.03
2.45
57.70
164.35
27.04
-
74.89
153.98
65.17
MDA: Malondialdeid, MPO: Miyeloperoksidaz, NO: Nitrik oksit, NT: Nitrotirozin, E=Erkek, K=Kadın.
40
NO
(µM)
Kontrol grubunda yer alan her bir olgunun demografik özellikleri ile ölçülen
parametrelerin düzeyleri Tablo 9’da görülmektedir.
Tablo 9. Kontrol grubundaki olguların demografik özelikleri, serum malondialdehid,
plazma miyeloperoksidaz, nitrik oksit ve nitrotirozin düzeyleri
Sıra No
Olgu
Cinsiyet
Yaş
(yıl)
1
R.B
E
71
2
C.U
E
59
3
F.S
E
72
4
M.İ
E
73
5
İ.Ç
E
53
6
A.Y
E
56
7
N.A
K
32
8
S.D
E
63
9
A.S
E
59
10
T.G
E
50
11
Ö.L.U
E
77
12
G.E
K
82
13
Ş.P
E
70
14
M.E.B
E
72
15
O.F
E
74
16
U.T
E
37
17
F.Ş
E
37
18
A.C
E
55
19
F.Y
K
63
20
İ.S
E
55
21
B.Y
E
56
MDA
(nmol/mL)
MPO
(ng/mL)
NT
(nM)
0.29
36.04
181.62
10.90
0.91
54.22
100.08
27.55
1.06
56.48
133.94
29.14
0.53
62.68
173.33
22.13
1.63
69.97
109.76
15.70
0.77
55.73
132.56
15.33
0.96
66.38
64.84
11.43
0.82
75.36
79.35
13.38
0.91
56.25
176.78
26.63
1.15
2.05
149.83
14.03
0.53
56.13
136.71
20.02
0.29
69.33
90.41
15.82
1.06
19.71
74.51
15.33
0.48
76.11
100.77
24.06
1.63
77.56
151.91
26.85
1.63
20.99
111.14
22.50
1.68
43.45
82.11
16.40
0.67
39.52
137.40
13.71
1.78
45.65
142.92
15.01
0.48
23.48
-
24.06
0.87
64.24
-
14.68
MDA: Malondialdeid, MPO: Miyeloperoksidaz, NO: Nitrik oksit, NT: Nitrotirozin, E=Erkek, K=Kadın.
41
NO
(µM)
TARTIŞMA
Kolorektal kanser; yaşam kalitesini düşüren, iş-güç kaybına yol açan önemli bir sağlık
sorunu olarak günümüzde en sık görülen kanserlerdendir. Ülkemizde de son yıllarda
kolorektal kanser belirgin oranda artış göstermektedir. Kolorektal kanserinden ölüm tüm
kanser nedeniyle ölümlerin %10’unu oluşturmaktadır (1,2).
Birçok kanser tipinde olduğu gibi kolon kanserinin oluşumu ve gelişiminde de
oksidatif hasar ve inflamasyonun etkisi olduğu; oksidasyon ürünlerinin metabolizmasında,
aktif olan genlerde degişiklikler olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte kolorektal
kanserde dokuda ve kanda oluşan biyokimyasal deşiklikler ve bunların hastalığın klinik evresi
ve ilerlemesiyle ile ilişkisi konusu hala netleşmemiştir.
Kolonda lümen mukozası sürekli reaktif oksijen türlerinin etkisine maruz kalmaktadır.
Bu maruziyet okside gıda artıklarından, yüksek düzeyde demir iyonlarından, oksidanlardan,
toksinlerden, bakterilerden ve safra asitlerinden kaynaklanmaktadır (44). Kolon lümenindeki
reaktif oksijen türleri direkt genotoksik etkileri yanında fekal mutajen oluşmasına yol açarlar.
Diyetle alınan çoklu doymamış yağ asitleri kolon lümenindeki lipid hidroperoksitlerinin ana
kaynağıdır. Gaytadaki bakterilerin oluşturduğu O2•⎯; demir varlığında •OH oluşumuna yol
açar. Hidroksil radikali ise bilinen en reaktif oksijen radikalidir. Kolorektal kanser açısından
inflamasyon bir risk faktörüdür. İnflamasyon sırasında nötrofillerin oluşturduğu ROT’nin
mutajenik etkiye yol açtığı ileri sürülmektedir (6).
Kanser gelişimi çok aşamalı bir süreçtir. Tek bir hücrede meydana gelen olayların
birikim etkisi ile karakterizedir; başlangıç, yükselme ve ilerleme olmak üzere üç aşamadan
oluşur. ROT karsinogenezin bütün evrelerinde etkindir (Şekil 20). Başlangıç evresinde
ölümcül olmayan DNA mutasyonları vardır. Yükselme evresi, hücre çoğalmasının uyarılması
42
ve/veya hücre ölümünün inhibe olması ile karakterizedir. Yüksek düzeydeki oksidatif stres
hücre için sitotoksiktir ve apopitoz veya nekroz sürecinin başlamasını da engeller. Bununla
birlikte düşük düzeydeki oksidatif stres yükselme evresinde hücre bölünmesini uyarır ve
böylece tümör büyümesini destekler. Karsinogenezin bu evresindeki ROT üretimi tümör
gelişimindeki ana hattı oluşturur. İlerleme evresi karsinogenezin üçüncü ve son aşamasıdır. Bu
evrede preneoplastik durumdan neoplastik duruma geçiş söz konusudur ve bu evre geri
dönüşümsüzdür (19).
ROT
Şekil 20. Karsinogenezin üç evre modeli ve karsinojenik etkilerin seviyesi ve
karsinojenik sürecin çeşitli evrelerinde serbest radikal seviyeleri (19)
Kolorektal kanserin başlangıç ve ilerleme aşamalarında reaktif oksijen türlerinin rolü
olduğu düşünülmektedir (44). Karsinogenezde DNA hasarı, hücre membranı, mitokondri
hasarları önemli olup ROT’un tümör ilerlemesine ve başlayan hücre çoğalmasının artışına
neden olduğu düşünülmektedir (35)
Reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin artması ve birbirleriyle reaksiyonları sonucu
oluşan ONOO⎯ gibi daha reaktif türler mitokondrial DNA, RNA, lipid ve proteinlerde;
nitrasyon,
oksidasyon
ve
halojenasyon
reaksiyonları
ile
artmış
mutasyonların
nedenlerindendir. Bununla birlikte ROT ve RNT direk olarak DNA’da modifikasyonlara
43
neden olmaktadır. DNA’nın doğrudan kimyasal modifikasyonu reaktif oksijen / nitrojen /
klorin türlerinin zarar verme yollarından sadece biridir ve bu durum mutasyonlara ve
karsinojenik durumların ilerlemesine neden olabilir. Radikaller lipid peroksidasyonu süresince
DNA’ya sadırıda bulunurlar. Reaktif türler kanserojen öncüllerinin aktifleşmesine yol
açabilirler Reaktif türler kromatin proteinleri, DNA tamir enzimleri ve DNA polimerazlar gibi
proteinlerin hasarına neden olabilir ve bu durum replikasyon hatası görülme oranını arttırabilir
(Şekil 21).
DNA/kromatin yapısında
değişiklikler
2
DNA/kromatinde
konformasynel değişiklikler
1
Lipid peroksidasyonunun
uyarılması
5
Kanserojenlerin aktivasyonu
3
Reaktif Türler
4
DNA polimeraz ve DNA tamir
enzimlerinin etkinliğinde azalma
(oksidatif protein hasarı ve anormal
DNA şekli)
Düzenleyici enzimler ve
transkripsiyonel faktörlerde
indirgenme/yükseltgenme
Hücre büyümesinin uyarılması
Apopitozisin baskılanması
Metastazın ilerlemesi
Şekil 21. Reaktif türlerin kanser gelişimini kolaylaştırmasını gösteren bazı yollar
(10)
Lipid peroksidasyon ürünlerinden olan aldehidler DNA bazları ile etkileşerek
malondialdehid-deoksiguanin (M1dG) ve etano/propano DNA gibi değişik türlerde eksosiklik
ürünler oluştururlar. Rektif oksijen türleri, RNT ve lipid peroksidasyon ürünleri sinyal
moleküllerini düzenlenmesinde, enzim ve moleküllerin fonksiyonlarında değişikliklerle
inflamasyon ve karsinogenez sürecinde rol oynarlar (Şekil 22) (43).
Kronik inflamatuar süreçte oksidatif/nitrozatif stresin neden olduğu hasarın insanlarda
görülen birçok kanser türünde anahtar rol oynayabileceği ileri sürülmektedir.
Serbest radikaller hücre içerisinde DNA, protein ve hücre membranı gibi değişik
moleküllere zarar verir. Zarar gören bu moleküller içinde en çok araştırılan lipid
peroksidasyonudur. Lipid peroksidasyon son ürünlerinden biri olan MDA, oksidatif hasarın in
vivo göstergesi olarak en sık ölçülen parametredir. Malondialdehidin bakteri ve memeli
44
hücreleri için mutajenik iken ratlar için karsinojenik olduğu ileri sürülmektedir.
Malondialdehid DNA bazları ile etkileşerek bu etkilere yol açtığı gibi DNA-DNA ve
DNA-protein arasında çapraz bağların oluşumuna ve zincir kırılmalarına neden olmaktadır
(35).
İnflamatuar hastalıklar
(pankreatit, kolit, hepatit)
İnflamatuar hücrelerin aktivasyonu/
oksidan üreten enzimlerin aktivasyonu
Sitokinler
NF-kB
MPO, NADPH-oksidaz
LOX
COX-2
iNOS
ROT
RNT
Lipid peroksidasyonu
HNE
8-oxo-dG
HPNE
Etano/propano ürünler
Replikasyon
MDA
M1dG
8-NO2-dG
DNA tamir bozuklukları
Mutasyon ve genomik
instabilite
Kanser
Şekil 22. Oksidatif ve nitrozatif stres kaynaklı inflamatuar süreç ve kanser
risk faktörleri (43)
COX-2: Sikloksijenaz-2, HNE: Hidroksinonenal, HPNE: 4-hidroksihidroperoksi 2-nonenal, iNOS:
Uyarılabilir nitrik oksit sentaz, LOX: Lipooksijnaz, 8-NO2-dG: 8-nitro-deoksiguanozin, 8-oxo-dG: 8okso-deoksiguanozin, MDA: Malondialdehid, M1dG: Malondialdehid deoksiguanozin, MPO:
Miyeloperoksidaz, NADPH: Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (indirgenmiş), NF-kB: Nükleer
faktör kappa B, RNT: Reaktif nitrojen türevi, ROT: Reaktif oksijen türevi.
Kanser hastalarında anormal olarak çoğalan hücrelerde artan lipid peroksidasyon
ürünlerinin arttığı ileri sürülmektedir. Skrzydlewska ve ark. (6) yaptıkları bir çalışmada
kolorektal kanser hastalarında tümöral doku MDA düzeyinin çevre sağlam dokuya göre
arttığını göstermişlerdir. Erata ve ark. (5) yaptıkları bir çalışmada kolorektal kanserli
hastaların normal dokuları ile malign dokuları arasındaki MDA düzeylerini karşılaştırmışlar
45
ve malign dokuda MDA düzeylerinin %111 daha yüksek olduğunu göstermişlerdir. Bayraktar
ve
ark.
(49)
yaptıkları
çalışmada
kolon
kanserli
hastalarda
kontrol
grubu
ile
karşılaştırıldığında serum MDA düzeylerinde anlamlı bir artış olduğunu göstermişlerdir.
Nayak ve ark. (45) kolorektal kanserli hastalarda yaptıkları çalışmada lipid peroksidasyonunu
yansıtan plazma MDA seviyelerini kontrol grubuna göre yüksek bulmuşlardır. Rainis ve ark.
(44) kolorektal kanserli hastalarda yaptıkları çalışmada kolonik tümör dokusuyla sağlam
kolonik dokuda MDA ve lipid peroksid düzeylerine bakmışlar ve tümör dokusundaki
seviyelerinin sağlam dokuya göre yüksek olduğunu görmüşlerdir. Yaptığımız çalışmada
kolorektal kanserli hastalarda serum MDA düzeyini kontrol grubuna göre anlamlı olarak
(p<0.05) yüksek saptadık. Çalışmamız sonucunda bulgularımız literatürdeki bulgularla uyum
sağlamaktadır. Bulgularmız ve literatürdeki bilgiler ışığında; kolon kanserli hastaların serum
MDA düzeyinin
yüksek
bulunması,
serbest
oksijen
radikalleri
ile
oluşan
lipid
peroksidasyonunun sonuçlarından biridir. Bu sonuç kolon kanserinde oluşan doku hasarında
serbest oksijen radikallerinin ve oksidatif stresin rol aldığını düşündürmektedir.
Nitrik oksit fizyolojik ve patofizyolojik olaylarda hücresel toksisiteyi gösteren bir
biyoregülatör moleküldür (7). Nitrik oksit, pro-inflamatuar etkieriyle akut ve kronik
inflamasyonda önemli bir role sahiptir. Nitrik oksit oldukça reaktif bir moleküldür ve
doğrudan ya da peroksinitrit oluşumu yoluyla oksidan etki gösterir. Bu oksidan özelliği
nedeniyle bakterisid ve tümör hücrelerine karşı sitotoksiktir, bu nedenle savunma sisteminin
bir parçası olarak da görev yapar. Nitrik oksidin birçok zararlı etkisi süperoksit anyonu ile
reaksiyonu sonucu oluşan peroksinitrite bağlı olarak ortaya çıkmaktadır (7). Biyolojik
sistemlerde üretilen yüksek konsantrasyonlardaki NO•’nun zararlı etkileri birkaç yolla
gerçekleşir. NO• paylaşılmamış elektronu bulunan bir molekül olduğu için hücre içinde
proteinlerin yapısında bulunan demir gibi geçiş metallerine bağlanır ve ortama serbest demir
salınmasına neden olur. Bir başka yol, otooksidasyon ile N-nitrozo bileşiklerini
oluşturmasıdır. Oluşan N2O3 gibi nitrojen oksitler güçlü nitrozile edici ajanlardır ve primer ve
sekonder aminleri nitrözilleyerek, nitrozaminleri oluştururlar. Nitrozaminler; potansiyel
karsinojenik maddelerdir. Çünkü bu bileşikler DNA’da nitrozilasyon, deaminasyon yapabilir
ve alkil nükleofillerin oluşumuna neden olabilirler. Nitrik oksit, oksijen radikalleri ile
reaksiyona girerek DNA, proteinler ve hücre membran lipidlerini okside eden ONOO⎯
üretmesi diğer bir önemli yoldur. Peroksinitrit guanin bazı ile reaksiyona girerek
8-nitroguanin oluşturur. Bunun sonucunda DNA’da baz değişimleri yaparak mutasyonlara
neden olur. Bilindiği gibi bu mutasyonlar karsinogeneziste rol oynamaktadır (37). Oldukça
reaktif bir türev olan peroksinitrit proteinlerdeki tirozin kalıntılarının orto pozisyonunda
46
nitrasyonu ile NT oluşumuna yol açar. Tirozinin geri dönüşümsüz olarak nitrasyonu, tirozinin
fosforillenmiş ve fosforillenmemiş formlarının birbirine dönüşümünü engelleyerek, enzim
aktivitesinin ve sinyal ileti mekanizmalarının düzenlenmesini etkiler. Nitrotirozin’in, ONOOoksidasyonunun kararlı son ürünü olması nedeniyle NT ölçümünün NO• bağımlı in vivo
hasarın tespitinde kullanışlı bir belirteç olduğu bildirilmektedir (27). Erdman ve ark. (50)
Helicobacter hepaticus verilerek kolonda infeksiyon modeli oluşturdukları ve NOS inhibitörü
olarak N-metil arginin kullandıkları çalışmalarında kolonik epitel hücre hiperplazisi ve
displazisinde azalma olduğunu, ancak inflamatuar hücre sayısında değişiklik olmadığını
bildirmişlerdir. Bilindiği gibi hücre hiperplazisi ve displazi kanser öncesi lezyonlardır. Yue ve
ark. (51) oluşturdukları inflamatuar barsak hastalığı modelinde artmış NO•, ONOO-, NT
oluşumunun apopitozisle ilişkili olduğunu göstermişlerdir. Seçici iNOS inhibitörü
kullanımının NO•, NT düzeylerinde ve apopitoziste azalmaya yol açtığını, kanser durumunda
apopitoziste de azalmanın söz konusu olabileceğini bildirmişlerdir. Kanserde NO• ve NT ile
apopitozis arasında ilişki olup olmadığını gösterecek yeni çalışmalara ihtiyaç vardır. Aynı
çalışmada artmış MPO aktivitesinin spesifik inhibitör kullanımıyla azaldığı bildirilmiştir.
Fonksiyonel p53 geni taşımayan HT-29 kolon kanseri hücrelerinde NO• konsantrasyonunun
artması ile mitokondrial süperoksit anyon radikallerini toplayarak apopitozu inhibe ettiği
bildirilmiştir. Aktive olmuş immün sistem hücrelerinde NO• üretiminin artmış bulunması, NO•
ve kanser gelişimi arasında bir bağ olduğunu düşündürmektedir. İnsan kolon adenomlarında
gözlenen NOS izoformlarındaki artış, kolon kanseri gelişimi sürecine önemli katkılarda
bulunmaktadır (9).
Szaleczsky ve ark. (52) kolorektal kanserli hasta, aktif inflamatuar barsak hastalığı
olan hasta ve sağlıklı kontrol grubundan oluşan çalışmalarında plazma NO• düzeylerini
kolorektal kanser grubunda ve inflamatuar barsak hastalığı grubunda sağlıklı kontrol grubuna
göre yüksek olduğunu bulmuşlardır. Aynı çalışmada HPLC metoduyla NT düzeyine
baktıklarında 32 kolorektal kanser hastasının 7’sinde pik saptamışlardır. Literatürde kolorektal
kanser hastalarında NT düzeylerini biyokimyasal açıdan inceleyen başka çalışmaya
rastlanmamıştır.
Çalışmamızda plazma NO• düzeylerinin kolorektal kanser grubunda kontrol grubuna
göre anlamlı olarak (p<0.01) yüksek saptandı. Nitik oksitin oldukça sitotoksik bir türevi olan
peroksinitritin belirteci olan NT düzeyinin de kolorektal kanser grubunda kontrol grubuna
göre anlamlı olarak (p<0.01) yüksek olduğu görüldü. Yaptığımız çalışmada kolorektal kanser
ve kontrol grubundan oluşan tüm olguları aldığımızda plazma NO• düzeyleri ile NT düzeyleri
arasında pozitif bir ilişki (r = 0.504, p<0.001) olduğu; gruplar ayrı ayrı ele alındığında kontrol
47
grubunda plazma NO• düzeyleri ile NT düzeyleri arasında ilişki bulunmazken kolorektal
kanser grubunda pozitif (r = 0.569, p<0.01) bir ilişki olduğu görüldü.
Biyolojik, kimyasal ve fiziksel faktörlerle uyarılan kronik inflamasyon, insanlarda
değişik türlerdeki kanserlerin artışıyla ilişkilidir. Kronik inflamasyon hücresel dengede
düzensizliklere, normal hücrelerde büyüme ve maligniteye ilerleyişin başlamasına, değişik
türlerde DNA hasar ürünleri oluşmasına, DNA onarım mekanizmalarının yetersizliğine,
proinflamatuar sitokinlerin artışına ve hasarlanmış hücrelerin apopitozis hızında azalmaya
neden olmaktadır (43). İnflamasyon sürecinde fagosit membranında bulunan NOX süperoksit
oluşumunu sağlayan önemli bir kaynaktır. Tümöral farklılaşmayla bağlı olarak NOX
düzeyinin arttığı düşünülmektedir. Fakat bununla ilgili bilgiler hala netleşmemiştir (10).
Ayrıca yapılan çalışmalarda MPO enziminin de kanser gelişiminde rolü olduğu görülmektedir.
MPO, uyarılmış olan nötrofillerden salındıktan sonra reaktif türlerin oluşumuna yol açmasının
dışında prokarsinojenlerin karsinojen formuna dönüşmesinde rol oynamaktadır. Bu yolla da
kanser gelişimine katkıda bulunmaktadır. Rainis ve ark. (44) kolorektal kanserli hastalarda
yaptıkları çalışmada kolonik tümör dokusuyla sağlam kolonik dokuda MPO ve ADA
düzeylerine bakmışlar ve tümör dokusundaki MPO seviyelerinin sağlam dokuya göre iki kat
yüksek olduğunu, ADA düzeylerinin de arttığını göstermişlerdir.
Çalışmada kolorektal kanserli olgularda plazma MPO düzeylerinin kontrol grubuyla
karşılaştırıldığında anlamlı olarak (p<0,01) yüksek olduğu görüldü. Çalışmamızda elde
ettiğimiz bulgular Rainis ve arkadaşlarının çalışmasında elde ettikleri bulgularla uyum
göstermektedir. Kolorektal kanserli olgularda MPO düzeyindeki yükseklik bu olgularda
oksidan moleküllerin üretiminde artış olduğuna işaret etmektedir.
Sonuç olarak kolorektal kanser hastalarında plazma lipid peroksidasyonunu yansıtan
MDA düzeyinin yüksek bulunması kolorektal karsinogeneziste oksidatif stresin rol oynadığını
göstermektedir. Plazma NO• ve NT düzeylerinin kolorektal kanser hastalarında yüksek
saptanması reaktif nitrojen türlerinin kolorektal kanser için risk faktörlerinden olan kronik
inflamatuar süreçte iNOS enziminin indüklenmesiyle oluşup miktarlarının arttığını
düşündürmektedir. Yapılan çalışmalarda prekanseröz dönemde iNOS inhibitörü kullanımının
inflamatuar nedenlerle olan hiperplaziyi engellediği gösterilmiştir. Tümörlü olgularda da
prekanseröz dönemde iNOS inhibitörlerinin yararlı etkilerinin olabilecegini ortaya
koyabilecek yeni çalışmalara ihtiyaç vardır. Çalışmamız bu açıdan yol göstericidir. Kolonda
inflamasyon yapılan deneysel modellerde iNOS inhibitörleri kullanımının apopitoziste
azalmayla birlikte NT ve NO• düzeylerinde de azalmaya yol açtığı bildirilmiştir. Kanserde NT
ve NO• düzeyleriyle apopitozis ilişkisini gösterecek yeni çalışmalara gerek duyulmaktadır.
48
Kronik inflamasyonda rol alan enzimlerden plazma MPO düzeyinin yüksek olması bu enzim
aracılıklı oluşan reaktif türlerin de kanser oluşumu üzerine etkisini açıklamaktadır.
Çalışmamız kolorektal kanser olgularında oksidatif ve nitrozatif stresi birlikte ele alan ilk
çalışmadır. Yaptığımız çalışmanın ileride kolorektal kanserli hastaların tedavisinde bu enzim
inhibitörlerinin ve reaktif türleri ortamdan uzaklaştıran antioksidanların kullanılabileceğini
göstermeye yönelik çalışmalara ışık tutacağını ümit etmekteyiz.
49
SONUÇLAR
Kolorektal kanserde oksidatif stres ve nitrozatif stres ile lökosit aktivasyonunun
hastalığın başlaması ve ilerlemesiyle ilişkili olabileceği ileri sürümektedir.
Kolorektal kanser tanısı almış olan hastalardan ve sağlıklı gönüllülerden oluşan
çalışmamızda kolorektal kanserli hastalarda oksidatif ve nitrozatif stresin incelenmesi, lökosit
aktivasyonu ile ilişkisini ortaya koymayı amaçladığımız ve bu amaçla serumda MDA,
plazmada MPO, NT ve NO• düzeylerinin ölçüldüğü çalışmamızda elde edilen sonuçlar
aşağıda belirtilmiştir.
1. Kolorektal kanserli hasta grubu ile kontrol grubu yaş ortalamaları açısından
karşılaştırıldığında istatatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p>0.05).
2. Kolorektal kanserli hasta grubu ile kontrol grubu cinsiyet dağılımları açısından
karşılaştırıldığında istatatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p>0.05).
3. Kolorektal kanserli hasta grubunda serum MDA düzeyleri kontrol grubuna göre artmış
olarak bulunmuştur (p<0.05).
4. Kolorektal kanserli hasta grubunda plazma MPO düzeyleri kontrol grubuna göre
artmış bulundu (p<0.01).
5. Plazma NT düzeylerinin kolorektal kanserli hasta grubunda kontrol grubuna göre
artmış olduğu görülmüştür (p<0.01).
6. Kolorektal kanserli hasta grubunda plazma NO• düzeyleri kontrol grubuna göre artmış
olduğu saptanmıştır (p<0.01).
7. Olguların tümü ele alındığında plazma NO• ve NT düzeyleri arasında pozitif bir ilişki
(r = 0.504, p<0.001) olduğu, diğer parametreler arasında ise korelasyon olmadığı
görülmüştür.
50
8. Gruplar ayrı ayrı incelendiğinde kontrol grubundaki parametreler arasında herhangi bir
ilişki bulunmazken; kolorektal kanserli olguların plazma NO• düzeyleri ile plazma NT
düzeyleri arasında pozitif ilişki (r = 0.569, p<0.01) olduğu görülmüştür.
Sonuç olarak bulgularımız kolorektal kanserli hastalarda serum MDA düzeyinin;
plazma MPO, NT, NO• düzeylerinin arttığı göstermektedir. Kolorektal kanserli hastalarda
oksidatif stres ve nitrozatif stresin ve lökosit aktivasyonunun hastalıkla ilişkili olduğunu
söyleyebiliriz.
51
ÖZET
Kolorektal kanser; yaşam kalitesini düşüren, iş-güç kaybına yol açan önemli bir sağlık
sorunu olarak günümüzde en sık görülen kanserlerdendir. Birçok kanser tipinde olduğu gibi
kolorektal kanser oluşumu ve gelişiminde de oksidatif hasar ve inflamasyonun etkisi olduğu
düşünülmektedir.
Çalışmamızın amacı kolorektal kanserde oksidatif ve nitrozatif stresi incelemek,
lökosit aktivasyonu ile ilişkisini ortaya koymaktır. Çalışma gruplarımızı kolorektal kanser
tanısı alan hastalar (n=21) ile kontrol grubu olarak sağlıklı kişiler (n=21) oluşturdu.
Kolorektal kanser ile kontrol grupları arasında yaş ortalaması ve cinsiyet dağılımı
bakımından anlamlı bir fark saptanmadı. Kolorektal kanserli hasta grubunda serum
malondialdehid ve plazma miyeloperoksidaz düzeyleri kontrol grubuna göre artmış olarak
bulundu (sırasıyla; p<0.05 ve p<0.01). Plazma nitrotirozin ve nitrik oksit düzeyleri kolorektal
kanser grubunda kontrol grubuna göre artmıştı (ikisi de; p<0.01 ve p<0.01). Olguların tümü
ele alındığında plazma nitrik oksit ve nitrotirozin düzeyleri arasında pozitif bir ilişki (r =
0.504, p<0.001) olduğu, diğer parametreler arasında ise korelasyon olmadığı görüldü. Gruplar
ayrı ayrı incelendiğinde kontrol grubundaki parametreler arasında herhangi bir ilişki
bulunmazken; kolorektal kanserli olguların plazma nitrik oksit düzeyleri ile plazma
nitrotirozin düzeyleri arasında pozitif ilişki (r = 0.569, p<0.01) olduğu görüldü.
Son olarak; bu bulgular kolorektal kansinomda oksidatif ve nitrozatif stresin olduğuna
işaret etmektedir. Ayrıca, nitrozatif stresin plazma proteinlerinin oksidasyonuna yol
açabileceğini söyleyebiliriz.
52
Anahtar
kelimeler:
Kolorektal
kanser,
nitrotirozin, nitrik oksit.
53
malondialdehid,
miyeloperoksidaz,
INVESTIGATIONS OF OXIDATIVE STRESS IN THE PATIENTS WITH
COLORECTAL CANCER
SUMMARY
Colorectal cancer is one of the most endemic cancers as a significant health problem
that decrease the life quality and cause job loss. As in several cancer types, it is also thought
that oxidative damage and its inflammation have an effect on colorectal cancer composition
and development.
Aim of our study is to examine oxidative stress and nitrosative stress at colorectal
cancer, introduce its correlation with leucocyte activation. Our study groups composed of
patients with colorectal cancer diagnosis (n=21) and healthy people as control group (n=21).
A significantly difference has not been determined in terms of age average and gender
dispersion between the colorectal cancer and the control groups. Serum malondialdehyde and
plasma myeloperoxidase levels of the colorectal cancer group were higher than those of the
control group (respectively; p<0.05 and p<0.01). The levels of plasma nitrotyrosine and nitric
oxide were increased in the colorectal cancer group compared as to the control group (both;
p<0.01). Considering all the cases together, it has been seen that there was a positive
correlation between plasma nitrotyrosine and nitric oxide levels (r = 0.504, p<0.01), but any
correlations were not observed among other parameters. When the groups analyzed
separately, any correlation has not been determined among parameters of the control group;
however, a positive correlation has been seen that between plasma nitric oxide and plasma
nitrotyrosine levels of the colorectal cancer group (r = 0.504, p<0.01).
54
In conclusion, these findings indicate that there were an oxidative and nitrosative
stress in the colorectal carcinoma. Also, we say that nitrosative stres may caused to oxidation
of the plasma proteins.
Key words: Colorectal cancer, malondialdehyde, myeloperoxidase, nitrotyrosine,
nitric oxide.
55
KAYNAKLAR
1.
Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J
Clin 2005;55(2):74-108.
2.
T.C. Sağlık Bakanlğı Kanser İstatistikleri (2003, 2004, 2005). http://www.saglik.gov.tr
Erişim tarihi:27.11.2009.
3.
Tez M, Göçmen E, Koç M, Akgül H. Kolekteral kanserde oksidatif stres (Erken Sonuçlar).
Selçuk Tıp Dergisi 2005;21:79-82.
4.
Çavdar C, Sifil A, Çamsarı T. Hastalıkların patogenez ve tedavisinde reaktif oksijen
partikülleri ve antioksidanlar. Türk Nefroloji Diyaliz ve Transplantasyon Dergisi 1997;34:96-101.
5.
Erata GO, Kanbağlı O, Durlanık O, Bulut T, Toker G, Uysal M. Induced oxidative stress
and decreased expression of inducible heat shock protein 70 (ihsp70) in patients with
colorectal adenocarcinomas. Jpn J Clin Oncol 2005;35(2):74–8.
6.
Skrzydlewska E, Sulkowski S, Koda M, Zalewski B, Kanczuga-Koda L, Sulkowska M.
Lipid peroxidation and antioxidan status in colorectal cancer. World J Gastroenterol
2005;11(3):403-6.
7.
Kılınç A, Kılınç K. Nitrik oksit biyolojik fonksiyonları ve toksik etkileri. Ankara: Palme
Yayıncılık, 2003:1-82.
8.
Çekmen MB, Turgut M, Türköz Y, Aygün AD, Gözükara EM. Nitrik oksit (NO) ve nitrik
oksit sentaz (NOS)’ın fizyolojik ve patolojik özellikleri. T Klin Pediatri 2001;10:226-36.
9.
Wenzel U, Kuntz S, De Sousa UJ, Daniel H. Nitric oxide suppresses apoptosis in human
colon cancer cells by scavenging mitochondrial superoxide anions. Int J Cancer
2003;106(5):666-75.
10. Halliwell B, and Gutteridge JMC. Free radicals in biology and medicine. Newyork: Oxford
University Press İnc 2007:55-79.
11. Turrens JF. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol 2003;15;552(Pt
2):335-44.
12. Young IS, Woodside JV. Antioxidants in health and diseae. J Clin Pathol
2001;54(3):176-86.
56
13. Tamer L, Polat G, Eskandari G., Ercan B, Atik U. Serbest radikaller. Mersin Üniv Tıp Fak
Derg 2000;1(1):52-8.
14. Kılınç K, Kılınç A. Oksijen toksisitesinin aracı molekülleri olarak oksijen radikalleri.
Hacettepe Tıp Dergisi 2002;33(2):110-8.
15. Lee J, Koo N, Min DB. Reactive oxygen species, aging, and antioxidative nutraceuticals.
Comp Rev Food Sci Food Safety 2004;3:21-33.
16. Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of
arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 1980;288(5789):373-6.
17. Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE, Chaudhuri G. Endothelium-derived relaxing
produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc Natl Acad Sci
1987;84(24):9265-9.
18. Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological
activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 1987;327(6122):524-6.
19. Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals, metals and
antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem Biol Interact 2006;160(1):1-40.
20. Valko M, Izakovic M, Mazur M, Rhodes CJ, Telser J. Role of oxygen radicals in DNA
damage and cancer incidence. Mol Cell Biochem 2004;266(1-2):37-56.
21. Proton Channels are Instrumental in the Respiratory Burst of Phagocytosis.
http://tomonthetrib.wordpress.com. Erişim tarihi:26.12.2009.
22. Klebanoff SJ. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol 2005;77(5):598-625.
23. Van Dalen CJ, Winterbourn CC, Senthilmohan R, Kettle AJ. Nitrite as a substrate and
inhibitor of myeloperoxidase. Implications for nitration and hypochlorous acid production
at sites of inflammation. J Biol Chem 2000;275(16):11638-44.
24. Yıldırım Sözmen E. Yaşlanma biyokimyası. Onat T, Emerk K, Yıldırım Sözmen E.
(Editörler). İnsan biyokimyası’nda. Ankara: Palme Yayıncılık; 2002.s.665-74.
25. Baykal Y, Kocabalkan F. Serbest radikaller ve hücre hasarı. Sendrom 2000;9:31-9.
26. Davies KJ. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimie 2001;83(34):301-10.
27. Kayalı R, Çakatay U. Protein oksidasyonunun ana mekanizmaları. Cerrahpaşa J Med
2004;35:83-9.
28. Liu C, Crawford JM. The gastrointestinal tract. In: Kumar V, Abbas AK, Fausto N. (Eds.)
Robbins and Cotran: Pathologic basis of disease. 7th ed. Philadelphia: WB Saunders
Company; 2005. p.798-877.
29. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts & Figures 2008-2010.
www.cancer.org/.../STT_1x_Colorectal_Cancer_Facts__Figures_2008-2010.asp.
Erişim
tarihi:27.11.2009.
30. Rosai J. Gastrointestinal tract, large bowel. In: Rosai J. (Ed.) Rosai and Ackerman’s
surgical pathology. 9th ed. China: Mosby Company; 2004 p.776-823.
31. Boyle P, Langman MJS. Epidemiology. In: Kerr DJ, Young AM, Hobbs FDR. (Eds.) ABC
of colorectal cancer. London: BMJ Books; 2001. p.1-5.
32. Küpelioğlu A. Kolorektal kanserde histopatoloji. T Klin J Surgery 2004;1(9):25-7.
57
33. Ensari A. İnce ve kalın barsak Hastalıkları. Mocan Kuzey G, Özdamar ŞO, Zergeroğlu S.
(Editörler). Temel patoloji’de. Ankara: Güneş Kitabevi; 2007. s.427-44.
34. Cooper HS. Intestinal neoplasm. In: Mills SE, Carter D, Greenson JK, Oberman HA,
Reuter V, Stoler MH (Eds.) Sternberg’s Diagnostic Surgical Pathology. 4th ed. Philadelphia:
Lippincott Williams & Wilkins; 2004. p.1543-95.
35. Klaunig JE, Kamendulis LM. The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annu Rev
Pharmacol Toxicol 2004;44:239-67.
36. Marnett LJ. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis 2000;21(3):361-70.
37. Sawa T, Ohshima H. Nitrative DNA damage in inflammation and its possible role in
carcinogenesis. Nitric Oxide 2006;14(2):91-100.
38. Halliwell B. Oxidative stress and cancer: have we moved forward? Biochem J
2007;401(1):1-11.
39. Akram S, Teong HF, Fliegel L, Pervaiz S, Clément MV. Reactive oxygen species-mediated
regulation of the Na+-H+ exchanger 1 gene expression connects intracellular redox status
with cells sensitivity to death triggers. Cell Death Differ 2006;13(4):628-41.
40. Toker A, Yoeli-Lerner M. Akt signaling and cancer: surviving but not moving on. Cancer
Res 2006;66(8):3963-6.
41. Storz P. Reactive oxygen species in tumor progression. Front Biosci 2005;10:1881-96.
42. Trueba GP, Sánchez GM, Giuliani A. Oxygen free radical and antioxidant defense
mechanism in cancer. Front Biosci 2004;9:2029-44.
43. Bartsch H, Nair J. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and
perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair. Langenbecks
Arch Surg 2006;391(5):499-510.
44. Rainis T, Maor I, Lanir A, Shnizer S, Lavy A. Enhanced oxidative stress and leucocyte
activation in neoplastic tissues of the colon. Dig Dis Sci 2007;52(2):526-30.
45. Nayak SB, Yashwanth S, Pinto SM, Bhat VR, Mayya SS. Serum copper, ceruloplasmin,
protein thiols and thiobarbituric acid reactive substance status in liver cancer associated
with elevated levels of alpha-fetoprotein. Indian J Physiol Pharmacol 2005;49(3):341-4.
46. Leung EY, Crozier JE, Talwar D, O'Reilly DS, McKee RF, Horgan PG et al. Vitamin
antioxidants, lipid peroxidation, tumour stage, the systemic inflammatory response and
survival in patients with colorectal cancer. Int J Cancer 2008;123(10):2460-4.
47. Cortas NK, Wakid NW. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic
cadmium-reduction method. Clin Chem 1990;36(8 Pt 1):1440-3.
48. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for Lipid peroxides animal tissues by thiobarbituric
acid reaction. Anal Biochem 1979;95(2):351-8.
49. Bayraktar MR, Harputluoğlu M, Bayraktar NM. Kolon kanserli hastaların serum c-reaktif
protein ve malondialdehit düzeylerinin incelenmesi. T Klin J Med Sci 2007;27:13-5.
50. Erdman SE, Rao VP, Poutahidis T, Rogers AB, Taylor CL, Jackson EA et al. Nitric oxide
and TNF-alpha trigger colonic inflammation and carcinogenesis in Helicobacter hepaticusinfected, Rag2-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106(4):1027-32.
58
51. Yue G, Lai PS, Yin K, Sun FF, Nagele RG, Liu X et al. Colon epithelial cell death in 2,4,6trinitrobenzenesulfonic acid-induced colitis is associated with increased inducible nitricoxide synthase expression and peroxynitrite production. J Pharmacol Exp Ther
2001;297(3):915-25.
52. Szaleczky E, Prónai L, Nakazawa H, Tulassay Z. Evidence of in vivo peroxynitrite
formation in patients with colorectal carcinoma, higher plasma nitrate/nitrite levels, and
lower protection against oxygen free radicals. J Clin Gastroenterol 2000;30(1):47-51.
59
EKLER
EK-1
EK-2
BİLGİLENDİRİLMİŞ GÖNÜLLÜ OLUR FORMU
Bu katıldığınız çalışma bilimsel bir araştırma olup, araştırmanın adı ‘‘Kolorektal kanserli
olgularda oksidatif stresin araştırılması’’dır.
Bu araştırmanın amacı literatürde çok az incelenmiş olan ve birçok yönden açıklanmayı
bekleyen soruların yer aldığı oksidatif stresle kolorektal kanserler arasındaki ilişkiyi incelemektir. Bu
araştırmada sizden yaklaşık 12 ml venöz kan örneği alınacaktır. Bu araştırmada yer almanız öngörülen
süre 1(bir) gün olup, araştırmada yer alacak gönüllülerin sayısı ortalama 60 (altmış)’dır.
Bu araştırmada sizin için kan alma işleminden kaynaklanan kolda morarma söz konusu
olabilir; sizin için beklenen yararlar ise hastalığınızla ilgili altta yatan patolojierin ortaya
çıkarılmasıdır. Araştırma sırasında sizi ilgilendirebilecek herhangi bir gelişme olduğunda, bu durum
size veya yasal temsilcinize derhal bildirilecektir. Araştırma hakkında ek bilgiler almak için ya da
çalışma ile ilgili herhangi bir sorun, istenmeyen etki ya da diğer rahatsızlıklarınız için 05052347041
no’lu telefondan Dr.Sabriye Kaya’ya başvurabilirsiniz.
Bu araştırmada yer almanız nedeniyle size hiçbir ödeme yapılmayacaktır Ayrıca, bu araştırma
kapsamındaki bütün muayene, tetkik, testler ve tıbbi bakım hizmetleri için sizden veya bağlı
bulunduğunuz sosyal güvenlik kuruluşundan hiçbir ücret istenmeyecektir. Bu araştırma TÜBAP
tarafından desteklenmektedir.
Bu araştırmada yer almak tamamen sizin isteğinize bağlıdır. Araştırmada yer almayı
reddedebilirsiniz ya da herhangi bir aşamada araştırmadan ayrılabilirsiniz; bu durum herhangi bir
cezaya ya da sizin yararlarınıza engel duruma yol açmayacaktır. Araştırıcı bilginiz dahilinde veya
isteğiniz dışında, uygulanan tedavi şemasının gereklerini yerine getirmemeniz, çalışma programını
aksatmanız veya tedavinin etkinliğini artırmak vb. nedenlerle sizi araştırmadan çıkarabilir.
Araştırmanın sonuçları bilimsel amaçla kullanılacaktır; çalışmadan çekilmeniz ya da araştırıcı
tarafından çıkarılmanız durumunda, sizle ilgili tıbbi veriler de gerekirse bilimsel amaçla
kullanılabilecektir.
Size ait tüm tıbbi ve kimlik bilgileriniz gizli tutulacaktır ve araştırma yayınlansa bile kimlik
bilgileriniz verilmeyecektir, ancak araştırmanın izleyicileri, yoklama yapanlar, etik kurullar ve resmi
makamlar gerektiğinde tıbbi bilgilerinize ulaşabilir. Siz de istediğinizde kendinize ait tıbbi bilgilere
ulaşabilirsiniz.
Çalışmaya Katılma Onayı:
Yukarıda yer alan ve araştırmaya başlanmadan önce gönüllüye verilmesi gereken bilgileri
okudum ve sözlü olarak dinledim. Aklıma gelen tüm soruları araştırıcıya sordum, yazılı ve sözlü
olarak bana yapılan tüm açıklamaları ayrıntılarıyla anlamış bulunmaktayım. Çalışmaya katılmayı
isteyip istemediğime karar vermem için bana yeterli zaman tanındı. Bu koşullar altında, bana ait tıbbi
bilgilerin gözden geçirilmesi, transfer edilmesi ve işlenmesi konusunda araştırma yürütücüsüne yetki
veriyor ve söz konusu araştırmaya ilişkin bana yapılan katılım davetini hiçbir zorlama ve baskı
olmaksızın büyük bir gönüllülük içerisinde kabul ediyorum.
Bu formun imzalı bir kopyası bana verilecektir.
Gönüllünün,
Adı-Soyadı:
Adresi:
Tel.-Faks:
Tarih ve İmza:
Velayet veya vesayet altında bulunanlar için veli veya vasinin,
Adı-Soyadı:
Adresi:
Tel.-Faks:
Tarih ve İmza:
Açıklamaları yapan araştırmacının,
Adı-Soyadı:
Görevi:
Adresi:
Tel.-Faks:
Tarih ve İmza:
Olur alma işlemine başından sonuna kadar tanıklık eden kuruluş görevlisinin/görüşme
tanığının,
Adı-Soyadı:
Görevi:
Adresi:
Tel.-Faks:
Tarih ve İmza: