farelerde leptinin lenfosit alt tipleri üzerine in vivo etkileri
advertisement
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARELERDE LEPTİNİN LENFOSİT ALT TİPLERİ ÜZERİNE İN VİVO ETKİLERİ Aykut Göktürk ÜNER FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Nesrin SULU 2009- ANKARA TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARELERDE LEPTİNİN LENFOSİT ALT TİPLERİ ÜZERİNE İN VİVO ETKİLERİ Aykut Göktürk ÜNER FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Nesrin SULU 2009- ANKARA TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARELERDE LEPTİNİN LENFOSİT ALT TİPLERİ ÜZERİNE İN VİVO ETKİLERİ Aykut Göktürk ÜNER FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Nesrin SULU Bu tez, Devlet Planlama Teşkilatı kapsamındaki Bilim İnsanı Yetiştirme Projesi tarafından 2005K-120140-8 proje numarası ile desteklenmiştir. 2009- ANKARA ii iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz v Simgeler ve Kısaltmalar vi Şekiller viii Çizelgeler ix 1. GİRİŞ 1 1.1. Leptin Hormonu 2 1.1.1. Leptinin Keşfi ve Yapısı 2 1.1.2. Leptinin Üretimi, Reseptörleri ve Etkisi 3 1.1.3. Leptin Sekresyonunun Düzenlenmesi 4 1.1.4. Leptinin Enerji Dengesinin Düzenlenmesi Üzerine Etkisi 5 1.1.5. Leptinin Bağışıklık Sistemi Üzerine Etkisi 5 1.1.6. Leptin Rezistansı 8 1.2. Lenfositler ve Alt Tipleri 10 1.2.1. T Lenfositler 11 1.2.2. B Lenfositler 12 1.2.3. Doğal Öldürücü Hücreler (NK hücreleri) 12 1.2.4. Lenfositlerin Fonksiyonları 13 1.2.4.1. Antijenin Tanınması ve Lenfositlere Antijen Sunumu 13 1.2.4.2. Lenfositlerin Uyarılması 14 1.2.4.3. Antikor Oluşumu ve Antijenin Yıkımlanması 15 1.3. Tezin Amacı ve Önemi 16 2. GEREÇ VE YÖNTEM 17 2.1. Hayvan Materyali 17 2.2. Deney Kurgusu 18 2.3. Kan Alınması 18 2.4. Analiz Yöntemleri 19 2.4.1. Lenfosit Alt Tiplemesi 19 iv 2.4.2. Leptin Analizi 22 2.4.3. İstatistiksel Analiz 24 3. BULGULAR 25 3.1. Vücut Ağırlığı ve Yem-Su Tüketimi 25 3.2. Kan Leptin Düzeyleri 31 3.3. Lenfosit Alt Tipleri 32 4. TARTIŞMA 36 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 44 ÖZET 46 SUMMARY 47 KAYNAKLAR 48 EKLER 54 EK-1 Sağlık Bakanlığı Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi Başkanlığı Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun 03.06.2009 tarih ve 11017 yazısı ÖZGEÇMİŞ 54 55 v ÖNSÖZ Leptinin keşfiyle organizmada leptinin birçok fizyolojik ve fizyopatolojik süreçlere katılarak önemli etkiler gösterdiği bilim dünyasında iyi bilinmektedir. Çalışmalarda leptinin obez bireylerin pek azını etkilediğinin belirlenmesi bilim insanlarında önce bir hayal kırıklığı yaratmıştır. Leptin eksikliğine bağlı obezitenin obez popülasyonun %1’inden daha azını temsil ettiği belirlenince, çalışmalar olası bir leptin rezistansına odaklanmıştır. Ancak, bu çalışmalar leptinin metabolik fonksiyonları dışında önemli pek çok fonksiyonlarının olduğunu da ortaya koymuştur. Leptinin saptanabilen fonksiyonları bu hormonun klinikte obezite dışında bağışıklık sistemi, üreme, pıhtılaşma, kan basıncı, fötal gelişim, hematopoiezis, anjiogenezis ve yara iyileşmesi üzerine olası kullanımını da düşündürmektedir. Şu an için tedavide leptinin başta besin alımını azaltıcı etkisi olmak üzere sınırlı da olsa bağışıklık sistemi üzerine de etkilerinden yararlanılmaktadır. Leptinin bağışıklık sisteminde fizyolojik işlevini yerine getirirken şekillenen karmaşık süreçlerde adeta bir orkestra şefi gibi görevi olan CD4+ hücreler üzerine etkisinin bulunmasıyla inflamasyon ve immun yanıtın oluşmasında da görevli olduğu açıkça ifade edilmiştir. Leptin bağışıklık sistemini ve bu sistemdeki hücreleri etkilerken değişik sistemlerdeki doku ve hücrelerin de direkt ya da dolaylı olarak etkilendiği düşünülmektedir. Bu çalışma söz konusu karmaşık süreçlerin bir bölümünün anlaşılmasında ışık tutmayı amaçlamaktadır. Bilim İnsanı Yetiştirme Projesi kapsamında desteklenen bu tez çalışması için şekillenen tüm zorluklar karşısında desteğini bana her saniye hissettiren danışman hocam sayın Prof. Dr. Nesrin SULU’ya sonsuz minnettarlık duymaktayım. Ayrıca uygulama ve yazım aşamasında yardımları için sayın Prof. Dr. Çiğdem ALTINSAAT’e teşekkürleri borç bilmekteyim. Yaptığı bilimsel ve psikolojik açıdan güzel açıklamalar ile rahatlatıcı yaklaşımlarda bulunan sayın Prof. Dr. Belma ALABAY’a, leptin seviyelerinin belirlenmesi aşamasında yardımlarından dolayı sayın Prof. Dr. Tevhide SEL’e, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Fizyoloji ve Biyokimya Anabilim Dalı Araştırma Görevlisi arkadaşlarıma, her türlü desteğini esirgemeyen Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi sayın Prof. Dr. Ahmet ERGÜN’e, akım sitometri tekniği aşamasında yardımlarından dolayı sayın Doç. Dr. Klara DALVA’ya ve Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı Akım Sitometri Laboratuarı’nda çalışanlara, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyoistatistik Anabilim Dalı’ndan sayın Doç. Dr. Sefa GÜRCAN’a ve gelmiş olduğum Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Doç. Dr. Muharrem BALKAYA ve diğer Öğretim Üyelerine sonsuz teşekkürlerimi sunarım. vi SİMGELER VE KISALTMALAR α Alfa AgRP Aguti ilişkili peptit ANOVA Varyans analizi ARC Arkuat nükleus β Beta CART Kokain amfetamin ilişkili transkript CD Başkalaşma kümesi db/db fare Leptin reseptör üretiminde bozukluk olan fare db gen Diyabet geni ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ER Endoplazmik retikulum FITC Fluorescein isothiocyanate FTS Fizyolojik tuzlu su γ Gama HIV-1 Human immunodeficiency virus-1 IF-γ İnterferon gama Ig İmmunglobulin IL İnterlökin JAK Janus kinase kg Kilogram KFTS Fizyolojik tuzlu su uygulanan çalışma grubu L100 100 µg/kg leptin uygulanan çalışma grubu L250 250 µg/kg leptin uygulanan çalışma grubu L500 500 µg/kg leptin uygulanan çalışma grubu L1000 1000 µg/kg leptin uygulanan çalışma grubu LHA Lateral hipotalamus, hipotalamusun lateral nükleusu MAPK Mitogen-activated protein kinase mg Miligram MHC Temel doku uyum kompleksi, major histocompatibility complex vii µl Mikrolitre ml Mililitre mRNA Mesajcı ribonükleik asit NK hücreler Doğal öldürücü hücreler NPY Nöropeptit Y ob/ob fare Leptin hormonunu üretmeyen fare Ob-R Leptin reseptörü PBS Phosphate buffered solution PE Phycoerythrin pg Pikogram PI3K Phosphatidylinositol 3-OH kinase POMC Proopiomelanokortin PVN Paraventriküler nükleus SPSS Statistical Package for the Social Sciences SOCS3 Suppressor of cytokine signaling 3 STAT Signal transducer and activator of transcription TCR T hücre reseptörü TH1 T yardımcı–1 TH2 T yardımcı–2 TNF-α Tümör nekrozis faktör-alfa VMH Ventromedial hipotalamus viii ŞEKİLLER Şekil 2.1: CD4 ve CD8 pozitif hücreleri belirten plot örneği 21 Şekil 2.2: CD19 ve CD3 pozitif hücreleri belirten plot örneği 21 Şekil 2.3: CD2 pozitif hücreleri belirten plot örneği 22 Şekil 2.4: Optik dansiteler ölçülmeden hemen önce ELISA pleytinin görünüşü 23 Şekil 3.1: Deneysel süreçteki farelerin vücut ağırlık değişimleri 26 Şekil 3.2: Deneysel süreçteki farelerin zamana bağlı yem tüketimleri 27 Şekil 3.3: Deneysel süreçteki farelerin zamana bağlı su tüketimleri 27 Şekil 3.4: Deneysel süreçteki farelerin yem tüketimleri 28 Şekil 3.5: Deneysel süreçteki farelerin su tüketimleri 29 Şekil 3.6: Leptinin vücut ağırlığı üzerine etkisi 30 Şekil 3.7: Leptinin yem tüketimine etkisi 30 Şekil 3.8: Leptinin su tüketimine etkisi 31 Şekil 3.9: Farelerin kan leptin düzeyleri 32 Şekil 3.10: Farelerin CD4 (yardımcı T lenfosit) değerleri 33 Şekil 3.11: Farelerin CD2 değerleri 33 Şekil 3.12: Farelerin CD3 (toplam T lenfosit) değerleri 34 Şekil 3.13: Farelerin CD8 (sitotoksik T lenfosit) değerleri 34 Şekil 3.14: Farelerin CD19 (toplam B lenfosit) değerleri 35 Şekil 3.15: Farelerin % NK değerleri 35 ix ÇİZELGELER Çizelge 2.1: Çalışmadaki farelere verilen rasyonun içeriği 17 Çizelge 2.2: Gruplar 18 Çizelge 3.1: Deneysel süreçteki farelerin vücut ağırlık değişimleri 26 Çizelge 3.2: Deneysel süreçteki farelerin zamana bağlı yem-su tüketim değerleri 27 Çizelge 3.3: Deneysel süreçteki farelerin yem tüketim değerleri 28 Çizelge 3.4: Deneysel süreçteki farelerin su tüketim değerleri 29 Çizelge 3.5: Farelerin kan leptin düzeyleri 31 Çizelge 3.6: Farelerin CD ekspresyon yüzdeleri ve % NK hücreleri 32 1 1. GİRİŞ Zhang ve çalışma arkadaşlarının (1994) leptini klonlanmasından sonra besin alımının fizyolojik ve fizyopatolojik mekanizmalarının anlaşılmasına yönelik araştırmalar yaygınlaşmıştır (Wynne ve ark., 2005). Bu araştırmaların sonucunda organizmadaki enerji dengesi ve vücut ağırlığının hipotalamik olarak düzenlenmesi ile ilgili yeni görüşler ortaya çıkmış ve besin alımı, iştah, kilo kazancı ve kaybı gibi fizyolojik mekanizmalar tekrar gözden geçirilmiştir (Houseknecht ve ark., 1998). Besin alımı ve vücut ağırlığının düzenlenmesi organizmada pek çok faktörün işe karıştığı karmaşık olaylardandır ve bu konudaki fizyolojik mekanizmalar ancak son yıllarda aydınlatılmaya başlanmıştır. Herhangi bir tür içindeki ergin bireylerin günlük besin alımı ve enerji harcaması önemli farklılıklar göstermesine rağmen, vücut ağırlıkları büyük ölçüde sabit tutulur. Bu denge başlıca nöroendokrin mekanizmalar ile kontrol edilmektedir. Hipotalamus ve beyin sapı gibi besin alımını kontrol eden beyin merkezleri, hormonal sinyaller ve periferal sinirler birbiriyle ilişki içindedir. Bu sinyaller besin alımı ve enerji harcamasında en önemli merkez olan hipotalamusu ve buradan ekspresse edilen nöropeptitleri etkiler (Houseknecht ve ark., 1998). Yağ dokusundan salınan leptin, adiponektin gibi sitokinler ile pankreastan salınan insülin vücut ağırlığı ve enerji dengesi yönünde organizmanın uzun dönemli beslenme durumunu düzenlerken, ghrelin ve kolesistokinin gibi dolaşımdaki mide-bağırsak hormonları akut olarak açlık ve tokluk hissiyle sonuçlanan olayları kontrol etmektedirler (Wynne ve ark., 2005). Kısa ve uzun süreçli bu mekanizmalarla vücut ağırlığının sabit bir şekilde korunması için besin alımı ve enerji harcaması arasında sürekli olarak bir denge kurulmaya çalışılır (Houseknecht ve ark., 1998; Tunçbilek, 2005). Yağ dokusunda sentezlenen leptinin kan dolaşımındaki düzeyi vücuttaki yağ miktarı ile doğru orantılıdır. Besin kısıtlamasına cevap olarak kan leptin düzeyleri düşer (Boden ve ark., 1996). Bununla birlikte akut yangı durumunda sitokinler [tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-a), interlökin (IL)-1, interferon gama (IF-g)] gibi bağışıklık sistemiyle ilgili ajanlar ile serum leptin düzeyleri artmaktadır (Sarraf ve ark., 1997). Leptin salınımının azalması ya da leptin reseptörlerindeki (Ob-R) 2 herhangi bir hasarın T lenfosit fonksiyonlarında azalmaya neden olduğu bildirilmektedir (Zhang ve ark., 1994; Ghilardi ve ark., 1996). Leptin uygulamaları bazı sitokin düzeylerini değiştirerek bağışıklık sistemi üzerine olumlu etkilere neden olmaktadır. Örneğin, akut olarak aç bırakılan farelerde oluşan bağışıklık sistemi baskılanması leptin uygulamaları ile düzeltilebilmiştir (Lord ve ark., 1998). Leptin üretmeyen veya leptin reseptörlerinde bozukluk olan ob/ob ve db/db farelerde IF-g, IL-2 ve IL-4 değerlerinin çok düşük olması leptinin immun cevapta önemli rolleri olduğunu açıklamaktadır (Lord ve ark., 1998). Bu farelere leptin uygulandığında sitokin üretimlerinde hızlı bir yükselme olması bunun en güzel kanıtıdır (Lord ve ark., 1998). Vücudun beslenme durumu ile bağışıklık sistemi arasındaki ilişkinin varlığı uzun süredir bilinse de, leptinin bulunmasından sonra bu mekanizmalar ile ilgili daha net bilgilere ulaşılmaktadır (Ferandes ve ark., 1978; Lord ve ark., 1998). 1.1. Leptin Hormonu 1.1.1. Leptinin Keşfi ve Yapısı Leptin Grekçe’de zayıf, ince anlamına gelir (Bado ve ark., 1998). Zhang ve çalışma arkadaşları tarafından ilk defa 1994’te keşfedilen leptin, ob genin 146 amino asitli 16 kilo Dalton’lu bir proteinidir. Leptinin prekürsörü, 167 amino asitlidir ve 21 amino asitin ayrılmasıyla aktive edilir (Zhang ve ark., 1994; Ogawa ve ark., 1995). Leptinin üretiminden sorumlu obez gen insanda 7., farede ise 6. kromozomda lokalize olmuştur (Castracane ve Henson, 2006). Leptin varlığı ile ilgili ilk çalışmalar 1950’li yıllara dayanmaktadır. Obezite için hayvan modelleri oluşturma çalışmalarında doğal mutasyonlu ob/ob fareler elde edilmiştir. Bu fareler ile normal kilolu fareler arasında 1970’li yıllardaki parabiosis (çapraz dolaşım, cross-circulation; obez fare ile normal farenin kan dolaşımının birbiri ile karıştırılması) çalışmalarında normal kilolu farelerin belirli bir süre sonra obez oldukları izlenmiş ve kanda obeziteye neden olan bir faktörün varlığından bahsedilmiştir. Bu hipotez 1994’te leptin proteini klonlanıncaya kadar açıklanamamıştır (Ingalls ve ark., 1950; Coleman, 1973; Houseknecht ve ark., 1998). 3 1.1.2. Leptinin Üretimi, Reseptörleri ve Etkisi Leptin, en çok yağ dokusunda üretilmektedir. Ayrıca hipotalamus, hipofiz bezi (Morash ve ark., 1999), midenin fundus epiteli (Bado ve ark., 1998), iskelet kası (Wang ve ark., 1998a), kemik iliği yağ hücreleri (Laharrague ve ark., 1998), plasenta, meme epiteli (Smith-Kirwin ve ark., 1998) ve kanatlı karaciğeri (Masuzaki ve ark., 1997; Taouis ve ark., 1998) gibi çeşitli doku ve organlardaki hücreler tarafından da salgılanmaktadır. Basit bir transmembran zincire sahip olan leptin reseptörleri diyabet genleri (db gen; leptin reseptörünü ekspresse eden gen) tarafından üretilir ve değişik formları IL1 ve TNF-α gibi sitokin reseptör ailesindendir (Nedvidkova, 1997). Bu reseptörler hipotalamus, ön hipofizin gonadotrop hücreleri, pankreasın endokrin bölümü, ovaryum, testis, yumurta hücresinin cumulus oophorusun granular tabakası, uterus, böbrekler, kalp, akciğerler, karaciğer, iskelet kasları, böbreküstü bezi, kemik iliği ve kan hücrelerinden nötrofil, monosit ve lenfositler gibi pek çok hücre veya organda üretilmektedir. Leptin reseptörlerinin uzun, kısa ve çözünmüş form olarak üç adet izoformu bulunur (Tartaglia, 1997). Uzun form, uzun intrasellüler zincire sahip olup leptinin iştah üzerine etkisi için gereklidir (Tartaglia, 1997). İntrasellüler zincirin sinyal iletimini sağlaması için hücre içinde JAK-STAT (janus kinase-signal transducer and activator of transcription) faktörlerine bağlanması gereken en önemli form uzun formdur. Bu reseptör ile hücre içinde glikoz kullanımı, lipolizis ve leptinin başka fonksiyonları ile ilgili genler aktive olur (Tartaglia, 1997). Leptin reseptörünün en az dört adet de kısa formu vardır (Caprio ve ark., 1999; Ergün, 1999; Moschos ve ark., 2002; Bruno ve ark., 2005). Transgenik db/db farelerdeki obezite, intrasellüler sinyalleri engelleyen leptin reseptörlerindeki mutasyon sonucunda şekillenir (Tartaglia, 1997). İnsanlarda da leptin reseptör mutasyonu durumunda obezite geliştiği bildirilmektedir (Siegrist-Kaiser ve ark., 1997; Tartaglia, 1997). Reseptörün kısa formunun leptinin kan-beyin bariyerinden geçerken işe karıştığı bildirilmektedir (Houseknecht ve ark., 1998). Çözünmüş form ise dolaşımdaki leptine bağlanıp onun biyolojik aktivitesini ayarlamaktadır (Ge ve ark., 2002). 4 Aktif haldeki leptin, hipotalamustaki kendi reseptörlerine bağlanarak nöropeptit Y (NPY) fonksiyonunu inhibe edip besin alımı, vücut ağırlığı ve enerji harcamasının düzenlenmesinde görev almaktadır (Houseknecht ve ark., 1998). Açlıkta leptinin kan-beyin bariyerinden geçişi azalırken, tekrar beslemede artar. Bu bilgi, leptinin merkezi sinir sistemine plazmadaki miktarı ile orantılı olarak girdiğini göstermektedir (Aslan ve ark., 2004; Wynne ve ark., 2005). Hipotalamusta bulunan arkuat nükleus (ARC), paraventriküler nükleus (PVN), lateral hipotalamus (LHA), ventromedial hipotalamus (VMH) ve medial preoptik alan gibi bölgeler leptin sinyalleri için direkt hedef olup bu nükleuslarda leptin reseptörleri bulunmaktadır (Hakansson ve ark., 1998). Arkuat nükleus, PVN ve VMH bölgelerinde leptinin fazla ekspresyonu besin alımı ve enerji harcamasını azaltırken (Bagnasco ve ark., 2002), medial preoptik bölgedeki fazla ekspresyonu sadece enerji harcamasını azaltmaktadır (Bagnasco ve ark., 2002). Ancak, leptinin etkisini gösterdiği en önemli hipotalamik merkez arkuat nükleustur (Hakansson ve ark., 1998). Arkuat nükleustaki NPY/AgRP (AgRP; aguti ilişkili peptit) ve POMC/CART (POMC; proopiomelanokortin, CART; kokain amfetamin ilişkili transkript) nöronları tarafından leptin reseptörleri ekspresse edilmektedir (Wynne ve ark., 2005). Oreksijenik NPY/AgRP nöronları leptin düzeyleri yüksek olduğunda inhibe edilirken, düşük leptin düzeylerinde ise aktive olmaktadırlar. Leptin, bunların yanında anoreksijenik POMC/CART nöronlarını da aktive etmektedir (Hakansson ve ark., 1998). Leptinin bu fonksiyonları birlikte değerlendirildiğinde, başlıca etkisinin besin alımını azaltmak olduğu görülmektedir (Hakansson ve ark., 1998; Aslan ve ark., 2004). 1.1.3. Leptin Sekresyonunun Düzenlenmesi Leptin gen aktivasyonu çeşitli hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler tarafından düzenlenir (Mantzoros ve Moschos, 1998). Östrojenler leptin üretimini artırırken (Shimomura ve ark., 1997) androjenler baskılamaktadır (Luukkaa ve ark., 1998). Bu da serum leptin değerlerindeki cinsiyetler arası ilgili seksüel farklılık için bir açıklama sağlamaktadır. İnsülin ve glikokortikoidler leptin üretimini artırır (Wabitsch ve ark., 1996). Ancak, glikokortikoidler leptin direncini de kuvvetlendirirler (Zakizewska ve ark., 1997). İnterlökin-1 ve TNF-α gibi yangı 5 sitokinleri, leptinin de rolü olduğu lokal immun cevapta, yangı ve anjiyogenezisin regülasyonunda (Lord ve ark., 1998) direkt leptin gen ekspresyonuna da sebep olurlar (Janik ve ark., 1997; Mantzoros ve ark., 1997). Tiroid hormonları, büyüme hormonu, somatostatin, serbest yağ asitleri, uzun süre soğuğa maruz kalma ve katekolaminler leptin salınımı üzerinde inhibitörik etki gösterirler (Aslan ve ark., 2004). 1.1.4. Leptinin Enerji Dengesinin Düzenlenmesi Üzerine Etkisi Fizyolojik koşullarda leptinin yapımı ve salınması organizmada bulunan yağ miktarı ile ilgilidir. Enerji dengesinin değiştiği durumlarda vücuttaki yağ miktarında da değişiklik olmaktadır. Plazma leptin seviyeleri enerji dengesindeki değişikliklere hemen tepki vermektedir. Ancak, obezlerin vücut ağırlıklarındaki hafif bir düşüş plazma leptin seviyelerinde şiddetli olmayan bir düşüşe neden olurken, vücut ağırlığındaki hafif bir artış plazma leptin seviyelerinde şiddetli artışa neden olmaktadır (Considine ve ark., 1996; Kolaczynski ve ark., 1996). Bu nedenle leptin vücutta sadece yağ miktarının belirleyicisi değil, aynı zamanda organizmadaki enerji durumu hakkında beyindeki spesifik merkezleri bilgilendiren bir sinyal olarak da görev yapmaktadır (Houseknecht ve ark., 1998). Leptin uygulamasından sonra vücut ağırlığındaki düşüş ve vücut yağ miktarındaki azalma oldukça belirgindir ve uygulamanın kesilmesinden birkaç hafta sonra bile ağırlık ve yağ miktarları önceki değerlerine ulaşmamaktadır (Azain ve ark., 1997). Bu nedenle leptin vücut ağırlığında ve yağ miktarında düşüş, metabolik hızda artış göstererek enerji dengesinde değişikliklere neden olmaktadır (Houseknecht ve ark., 1998). 1.1.5. Leptinin Bağışıklık Sistemi Üzerine Etkisi Bağışıklık ile metabolizma arasındaki karmaşık ilişki olabileceği hipotezi son birkaç senede tartışılmaktadır. Yağ dokusunun artık sadece enerji depolarının bir bölümü değil adipositokinler denilen bir takım molekülleri üreten immun-ilişkili bir organ olduğu kabul edilmektedir (Matarase, 2000). Pek çok organ, doku ve hücrede reseptörü bulunan leptinin kemik iliği kök hücrelerinde (hemositoblastlar), yardımcı 6 T (Lord ve ark., 1998) ve sitotoksik T (Martin-Romero ve ark., 2000) lenfositleri gibi lenfosit alt tiplerinde reseptörleri tespit edilmiştir. Ayrıca doğal öldürücü hücrelerde (NK hücreleri) de leptin reseptörlerinin varlığı tespit edilmiş ve leptinin bu hücrelerin sitotoksik aktivitelerini düzenlediği bildirilmiştir (Zhao ve ark., 2003). Bağışıklık sisteminin aktivasyonundan sorumlu diğer sitokin reseptörlerinde olduğu gibi, leptin de kendi reseptörleri vasıtası ile lenfoid hücrelerde JAK-STAT proteinlerini aktive eder ve gen transkripsiyonu ile lenfoid hücreler üzerine başta sitokin sentezletici etkisi olmak üzere pek çok etki (antiapopitotik ve proliferatif) gösterir (Lord ve ark., 1998; Martin-Romero ve ark., 2000; Papathanassoglou ve ark., 2006). Beslenme yetersizliği ve akut açlık durumunda şekillenen immunsupresyon ve timus atrofisi leptinin yokluğunda da şekillenmektedir. Bu nedenle beslenme durumu ile immun fonksiyonlar arasındaki ilişkinin düzenlenmesinde leptin, immunoendokrin bir fonksiyon göstererek ana roller üstlenmektedir (Castracane ve Henson, 2006). Leptin nötrofillerin kemotaksis ve oksijen radikal sekresyonunu artırarak doğal bağışıklık üzerine etkili olmaktadır. Ayrıca monosit/makrofajlar sisteminde fagositik aktiviteyi artırmaktadır (Castracane ve Henson, 2006). Kazanılmış bağışıklık sistemi üzerine leptin CD4+ hücrelerin çoğalmalarını doza bağımlı olarak artırmakta ve IL-2, IF-g gibi sitokinlerin üretimini artırarak güçlü bir immun cevap şekillenmesine neden olmaktadır (Lord ve ark., 1998). Ayrıca leptin bağışıklık sistemi hücrelerinin inflamasyon bölgesindeki aktivasyonlarından sorumlu adezyon moleküllerinin ekspresyonunu artırarak immun yanıtı güçlendirir (Lord ve ark., 2001). Hücresel immun yanıtta önemli olan T yardımcı-1 (T helper–1, TH1) hücre başkalaşması ve bu başkalaşımdan sorumlu sitokinlerin (IL-2, IF-g, TNF-a ve IL-18) sentezinin düzenlenmesinde de leptin hormonunun etkisi vardır (Castracane ve Henson, 2006). Yağ dokusundan TNF-α, IL–6 gibi proinflamatorik sitokinlerin sentezlendiğinin bulunmasından sonra yağ dokusu ile bağışıklık sistemi arasında bir ilişkinin varlığı ortaya çıkmıştır (Lord ve ark., 1998; Matarese ve ark., 2005). Tümör nekrozis faktör-α ve IL-6’nın dolaşımdaki düzeyleri direkt olarak yağlanma ve insülin rezistansıyla ilişkilidir. Doğumdan itibaren kemik iliğindeki kök hücreler farklılaşarak kan yapımı ile ilgili hematopoietik progenitör (öncül) hücreler oluşmaktadır. Bu progenitör hücreler birçok sitokin ve büyüme faktöründen etkilenip çoğalma özelliği gösterirler (Houseknecht ve ark., 1998). Fötal ve erişkin fare kemik 7 iliğinde leptin reseptörlerinin hem uzun hem de kısa formlarının belirlenmesi ve sitokin yapısında olması leptinin kan yapımı üzerine etkili olduğunu göstermektedir (Houseknecht ve ark., 1998). Leptin, peritoneal fare makrofajlarında sitokin üretimini ve makrofaj fagositoz aktivitesini artırmaktadır (Gainsford ve ark., 1996). Ayrıca eritropoiezisin stimülasyonunda leptin ve eritropoietin sinerjistik etki göstermektedir. Leptin reseptör eksikliği bulunan db/db farelerde kan B ve T lenfosit düzeylerinde değişmelerin gerçekleştiği, bu farelerin kemik iliğindeki lenfopoietik progenitör hücrelerde bir azalma olduğu saptanmıştır (Bennett ve ark., 1996). Leptin, bağışıklık sistemi hücreleri üzerine etkilerini JAK, STAT3, phosphatidylinositol 3-OH kinase (PI3K) ve mitogen-activated protein kinase (MAPK) mesajcı sistemleri ile yapmaktadır. Fakat JAK-STAT yolunun leptin etkisinin oluşması için en etkili yol olduğu düşünülmektedir (Martin-Romero ve ark., 2000; Sanchez-Margalet ve Martin-Romero, 2001; Lamas ve ark., 2004). Bağışıklık sistemi ve leptin arasında ilişkinin olduğu ilk olarak Hirose ve arkadaşları (1998) tarafından gösterilmiştir. Fötal karaciğer, kemik iliği ve dalak gibi organlarda leptin reseptörlerinin tespit edilmesi leptin ile hematopoietik sistem arasında bir ilişkinin varlığını ortaya koymaktadır (Fantuzzi ve Faggioni, 2000; Matarese, 2000). Düşük vücut ağırlıklı veya obez insanların leptin düzeyleri ile birlikte makrofaj sayısı ve aktivasyonu gibi hücresel immun yanıtlarda değişmeler görülmektedir (Cason ve ark., 1986; Bruno ve ark., 2005; Fantuzzi, 2005). Leptinin bulunmasından sonra yapılan çalışmalarda besin kısıtlaması uygulanan hayvanlara leptin verilmesinin ağırlıklarında azalma görülen dalak ve timus gibi organların ağırlıklarını tekrar normale döndürdüğü, timustaki timosit sayılarını da artırdığı tespit edilmiştir (JugeAubry ve Meier, 2002). Hem ob/ob hem de db/db farelerde T lenfositlere bağlı immunite bozulmaktadır (Ferandes ve ark., 1978; Chandra, 1980). Leptin IL-2 ve IFg gibi proinflamatorik sitokinlerin üretimini artırıp T lenfositlerin cevabını ve humoral immun yanıtta önemli olan IL-4, IL-6, IL-10 seviyelerini de etkilemektedir (Lord, 1998). İn vitro hücre kültürlerine leptin ilavesi ile T lenfosit sayılarının arttığının tespit edilmesi sonucu leptinin lenfositler için güçlü bir düzenleyici ajan olduğu gösterilmiştir (Fantuzzi, 2005). Leptin, T lenfositlerin apopitozisini önleyip, fonksiyonlarını düzenler. Vücut kitle indeksleri çok düşük olan kişilerde düşük leptin 8 değerlerine paralel olarak T lenfosit fonksiyonları da azalmaktadır. Leptin eksik kişilerde T lenfositlerin sitokin üretimlerinin de azaldığı tespit edilmiştir. Bu kişilere uygulanan leptin tedavisi ile söz konusu bozukluk düzeltilmektedir (Martin-Romero ve ark., 2000; Mito ve ark., 2000; Fujita ve ark., 2002; Mito ve ark., 2004). Deneysel olarak obez yapılan ratlarda doğal öldürücü hücrelerin (NK hücreleri) fonksiyonları azalmaktadır. Obez ratlar, tekrar önceki kilolarına döndürüldüğünde ise bozulan bu fonksiyonlar düzelmektedir (Sanchez-Margalet ve Martin-Romero, 2001). Leptin uygulaması NK hücrelerinin sayı (Haas ve ark., 2008) ve fonksiyonlarında (Zhao ve ark., 2003) bir artış şekillendirmektedir. Hipogamaglobunemi (antikor azlığı) ile karakterize bağışıklık sistemi yetersizliği şekillenen insanlardan yapılan in vitro kültürlere leptin ilavesi lenfosit miktarlarını artırıp bu hücrelerin apopitozisini azaltmıştır (Goldberg ve ark., 2005). Leptin, T lenfositler üzerine olan etkilerinden başka, monositlerin fagositozis ve sitokin üretimlerini etkilemektedir (SanchezMargalet ve Martin-Romero, 2001). Leptin, yangı bölgesinde nötrofillerin apopitozisini önleyerek daha uzun süre yaşamaları için bir faktör olarak da görev almaktadır (Bruno ve ark., 2005). 1.1.6. Leptin Rezistansı Leptin eksikliğinin obezite ile sonuçlandığı, günümüzde artık oldukça iyi bilinen ve kabul edilmiş bir gerçektir (Ozata ve ark., 1999). Obez ob/ob farelerde şekillenmiş nonsense mutasyon (anlamsız mutasyon) iştah artışı, obezite ve diyabet gelişmesi ile sonuçlanmaktadır. Ayrıca bu farelerde leptinin sentez ve sekresyonu bozuk ve yetersizdir. Benzer şekilde leptine direnç gösteren db/db fareler de obezdirler ve tıpkı ob/ob fareler gibi leptin yeterli fonksiyon gösterememektedir. Obez ob/ob farelere rekombinant leptin verilmesi ile besin alımı, vücut ağırlığı, insülin ve glikoz konsantrasyonlarında azalma görülürken db/db farelere leptin verilmesi ile herhangi bir etkinin görülmemesi obezitede asıl sorunun leptin eksikliğinden çok leptin rezistansı olduğunu göstermektedir (Aslan ve ark., 2004). Obezlerin büyük çoğunluğunda serum leptin düzeyleri yüksektir ve vücut ağırlığının düşürülmesi ile azalır. Ayrıca obezlerdeki kan leptin düzeyleri normal kilolulara göre daha yüksek olmakla birlikte, serebral sıvıdaki leptin düzeylerinin hafif yüksek olması leptin 9 rezistansı ve leptinin merkezi sinir sistemine geçişinde bir hasar olduğunu göstermektedir (Banks ve ark., 1996). Leptin hormonu keşfedildikten ve leptin gen mutasyonu da belirlendikten sonra obezitenin insanlarda ve laboratuar hayvanlarında basit bir fenomen olduğu hipotezi ortaya çıkmıştır. Fakat ob/ob fareler ve tüm dünyada birkaç leptin mutasyonlu insan dışında leptin gen mutasyonuna bağlı şiddetli obezite formları tüm obez popülasyonun çok azını oluşturmaktadır. Mutasyona bağlı obezite durumlarında plazma leptin seviyeleri çok düşükken genetik bir nedene bağlı olmayan obezitede ise leptin seviyeleri normal kilolulara göre yüksektir. Bu durum obezitede leptin rezistansının oluştuğunu ve plazmada leptin seviyelerinin bu nedenden dolayı arttığını açıklamaktadır. Leptin rezistansı şekillendiğinde leptin, hedef hücrelerde fizyolojik etkisini gösterememekte ve buna bağlı olarak başta metabolik sistem, bağışıklık sistemi ve üreme sistemi ile birlikte pek çok sistemde bozukluklar şekillenmektedir (Houseknecht ve ark., 1998). Leptin rezistansının leptin reseptöründe ya da leptin sinyalinin iletimi sırasında oluşan bir sorundan dolayı şekillendiği düşünülmektedir. Bu amaçla en fazla odaklanılan konu leptin reseptörleri olsa da sinyal iletiminde rol alan daha alt yollarda da hasar olabileceği söz konusudur (Houseknecht ve ark., 1998). Sitokin ailesine ait birçok protein, sirkülasyonda başka bir proteine bağlanır ve biyolojik olarak etkisini bu şekilde gösterir. Leptin rezistansı oluşmasındaki diğer bir faktörün de bu bağlayıcı proteindeki bir kusur olduğu düşünülmektedir (Houseknecht ve ark., 1998). Özellikle leptinin kan-beyin bariyerinden geçişi doyurulabilir (saturable) süreçler ile olduğu için leptin bağlayıcı proteinlerin bu geçişteki etkisi ve leptinin biyolojik etkisinin oluşmasında önemli rolleri olmaktadır (Banks ve Farrell, 2003). Olası bir diğer bozukluk ise hedef hücrede oluşan sinyal inhibisyonu ya da post-reseptör sorunlarıdır (Munzberg ve Myers, 2005; Enriori ve ark., 2006). Leptin rezistansının moleküler mekanizması tam açıklanamamıştır (Ozcan ve ark., 2009). Konuyla ilgili suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) geninden ve bu gendeki mutasyondan söz edilmektedir. Leptinin etkisini göstermesinde hücre içinde önemli bir molekül olan JAK’ın inhibe edilmesi için SOCS3 geni önemli görevler üstlenmektedir. Obez hayvan modellerinde SOCS3’ün hipotalamusta yüksek çıkması bu genin leptin 10 rezistansının oluşmasında etkili olabileceğine işaret etmektedir (Bjorbak ve ark., 2000). Yine sinyal iletiminde görev alan tyrosine phosphatase 1 B’nin de leptin sinyalinin iletiminde inhibisyona neden olup leptin rezistansının oluşmasında etkili olabileceği bildirilmektedir (Bence ve ark., 2006). Leptin rezistansının oluşmasında JAK reseptöründeki serine amino asitinin fosforilasyonunun artması da leptin sinyalinde inhibisyona neden olmaktadır (Ishida-Takahashi ve ark., 2006). Son dönemlerde yapılan çalışmalarda ise reseptör direncinin oluşmasında hipotalamustaki endoplazmik retikulum (ER)’un önemini belirtmiştir (Ozcan ve ark., 2004; Ozcan ve ark., 2009). Yapılan çalışmalarda endoplazmik retikulum düzeyinde kimyasallar kullanılarak obez farelerde oluşan insüline karşı reseptör hassasiyetin artırılması ile insülin direnci düzeltilebilmiştir (Ozcan ve ark., 2006). Benzer olarak obezite durumlarında oluşan leptin direncinin de ER’ye bağlı olduğu ve aynı şekilde leptin direncinin düzeltilebileceği bildirilmiştir (Ozcan ve ark., 2009). Leptin direncinin azaltılmasıyla obezite tedavisinde leptinin terapötik etkisinin olabileceği ve leptinin lipolizis yapıcı etkisinden tekrar yararlanılabileceği konusu güncellik kazanmıştır (Ozcan ve ark., 2009). 1.2. Lenfositler ve Alt Tipleri Memeli bağışıklık sistemindeki hücreler kemik iliğinin hemositoblastları olarak bilinen ve farklı şekilde başkalaşım geçiren hücrelerdir (Hartenstein, 2006). Hemositoblastlar farklılaşıp lenfoid ve miyeloid yönünde gelişim gösterirler. Lenfoid yönde farklılaşan hücreler lenfositleri oluşturuken miyeloid grupta nötrofil, monosit, eozinofil, bazofil, eritrosit ve trombositler bulunur. Kanda bulunan monositler dokulara geçerek makrofajlara dönüşürler (Hartenstein, 2006) ve makrofajların çoğu B ve T lenfositlere antijen sunmakla görevlidir. Bu yüzden bu hücrelere antijen sunan hücreler adı verilir (Gershwin ve ark., 1995). Lenfositler primer lenfoid organlarda (timus ve kemik iliği) olgunlaşıp buradan sekonder lenfoid organlara geçerler. Morfolojik olarak T ve B lenfositler ayrılamamaktadır. Ancak hücre zarlarındaki kendine özgü proteinler özel marker’lar ile işaretlenirse ayırt edilebilirler. Lenfositlerin hücre zarlarındaki antijenik determinantlara karşı hibridoma teknolojisi (kanser hücreleri ile immunize edilmiş dalak lenfosit 11 hücrelerinin birleştirilmesi sonucunda spesifik monoklonal antikor elde etme tekniği) ile monoklonal antikorlar hazırlanmaktadır (Gülmezoğlu ve Ergüven, 1994). Bu antikorlar floresan boyalar ile işaretlendiğinde akım sitometri tekniği ile çoğu lenfosit alt tipinin ayırt edilmesi ve miktarlarının belirlenmesi mümkün olmaktadır. Monoklonal antikorlar ile saptanan yüzeysel moleküller CD (başkalaşma kümesi, cluster differentiation) terminolojisi ile tanımlanmaktadır. Örneğin: CD2 bütün T lenfositlerde ve NK hücrelerde bulunurken CD3 sadece olgun T lenfositlerde bulunmaktadır. Yardımcı T lenfositlerde CD4, sitotoksik T lenfositlerde ise CD8 bulunur. Hücrelerdeki CD molekülleri antijen tanınmasından sonra gelen uyarımın hücre içine iletilmesinde görev almaktadır (Gülmezoğlu ve Ergüven, 1994). Lenfositlerin görevleri tiplerine göre değişmekle birlikte, oluşacak immun yanıtta tüm alt tipler kollektif olarak çalışmaktadırlar. Ancak, B lenfositler humoral immun yanıtta etkili olurken (Pape ve ark., 2007), T lenfositler ise daha çok hücresel bağışıklıkta etkilidir (Gershwin ve ark., 1995). 1.2.1. T Lenfositler Bağışıklık sisteminin çok önemli hücreleri olan T lenfositler antijene karşı spesifik olarak uyarılırlar. Yüzey reseptörü olarak T lenfositlerde T hücre reseptörü (TCR, T cell receptor)-1 ve TCR–2 şeklinde iki türlü reseptör bulunmaktadır. Yüzey reseptörleri iki adet polipeptit zincirden oluşur. T hücre reseptörü–2 alfa ve beta zincirinden oluşurken, TCR–1 gama ve delta zincirinden oluşur. T lenfositlerinin % 95’i TCR–2, % 5’i TCR–1 taşırlar. Bu reseptör yapısı B lenfositlerin antijeni bağlayan immunglobulin (Ig) reseptörlerine benzemekle birlikte, onlardan farklıdır (Gülmezoğlu ve Ergüven, 1994). Bağışıklık sisteminde bulunan T lenfositlerin yüzey reseptörleri “temel doku uyum kompleksi” (MHC, major histocompatibility complex) ile birlikte olduğu zaman antijenleri tanıyabilir (Gershwin ve ark., 1995; Hartenstein, 2006). Hepsinin kendilerine özgü yüzey reseptörleri olduğundan T lenfositlerin alt tipleri bu reseptörlerin tanımlanmasıyla belirlenebilir. Diğer reseptör tipi olan TCR–2 taşıyan lenfositler iki alt gruba ayrılmıştır. 1) Yardımcı T lenfositler; bunlar aynı zamanda hücre yüzeylerinde CD4 molekülünü taşımaktadır (Gülmezoğlu ve Ergüven, 1994). Yardımcı T lenfositler bir kere aktive olduğunda hızlı bir şekilde 12 bölünüp immun cevapta önemli rolleri olan sitokinler üretirler. Bu hücreler TH1 ve TH2 hücreleri (T yardımcı–2, T helper–2) gibi hücrelere dönüşüp her biri farklı sitokin üretiminden sorumlu olur. Yardımcı T lenfositler immun cevapta MHC-II moleküllerini kullanırlar (Jiang ve Chess, 2004; Schwarz ve Bhandoola, 2006). 2) Sitotoksik T lenfositler; bu alt tip ise hücre yüzeyinde CD8 molekülü taşımaktadır (Gülmezoğlu ve Ergüven, 1994). Sitotoksik T lenfositler virüsle enfekte olmuş hücreler ile tümör hücrelerini yıkımlar. Ayrıca doku naklinden sonra oluşan doku reddinde de bu hücre rol oynamaktadır. Bu hücreler farklılaşarak düzenleyici T hücreleri (regulatory T cell)’ne dönüşür ve otoimmun hastalıkların önlenmesinde görev alır (Jiang ve Chess, 2004). Antijen spesifik T lenfositleri bir enfeksiyondan sonra o enfeksiyonu izleyen uzun dönemde tanınması amacıyla, bellek (memory) T hücrelerine dönüşür ve o antijenin tekrar tanınmasında görev alır. Yardımcı T ve sitotoksik T lenfositleri bellek T hücrelerini oluşturabilir (Jiang ve Chess, 2004). 1.2.2. B Lenfositler Kan dolaşımında bulunan B lenfositlerde MHC-II antijenleri vardır. Bu antijenler T lenfositler ile kollektif bağışıklık cevapta önemli görevler alırlar. Ayrıca lenfositler gelen uyarıları CD19 ve CD20 reseptörleri ile alırlar (Harwood ve Batista, 2008). Bağışıklık sistemindeki B lenfositlerin en önemli görevi organizmada bulunan antijenlere karşı antikor oluşturmaktır (Montecino-Rodriguez ve Dorshkind, 2006). Kandaki serbest bir antijeni B lenfositler kendine özgü B hücre reseptörlerini ya da membrana bağlı immunglobulinleri kullanarak tanırlar. Buna karşın T lenfositlere mutlaka antijenin sunulması gerekmektedir (Montecino-Rodriguez ve Dorshkind, 2006). 1.2.3. Doğal Öldürücü Hücreler (NK hücreleri) Doğal öldürücü hücrelerde antijen özgüllüğü ve MHC moleküllerine bağımlı bir antijen tanıma özelliği yoktur (Mavilio ve ark., 2005). Bu hücreler tümör hücrelerini 13 ve virüsle enfekte olmuş hücrelere karşı sitotoksik etki göstermektedir. Antijen özgüllüğü olmadığı için NK hücreler doğal bağışıklık kapsamında etkinlik gösteren hücre grubu olarak kabul edilirler. Doğal öldürücü hücreler, T lenfositlerde olduğu gibi, timusta olgunlaşma süreci de geçirmezler (Herberman ve Ortaldo, 1981). Bu hücrelerde CD2, CD16 ve CD56 molekülleri bulunur ve bu moleküller sitokinler tarafından uyarılarak aktive olur ve hücreyi CD16 reseptörü ile tanıyarak direkt hücre ölümüne neden olur (sitolitik etki). Bu tür etkiye antijene bağlı hücresel sitotoksisite denir (Moebius ve ark., 2007). 1.2.4. Lenfositlerin Fonksiyonları Bağışıklık sisteminde lenfositlerin görevleri organizmaya giren antijenlere karşı immun cevabın oluşması, tanımlama fazı (antijenin tanınması), aktivasyon fazı (antijen ile spesifik reaksiyon sonrası lenfositlerin yanıtları) ve antijen ile uyarılmış hücreler ile antijenin yıkımlanması (sonuç fazı) gibi 3 ana başlık altında toplanmaktadır (Gershwin ve ark., 1995). 1.2.4.1. Antijenin Tanınması ve Lenfositlere Antijen Sunumu Bu faz, antijen sunan hücrelerin B ve T lenfositlere antijen sunulması ile ilgili geçen süreçleri kapsamaktadır. Antijen sunumu B ve T lenfositler için farklıdır. B lenfositler sadece uygun bir epitop [antijenin özgüllüğünü belirleyen kimyasal uç yapılar (antijenik determinant)] bağlamaya ihtiyaç duyarlarken T lenfositler MHC molekülü ile birlikte antijeni tanıyabilir. Yardımcı T lenfositler antijen sunan hücrelerdeki MHC-II molekülleri ile birlikte antijen sunumuna gereksinim duyar (Weaver ve Unanue, 1990). Antijen sunan hücreler arasında makrofajlar, B lenfositler, derideki langerhans hücreleri, dalak ve lenf yumrularındaki dendritik hücreler bulunmaktadır (Gershwin ve ark., 1995). Bu hücreler yüzeylerindeki MHCII molekülleri ile antijen sunma özelliklerine sahiptir (Mori ve Libero, 2008). Antijen sunumu antijenin endositozu veya fagositozu ile başlar. Bakteri ve parazitler gibi büyük antijenler makrofajlar tarafından fagosite edilirken, daha küçük antijenler B lenfositler tarafından endositozise uğratılarak antijen sunumu gerçekleştirilir. 14 Antijen, hücreye alındıktan sonra peptit fragmentleri (10-20 amino asit) MHC moleküllerine bağlanır. Antijenik peptit, antijen sunan hücrenin yüzeyine getirilir ve bu yapı yardımcı T lenfositler için artık spesifik bir antijenik determinanttır. Yardımcı T lenfositler CD4 molekülleri ile antijen sunan hücre ile temasa geçip sinyal iletiminde görev alırlar (Gershwin ve ark., 1995). B lenfositler antijenler ile reaksiyona girebilen delta ve gama membran moleküllerini ekspresse ederler (Youinou, 2007). Antijen, hücre yüzeyine geldiğinde bu moleküllerle etkileşime girerek endositoz yoluyla hücreye alınır ve bu antijen MHC-II molekülü ile yardımcı T lenfositine sunulur. Bu arada B lenfositte aktivasyon ve farklılaşma (diferensiyasyon) için gerekli sinyaller de başlatılmış olur (Chen ve Jensen, 2008). Bazı antijenler yardımcı T lenfositlerden sitokin uyarımı yardımı olmaksızın B lenfositlerce tanınıp bu hücrelerde çoğalmaya neden olabilir. Ayrıca yardımcı T lenfositler salgıladıkları bazı sitokinler ile de B lenfositleri aktive ederler. Yardımcı T lenfositlerde üretilen sitokinler humoral immun yanıt için önemli kimyasal maddelerdir. Bu hücrelerde üretilen IL–4 B lenfositlerde bir uyarıya ve hücrenin bölünmesine neden olur. İnterlökin–2, IL–4 ve IL–5 ise B lenfositlerin çoğalmasını düzenler. Sonraki aşamada B lenfositler antikor üreten plazma hücrelerine dönüşürler. Bu arada yardımcı T lenfositler de aktive olduklarında TH1 ve TH2 hücrelerine dönüşür ve her hücre farklı sitokin üretir. T yardımcı–1 hücreleri IL–2 ve IF-γ üretirken, TH2 hücreleri IL–4 ve IL–5 üretir. Bu sitokinler B lenfosit çoğalması üzerine farklı etkilere sahiptir. İnterferon-gama, IgG2a üretimine neden olurken IL–4, IgE ve IgG1, IL–5 ise IgA üretimine neden olur. İnterlökin–4 ve IL–5 ise birlikte IgM üretimine neden olmaktadır (Gershwin LJ ve ark., 1995). Bu sitokinler antijene karşı spesifik antikor üretimi için anahtar rolü üstlenmektedir (Abbas ve ark., 1991). 1.2.4.2. Lenfositlerin Uyarılması Antijenin MHC molekülüne bağlanması T lenfosit uyarılmasını başlatıcı bir sinyal olarak bilinir (Abbas ve ark., 1991). Üretilen sitokinler ile hücrenin tekrar uyarılması bir başka önemli adımdır. Bu amaçla IL–1 hücrenin tekrar uyarılması için üretilirken 15 eş zamanlı olarak IL–2 de üretilir ve T lenfositlerde büyüme ve mitotik bölünme şekillenir. Bu aşamadan sonra T lenfositler, B lenfosit gelişmesi ve çoğalmasını etkileyecek olan ek lenfokinleri de üretir (Gülmezoğlu ve Ergüven, 1994). Antijen, B lenfosit tarafından alındıktan sonra B lenfositin uyarılma süreci başlar. Yardımcı T lenfositlerden salınan IL–1, IL–2, IL–4, IL–5, IL–6 ve makrofajlardan üretilen faktörler ve TNF gibi faktörler de B lenfositlerin sonraki aşamalardaki farklılaşması ve çoğalmasında etkili olan sitokinlerdir (Gershwin LJ ve ark., 1995). 1.2.4.3. Antikor Oluşumu ve Antijenin Yıkımlanması Son faz antijen tanınması ve lenfosit aktivasyonundan sonra lenfositlerde gerçekleşen çeşitli antikor fonksiyonlarını içeren immun cevap mekanizmalarından şekillenir. Bu mekanizmalar komplement fikzasyonu, virüs nötralizasyonu, toksin nötrolizasyonu, opsonizasyon (antijene antikor kaplanarak fagositozun kolayca sağlanabilmesi işlemi) ve antikor bağımlı hücresel sitotoksisitedir. Ayrıca T hücre sitotoksisitesi ve makrofajların uyarılmaları da gerçekleşir (Gershwin LJ ve ark., 1995). T hücre sitotoksisitesi sitotoksik T lenfositlerin aktivasyonu ile gerçekleştirilir. Sitotoksik T lenfositler de antijenik yapıların tanınması amacıyla T hücre reseptörü taşırlar. Sitotoksik T lenfositler hedef hücre yüzeyinde bulunan MHC-I molekülüne homolog bir yapı ile antijeni tanır. Sitotoksik T lenfositlerin virüsleri tanıması bu mekanizma ile olmaktadır (Abbas ve ark., 1991; Gershwin LJ ve ark., 1995). Hedef hücrelerin yok edilmesi ise iki şekilde olmaktadır. Birincisinde, yukarıda belirtildiği gibi, hedef hücrelerdeki MHC-I molekülü ile CD8 moleküllerinin etkileşime girmesi ile antijen T hücre reseptörüne bağlanır. İkincisinde ise yardımcı T lenfositler tarafından üretilen IL–4, IL–6 ve IF-γ sitokinleri sitotoksik T lenfositlerin aktive olmasını ve hedef hücreye giderek o hücreyi yok edici proteinlerin salgılanmasına neden olur. Antijen yıkımlanmasının son aşamasında T hücrelerden üretilen sitokinler ile makrofajlar da aktive olurlar. Bu amaçla IF-γ, makrofaj sitoplazmasındaki oksidatif enzimleri artırarak daha güçlü bir intrasellüler savunma şekillendirir. Ayrıca antijene bağımlı olarak pek çok antikor üretimi de gerçekleşir. Sirkülasyondaki antijenleri bağlamada IgG ve IgM oldukça etkilidir. Bu şekildeki bağlı antijenler retiküloendotelyal sistem tarafından yok edilir. İmmunglobulin G ve IgM aynı 16 zamanda patojenleri hasara uğratma ve öldürmede de görev alırlar. Antijen bir toksinse, antikor toksini nötralize edecek niteliktedir. Virüslerın hücre yüzeyine tutunmasını engellemek için ise IgA antikoru üretilir (Gershwin LJ ve ark., 1995). 1.3. Tezin Amacı ve Önemi In vitro çalışmalardan elde edilen bulgular leptin ile bağışıklık sistemi arasında ilişki olduğunu ve leptinin lenfosit alt tiplerini farklı şekillerde etkileyerek T lenfosit cevaplarını düzenlediğini göstermektedir. Ancak, leptinin canlı sistemde lenfosit alt tiplerini gerçekte nasıl etkilediğini belirlemek için in vivo çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır (Goldberg ve ark., 2005; Matarese ve ark., 2005; Fantuzzi ve Faggioni, 2000). Bu araştırmada farelere farklı dozlarda (100 µg/kg/gün, 250 µg/kg/gün, 500 µg/kg/gün, 1000 µg/kg/gün) uygulanan leptinin lenfosit alt tipleri üzerine etkileri incelenmiştir. Bu amaçla kandaki toplam T lenfosit, toplam B lenfosit, yardımcı T lenfosit, sitotoksik T lenfosit ve NK hücreleri gibi bazı lenfosit alt tiplerinin yüzeylerindeki CD2, CD3, CD4, CD8, CD19 reseptör ekspresyon seviyeleri ve %NK hücre (CD56) miktarlarının olası değişimleri belirlenmiştir. Çalışmayla kan leptin düzeylerindeki değişikliklerin bağışıklık sistemini nasıl etkilediğinin açıklanması amaçlanmaktadır. Bu araştırma leptinin bağışıklık sistemi üzerine etkilerinin in vivo olarak incelendiği sınırlı sayıdaki çalışmalara da katkı sağlayacaktır. 17 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Hayvan Materyali Araştırma için Sağlık Bakanlığı Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi Başkanlığı Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan onay alındı (03.06.2009 tarih ve 11017 sayılı karar, Ek-1). Çalışmada Sağlık Bakanlığı Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi Başkanlığı Serum Çiftliği’nden temin edilen 40 adet 30-35 gram ağırlığında, ergin, erkek Swiss albino fare kullanıldı. Farelere adaptasyon döneminde ve deneysel süreçte standart fare yemi (Bil-Yem Gıda Sanayi Tic. Ltd. Şti., Çizelge 2.1) ve su ad libitum olarak verildi. Fareler adaptasyon döneminden deney tamamlanıncaya kadar uygun oda ısısında (23 ± 2 °C), % 40-60 nem koşullarında ve ortam 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık olacak şekilde özel fare kafeslerinde barındırıldı. Çizelge 2.1: Çalışmadaki farelere verilen rasyonun içeriği. İçindekiler Kuru madde (%) 88 Ham protein (%) 23 Ham selüloz (%) 7 Ham kül (%) 8 HCI’de çözünmüş kül (%) 2 NaCI (%) 1 Yağ (%) 5 Makro elementler Kalsiyum (%) 1-2,5 Fosfor (%) 0,9 Sodyum (%) 0,5-1 Mikro elementler Mangan (mg/kg) 10 Çinko (mg/kg) 4 Amino asit Lizin (%) 1 Metiyonin (%) 0,3 Sistin (%) 0,1 Vitaminler A (IU/kg) 400 D3 (IU/kg) 300 B2 (mg/kg) 5 B12 (mg/kg) 20 E (IU/kg) 30 K3 (IU/kg) 1 Metabolik enerji (kkal/kg) 2600 18 2.2. Deney Kurgusu Deneyin başlangıcında fareler rasgele 5 eşit gruba ayrıldı (Çizelge 2.2) ve deney koşullarına uyum sağlamaları için 10 günlük bir adaptasyon dönemine alındı. Adaptasyon dönemini 6 günlük deneysel süreç izledi. Birinci gruptaki fareler fizyolojik tuzlu su (FTS) uygulanan kontrol grubunu oluşturdu. Grup 2, 3, 4 ve 5’teki farelere ise kilogram canlı ağırlık için sırasıyla 100, 250, 500 ve 1000 µg dozlarında rekombinant fare leptini (Millipore, kat no: GF050) uygulandı. Leptin ve FTS (diğer leptin dozları ile aynı hacimde) uygulamaları deneysel sürecin başından itibaren 6 gün süreyle 0900 ve 1600 saatlerinde günde iki kez ve günlük doz ikiye bölünerek deri altı enjeksiyonu şeklinde gerçekleştirildi (Lord ve ark., 1998; Howard ve ark., 1999; Faggioni ve ark., 2000; Fujita ve ark., 2002; Bowen ve ark., 2003; Kalaivanisailaja ve ark., 2003; Lalonde ve ark., 2004; Mito ve ark., 2004; Balasubramaniyan ve Nalini, 2007; Maya-Monteiro ve ark., 2008). Farelerin canlı ağırlıkları adaptasyon döneminin 0., 5. ve 10. günlerinde, deneysel süreçte ise her gün aynı saatlerde tartılarak kaydedildi. Ayrıca, bireysel olarak günlük yem ve su tüketim miktarları da hesaplandı. Son leptin uygulamasından (6. gün) 15 saat sonra kan alımı gerçekleştiğinden leptin uygulamasının 6. günündeki yem-su tüketim değerleri tam bir gün geçmediğinden dolayı değerlendirmeye alınmadı. Çizelge 2.2: Gruplar. Gruplar (n=8) Uygulama 1. grup (KFTS) FTS : 200 µl/fare 2. grup (L100) Leptin: 100 µg/kg/gün 3. grup (L250) Leptin: 250 µg/kg/gün 4. grup (L500) Leptin: 500 µg/kg/gün 5. grup (L1000) Leptin: 1000 µg/kg/gün FTS: Fizyolojik tuzlu su., µl: Mikrolitre, kg: Kilogram. 2.3. Kan Alınması Deney sonunda [son leptin enjeksiyonundan 15 saat sonra (Mito ve ark., 2004)] eter anestezisi altında 1 mililitre (ml)’lik insülin enjektörü (26 gauge’luk) kullanılarak 19 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile pıhtılaşması engellenmiş kan (1 ml) intrakardiyak olarak alındı. Alınan kanlardan tüm gruplarda lenfosit alt tiplemesi [(yardımcı T (CD4), sitotoksik T (CD8), toplam T (CD3), toplam B (CD19) lenfosit ve NK hücre (CD56)] analizleri yapıldı. Leptin düzeylerinin belirlenmesi için kanlar 15 dakika 3000 devirde santrifüj edilerek (Hettich Universal 16A) plazmaları ayrıldı ve analizin yapılacağı güne kadar – 20 0C’de saklandı. 2.4. Analiz Yöntemleri 2.4.1. Lenfosit Alt Tiplemesi Lenfosit alt tiplemesi akım sitometrik yöntem ile spesifik antikorlarla konjuge olmuş fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE) gibi florokrom maddeler kullanılarak yapıldı (Papathanassoglou ve ark., 2006). Bu amaçla kan alındıktan hemen sonra örnekler lenfosit alt tiplemesi için özel bir yöntem ile işlendi (Papathanassoglou ve ark., 2006). Bunun için, fareye özel olarak üretilmiş 100 testlik “rat anti mouse CD2:RPE (Serotec, katalog no: MCA1261PE)”, “rat anti mouse CD4:FITC/CD8:RPE (Serotec, katalog no: DC034)” ve “rat anti mouse CD19:FITC/CD3:RPE (Serotec, katalog no: DC035)” monoklonal antikorlar kullanıldı. Alyuvarların yıkımlanması için lysing solüsyonu (FACS lysing solution, Becton Dickinson katalog no: 349202), preparatları yıkama işlemi için ise fosfat buffer solüsyonu (PBS, phosphate buffered solution) kullanıldı. Fosfat buffer solüsyonu, özel PBS tabletleri (Invitrogen, katalog no: 00-3002) kullanılarak hazırlandı. İşlenmiş kanları fikse etmek için fikzasyon solüsyonu (Cellfix, Becton Dickinson katalog no: 340181) kullanıldı (Papathanassoglou ve ark., 2006). Lenfosit alt tiplemesi için yapılan optimizasyon çalışmasında aşağıdaki metot oluşturuldu; · Akım sitometri için kullanılan 3 adet deney tüpüne (BD Falcon, 5 ml polystrene Round-Bottom tube, Becton Dickinson katalog no: 352052) 100’er µl pıhtılaşması engellenmiş kan ve üzerine sırasıyla rat anti mouse CD2:RPE, rat anti 20 mouse CD4:FITC/CD8:RPE ve rat anti mouse CD19:FITC/CD3:RPE antikorları eklenip vorteksle karıştırılıp ve 15 dakika karanlıkta inkubasyona bırakıldı. · İnkubasyondan sonra her tüpe 500’er µl lysing solüsyonu (FACS Lysing Solution, Becton Dickinson, kat no: 349292) eklendi. Vorteksle karıştırıldıktan sonra 10 dakika inkubasyona bırakıldı. · İnkubasyondan sonra her tüpe 500’er µl PBS eklenip vortekslendi ve 10 dakika inkubasyona bırakıldı. · İnkubasyondan sonra 1090 devirde (250 g’lik devirde) 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatant atıldıktan sonra üzerine 2 ml PBS eklenip vorteksle karıştırıldı. Aynı işlem bir kere daha yapıldı ve süpernatant atıldı. · Son süpernatant atıldıktan sonra tüplere 500 µl tespit solüsyonu eklendi. · Antikorlar ile işlenmiş kanlar akım sitometri cihazında (Beckman Coulter, Cytomic FC500) okutuldu. Lenfosit alt tiplerinin değerleri cihaz üzerinde yüzde (%) olarak hesaplandı (Lord ve ark., 1998; Martin-Romero ve ark., 2000). Elde edilen plotlardan CD4 reseptörlerini bulunduran hücreler yardımcı T lenfositleri, CD8 reseptörlerini bulunduran hücreler sitotoksik T lenfositleri (Şekil 2.1), CD3 reseptörlerini bulunduran hücreler toplam T lenfositleri, CD19 reseptörlerini bulunduran hücreler ise toplam B lenfositleri temsil etmiştir (Şekil 2.2). Lenfositlerin üzerindeki CD56 reseptörleri NK hücreleri ifade etmektedir (Moebius ve ark., 2007). Bu çalışmada NK hücreler CD2 (Şekil 2.3) pozitif hücrelerden CD3 pozitif hücrelerin çıkartılmasıyla (% NK=CD2–CD3) matematiksel olarak hesaplandı (Ferreira-Dias ve ark., 2005). 21 Şekil 2.1: CD4 ve CD8 pozitif hücreleri belirten plot örneği. Şekil 2.2: CD19 ve CD3 pozitif hücreleri belirten plot örneği. 22 Şekil 2.3: CD2 pozitif hücreleri belirten plot örneği. 2.4.2. Leptin Analizi Plazma leptin düzeyleri fare leptin Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kiti (Mouse Leptin ELISA kit, RayBio, katalog no: ELM-LEPTIN–001) kullanılarak, üretici firmanın önerileri doğrultusunda aşağıdaki şekilde belirlenmiştir; · Kitin içinde bulunan ve spesifik olarak kaplanmış her ELISA mikroplate bölmesine çift olarak 100’er µl standart ve test edilecek plazma örnekleri eklendi ve bir gece + 4 0C’de inkube edildi. · İnkubasyondan sonra mikroplate ters çevrilip içindeki solüsyonlar atıldı ve yıkama solüsyonu (300 µl) ile 4 defa yıkandı. · Her bölmeye 100 µl biotinylated antibody solüsyonu eklenip 1 saat oda ısısında inkube edildi. · İnkubasyondan sonra mikroplate ters çevrilip içindeki solüsyonlar atıldı ve yıkama solüsyonu (300 µl) ile 4 defa yıkandı. 23 · Her bölmeye 100 µl Streptavidin solüsyonu eklenip 45 dakika oda ısısında inkube edildi. · İnkubasyondan sonra mikroplate ters çevrilip içindeki solüsyonlar atıldı ve yıkama solüsyonu (300 µl) ile 4 defa yıkandı. · Her bölmeye 100 µl TMP One-Step Substrate Reagent’tan eklenip 30 dakika oda ısısında ve karanlık bir ortamda inkube edildi. · İnkubasyondan sonra her bölmeye 50 µl stop solüsyonu eklendi. Plate bölmeleri sarı renk aldıktan hemen sonra (Şekil 2.6), optik dansiteler ELISA cihazında 450 nanometre dalga boyunda okutuldu. Optik dansite değerleri çift çalışıldığı için ortalamaları alındı. Elde edilen optik dansite değerleri ile standart eğri çizdirilerek plazma leptin düzeyleri Graphpad prism programında hesaplandı. Kullanılan kitin hassasiyeti firmanın önerisine göre 1,5 pg/ml’den daha azdır. Şekil 2.4: Optik dansiteler ölçülmeden hemen önce ELISA pleytinin görünüşü (daha yoğun sarı bölmeler leptin düzeylerinin daha fazla olduğuna işaret etmektedir). 24 2.4.3. İstatistiksel Analiz Elde edilen verilerin varyasyonunun kontrolü için dağılım analizleri Shapiro-Wilk testi kullanılarak ve her grupta varyasyon katsayıları hesaplanarak yapıldı. Dağılımların normal olduğu belirlendi. Gruplardaki lenfosit alt tipleri ve leptin düzeyleri arasındaki farklar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirildi. Farkın hangi grup veya gruplardan kaynaklandığını belirlemek için post hoc Tukey testi yapıldı. Yem-su tüketim miktarları ile vücut ağırlık değişimleri zaman ve grup faktörleri gözönünde bulundurularak tekrarlayan ölçümlerde iki yönlü ANOVA ile değerlendirildi ve p≤0,05 anlamlı olarak kabul edildi. Verilerin analizi Statistical Package for the Social Sciences (SPSS for Windows; version 15.0, seri no: 416a1604ed18748d3f27) paket programı ile gerçekleştirildi (Winer ve ark, 1991). Sonuçlar ortalama ± standart hata (SH) şeklinde verildi. 25 3. BULGULAR Çizelge ve grafiklerdeki L100, L250, L500 ve L1000 sırasıyla 100, 250, 500 ve 1000 µg/kg/gün şeklinde leptin verilen doz gruplarını ifade etmektedir. KFTS ise FTS verilen kontrol grubudur. Çizelgelerde grup ortalamaları ve standart hata kullanılmıştır. Sütun grafiklerde her sütun, ortalama değeri ve standart hatayı belirtmektedir. Çizgi grafiklerde ortalama ve standart hata çubukları belirtilmektedir. 3.1. Vücut Ağırlığı ve Yem-Su Tüketimi Leptin uygulamasının gerçekleştirildiği deneysel süreçte zamanın vücut ağırlığı üzerine etkisi istatistiksel olarak onaylanırken (p<0,05) grupların canlı ağırlığı etkilemediği saptandı (p>0,05). Bununla birlikte kontrol grubunun 3. (36,3±1,10 g), 4. (36,5±1,10 g) ve 5. (36,5±1,01 g) gününde vücut ağırlık değerleri 0. güne (34,2±0,96 g) göre daha yüksekti. Ayrıca, L100 grubunda ise leptin uygulamasının 1. (36,3±1,05 g) ve 2. (36,3±1,04 g) günündeki vücut ağırlık değerleri 0. güne (34,7±0,96 g) göre yüksekti (Çizelge 3.1 ve Şekil 3.1). İstatistiksel olarak onaylanmamasına rağmen deneysel süreçte L100 ve L500 gruplarında leptin uygulamasından sonraki ilk günden itibaren, L250 grubunda ise leptin uygulamasından sonra ikinci günden itibaren bir ağırlık kaybı görülmektedir. En yüksek doz grubu olan L1000 grubunda ise leptin uygulamasından sonraki ilk üç günde vücut ağırlıkları düşerken dördüncü günden itibaren vücut ağırlık kazancı görülmektedir (Çizelge 3.1, Şekil 3.1). Deneysel süreçteki yem ve su tüketimleri sadece zamana bağlı anlamlı (p<0,001) bir değişim gösterdi (Çizelge 3.2, Şekil 3.2, ve Şekil 3.3). Yem tüketimi açısından bütün gruplar birlikte değerlendirildiğinde deneysel sürecin 0. (13,3±0,54 g) gününe göre 1. (10,9±0,41 g), 3. (11,1±0,60 g), 4. (10,5±0,50 g) ve 5. (11,6±0,50 g) günlerde önemli (p<0,001) bir azalma bulundu (Çizelge 3.2, Şekil 3.2). Su tüketim değerlerinde deneysel sürecin 0. (9,4±0,31 ml) gününe göre 1. (11,4±0,34 ml), 4. (10,1±0,32 ml) ve 5. (10,8±0,32 ml) güne göre anlamlı (p<0,001) olarak arttığı bulundu (Çizelge 3.2, Şekil 3.3). Leptin gruplarının yem ve su tüketim değerleri 26 üzerindeki etkisinin önemli (p>0,05) olmadığı bulundu (Çizelge 3.3, Şekil 3.4, Çizelge 3.4 ve Şekil 3.5). Ayrıca, vücut ağırlığı ve yem-su tüketim değerleri için gruplar arası farklar onaylanmadığından (p>0,05) leptin grupları birleştirilip kontrol grubuyla karşılaştırıldı. Toplam leptin grupları verileri değerlendirildiğinde, vücut ağırlığı ile yem-su tüketim değerlerindeki değişimleri istatistik onaylamamış olmasına rağmen, birleştirme (pooling) yapılan leptin grubunda vücut ağırlıkları kontrol grubuna göre leptin uygulamasının 1. gününden itibaren 4. güne kadar düştüğü, 5. ve 6. günlerde ise kontrol değerlerine ulaştığı bulundu (Şekil 3.6). Aynı şekilde yem tüketimlerinde de leptin grubunda kontrol grubuna göre 4. güne kadar hafif bir düşüş görüldü, 5. günde kontrol seviyelerine geldiği bulundu (Şekil 3.7). Leptin grubunun su tüketim değerleri ise leptin uygulaması boyunca kontrol grubuna göre yüksek olduğu bulundu (Şekil 3.8). Çizelge 3.1: Deneysel süreçteki farelerin vücut ağırlık değişimleri. Günlere göre vücut ağırlığı (gram, X±SH) Grup n 0 1 2 3 4 5 6 KFTS 34,2±0,96 35,5±1,05 36,2±1,04 36,3±1,10 36,5±1,10 36,5±1,01 36,1±1,05 L100 8 8 34,7±0,96 36,3±1,05 36,3±1,04 36,2±1,10 35,9±1,10 36,0±1,01 35,9±1,05 L250 8 35,7±0,96 36,7±1,05 37,1±1,04 36,6±1,10 36,6±1,10 36,6±1,01 36,6±1,05 L500 8 35,8±0,96 36,7±1,05 36,2±1,04 36,1±1,10 35,9±1,10 36,1±1,01 36,0±1,05 L1000 8 34,5±0,96 34,0±1,05 34,1±1,04 34,1±1,10 34,4±1,10 35,5±1,01 35,4±1,05 Şekil 3.1: Deneysel süreçteki farelerin vücut ağırlık değişimleri (değerler ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 27 Çizelge 3.2: Deneysel süreçteki farelerin zamana bağlı yem-su tüketim değerleri. Parametreler N 0. gün 1. gün 2.gün 3.gün 4.gün 5.gün Yem tüketimi 36 13,3±0,54A 10,9±0,41B 12,9±0,68A 11,1±0,60B 10,5±0,50B 11,6±0,50B (gram, X±SH) Su tüketimi 40 9,4±0,31A 11,4±0,34B 10,0±0,38A 9,8±0,37A 10,1±0,32B 10,8±0,32B (ml, X±SH) A,B : Aynı satırdaki farklı harfler sıfırıncı güne göre istatistiksel farklılığı ifade etmektedir (p<0,001). Şekil 3.2: Deneysel süreçteki farelerin zamana bağlı yem tüketimleri (n=36) (değerler ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). * : Sıfırıncı güne göre p<0,001 düzeyinde farklılığı ifade etmektedir. Şekil 3.3: Deneysel süreçteki farelerin zamana bağlı su tüketimleri (n=40) (değerler ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). * : Sıfırıncı güne göre p<0,001 düzeyinde farklılığı ifade etmektedir. 28 Çizelge 3.3: Deneysel süreçteki farelerin yem tüketim değerleri. Günlere göre yem tüketimi (gram, X±SH) Grup n 0 1 2 3 4 5 KFTS L100 L250 L500 L1000 5 8 8 8 7 14,3±1,43 12,7±1,13 13,7±1,13 12,1±1,13 13,7±1,20 10,6±1,08 10,7±0,86 11,8±0,86 10,0±0,86 11,6±0,91 15,7±1,80 11,8±1,42 14,3±1,42 12,1±1,42 10,8±1,52 13,0±1,58 10,5±1,25 12,6±1,25 10,3±1,25 9,2±1,34 11,7±1,32 10,0±1,04 11,6±1,04 9,0±1,04 10,0±1,11 11,0±1,31 11,3±1,04 12,1±1,04 11,6±1,04 11,8±1,11 Şekil 3.4: Deneysel süreçteki farelerin yem tüketimleri (değerler ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 29 Çizelge 3.4: Deneysel süreçteki farelerin su tüketim değerleri. Günlere göre su tüketimi (gram, X±SH) Grup n 0 1 2 3 4 5 KFTS L100 L250 L500 L1000 8 8 8 8 8 8,3±0,69 9,6±0,69 10,7±0,69 9,0±0,69 9,3±0,69 11,0±0,75 11,9±0,75 12,7±0,75 11,0±0,75 10,4±0,75 9,5±0,84 10,6±0,84 11,3±0,84 8,9±0,84 9,6±0,84 8,6±0,82 10,6±0,82 11,1±0,82 9,4±0,82 9,5±0,82 9,4±0,71 105±0,71 10,9±0,71 9,4±0,71 10,3±0,71 10,1±0,71 11,0±0,71 11,6±0,71 10,7±0,71 10,7±0,71 Şekil 3.5: Deneysel süreçteki farelerin su tüketimleri (değerler ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 30 Şekil 3.6: Leptinin vücut ağırlığı üzerine etkisi (Leptin grubu birleştirilmiş veri olarak verilmiştir. Kontrol grubu; n=8, leptin grubu; n=32) (değerler ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). Şekil 3.7: Leptinin yem tüketimine etkisi (Leptin grubu birleştirilmiş veri olarak verilmiştir. Kontrol grubu; n=5, leptin grubu; n=31) (değerler ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 31 Şekil 3.8: Leptinin su tüketimine etkisi (Leptin grubu birleştirilmiş veri olarak verilmiştir. Kontrol grubu; n=8, leptin grubu; n=32) (değerler ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 3.2. Kan Leptin Düzeyleri Farelerin ortalama leptin düzeyleri Çizelge 3.5’de ve Şekil 3.9’de gösterilmektedir. Leptinin dozu ile kan leptin düzeyleri arasında negatif bir ilişki eğilimi gözlendi. Verilen leptinin dozu artırıldığında kan leptin düzeyleri azaldı, ancak bu azalma istatistiksel olarak onaylanmadı (p>0,05). Çizelge 3.5: Farelerin kan leptin düzeyleri (X±SH). Grup n Leptin [pg/ml] KFTS L100 L250 L500 L1000 8 7 6 8 8 146,3±39,24 139,4±32,08 98,4±53,86 77,3±10,17 76,1±21,95 32 Şekil 3.9: Farelerin kan leptin düzeyleri (p>0,05) (her sütun ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 3.3. Lenfosit Alt Tipleri Lenfosit alt tipleri yüzey reseptör ekspresyonlarının yüzdeleri Çizelge 3.6’da görülmektedir. Yüzey reseptör ekspresyonları açısından değerlendirildiğinde, CD4+ (yardımcı T lenfosit) ekspresyon yüzdeleri bakımından L1000 grubunda kontrol grubuna ve diğer leptin gruplarına göre istatistiksel olarak önemli (p<0,05) bir artış bulundu (Şekil 3.10). Lenfosit alt tiplerinin belirlenmesinde kullanılan CD2+, CD3+ (toplam T lenfosit), CD8+ (sitotoksik T lenfosit), CD19+ (toplam B lenfosit) yüzey reseptör ekspresyonları ve % NK hücreleri açısından gruplar arasında önemli (p>0,05) bir fark bulunmadı (Sırasıyla Şekil 3.11, Şekil 3.12, Şekil 3.13, Şekil 3.14 ve Şekil 3.15). Çizelge 3.6: Farelerin CD ekspresyon yüzdeleri ve % NK hücreleri. CD ekspresyon yüzdeleri (X±SH) Grup n CD2 CD3 CD4 CD8 CD19 KFTS 8 78,2±3,08 25,4±2,09 14,5±3,29A 7,6±1,07 46,9±3,45 L100 7 76,9±3,31 28,0±5,70 11,1±2,04A 10,4±3,00 44,2±4,53 L250 8 69,4±3,72 25,3±2,35 15,2±1,87A 8,2±0,90 37,7±3,70 L500 8 74,3±2,21 24,5±2,69 15,4±2,64A 7,3±0,71 43,0±2,48 L1000 7 78,8±1,62 37,2±3,60 26,8±2,96B 8,8±0,78 33,7±3,76 Farklı harfler istatistiksel olarak farklılığı ifade etmektedir (A,B: p<0,05). % NK 52,8±3,82 48,9±7,95 44,1±2,96 49,8±4,29 41,7±3,26 33 Şekil 3.10: Farelerin CD4 (yardımcı T lenfosit) değerleri (her sütun ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). * : Diğer gruplara göre p<0,05 düzeyinde farklılığı ifade etmektedir. Şekil 3.11: Farelerin CD2 değerleri (p>0,05) (her sütun ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 34 Şekil 3.12: Farelerin CD3 (toplam T lenfosit) değerleri (p>0,05) (her sütun ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). Şekil 3.13: Farelerin CD8 (sitotoksik T lenfosit) değerleri (p>0,05) (her sütun ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 35 Şekil 3.14: Farelerin CD19 (toplam B lenfosit) değerleri (p>0,05) (her sütun ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). Şekil 3.15: Farelerin % NK değerleri (p>0,05) (her sütun ortalama ve standart hata çubuklarını belirtmektedir). 36 4. TARTIŞMA Obez genin ürünü olan leptin, besin alımı ile metabolik ve endokrin fonksiyonların düzenlenmesi gibi pek çok fizyolojik süreçlerde önemli rolleri olan sitokin yapısında bir hormondur. Besin alımını ve vücut ağırlığını azaltıcı etkileri leptinin ilk bulunan etkilerindendir (Azain ve ark., 1997). Leptin yokluğunda şiddetli obezite oluşması ile birlikte çeşitli metabolik hormonların salınımında dengesizlik, üreme fonksiyonlarında anormallikler, hematopoietik ve bağışıklık sisteminde değişmelerin şekillendiği gösterilmiştir (Ozata ve ark., 1999; Fantuzzi ve Faggioni, 2000). Gıda kısıtlamasında ve leptin eksikliğinin görüldüğü ob/ob memelilerde leptinin dolaşımdaki seviyeleri çok düşüktür (Fantuzzi ve Faggioni, 2000). Bu çalışmada farelerde leptinin vücut ağırlığı ve yem tüketimi üzerine etkisi ile leptin uygulamasının kan leptin düzeylerini doza bağımlı olarak ne şekilde etkilediği araştırılmıştır. Leptin sitokin üretimi, monosit-makrofajlar sisteminin aktivasyonu, yara iyileşmesi (Ring ve ark., 2000), anjiogenezis (Bouloumie ve ark., 1998) ve kan yapımı (Bennet ve ark., 1996) üzerine de etkiler gösterir. Leptin reseptörü eksikliğinde leptin hücre içine giremediğinden hücre içi işlevlerini gerçekleştiremez ve hücreden başlayarak tüm organizmayı etkileyen bozukluklar meydana gelir (Mandel ve Mahmoud, 1978). Leptin ve leptin reseptörleri immun yanıtta önemli olan sitokinler ile yapısal ve fonksiyonel olarak benzerlik göstermektedir (Matarese ve ark., 2005). Leptinin T lenfositler ve kan yapımından sorumlu öncül hücreler gibi bir takım hücre tiplerinde çoğaltıcı ve antiapopitotik etkileri vardır (Fantuzzi ve Faggioni, 2000). Ancak, leptinin özellikle bağışıklık sistemi üzerine etkileriyle ilgili bilgiler in vitro çalışmalara dayanmakta ve canlı sisteme uyarlanabilirliği sorgulanmaktadır. Bu nedenle bağışıklık sistemi üzerine leptinin etkisi ile ilgili çalışmalarda ve yayımlanan derlemelerde in vivo çalışmalara ihtiyaç olduğu önemle belirtilmektedir (Fantuzzi ve Faggioni, 2000; Goldberg ve ark., 2005; Matarese ve ark., 2005). Bu çalışmada in vivo olarak uygulanan leptinin toplam T (CD3), toplam B (CD19), yardımcı T (CD4), sitotoksik T (CD8) ve doğal öldürücü hücreler (NK: CD56)’i miktar olarak nasıl etkilediği araştırılmıştır. 37 Leptinin intraserebroventriküler ve periferal olarak verilmesi besin alımı ve vücut ağırlığında azalmaya neden olmaktadır (Campfield ve ark., 1995). Campfield ve ark. (1995), 12 µg/fare/gün dozunda 3 gün intraperitoneal olarak leptin uyguladıkları normal kilolu farelerin besin alımlarında ve vücut ağırlıklarında istatistiksel olarak onaylanmasa da düşüş olduğunu bildirmişlerdir. Halaas ve ark. (1995), 5 µg/gram/gün dozunda 2 hafta leptin uygulamasının obez farelerde % 30, normal kilolu farelerde ise % 12’lik bir vücut ağırlık kaybına neden olduğunu bildirmiştir. Bununla birlikte Halaas ve ark. (1995), 14 günlük leptin uygulama periyodunun 12 günlük kısmında vücut ağırlık kaybının istatistiksel olarak önemli olduğunu belirtmektedirler. Aynı çalışmada normal kilolu farelere aynı dozlarda uygulanan leptinin sadece vücut ağırlıkları stabilize edilene kadar besin alımında bir azalmaya neden olduğu bildirilmiştir. Bu açıdan değerlendirildiğinde, leptin normal kilolu farelerde vücut ağırlığının düzenlenmesinde, yağ dokusu üzerine olan etkisini yağ depolarının miktarına göre gösterdiği anlaşılmaktadır (Halaas ve ark., 1995). Campfield ve ark. (1995) ile Halaas ve ark. (1995), normal kilolu farelere leptin uygulandığında vücut ağırlıklarında sınırlı azalmalar görülmesi leptinin vücut ağırlığı ve besin alımı üzerine etkisini obez farelerde yağ depoları daha fazla olduğundan normal kilolu farelere göre daha etkin göstermesinden kaynaklandığını bildirmektedirler. Bu çalışmadaki leptin uygulanan gruplarda vücut ağırlıkları sınırlı olarak (% 1,21-2,18) azalmıştır. Leptin uygulanan gruplarda vücut ağırlıkları ile yem tüketim değerlerinde leptin uygulamasının 5. gününe kadar doz gruplarında sınırlı düşüşler olduğu görülmektedir. En yüksek doz grubu olan L1000 grubunun leptin uygulamasından sonraki 1-2 günlük dönemde vücut ağırlıklarında önce bir düşme, sonraki dönemde ise hafif bir artış göstererek başlangıçtaki seviyelerine ve kontrol grubu seviyelerine yaklaştığı görülmektedir. Bununla birlikte yapılan istatistiksel testlerde tüm gruplar birlikte düşünüldüğünde vücut ağırlığı (p<0,05) ve yem (Şekil 3.2, p<0,001) tüketim değerlerinde zamana bağlı bir düşüş ve su tüketiminde (Şekil 3.3, p<0,001) ise zamana bağlı bir artış görülmektedir. Ayrıca, vücut ağırlığı ve yemsu tüketim değerleri için leptin grupları birleştirilip kontrol grubuyla karşılaştırıldığında istatistik (p=0,104) onaylamamış olmasına rağmen, leptin gruplarında vücut ağırlıkları ve yem tüketimlerinde 4. güne kadar hafif bir düşüş görülmüş, bundan sonraki dönemde ise kontrol seviyelerine geldiği tespit edilmiştir 38 (Şekil 3.6 ve Şekil 3.7, p>0,05). Su tüketimleri için ise benzer bir etki görülmemektedir (Şekil 3.8). Pelleymounter ve ark. (1995)’nın çalışmasında farklı dozlardaki (0,1 mg/kg, 1 mg/kg ve 10 mg/kg) leptinin 28 gün boyunca intraperitoneal enjeksiyonunun vücut ağırlığı, besin alımı, su tüketimi ve vücut yağ oranında doza bağlı bir etki bulunduğu, fakat bu etkinin sadece obez (ob/ob) farelerde olduğu bildirilmektedir. Buna karşın, normal kilolu farelerin olduğu kontrol grubunda bu parametrelerde önemli değişimler gözlemlenmediği belirtilmiştir (Pelleymounter ve ark., 1995). Pelleymounter ve arkadaşlarının çalışmasında 28 günlük leptin uygulaması ile obez farelerde daha fazla olmakla birlikte normal kilolu farelerde de hafif bir vücut ağırlık kaybı olduğu saptanmıştır. Harris ve ark. (1998)’nın çeşitli metabolik parametrelerin belirlendiği çalışmasında normal ve obez farelerde leptinin intraperitoneal olarak 7 gün boyunca farklı dozlarının (1, 2, 5, 10 ve 42 µg/gün) uygulanmasının besin alımı ve vücut ağırlığı üzerine obez farelerde normal kilolu farelere göre çok daha fazla etkilediğini bildirilmektedir. Harris ve ark. (1998) obez farelerin sadece en düşük doz grubu olan 1 µg/gün şeklindeki leptin uygulamasına besin alımında ve vücut ağırlıklarında bir azalma görülmediği diğer tüm dozların besin alımı ve vücut ağırlıklarında anlamlı düşüşler olduğunu belirtmektedir. Aynı çalışmada normal kilolu fareler ise leptinin sadece en yüksek iki doz grubunda geçici olarak (ilk 2 günlük dönemde) besin alımı ve vücut ağırlığında azalma ile cevap vermiş, daha düşük olan doz gruplarında leptinin besin alımı ve vücut ağırlığı üzerine etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Bununla birlikte Harris ve ark. (1998) ve Pelleymounter ve ark. (1995)’nın çalışmalarının aksine Balasubramaniyan ve Nalini (2006), normal kilolu farelere 15 gün intraperitoneal leptin (230 µg/kg) uygulamasının vücut ağırlığı ve yem-su tüketimini anlamlı olarak azalttığını bildirmişlerdir. Bu araştırmada elde edilen vücut ağırlıkları ve yem-su tüketim değerleri Balasubramaniyan ve Nalini (2006)’nın çalışmasıyla farklılık gösterirken, Harris ve arkadaşlarının (1998) çalışmasına paralellik göstermektedir. Obez gruplarda leptinin etkisinin normal kilolu farelere göre daha fazla görülmesinin nedeni obez (ob/ob) farelerin leptine karşı daha hassas olmasından kaynaklandığı bildirilmektedir (Harris ve ark., 1998). Normal kilolu farelerin ise, bu çalışmada olduğu gibi, yüksek dozda leptin uygulamalarından hemen 39 sonra geçici olarak besin alımının azalması ve sonra yem tüketim değerlerinin kontrol seviyelerine gösterebileceği gelmesi fazladan yağ (Şekil 3.4), deposunun organizmada olmaması leptinin nedeniyle etkisini olabileceği düşünülmekte, bu durum ise Harris ve ark. (1998)’nın leptinin besin alımı ile vücut ağırlığı üzerine olan etkisinin normal kilolu farelerde obez farelere göre daha az olduğu bildirimine ve yorumuna uymaktadır. Ayrıca insanlarda olduğu gibi, normal kilolu fareler leptin düzeyleri arttığında kan-beyin bariyerinden sınırlı bir transport sistemine uyabileceği bildirilmektedir (Harris ve ark., 1998). Bu mekanizmalar obez farelerde (ob/ob) olmadığından dolayı obez fareler leptinin düşük dozlarına bile metabolik parametrelerinde değişiklikler gerçekleştirerek cevap verebilmektedir (Harris ve ark., 1998). Leptinin intraserebroventriküler olarak verildiği çalışmalara (Qian ve ark., 1998; Wang ve ark., 1998b; Wang ve ark., 1999) bakıldığında kan beyin-bariyeri engeli ortadan kalktığı için yukarıda bahsedilen süreçlerin de şekillenmesi söz konusu olmayacağından dolayı, leptin besin alımı ve vücut ağırlığı üzerine olan etkisini kolaylıkla yapacağı belirtilmektedir. Çalışmada canlı ağırlık ve yem tüketim değerleri üzerine leptinin 6 günlük periferal etkisi incelenmiştir. Kısa ve uzun dönemli leptin uygulaması gerçekleştirilen çalışmalara bakıldığında (Campfield ve ark., 1995; Halaas ve ark., 1995; Pelleymounter ve ark., 1995; Harris ve ark., 1998) bu çalışmada da olduğu gibi leptinin bu etkisinin çok fazla değişmediği görülmektedir. Leptinin canlı ağırlık ve yem tüketimine sınırlı etkisinin bir başka nedeni ise leptinin hipotalamik düzeyde SOCS3 seviyelerini artırıp kendi sinyal iletimini engellemiş olabileceğini Bjorbaek ve ark. (1998), Bjorbaek ve ark. (1999) bildirmektedirler. Bu çalışmadan elde edilen veriler (Şekil 3.6, Şekil 3.7 ve Şekil 3.8) vücut ağırlığı ve yem tüketimi değerlerinde azalmalar göstermekte iken, su tüketim değerlerinin kontrol grubuna göre azalmadığı görülmektedir. Leptinin su tüketimine etkisinin yem tüketimi ve vücut ağırlığı üzerine olan etkisinden daha farklı olabileceği ya da su tüketiminin leptin uygulamasından bağımsız olarak sadece yem tüketimine bağlı değişimler göstermiş olabileceği, bu nedenle leptinin direkt olarak su tüketimini etkilemediği Pelleymounter ve ark. (1995) çalışmasıyla benzerlik göstermektedir. 40 Dolaşımdaki leptin seviyeleri vücuttaki yağ dokusu miktarı ile ilişkilidir (Campfield ve ark., 1995). İnsan, rodent, Avrupa kahverengi ayısı, at ve kedide plazma leptin seviyesi ve vücut kitlesi arasında pozitif bir ilişki olduğu bildirilmektedir (Frederich ve ark., 1995; Saladin ve ark., 1995; Trayhun ve ark., 1995). Enerji girişi enerji harcamasından fazla olduğunda vücuttaki enerji dağılımı yağ birikmesi yönünde olur ve yağ hücrelerinde büyüme şekillenir (Loos ve Bouchard, 2003). Ayrıca erişkin bir canlıda vücuttaki protein ve karbonhidrat miktarları sürekli dengede tutulmaya çalışılırken enerji fazlalığı durumunda yağ miktarı artırılıp leptin seviyeleri de buna paralel olarak artar (Loos ve Bouchard, 2003). Yapılan araştırmalar incelendiğinde leptin uygulamasının genel olarak kan leptin seviyelerini de artırdığı sonucuna varılmaktadır (Mito ve ark., 2004; Ruffin ve ark., 2004; Benomar ve ark., 2005; Eiden ve ark., 2005). Bununla birlikte Harris ve ark. (1998), en yüksek leptin doz grubundaki kan leptin seviyelerinin istatistiksel olarak onaylanmamış olsa da düşme eğilimi olduğunu bildirmiştir. Çalışmadaki yüksek dozda (L1000) leptin uygulanan farelerde plazmada ölçülen leptin seviyelerinde (76,1±21,95 pg/ml) düşüş görülmüştür. Bu sonuç Harris ve ark. (1998)’nın çalışması ile kısmen uyumlu iken diğer literatür bilgisiyle (Mito ve ark., 2004; Ruffin ve ark., 2004; Benomar ve ark., 2005; Eiden ve ark., 2005) uyuşmamaktadır. Bu çalışmada leptinin dozu ne kadar artırılırsa kan leptin düzeylerinde de ters orantılı olarak azalmalar belirlenmiştir. Bu sonucun oluşmasında leptin uygulamasının özellikle yağ dokusundaki leptin sentezinde bir inhibitorik etki gerçekleştirmesinden dolayı olabileceği Harris ve ark. (1998) tarafından bildirilmektedir. Nitekim, Harris ve ark. (1998)’nın çalışmasında yağ dokusundaki leptin mRNA ekspresyonu seviyeleri de belirlenmiş ve yağ dokusundaki leptin mRNA ekpresyonlarında uygulanan leptin dozunun artışına bağlı azalmalar tespit edilmiştir. Leptinin SOCS3 proteinini artırıp kendi sinyal iletimini azaltmasının yanında (Bjorbaek ve ark., 1998; Bjorbaek ve ark., 1999) ayrıca SOCS3 proteini yağ dokusunda insülin sinyalini engelleyerek lipogenezisi baskılamaktadır (Shi ve ark., 2006). Shi ve ark. (2006) çalışmalarında, SOCS3 proteinini çok fazla ekspresse eden normal ve yüksek yağlı rasyonla beslenen transgenik farelerin kan leptin seviyelerini transgenik olmayan farelere göre daha düşük tespit etmişlerdir. Bu çalışmada leptinin dozu arttıkça leptin seviyeleri de düşük tespit edilmiştir (KFTS: 146,3±39,24 pg/ml, 41 L100: 139,4±32,08 pg/ml, L250: 98,4±53,86 pg/ml, L500: 77,3±10,17 pg/ml, L1000: 76,1±21,95 pg/ml). Leptin hormon salınımı ve leptin reseptörü olmayan farelerde bağışıklık sisteminde bozukluklar şekillenmektedir (Fantuzzi ve Faggioni, 2000). Aynı durum uzun süreli açlık ile şekillendirilmiş leptin eksikliğinde de görülmektedir (Papathanassoglou ve ark., 2006). Açlığa bağlı gelişen leptin eksikliğinde görülen bağışıklık sistemi bozuklukları leptin uygulaması ile düzelmektedir. Leptin bu etkisini reseptörleri ile T lenfositlerde ve TH1 hücre sitokinlerinde bir artış şekillendirerek göstermektedir (Lord ve ark., 1998). Yangısal uyarının oluşmasından kısa süre sonra leptin seviyelerinin arttığı dikkati çekmektedir (Faggioni ve ark., 1998; Moshyedi ve ark., 1998). Bu açıdan leptinin immun yanıtta görevleri olabileceği düşünülmüş ve yapılan bir çalışmada leptinin T lenfositlerde üretilen sitokin seviyelerinin düzenlenmesinde ana role sahip olduğu bildirilmiştir (Lord ve ark., 1998). Lord ve ark. (1998) leptinin IL–2 ve IF–γ sitokinlerini artırırken, IL–4 seviyelerini düşürerek bağışıklık sistemindeki lenfosit fonksiyonunu düzenlediğini bildirmektedirler. Sunulan çalışmada bağışıklık sistemi ile ilişkili olan CD3+ (toplam T lenfosit), CD4+ (yardımcı T lenfosit), CD8+ (sitotoksik T lenfosit), CD19+ (toplam B lenfosit) hücreler ile NK hücrelerinin düzeylerine bakılarak leptinin bu hücrelere etkisinin nasıl olduğu incelendiğinde; toplam T lenfositleri ifade eden CD3+ hücrelerdeki artışı istatistik onaylamamıştır (p=0,08). Yardımcı T lenfositleri ifade eden CD4+ hücrelerde ise önemli (p<0,05) bir artış görülmüştür. Leptin, monosit/makrofajlar sisteminden üretilen sitokinleri etkileyerek de immun cevabın oluşmasında anahtar roller üstlenir (Loffreda ve ark., 1998; Mattioli ve ark., 2005). Leptin bağışıklık sistemi üzerine etkisini dolaşımdaki lenfositlerde (özellikle T lenfositler) çoğaltıcı ve apopitozisi önleyici etkiler yaparak da gösterir (Martin-Romero ve ark., 2000). Uzun süreli aç kalma ile organizmadaki besin alımının kısıtlanması sonucunda bağışıklık sisteminde olumsuz yönde değişiklikler olmaktadır (Marti ve ark., 2001). Bu değişiklikler arasında enfeksiyonlara karşı hassasiyet ve lenfositlerin sayı ve fonksiyonlarında azalmadan söz edilmektedir. Chan ve ark. (2006)’nın in vitro çalışmalarında leptinin CD3+ (toplam T lenfosit) hücreleri artırmaya çalıştığını bildirmiştir. Benzer olarak bu çalışmada en yüksek 42 leptin doz grubu olan L1000 grubunda CD3+ hücrelerde (toplam T lenfosit) istatistiğin onaylamadığı bir artış görülmüştür. Lord ve ark. (1998), Howard ve ark. (1999), Martin-Romeo ve arkadaşları (2000), Chan ve ark. (2006)’nın çalışmalarında leptinin CD4+ hücreleri (yardımcı T lenfositler) artırdığı bildirilmektedir. Sunulan çalışmada, CD4+ (yardımcı T lenfositler) hücre yüzdeleri en yüksek leptin doz grubu olan L1000 (26,8±2,96) grubunda kontrol grubuna (14,5±3,29) ve diğer gruplara (L100: 11,1±2,04, L250: 15,2±1,87, L500: 15,4±2,64) göre anlamlı (p<0,05) olarak artış göstermiştir. Howard ve ark. (1999), Martin-Romeo ve arkadaşları (2000), Chan ve ark. (2006)’nın çalışmalarında leptin in vitro olarak CD8+ hücrelerde (sitotoksik T lenfosit) artışa neden olduğu bildirilmektedir. Bu çalışmada ise leptinin CD8+ hücreleri (sitotoksik T lenfosit) etkilemediği görülmektedir. Chan ve ark. (2006) leptinin CD19+ hücreleri (toplam B lenfosit) artırdığını, Papathanassoglou ve ark. (2006) ise leptinin CD19+ hücrelerin (toplam B lenfosit) apopitozislerini önleyerek hayatta kalma sürelerini uzattığını bildirmektedirler. İn vivo yapılan bu çalışmada Papathanassoglou ve ark. (2006)’nın aksine leptinin CD19+ hücre (toplam B lenfosit) miktarlarına etki etmediği görülmüştür. Haas ve ark. (2008), ratlarda yaptığı in vivo çalışmada 500 µg/kg intravenöz olarak (tek doz) uygulanan leptinin NK (CD56) hücrelerinde artışa neden olduğunu göstermişlerdir. Zhao ve ark. (2003) ise insan NK (CD56) hücrelerinin leptin uygulamasına cevap olarak sitotoksik aktivitelerinde artma olduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışmada ise leptin NK hücre oranını etkilememiştir. Bu açıdan Haas ve ark. (2008)’nın çalışması ile paralellik göstermemektedir. Zhao ve ark., (2003) bu etkinin görülmemesinin leptinin NK hücreleri üzerine sadece sitotoksik özelliklerini artırıcı etki göstermiş olmasından kaynaklanabileceğini bildirmektedir. İn vivo leptin uygulaması yapılan bu çalışmada lenfosit alt tiplerinde doza bağımlı artış görülmemiş ve özellikle CD4+ hücreler (yardımcı T lenfosit) dışındaki diğer lenfosit alt tipleri (CD3+: toplam T lenfosit, CD8+: sitotoksik T lenfosit, CD19+: toplam B lenfosit ve NK hücreler) leptin uygulamalarından etkilenmemiştir. Leptinin bağışıklık sistemi üzerine doza bağımlı etkisinin gösterildiği çalışmalar çoğunlukla in vitro çalışmalardır (Lord ve ark., 1998; Howard ve ark., 1999; Martin-Romero ve ark., 2000; Chan ve ark., 2006). Bu açıdan leptinin canlıda doza bağımlı etkisinin nasıl şekilleneceği tam olarak öngörülemediği için in vivo çalışmaların yapılması gerektiği önerilmiştir (Goldberg ve ark., 2005; 43 Matarese ve ark., 2005; Fantuzzi ve Faggioni, 2000). Leptin organizmada in vivo olarak direkt ve indirekt pek çok nöroendokrin ve metabolik değişimlere neden olurken (Sanchez-Margaret ve ark., 2003; Bernotiene ve ark., 2006). reseptörleri aracılığı ile de bağışıklık sistemi hücrelerinde doğrudan etkiler gösterir ve hipotalamus-hipofiz-adrenal ekseni üzerinden ve ayrıca troid bezi üzerinden glikokortikoidler, glikoz, troid hormonları, büyüme hormonu, adrenokortikotropik hormonu ve sempatik sistemini de dolaylı olarak etkilemektedir. Bu açıdan leptinin bağışıklık sistemini etkilerken çok daha karmaşık fizyolojik olaylara neden olduğu bildirilmektedir (Bernotiene ve ark., 2006). Bu çalışmada diğer çalışmaları destekleyen yardımcı T lenfosit (CD4+ hücreler) artışının birkaç nedeni olabilir. Birincisi Lord ve ark. (1998)’nın belirttiği gibi leptinin bağışıklık sistemindeki makrofajları reseptörleri aracılığıyla uyararak IL-1, IL-2 ve TNF-a gibi immun yanıtta önemli sitokinlerin artmasına ve CD4+ hücre çoğalmasına neden olduğu düşünülebilir. İkincisi Martin-Romero ve ark. (2000)’nın bildirdiği üzere leptin direkt olarak yardımcı T lenfositler (CD4+ hücreler) üzerine yine reseptörleri aracılığıyla çoğaltıcı etki göstermiş olabilir. Üçüncüsü ise Papathanassoglou ve ark. (2006)’nın bildirimine uygun olarak leptin yardımcı T lenfositlerin apopitozisini önleyip daha uzun süre yaşamalarına neden olmuş olabilir. Ayrıca, SanchezMargaret ve ark. (2003) leptinin bağışıklık sistemi üzerine direkt etkisinin dışındaki diğer nöroendokrin ve metabolik etkilerinin daha karmaşık olabileceğini bildirmektedir. Leptin in vitro olarak CD3+ (toplam T lenfosit), CD4+ (yardımcı T lenfosit), CD8+ (sitotoksik T lenfosit) ve CD19+ (toplam B lenfosit) hücreler ile NK hücreleri gibi pek çok lenfosit alt tipine gerek sayılarını gerekse hücresel aktivitelerini artırarak etki ettiği bildirilmektedir (Howard ve ark., 1999; Martin-Romeo ve ark., 2000; Zhao ve ark., 2003; Chan ve ark., 2006; Papathanassoglou ve ark., 2006; Haas ve ark., 2008). Bu çalışma ile leptinin bu etkisinin in vivo olarak sadece CD4+ hücrelerde (yardımcı T lenfosit) olduğu tespit edilmiştir. 44 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bu araştırmada, leptin hormonunun farelerde lenfosit alt tiplerini nasıl etkilediği incelenmiştir. Ayrıca leptinin vücut ağırlığı, yem tüketimi ve su tüketimi gibi metabolik parametreler üzerine de etkisi belirlenmiştir. Bu araştırmadan elde edilen bulgular ışığında aşağıdaki sonuçlar çıkartılmıştır; - Çalışmada leptin uygulamalarının normal kilolu farelerde vücut ağırlığı ve yem tüketimi değerleri üzerine azaltıcı etkisini sınırlı olarak gösterdiği, su tüketimini ise etkilemediği belirlenmiştir. - Araştırmada leptinin uygulanan dozu arttıkça plazmada ölçülen leptin seviyelerinde leptin uygulamasının kesilmesinden 15 saat sonra bir düşüş tespit edilmiştir. Leptin uygulamasının kan leptin seviyelerini baskıladığı düşünülmektedir. - Yüksek dozdaki in vivo leptin uygulamasının CD4+ hücrelerini (yardımcı T lenfosit) artırarak immun yanıtta çok önemli görevi olan bu hücre grubu üzerinden etkisini gösterdiği, CD3+ hücreler (toplam T lenfosit) üzerine in vivo etkisinin net olmadığı, CD8+ (sitotoksik T lenfosit), CD19+ (toplam B lenfosit) ve NK hücreleri ise in vivo olarak etkilemediği tespit edilmiştir. Leptinin bağışıklık sistemi hücreleri üzerine in vivo etkilerinin çok daha karmaşık süreçler ile şekillendiği düşünülerek konu ile ilgili hipotalamushipofiz-adrenal eksen ile hipotalamus-hipofiz-troid eksen üzerine nöroendokrin yeni çalışmalar yapılması bu karmaşık süreçlerin ve fizyolojik mekanizmaların nasıl şekillendiğinin açıklanması açısından literatüre katkı sağlayacaktır. Ayrıca leptinin daha farklı dozlarının farklı sürelerde in vivo olarak denenmesi önerilmektedir. Günümüzde leptin terapisi klinik olarak henüz sınırlı bir uygulama alanı bulmaktadır. Özellikle genetik olarak leptin eksikliği görülen bireyler ile leptin eksikliği olmayan fakat şiddetli obezite görülen bireylerde leptin tedavileri denenmektedir. Genetik olarak leptin eksikliği olan bireylerde leptin tedavisi besin alımını baskılamak ve bozulan nöroendokrin fonksiyonları tekrar düzeltmek amaçlı olarak uygulanırken, leptin eksikliği olmayan obez bireylerde ise leptine duyarsızlığı 45 azaltma amacıyla yüksek dozlarda denenmektedir. Leptinin bağışıklığı düzenleyici etkilerinden yararlanmak amacıyla da klinikte sınırlı bir kullanımı olduğu bildirilmektedir. Bu amaçla en fazla denenen medikal durum human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) enfeksiyonlu hastalardır. Bu virus ile enfekte olmuş hastaların serum leptin seviyelerinde dramatik bir düşüş görülmesinden dolayı bağışıklığın regülasyonu da bozulmaktadır. Bu nedenle HIV-1 enfeksiyonlu hastalara leptin tedavisi uygulamaları yapılmaktadır. Bu çalışmadan elde edilen bilgiler leptinin yüksek dozda bağışıklık sistemi üzerine etkili olabileceğini göstermektedir. Bu nedenle klinik olarak leptin uygulamalarında leptinin dozunun bu çalışma ve benzeri doz çalışmaları dikkate alınarak ayarlanmasının uygun olacağı önerilmektedir. Literatürde leptinin lenfosit alt tiplerine etkisi oldukça tartışmalı bir konudur. Bu araştırma ile leptin hormonunun lenfosit alt tipleri üzerine etkisi in vivo olarak gösterilirken, aynı zamanda bu etkinin nasıl şekillenmiş olabileceği konusunda da bulgular elde edilmiş, mekanizmalar açıklanmaya çalışılmıştır. Leptinin lenfosit alt tipleri üzerine etkisinin nasıl olduğu konusunda literatüre katkıda bulunulmuştur. Bu araştırma ile in vivo leptin uygulamasının normal kilolu farelerde vücut ağırlığı ve yem tüketimi üzerine sınırlı bir etkisinin olduğu, yüksek dozlarda ise CD4+ hücrelerin (yardımcı T lenfosit) miktarlarını artırarak bağışıklık sistemini etkilediği ve leptinin özellikle hücresel immun aktivasyonda ve bağışıklık sisteminin olumlu yönde düzenlenmesi açısından önemli görevleri olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmanın diğer deneysel modellerde ve gelecek çalışmalara ışık tutacağı düşünülmektedir. 46 ÖZET Farelerde Leptinin Lenfosit Alt Tipleri Üzerine İn Vivo Etkileri Bu çalışmanın amacı başlıca yağ dokusunda üretilen ve pek çok görevi olan leptin hormonunun farelerde vücut ağırlığı, yem-su tüketimi ile lenfosit alt tiplerini nasıl değiştirdiğinin araştırılmasıdır. Çalışma başlangıcında 40 adet sağlıklı, erkek Swiss albino fare rasgele olacak şekilde 5 gruba ayrıldı. Birinci grubu fizyolojik tuzlu su uygulanan fareler (KFTS grubu, kontrol), ikinci, üçüncü, dördüncü ve beşinci grubu sırasıyla 100 (L100), 250 (L250), 500 (L500) ve 1000 (L1000) µg/kg/gün dozlarında rekombinant fare leptini uygulanan gruplar oluşturdu. Leptin hormonu 6 gün süreyle deri altı olarak uygulandı. Deney süresince tüm gruplardaki farelerin bireysel canlı ağırlıkları ile yem-su tüketimlerinin nasıl değiştiği belirlendi. Deney sonunda her farenin kalbinden 500 µl EDTA ile pıhtılaşması engellenmiş kan alındı. Alınan kanlardan leptin analizi ve lenfosit alt tipleri analizleri yapıldı. Elde edilen verilerden lenfosit alt tiplerinin miktarları ve leptin seviyeleri tek yönlü varyans analizi ile değerlendirildi. Altı günlük leptin uygulaması döneminde vücut ağırlık değişimleri tekrarlayan ölçümlerde iki yönlü varyans analizi ile değerlendirildi. Deneyin adaptasyon döneminde farelerde hafif bir kilo artışı belirlendi. Altı günlük leptin uygulaması döneminde L100, L250 ve L500 gruplarında birinci ve/veya ikinci günden itibaren, L1000 grubunda ise leptin uygulamasının hemen başlangıcından itibaren hafif bir vücut ağırlık azalması belirlendi. Bu ağırlık azalmasının L1000 grubunda dördüncü güne kadar olduğu ve bu gruptaki vücut ağırlıklarının tekrar eski seviyelerine ulaştığı belirlendi. Aynı dönemde leptinin yem tüketimlerini 2. günden itibaren su tüketimlerini ise 1. günden itibaren hafif olarak azalttığı bulundu. En yüksek leptin doz grubu olan L1000 grubunda CD4+ hücrelerin yüksek (p<0,05) olduğu bulundu. Leptinin CD3+ hücre grubu üzerine çoğaltıcı etkisinin olduğu fakat bu etkinin istatistiksel olarak onaylanmadığı (p>0,05), yüzde olarak doğal öldürücü hücreler (% NK), CD8+ ve CD19+ hücrelerin ise leptin uygulamasından etkilenmediği belirlendi. Anahtar Sözcükler: Leptin, lenfosit alt tipleri, bağışıklık sistemi, in vivo, fare. 47 SUMMARY In Vivo Effects of Leptin on Lymphocyte Subpopulations in Mice The aim of this study was to investigate effects of leptin, mainly produced by the adipose tissue and has pleiotropic effects, on food/water intake and lymphocyte subpopulations count in mice. Initially fourty healthly male Swiss albino mice were randomly divided into five groups. Mice in group I (group KFTS, control) were given serum physiologic and group II (group L100), III (group L250), IV (group L500), and V (group L1000) were given 100, 250, 500 ve 1000 µg/kg/day recombinant mouse leptin, respectively. Leptin were injected by subcutan for the next 6 days in groups II, III, IV, and V. Mice were monitored and weighed everyday during the experimental period. Daily food-water intake was recorded for each group. At the end of the study, blood samples (500 µl) with EDTA (as an anticoagulant) were obtained via intracardiac punction. Leptin levels and lymphocyte subpopulations in blood samples were analyzed. Lymphocyte subpopulations and leptin levels were examined by oneway analysis of variance (ANOVA). Changes of body weight and food-water intake during leptin administration period were evaluated with two-way ANOVA for repeated measures. Mean body weight and food intake slightly increased during the adaptation period. During the 6 days leptin administration period the mean body weight slightly decreased starting from the first and/or second day of the experiment in group L100, L250, and L500. In addition, the mean body weight in group L1000 also decreased from the starting day to day 4 of leptin administration. At the same period, food (from the second day of leptin administration) and water (from the first day of leptin administration) intake also decreased slightly. CD4+ cells markedly (p<0,05) increased in highest leptin administrated group. Proliferative effect of leptin was determined on CD3+ cells but this was not statistically confirmed (p>0,05). Among all groups, no difference was found in the percentage of natural killer cells (NK%) and the amount of CD19+ and CD8+ cells. Key Words: Leptin, immune system, lymphocyte subpopulations, in vivo, mouse. 48 KAYNAKLAR ABBAS, A.K., LICHTMAN, A.H., ROBER, J.S. (1991). Cellular and molecular immunology. Philadelphia: W.B. Saunders. ASLAN, K., SERDAR, Z., TOKULLUGİL, H.A. (2004). Multifonksiyonel hormon: Leptin. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 30: 113–118. AZAIN, M.J., WANG, T., HULSEY, M.G., HARTZELL, D.L., BAILE, C.A. (1997). Adipose tissuespecific effects of intracerebroventricular leptin in rats. J. Anim. Sci., 75: 167 (özet). BADO, A., LEVASSEUR, S., LE MARCHAND-BRUSTEL, Y., LEWIN, M.J.M. (1998). The stomach is a source of leptin. Nature, 394: 790–793. BAGNASCO, M., DUBE, M.G., KALRA, P.S., KALRA, S.P. (2002). Evidence for the existence of distinct central appetite, energy expenditure, and ghrelin stimulation pathways as revealed by hypothalamic site-specific leptin gene therapy. Endocrinology, 143: 4409–4421. BALASUBRAMANIYAN, V., NALINI, N. (2006). Intraperitoneal leptin regulates lipid metabolism in ethanol supplemented Mus musculas heart. Life Sci, 78: 831-837. BALASUBRAMANIYAN, V., NALINI, N. (2007). Effect of leptin on peroxidation and antioxidant defense in ethanol-supplemented Mus musculus heart. Fundam Clin Pharmacol, 21: 245-53. BANKS, W.A., FARRELL, C.L. (2003). Impaired transport of leptin across the blood-brain barrier in obesity is acquired and reversible. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 285: E10 –15. BANKS, W.A., KASTIN, A.J., HUANG, W., JASPAN, J.B., MANESS, L.M. (1996). Leptin enters the brain by a saturable system inde-pendent of insulin. Peptides, 17: 305-11. BENCE, K.K., DELIBEGOVIC, M., XUE, B., GORGUN, C.Z., HOTAMISLIGIL, G.S., NEEL, B.G., KAHN, BB. (2006). Neuronal PTP1B regulates body weight, adiposity and leptin action. Nat. Med., 12: 917-924. BENNETT, B.D., SOLAR, G.P., YUAN, J.Q., MATHIAS, J., THOMAS, G.R., MATTHEWS, W. (1996). A role for leptin and its cognate receptor in hematopoiesis. Curr. Biol., 6: 1170–1180. BENOMAR, Y., WETZLER, S., LARUE-ACHAGIOTIS, C., DJIANE, J., TOMÉ, D., TAOUIS, M. (2005). In vivo leptin infusion impairs insulin and leptin signalling in liver and hypothalamus. Mol Cell Endocrinol, 242: 59-66. BERNOTIENE, E., PALMER, G., GABAY, C. (2006). The role of leptin in innate and adaptive immune responses. Arthritis Res Ther, 8: 217. BJØRBAEK, C., EL-HASCHIMI, K., FRANTZ, J.D., FLIER, J.S. (1999). The role of SOCS-3 in leptin signaling and leptin resistance. J. Biol. Chem, 274: 30059-65. BJØRBAEK, C., ELMQUIST, J.K., FRANTZ, J.D., SHOELSON, S.E., FLIER, J.S. (1998). Identification of SOCS-3 as a potential mediator of central leptin resistance. Mol. Cell, 1: 619625. BJORBAK, C., LAVERY, H.J., BATES, S.H., OLSON, R.K., DAVIS, S.M., FLIER, J.S., MYERS, M.G.JR. (2000). SOCS3 mediates feedback inhibition of the leptin receptor via Tyr985. J. Biol. Chem., 275: 40649-40657. BODEN, G., CHEN, X., MOZZOLI, M., RYAN, I. (1996). Effect of fasting on serum leptin in normal human subjects. J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: 3419–3423. BOULOUMIE, A., DREXLER, H.C.A., LAFONTAN, M., BUSSE, R. (1998). Leptin, the product of ob gene, promotes angiogenesis. Circ. Res, 83: 1059–1066. BOWEN, H., MITCHELL, T.D., HARRIS, R.B. (2003). Method of leptin dosing, strain, and group housing influence leptin sensitivity in high-fat-fed weanling mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 284: R87-100. BRUNO, A., CONUS, S., SCHMID, I., SIMON, H.U. (2005). Apoptotic pathways are inhibited by leptin receptor activation in neutrophils. J. Immunol., 174: 8090–8096. CAMPFIELD, L.A., SMITH, F.J., GUISEZ, Y., DEVOS, R., BURN, P. (1995). Recombinant mouse OB protein: evidence for a peripheral signal linking adiposity and central neural networks. Science, 269: 546–549. CAPRIO, M., ISIDORI, A.M., CARTA, A.R., MORETTI, C., DUFAU M.L., FABBRI, A. (1999). Expression of functional leptin receptors in rodent Leydig cells. Endocrinology, 140: 4939– 4947. CASON, J., AINLEY, C.C., WOLSTENCROFT, R.A., NORTON, K.R., THOMPSON, R.P. (1986). Cell-mediated immunity in anorexia nervosa. Clin. Exp. Immunol., 64: 370–375. 49 CASTRACANE, V.D., HENSON, M.C. (2006). Leptin. New York/USA: Springer Science+Business Media, LLC, Chapter 7. CHAN, J.L., MATARESE, G., SHETTY, G.K., RACITI, P., KELESIDIS, I., AUFIERO, D., DE ROSA, V., PERNA, F., FONTANA, S., MANTZOROS, C.S. (2006). Differential regulation of metabolic, neuroendocrine, and immune function by leptin in humans. Proc Natl Acad Sci U S A, 103: 8481-6. CHANDRA, R.K. (1980). Cell-mediated immunity in genetically obese (C57BL/ 6J ob/ob) mice. Am. J. Clin. Nutr., 53: 1087–1101. CHEN X, JENSEN PE. (2008). The role of B lymphocytes as antigen-presenting cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 56: 77-83. COLEMAN, D.L. (1973). Effects of parabiosis of obese with diabetes and normal mice. Diabetologia, 9: 294–298. CONSIDINE, R.V., SINHA, M.K., HEIMAN, M.L., KRIAUCIUNAS, A., STEPHENS, T.W., NYCE, M.R., OHANNESIAN, J.P., MARCO, C.C., MCKEE, L.J., BAUER, T.L., CARO, J.F. (1996). Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med, 334: 292-5. EIDEN, S., SIMON, E., SCHMIDT, I. (2005). Dose-related steady states of fat loss in long-term leptin-treated ob/ob mice: leptin resistance or desensitization versus counterregulatory signaling. J Comp Physiol B, 175: 487-97. ENRIORI, P.J., EVANS, A.E., SINNAYAH, P., COWLEY, M.A. (2006). Leptin resistance and obesity. Obesity (Silver Spring), 14: 254S-258S. ERGÜN, A. (1999). Leptin (ob Protein). Turkiye Klinikleri J. Med. Sci., 19: 130–136. FAGGIONI, R., FANTUZZI, G., FULLER, J., DINARELLO, C.A., FEINGOLD, K.R., GRUNFELD, C. (1998). IL-1b mediates leptin induction during inflammation. Am. J. Physiol., 274: 204–208. FAGGIONI, R., JONES-CARSON, J., REED, D.A., DINARELLO, C.A., FEINGOLD, K.R., GRUNFELD,C., FANTUZZI, G. (2000). Leptin-deficient (ob/ob) mice are protected from T cell-mediated hepatotoxicity: role of tumor necrosis factor-a and IL-18. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 2367–2372. FANTUZZI, G., FAGGIONI, R. (2000). Leptin in the regulation of immunity, inflammation, and hematopoiesis. J. Leukoc. Biol., 68: 437–446. FANTUZZI, G. (2005). Adipose tissue, adipokines, and inflammation. J. Allergy Clin. Immunol., 115: 911–919. FERANDES, G., HANDWERGER, B.S., YUNIS, E.J., BROWN, D.M. (1978). Immune response in the mutant diabetic C57 BL/ks-db1 mouse. J. Clin. Invest., 61: 243–250. FERREIRA-DIAS, G., CLAUDINO, F., CARVALHO, H., AGRICOLA, R., ALPOIM-MOREIRA, J., ROBALO SILVA, J. (2005). Seasonal reproduction in the mare: possible role of plasma leptin, body weight and immune status. Domest. Anim. Endocrinol., 29: 203–213. FREDERICH, RC., LOLLMANN, B., HAMANN, A., NAPOLITANO-ROSEN, A., KAHN, B.B., LOWELL, B.B., FLIER J.S. (1995). Expression of ob mRNA and its encoded protein in rodents. Impact of nutrition and obesity. J Clin Invest., 96: 1658–1663. FUJITA, Y., MURAKAMI, M., OGAWA, Y., MASUZAKI, H., TANAKA, M., OZAKI, S., NAKAO, K., MIMORI, T. (2002). Leptin inhibits stress-induced apoptosis of T lymphocytes. Clin. Exp. Immunol., 128: 21–26. GAINSFORD, T., WILLSON, T.A., METCALF, D., HANDMAN, E., MCFARLANE, C., NG, A., NICOLA, N.A., ALEXANDER, W.S., HILTON, D.J. (1996). Leptin can induce proliferation, differentiation, and functional activation of hemopoietic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14564–14568. GE, H., HUANG, L., POURBAHRAMI, T., LI, C. (2002). Generation of soluble leptin receptor by ectodomain shedding of membrane-spanning receptors in vitro and in vivo. J. Biol. Chem., 277: 45898-49503. GERSHWIN, L.J., KRAKOWKA, S., OLSEN, R.G. (1995). Immunology and Immunopathology of Domestic Animals. Missouri: Mosby-Year Book, Inc, Chapter 8. GHILARDI, N., ZIEGLER, S., WIESTNER, A., STOFFEL, R., HEIM, M.H., SKODA, R.C. (1996). Defective STAT signaling by the leptin receptor in diabetic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 93: 6231-6235. GOLDBERG, A.C., ELIASCHEWITZ, F.G., MONTOR, W.R., BARACHO, G.V., ERRANTE, P.R., CALLERO, M.A., CARDOSO, M.R., BRAGA, P.E., KALIL, J., SOGAYAR, M.C., RIZZO, 50 L.V. (2005). Exogenous leptin restores in vitro T cell proliferation and cytokine synthesis in patients with common variable immunodeficiency syndrome. Clin. Immunol., 114: 147–153. GÜLMEZOĞLU, E., ERGÜVEN, S. (1994). İmmnoloji. Ankara: Hacettepe-Taş Kitapçılık Ltd. Şti, Bölüm 8. HAAS, P., STRAUB, R.H., BEDOUI, S., NAVE, H. (2008). Peripheral but not central leptin treatment increases numbers of circulating NK cells, granulocytes and specific monocyte subpopulations in non-endotoxaemic lean and obese LEW rats. Regul Pept, 151: 26-34. HALAAS, J.L., GAJIWALA, K.S., MAFFEI, M., COHEN, S.L., CHAIT, B.T., RABINOWITZ, D., LALLONE, R.L., BURLEY, S.K., FRIEDMAN, J.M. (1995). Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science, 269: 543-6. HAKANSSON, M.L., BROWN, H., GHILARDI, N., SKODA, R.C., MEISTER, B. (1998). Leptin receptor immunoreactivity in chemically defined target neurons of the hypothalamus. Journal of Neuroscience, 18: 559–572. HARRIS, R.B.S., ZHOU, J., REDMAN, S.M., SMAGIN, G.N., SMITH, S.R., RODGERS, E., ZACHWIEJA, J.J. (1998). A leptin dose-response study in obese (ob/ob) and lean (+/?) mice. Endocrinology, 139: 8-19. HARTENSTEIN, V. (2006). Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol, 22: 677-712. HARWOOD, N.E., BATISTA, F.D. (2008). New insights into the early molecular events underlying B cell activation. Immunity, 28: 609-19. HERBERMAN, R.B., ORTALDO, J.R. (1981). Natural killer cells: Their role in defenses against disease. Science, 214: 24-26. HIROSE, H., SAITO, I., KAWAI, T., NAKAMURA, K., MARUYAMA, H., SARUTA, T. (1998). Serum leptin level: possible association with haematopoiesis in adolescents, independent of body mass index and serum insulin. Clin. Sci. (Lond)., 94: 633–636. HOUSEKNECHT, K.L., BAILE, C.A., MATTERI, R.L., SPURLOCK, M.E. (1998). The biology of leptin: a review. J. Anim. Sci. 76: 1405–1420. HOWARD, J.K., LORD, G.M., MATARESE, G., VENDETTI, S., GHATEI, M.A., RITTER, M.A., LECHLER, R.I., BLOOM, S.R. (1999). Leptin protects mice from starvation-induced lymphoid atrophy and increases thymic cellularity in ob/ob mice. J. Clin. Invest., 104: 1051– 1059. INGALLS, A.M., DICKIE, M.M., SNELL, G.D. (1950). Obese, a new mutation in the mouse. J. Hered., 41: 317–318. ISHIDA-TAKAHASHI, R., ROSARIO, F., GONG, Y., KOPP, K., STANCHEVA, Z., CHEN, X., FEENER, E.P., MYERS, M.G.JR. (2006). Phosphorylation of Jak2 on Ser(523) inhibits Jak2dependent leptin receptor signaling. Mol. Cell. Biol., 26: 4063-4073. JANIK, JE., CURTI, B.D., CONSIDINE, R.V., RAGER, H.C., POWERS, G.C., ALVORD, W.G., SMITH, J.W., GAUSE, B.L., KOPP, W.C. (1997). Interleukin 1 alpha increases serum leptin concentrations in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3084–3086. JIANG, H., CHESS, L. (2004). An integrated view of suppressor T cell subsets in immunoregulation. J. Clin. Invest., 114: 1198–1208. JUGE-AUBRY, C.E., MEIER, C.A. (2002). Immunomodulatory actions of leptin. Mol. Cell Endocrinol., 194: 1–7. KALAIVANISAILAJA, J., MANJU, V., NALINI, N. (2003). Lipid profile in mice fed a high-fat diet after exogenous leptin administration. Pol. J. Pharmacol., 55: 763–769. KOLACZYNSKI, J.W., OHANNESIAN, J.P., CONSIDINE, R.V., MARCO, C.C., CARO, J.F. (1996). Response of leptin to short-term and prolonged overfeeding in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: 4162-4165. LAHARRAGUE, P., LARROUY, D., FONTANILLES, A.M., TRUEL, N., CAMPFIELD, A., TENENBAUM, R., GALITZKY, J., CORBERAND, J.X., PENICAUD, L., CASTEILLA, L. (1998). High expression of leptin by human bone marrow adipocytes in primary culture. FASEB J., 12: 747–752. LALONDE, J., SAMSON, P., POULIN, S., DESHAIES, Y., RICHARD, D. (2004). Additive effects of leptin and topiramate in reducing fat deposition in lean and obese ob/ob mice. Physiol Behav, 80: 415-20. LAMAS, O., MARTINEZ, J.A., MARTI, A. (2004). Energy restriction restores the impaired immune response in overweight (cafeteria) rats. J. Nutr. Biochem., 15: 418–425. 51 LOFFREDA, S., YANG, S.Q., LIN, H.Z., KARP, C.L., BRENGAMAN, M.L., WANG, D.J., KLEIN, A.S., BULKLEY, G.B., BAO, C., NOBLE, P.W., LANE, M.D., DIEHL, A.M. (1998). Leptin regulates proinflammatory immune responses. FASEB J., 12: 57–65. LOOS, R.J., BOUCHARD, C. (2003). Obesity-is it a genetic disorder? J. Intern. Med., 254: 401–425. LORD, G.M., MATARESE, G., HOWARD, J.K., BAKER, R.J., BLOOM, S.R., LECHLER, R.I. (1998). Leptin modulates the T-cell immune response and reverses starvation-induced immunosuppression. Nature, 394: 897–901. LORD, G.M., MATARESE, G., HOWARD, J.K., LECHLER, R.I. (2001). The bioenergetics of the immune system, Science, 292: 855-856. LUUKKAA, V., PESONEN, U., HUHTANIEMI, I., LEHTONEN, A., TILVIS, R., TUOMILEHTO, J., KOULU, M., HUUPPONEN, R. (1998). Inverse correlation between serum testosterone and leptin in men. J. Clin. Endocrinol. Metab., 83: 3243–3246. MANDEL, M.A., MAHMOUD, A.A. (1978). Impairment of cell-mediated immunity in mutation diabetic mice (db/db). J. Immunol, 120: 1375. MANTZOROS, C.S., MOSCHOS, S.J. (1998). Leptin: in search of role(s) in human physiology and pathophysiology. Clin. Endocrinol. (Oxf), 49: 551–567. MANTZOROS, C.S., MOSCHOS, S., AVRAMOPOULOS, I., KAKLAMANI, V., LIOLIOS, A., DOULGERAKIS, D.E., GRIVEAS, I., KATSILAMBROS, N., FLIER, J.S. (1997). Leptin concentrations in relation to body mass index and the tumor necrosis factor-alpha system in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3408–3413. MARTI, A., MARCOS, A., MARTINEZ, J.A. (2001). Obesity and immune function relationships. Obes. Rev., 2: 131-140. MARTIN-ROMERO, C., SANTOS-ALVAREZ, J., GOBERNA, R., SANCHEZ-MARGALET, V. (2000). Human leptin enhances activation and proliferation of human circulating T lymphocytes. Cell Immunol., 199: 15–24. MASUZAKI, H., OGAWA, Y., SAGAWA, N., HOSODA, K., MATSUMOTO, T., MISE, H., NISHIMURA, H., YOSHIMASA, Y., TANAKA, I., MORI, T., NAKAO, K. (1997). Nonadipose tissue production of leptin: leptin as a novel placenta-derived hormone in humans. Nat. Med., 3: 1029–1033. MATARESE, G., MOSCHOS, S., MANTZOROS, C.S. (2005). Leptin in immunology. J. Immunol., 174: 3137–3142. MATARESE, G. (2000). Leptin and immune system: how nutritional status influences the immune response. Eur. Cytokine Netw., 11: 7–14. MATTIOLI, B., STRAFACE, E., QUARANTA, M.G., GIORDANI, L., VIORA. M. (2005). Leptin promotes differentiation and survival of human dendritic cells and licenses them for Th1 priming. J. Immunol., 174: 6820–6828. MAVILIO, D., LOMBARDO, G., BENJAMIN, J., KIM, D., FOLLMAN, D., MARCENARO, E., O'SHEA, M.A., KINTER, A., KOVACS, C., MORETTA, A., FAUCI, AS. (2005). Characterization of CD56-/CD16+ natural killer (NK) cells: a highly dysfunctional NK subset expanded in HIV-infected viremic individuals. Proc Natl Acad Sci U S A., 102: 2886-91. MAYA-MONTEIRO, C.M., ALMEIDA, P.E., D'AVILA, H., MARTINS, A.S., REZENDE, A.P., CASTRO-FARIA-NETO, H., BOZZA, P.T. (2008). Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. J Biol Chem, 283: 2203-10. MITO, N., HOSODA, T., KATO, C., SATO, K. (2000). Change of cytokine balance in diet-induced obese mice. Metabolism, 49: 1295–1300. MITO, N., YOSHINO, H., HOSODA, T., SATO, K. (2004). Analysis of the effect of leptin on immune function in vivo using diet-induced obese mice. J. Endocrinol., 180: 167–173. MOEBIUS JM, WIDERA D, SCHMITZ J, KALTSCHMIDT C, PIECHACZEK C. (2007). Impact of polysialylated CD56 on natural killer cell cytotoxicity. BMC Immunol., 8:13. MONTECINO-RODRIGUEZ, E., DORSHKIND, K. (2006). New perspectives in B-1 B cell development and function. Trends Immunol., 27: 428–433. MORASH, B., LI, A., MURPHY, P.R., WILKINSON, M., U,R E. (1999). Leptin gene expression in the brain and pituitary gland. Endocrinology, 140: 5995–5998. MORI, L., DE LIBERO, G. (2008). Presentation of lipid antigens to T cells. Immunol Lett, 117: 1-8. MOSCHOS, S., CHAN, J.L., MANTZOROS, C.S. (2002). Leptin and reproduction: a review. Fertil. Steril., 77: 433–444. 52 MOSHYEDI, A.K., JOSEPHS, M.D., ABDALLA, E.K., MACKAY, S.L., EDWARDS, C.K., COPELAND, E.M., MOLDAWER, L.L. (1998). Increased leptin expression in mice with bacterial peritonitis is partially regulated by tumor necrosis factor alpha. Infect. Immun., 66: 1800–1802. MUNZBERG, H., MYERS, M.G.JR. (2005). Molecular and anatomical determinants of central leptin resistance. Nat. Neurosci., 8: 566–570. NEDVIDKOVA, J. (1997). Leptin. Cesk. Fysiol., 46: 182–188. OGAWA, Y., MASUZAKI, H., ISSE, N., OKAZAKI, T., MORI, K., SHIGEMOTO, M., SATOH, N., TAMURA, N., HOSODA, K., YOSHIMASA, Y., JINGAMI, H., KAWADA, T., NAKAO, T. (1995). Molecular cloning of rat obese cDNA and augmented gene expression in genetically obese Zucker fatty (fa/fa) rats. J. Clin. Invest., 96: 1647–1652. OZATA, M., OZDEMIR, I.C., LICINIO, J. (1999). Human leptin deficiency caused by a missense mutation: multiple endocrine defects, decreased sympathetic tone, and immune system dysfunction indicate new targets for leptin action, greater central than peripheral resistance to the effects of leptin, and spontaneous correction of leptin-mediated defects. J. Clin. Endocrinol. Metab., 84: 3686–3695. OZCAN, L., ERGIN, A.S., LU, A., CHUNG, J., SARKAR, S., NIE, D., MYERS, M.G.JR., OZCAN, U. (2009). Endoplasmic reticulum stress plays a central role in development of leptin resistance. Cell Metab., 9: 35-51. OZCAN, U., CAO, Q., YILMAZ, E., LEE, A.H., IWAKOSHI, N.N., OZDELEN, E., TUNCMAN, G., GORGUN, C., GLIMCHER, L.H., HOTAMISLIGIL, G.S. (2004). Endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science, 306: 457–461. OZCAN, U., YILMAZ, E., OZCAN, L., FURUHASHI, M., VAILLANCOURT, E., SMITH, R.O., GORGUN, C.Z., HOTAMISLIGIL, G.S. (2006). Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes. Science, 313: 1137–1140. PAPATHANASSOGLOU, E., EL-HASCHIMI, K., LI, X.C., MATARESE, G., STROM, T., MANTZOROS, C. (2006). Leptin receptor expression and signaling in lymphocytes: kinetics during lymphocyte activation, role in lymphocyte survival, and response to high fat diet in mice. J. Immunol., 176: 7745–7752. PAPE, K., CATRON, D., ITANO, A., JENKINS, M. (2007). The humoral immune response is initiated in lymph nodes by B cells that acquire soluble antigen directly in the follicles. Immunity, 26: 491–502. PELLEYMOUNTER, M.A., CULLEN, M.J., BAKER, M.B., HECHT, R., WINTERS, D., BOONE, T., COLLINS, F. (1995). Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science, 269: 540-3. QIAN, H., AZAIN, M.J., COMPTON, M.M., HARTZELL, D.L., HAUSMAN, G.J., BAILE, C.A. (1998). Brain administration of leptin causes deletion of adipocytes by apoptosis. Endocrinology, 139: 791-4. RING, B.D., SCULLY, S., DAVIS, C.R., BAKER, M.B., CULLEN, M.J., PELLEYMOUNTER, M.A., DANILENKO, D.M. (2000). Systemically and topically administered leptin both accelerate wound healing in diabetic ob/ob mice. Endocrinology, 141: 446–449. RUFFIN, M.P., ADAGE, T., KUIPERS, F., STRUBBE, J.H., SCHEURINK, A.J., VAN DIJK, G. (2004). Feeding and temperature responses to intravenous leptin infusion are differential predictors of obesity in rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 286: R756-63. SALADIN, R., DE VOS, P., GUERRE-MILLO, M., LETURQUE, A., GIRARD, J., STAELS, B., AUWERX, J. (1995). Transient increase in obese gene expression after food intake or insulin administration, Nature, 377: 527–529. SANCHEZ-MARGALET, V., MARTIN-ROMERO, C. (2001). Human leptin signaling in human peripheral blood mononuclear cells: activation of the JAK-STAT pathway. Cell Immunol., 211: 30–36. SÁNCHEZ-MARGALET V, MARTIN-ROMERO C, SANTOS-ALVAREZ J, GOBERNA R, NAJIB S, GONZALEZ-YANES C. (2003). Role of leptin as an immunomodulator of blood mononuclear cells: mechanisms of action. Clin Exp Immunol, 133: 11-9. SARRAF, P., FREDERICH, R.C., TURNER, E.M., MA, G., JASKOWIAK, N.T., RIVET, D.J.III., FLIER, J.S., LOWELL, B.B., FRAKER, D.L., ALEXANDER, H.R. (1997). Multiple cytokines and acute inflammation raise mouse leptin levels: potential role in inflammatory anorexia. J. Exp. Med., 185: 171–175. 53 SCHWARZ, B.A., BHANDOOLA, A. (2006). Trafficking from the bone marrow to the thymus: a prerequisite for thymopoiesis. Immunol. Rev., 209: 47–57. SHI, H., CAVE, B., INOUYE, K., BJØRBAEK, C., FLIER, J.S. (2006). Overexpression of suppressor of cytokine signaling 3 in adipose tissue causes local but not systemic insulin resistance. Diabetes, 55: 699-707. SHIMOMURA, S.Y., NAKANISHI, Y., FUTAWATARI, T., OHTANI, K., SATO, N., MORI, M. (1997). Estrogen increases in vivo leptin production in rats and human subjects. J. Endocrinol., 154: 285–292. SIEGRIST-KAISER, C.A., PAULI, V., JUGE-AUBRY, C.E., BOSS, O., PERNIN, A., CHIN, W.W., CUSIN, I., ROHNER-JEANRENAUD, F., BURGER, A.G., ZAPF, J., MEIER, C.A. (1997). Direct effects of leptin on brown and white adipose tissue. J. Clin. Invest., 100: 2858–2564. SMITH-KIRWIN, S.M., O’CONNOR, D.M., DE JOHNSTON, J., LANCEY, E.D., HASSINK, S.G., FUNANAGE, V.L. (1998). Leptin expression in human mammary epithelial cells and breast milk. J. Clin. Endocrinol. Metab., 83: 1810–1813. TAOUIS, M., CHEN, J.W., DAVIAUD, C., DUPONT, J., DEROUET, M., SIMON, J. (1998). Cloning the chicken leptin gene. Gene., 208: 239–242. TARTAGLIA, L.A. (1997). The leptin receptor. Journal of Biological Chemistry, 272: 6093–6096. TRAYHURN, P., THOMAS, M.E., DUNCAN, J.S., RAYNER, D.V. (1995). Effects of fasting and refeeding on ob gene expression in white adipose tissue of lean and obese (ob/ob) mice, FEBS. Lett., 368: 488–490. TUNÇBİLEK, E. (2005). Obezite genetik bir hastalık mıdır? Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 48: 101–108. WABITSCH, M., JENSEN, P.B., BLUM, W.F., CHRISTOFFERSEN, C.T., ENGLARO, P., HEINZE, E., RASCHER, W., TELLER, W., TORNQVIST, H., HAUNER, H. (1996). Insulin and cortisol promote leptin production in cultured human fat cells. Diabetes, 45: 1435–1438. WANG, J., LIU, R., HAWKINS, M., BARZILAI, N., ROSSETTI, L. (1998a). A nutrient-sensing pathway regulates leptin gene expression in muscle and fat. Nature, 393: 684–688. WANG, T., HARTZELL, D.L., FLATT, W.P., MARTIN, R.J., BAILE, C.A. (1998b). Responses of lean and obese Zucker rats to centrally administered leptin. Physiol Behav, 65: 333-41. WANG, T., HARTZELL, D.L., ROSE, B.S., FLATT, W.P., HULSEY, M.G., MENON, N.K., MAKULA, R.A., BAILE, C.A. (1999). Metabolic responses to intracerebroventricular leptin and restricted feeding. Physiol Behav, 65: 839-48. WEAVER, C.T., UNANUE, E.R. (1990). The costimulatory function of antigen presenting cells. Immunol Today, 11: 49-54. WINER, B.J., DONALD, R.B., KENNETH, M.M. (1991). Statistical Principles in experimental Desing, Third Ed, A. Bradford Hill. London. WYNNE, K., STANLEY, S., MCGOWAN, B., BLOOM, S. (2005). Appetite control. J. Endocrinol., 184: 291–318. YOUINOU, P. (2007). B cell conducts the lymphocyte orchestra. J Autoimmun, 28: 143-51. ZAKIZEWSKA, K.E., CUSIN, I., SAINSBURY, A., ROHNER-JEANRENAUD, F., JEANRENAUD, B. (1997). Glucocorticoids as counterregulatory hormones of leptin: toward an understanding of leptin resistance. Diabetes, 46: 717–719. ZHANG, Y., PROENCA, R., MAFFEI, M., BARONE, M., LEOPOLD, L., FRIEDMAN, J.M. (1994). Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, 372: 425–432. ZHAO, Y., SUN, R., YOU, L., GAO, C., TIAN, Z. (2003). Expression of leptin receptors and response to leptin stimulation of human natural killer cell lines. Biochem Biophys Res Commun, 300: 247-52. 54 EKLER EK-1 55 ÖZGEÇMİŞ I- II- Bireysel Bilgiler Adı Aykut Göktürk Soyadı ÜNER Doğum yeri ve tarihi İzmir, 01.09.1977 Uyruğu Türkiye Cumhuriyeti Medeni durumu Evli Askerlik durumu Tecilli İletisim adresi ve telefonu [email protected], +905052560569 Eğitimi (tarih sırasına göre yeniden eskiye dogru) Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi 2001 III- IV- Manisa Lisesi 1994 Mehmetçik İlköğretim Okulu (Balıkesir) 1989 Yabancı dili İngilizce Ünvanları (tarih sırasına göre eskiden yeniye dogru) Veteriner Hekim 2001 Araştırma Görevlisi 2002 Mesleki Deneyimi 2001-2002 Serbest Veteriner Hekimlik 2002-2004 Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı’nda Araştırma Görevliliği 2004-2009 Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı’nda Araştırma Görevliliği ve Doktora Öğrenciliği V- Üye Oldugu Bilimsel Kuruluşlar - VI- Bilimsel İlgi Alanları Kongreler 1- Voyvoda H., Paşa S., Üner A.G. Aydında bir köpekte ilk klinik Hepatozoon canis enfeksiyonu, II. Ulusal Küçük Hayvan Hekimliği Kongresi, 10–13 Nisan 2003, Bursa. 2- II. Leptin Kongresi 8-10 Ekim 2004, Ankara (katılımcı). 56 3- Sulu N., Altınsaat Ç., Ergün A., Üner AG. Atlarda Fotoperiyodun Lenfosit Alt Tipleri Üzerine Etkileri, Türk Fizyolojik Bilimler Derneği 33. Ulusal Fizyoloji Kongresi, 15–19 Ekim 2007, Girne-Kıbrıs. 4- Çiğdem Altınsaat, Aykut Göktürk Üner, Nesrin Sulu, Ahmet Ergün Arap atlarında leptin, triiodotronin ve troksinin mevsimsel değişimleri, Türk Fizyolojik Bilimler Derneği 34. Ulusal Fizyoloji Kongresi, 6–10 Ekim 2008, Erzurum. 5- Çiğdem Altınsaat, Aykut Göktürk Üner, Nesrin Sulu, Ahmet Ergün Arap atlarinda serum melatonin, testosteron ve progesteron düzeylerinin mevsimsel değişimleri Türk Fizyolojik Bilimler Derneği 34. Ulusal Fizyoloji Kongresi, 6–10 Ekim 2008, Erzurum. Yayınları 1- Voyvoda H, Pasa S, Uner A. Clinical Hepatozoon canis infection in a dog in Turkey. J Small Anim Pract. 2004 Dec;45(12):613-617. 2- Cengiz Ünsal, Muharrem Balkaya, Hikmet Yılmaz, Aykut Göktürk Üner. The effects of paclitaxel on nerve conduction velocity and motor unit action potential in Spraque-Dawley rats. J Neurol Sci [Turk] 23:(3)# 8;159-165, 2006. 3- Çiğdem ALTINSAAT, Aykut Göktürk ÜNER, Nesrin SULU. Seasonal changes of serum leptin, triiodothyronine, and thyroxine levels in Arabian mares. Kafkas Üniv Vet Fak Derg, 14 (2): 217-222, 2008. 4- Çiğdem Altınsaat, Aykut Göktürk Üner, Nesrin Sulu, Ahmet Ergün. Seasonal variations in serum concentrations of melatonin, testosterone, and progesterone in Arabian horse. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 56, 19-24, 2009. 57 VII- Bilimsel Etkinlikleri Aldıgı burslar Ödüller: TUBİTAK yayın teşvik ödülü. Projeleri: 1- Balkaya M., Ünsal H., Metin K., Temoçin S., Üner A.G., Bakır B. Kalitatif ve kantitatif protein yetmezliklerinde endojen proteinlerin tekrar kullanımında nötrofillerin rolü. Bilimsel Araştırma Projeleri Kurulu, VTF2002/1, 15.12.2002, Aydın. 2- Sulu N., Altınsaat Ç., Ergün A., Üner AG. Atlarda leptinin koşu performansı, reprodüksiyon ve bağışıklık sistemi üzerine etkileri. TUBİTAK, TOVAG Araştırma Projesi, Proje no: 105 O 209, 2005-2007. 3- Sulu N., Üner A. Farelerde leptinin lenfosit alt tipleri üzerine in vivo etkileri. Ankara Üniversitesi Bilim İnsanı Yetiştirme Projesi, Proje no: 2005K-120140-8, 2005-2009, Ankara. Verdigi konferans ya da seminerler: 1- Gıda alımının kontrolü, obezite ve genler (seminer). 2- Kalıtsal kanama bozuklukları (seminer). Katıldıgı paneller (panelist olarak) - VIII- Diğer Bilgiler Egitim programı haricinde aldıgı kurslar ve katıldıgı egitim seminerleri Organizasyonunda katkıda bulundugu bilimsel toplantılar Diger üyelikleri -
