mycoplasma real tıme pcr kđtđ

MYCOPLASMA REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNPRT-MYC
GĐRĐŞ
SNP Mycoplasma Real Time PCR Kiti, hücre kültürü ve benzerii biyolojik
materyallerdeki mycoplasma varlığını tespit eder.
SAKLAMA KOŞULLARI
•
Buffer A hariç tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
•
Buffer A +4 °C de saklanmalıdıdır.
KĐT PRENSĐBĐ
Mycoplasma’ spp. için oluşturulmuş spesifik florojenik probun 5’ ucunda bir
reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya bulunmaktadır. Normal şartlarda
DNA ĐZOLASYONU
1.
santrifüj yapınız
quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı zamanda da probun
primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. Rael Time PCR aşamasında
2.
3.
reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma doğrusal olarak artmakta ve bu
tüp’ün
dibindeki
beyaz
pellet’e
dokunmadan
üst
sıvıyı
Ependorf tüp içine Buffer A’ dan 400 µl alıp 10000 rpm. +4 0C’de 2 dk
santrifüj yapınız.
ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu işlem sadece hedef bölge üzerinde
hibridize olmuş spesifik problarda gerçekleşir. Amplifikasyon miktarı arttıkça,
Ependorf
(Süpernatant) pipet yardımı ile çekip atınız.
uzayan sense iplik üzerinde Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesi ile
reporter ve quencer arasında bulunan prob parçalanarak ayrılır ve baskılanmanın
Ependorf tüp içine 500 µl hücre kültür sıvısı alıp 10000 rpm. +4 0C’de 2 dk
4.
Đkinci adımı tekrarlayınız.
5.
Ependorf tüp’ün içine Buffer A’ dan 250 µl ilave edip, vorteksleyiniz ve 95
0
C’de 5 dk tutunuz,
artış Real Time PCR cihazı tarafından eş-zamanlı olarak tespit edilmektedir.
6.
Isı bloğundan aldığınız bu ependorf tüp’ü 10000 rpm. +4 0C’de 2 dk santrifüj
yapınız ve berrak/şeffaf olan üst sıvıdan (Süpernatant) 5 µl Real Time PCR
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
testi için kullanınız.
Kit, Real Time PCR için gerekli bileşenleri içerisinde bulundurur. Tüm mycoplasma
türlerine özgü prob ve primerler yardımı ile örnekteki mycoplasma türlerinin
herhangi birisinin varlığı tespit edilir. Buffer A yardımı ile tek solüsyonla DNA
izolasyonu çok kısa sürede yapılmaktadır. Kit ayrıca internal kontrol içeriği ile
TEST PROSEDÜRÜ
•
Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20 µl master miks ve 0,3
µl Hot Start Taq DNA Polimeraz konulur. Sonra 5 µl (1-100 ng) örnek
Real Time PCR reaksiyonunuzun çalışmasını ve inhibitör içeriğini de kontrol
DNA ‘sı ilave edilir.
etmektedir.
TESPĐT EDĐLEN MYCOPLASMA TÜRLERĐ
M. fermentans
M. gallisepticum
M. ovipneumoniae
M. hyorhinis
M. pulmonis
M. pirum
M. arginini
M. arthritidis
M. capricolu
M. orale
M. bovis
Ayrıca Acholeplasma
M. salivarium
M. pneumoniae
Ayrıca Spiroplasma
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır.
•
Aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
•
Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq DNA Polimeraz
miktarları, çalışılacak örnek sayısı ile çarpılmalı, oluşan karışımdan 20 µl
tüplere bölünmeli ve ayrı ayrı örnek DNA’ları konulmalıdır.
PCR PROGRAMI
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
35 Döngü
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
M. hominis
•
M. haemofelis
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
M. genitalium
M. hyopneumoniae
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
Mx3000P/Mx3005P
KĐT ĐÇERĐĞĐ
•
•
•
•
Bileşen
Mycoplasma Master Miks
Buffer A
Hot Start Taq DNA Polymerase
Pozitif Kontrol DNA
20 Test
430 µl
4,5 ml x 3
7 µl
25 µl
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
Roche LightCycler® 480 System
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile, türe ait pikleri ise FAM
boyası ile analiz edilmelidir.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
•
DNA eksikliği,
Đnternal kontrol, tüm kuyularda pik vermeli ve CT değeri 23 ≤ X ≤ 29
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
aralığında olmalıdır. Pik alamadığınız durumlar için “olası problemler” bölümüne
•
Test’te inhibitör varlığı ,
bakabilirsiniz.
söz konusudur.
Ekstrakte DNA örneklerinde internal kontrol pikleri geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
•
Kit içeriği 5 seferden fazla çözdürülmüş olabilir,
Böyle durumlarda çalışma tekrar edilmelidir. Eğer aynı problem devam ediyorsa
yeniden DNA izolasyonu ve yeni bir kit ile test tekrar yapılmalıdır.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
Pozitif kontrol DNA örneklerinde internal kontrol pikleri geç başlıyorsa
•
Yeni bir kit ile test tekrar yapılmalıdır
[email protected].
UYARILAR
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
Mycoplasma türlerine ait pikler için de FAM boyasında analiz yapmanız
•
Oda sıcaklığında unutulmuş Real Time PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
gerekmektedir. Eğer pik yoksa mycoplasma varlığı için “negatif” yorumunu
•
Real Time PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı
yapabilirsiniz.
edilerek hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen Real Time PCR işlemine geçilmelidir.
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz kullanılmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen Real Time PCR programı uygulanmalıdır.
•
Real Time PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir.
Sadece belirtilen türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
Real Time PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim
tarihine dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 01.12.2015