mycoplasma real tıme pcr kđtđ

MYCOPLASMA REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNPRT-MYC
GĐRĐŞ
SAKLAMA KOŞULLARI
SNP Mycoplasma Real Time PCR Kiti, hücre kültürü gibi biyolojik materyallerde
•
Buffer A Hariç tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
mycoplasma türlerini tespit eder.
•
Buffer A 2-8 °C’ de saklanmalıdır.
KĐT PRENSĐBĐ
DNA ĐZOLASYONU
Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır.
1.
Ependorf tüp içine 500 µl hücre kültür sıvısı alıp 10000 rpm. +4 0C’de 2dk
2.
Ependorf
santrifüj yapınız
Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya
bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı
esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob
tüp’ün
dibindeki
beyaz
pellet’e
dokunmadan
üst
sıvıyı
(Süpernatant) pipet yardımı ile çekip atınız.
zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR
3.
Ependorf tüp içine Buffer A’ dan 400 µl alıp 10000 rpm. +4 0C’de 2dk
santrifüj yapınız.
parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu
işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir.
4.
Đkinci adımı tekrarlayınız.
Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma
5.
Ependorf tüp’ün içine Buffer A’ dan 200 µl ilave edip, vorteksleyiniz ve 95
0
C’de 5dk tutunuz,
doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit
6.
edilmektedir.
Isı bloğundan aldığınız bu ependorf tüp’ü 10000 rpm. +4 0C’de 2dk santrifüj
yapınız ve berrak/şeffaf olan üst sıvıdan (Süpernatant) 5 µl Real Time PCR
testi için kullanınız.
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
Kit, PCR için gerekli tüm bileşenleri içerisinde bulundurur. Tüm mycoplasma
türlerine spesifik primer ve problar yardımı ile örnekteki mycoplasma türlerinin
TEST PROSEDÜRÜ
varlığı tespit edilir. Buffer A yardımı ile tek solüsyonla DNA izolasyonu çok kısa
•
sürede
yapılabilmektedir.
Kit
ayrıca
internal
kontrol
içeriği
ile
Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20 µl master miks ve 0,3
µl Hot Start Taq DNA Polimeraz konulur. Sonra 5 µl (~10-100 ng)
PCR
örnek DNA ‘sı ilave edilir.
reaksiyonunuzun çalışmasını da kontrol etmektedir.
TESPĐT EDĐLEBĐLEN MYCOPLASMA TÜRLERĐ
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır.
•
Aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
•
Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq DNA Polimeraz
miktarları, çalışılacak örnek sayısı ile çarpılmalı, oluşan karışımdan 20 µl
M. fermentans
M. gallisepticum
M. ovipneumoniae
M. hyorhinis
M. pulmonis
M. pirum
M. arginini
M. arthritidis
tüplere bölünmeli ve ayrı ayrı örnek DNA’ları konulmalıdır.
PCR PROGRAMI
M. capricolu
M. orale
M. bovis
Ayrıca Acholeplasma
M. salivarium
M. pneumoniae
Ayrıca Spiroplasma
M. hominis
M. haemofelis
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
30 Döngü
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
•
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
M. genitalium
M. hyopneumoniae
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
Mx3000P/Mx3005P
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
KĐT ĐÇERĐĞĐ
•
•
•
•
Bileşen
Mycoplasma Master Miks
Buffer A
Hot Start Taq DNA Polymerase
Pozitif Kontrol DNA
20 Test
430 µl
6 ml x 2
10 µl
20 µl
Roche LightCycler® 480 System
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile, türe ait pikleri ise FAM
boyası ile analiz edilmelidir.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
•
DNA eksikliği,
Đnternal kontrol, tüm kuyularda pik vermeli ve CT değeri 24 ≤ X ≤ 28
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
aralığında olmalıdır. Pik alamadığınız durumlar için “olası problemler” bölümüne
•
Test’te inhibitör varlığı ,
bakabilirsiniz.
söz konusudur.
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Böyle durumlarda çalışma tekrar edilmeli eğer aynı problem devam ediyorsa
yeniden DNA izolasyonu yapılmalıdır.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
[email protected].
UYARILAR
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
Mycoplasma türlerine ait pikler için de FAM boyasında analiz yapmanız
gerekmektedir. Bu boyada görmeniz gereken CT değer aralığı ise 12 ≤ X ≤ 28
dir. Eğer pik yoksa mycoplasma varlığı için “negatif” yorumunu yapabilirsiniz.
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012