TANI ve İLAÇ DUYARLILIK TESTLERİNDE MOLEKÜLER
advertisement
21. Yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu ve II. Tüberküloz Laboratuvar Tanı Yöntemleri Kursu, Samsun TANI ve İLAÇ DUYARLILIK TESTLERİNDE MOLEKÜLER YÖNTEMLERİN DEĞERİ Y. Doç. Dr. Nuran Esen Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir Tüberküloz insanlık tarihi kadar eskilere kadar çoğaltılması esasına dayanmaktadır. dayanan bir infeksiyon hastalığı olmasına Geleneksel yöntemlere göre daha hızlı tanı rağmen konulmasını sağlamakla birlikte bu testlerin günümüzde korumaktadır. hala Geleneksel önemini yöntemler-le klinik örnekte tüberküloz varlığının laboratuvar tanısı zaman alıcı ve zahmetli saptanmasında altın standart olan direkt bakı olan mikobakteriyel enfeksiyonların erken ve tanı ve tedavilerinde güvenilir sonuçlar uygulanması veren laboratuvarda hızlı duyulmaktadır. giderek artan testlere Son gereksinim yıllarda moleküler kültür kombinasyonu ile önerilmektedir. kullanılmakta birlikte Bir olan çok in-house kullanımı PCR yönteminin duyarlılık ve özgüllükleri, yöntemler ekstraksiyon ve amplifiye ürün saptanmasında mikobakterilerin klinik örnekten tanısında, kullanılan tür ilaç değişmektedir. Noordhoek ve arkadaşları yedi direncinin belirlenmesinde ve epidemiyolojik laboratuvarda aynı örneklerden aynı primerler araştırmalarda kullanılmaktadır. Nükleik asit kullanılarak PCR yöntemiyle M. tuberculosis’in tabanlı araştırıldığı düzeyinde tanımlanmasında, yöntemlerin klinik tanıda farklı kör yöntemler çalışmada, nedeniyle duyarlılık ve kullanılabilmesi için standardize edilmeleri özgüllüklerin %2-90, yalancı pozitifliklerin ise gerekmekte, bir kısmı ise yüksek maliyet %3-77 oranında değiştiğini saptamışlardır. Bu ve/veya deneyimli personel gerektirmeleri nedenlerle nedeniyle kullanımları kısıtlanmaktadır. tanısının konulmasında standardize edilmiş 1. Klinik Örnekten Mycobacterium klinik örnekte M. tuberculosis testlere gereksinim artmış ve iki test Amerika Birleşik Devletlerinde, FDA (Gıda ve İlaç tuberculosis Tanısı: Yönetimi) tarafından onaylanmıştır. Bu testler Nüklek asit tabanlı (NAT) testler, diğer son bir yıl içinde tedavi almayan, direkt bakısı enfeksiyon gibi pozitif olguların solunum yolu örneklerinde ve asit M. etkenlerinde mikobakterilerde olduğu de özgül nükleik dizisinin, saptanabilecek düzeye gelinceye 402 tuberculosis ayrımının yapılabildiği merkezlerde, kültür ile birlikte yapılması koşulu Tanı Ve İlaç Duyarlılık Testlerinde Moleküler Yöntemlerin Değeri ile FDA onayı almıştır. Bunlardan PCR yılında tüberkülozda nükleik asit amplifikasyon tabanlı Amplicor (Roche) testinde internal testlerinin kullanımıyla ilgili güncelleştirilen kontrol yazıda direkt bakıda ARB ve moleküler bulunmakta, AmpErase (UNG) 3 yalancı pozitifliği (10 amplikon/reaksiyon) engellemektedir. Amplikor saptanabilecek testinde minimal konsantrasyonunun mikobakteri yöntemler için bir algoritma geliştirilmiştir. 1- Direkt bakıda ARB ve kültür için üç ayrı gün balgam örneği alınır. belirlenebilmesi amacıyla Yajko ve arkadaşları klinik balgam 2- A. Hastanın ilk örneğinde ARB ve NAT testleri pozitif ise hastanın tüberküloz örneklerinin seri dilüsyonlarını hazırlayarak olduğu düşünülerek başka örnekte NAT kantitatif kültür yapmış ve bu dilüsyonlardan Amplicor testi çalışmışlardır. testi yapılmaz. Amplikor testinin, dekontamine edilmiş 50µL balgam 2- B. ARB pozitif, NAT negatif ise örneğinde 42 CFU (koloni oluşturan ünite) inhibitörlerin varlığının araştırılması için veya amplikor testi uygulanır. üzerinde M. tuberculosis’i saptayabildiğini belirlemişlerdir. a. İnhibitörler belirlenmezse, örnek FDA onaylı diğer test ise izotermal bir sayısı üçü aşmayacak şekilde diğer örneklerde amplifikasyon NAT test tekrarlanır. Tekrar ARB pozitif, NAT yöntemi olan MTD, (Mycobacterium tuberculosis direct test) negatif (Gen-Probe) TMA (transcription mediated mikobakteriler düşünülür. amplification- transkripsiyon aracılı çoğaltma) tabanlı bir testtir. Bu yöntemde çoğaltılan hedef nükleik asit ribozomal RNA (rRNA) olduğundan canlı M. tuberculosis basillerini saptamaktadır. Bu test, bulunursa tüberküloz dışı b. İnhibitör belirlenirse bu örnekte NAT testlerin tanısal değeri yoktur. Örnek sayısı üçü aşmayacak şekilde diğer örneklerde NAT test çalışılır. c. Amplicor’dan farklı olarak sadece direkt ARB negatif, MTD pozitif ise negatif örnek sayısı üçü aşmayacak şekilde diğer örneklerde de FDA onayı almıştır. Direkt örnekler MTD ile test edilir. Tekrarlar da pozitif bakıda ARB pozitifliği ile birlikte bu testlerin ise hastada tüberküloz düşünülür bakı pozitif pozitif örneklerde bulunması değil, tanısını d. ARB ve MTD negatif ise bir desteklerken, her iki test sonucunun negatif örnek daha MTD ile test edilir. Eğer tüm olması ise kültürde M. tuberculosis üreme örneklerde ARB ve MTD negatif bulunmuşsa olasılığından uzaklaşılmaktadır. Direkt bakı infeksiyonu olmadığı düşünülebilir fakat klinik ve değerlendirme çok önemlidir. NAT testlerin moleküler tüberküloz yöntemlerin birbirlerini desteklemesi klinik tanıyı kolaylaştırırken, negatif sonuçların farklı olması durumunda, klinik ekarte ettirmez. tabloya göre tanı konulmakta veya testin tekrarlanması gerekmektedir. MMWR’da, (Mortality and morbidity weekly report) 2000 olması aktif tüberküloz olasılığını 3. İlk NAT test ve tekrarları uyumsuz ise klinik olarak tanı önemlidir. 4. Son olarak hastanın tedaviye yanıtı ve 403 Nuran Esen kültür sonuçları tüberküloz desteklenmesinde veya tanısının reddedilmesinde (Abbott LCx M.tuberculosis) yöntemlerinin ticari formları bulunmaktadır. İzotermal olan SDA yönteminde, restriksiyon kullanılır. Bu reaksiyonu) testlerin solunum yolu dışındaki örneklerde FDA onaylarının olmamasına ve standardize edilmemelerine rağmen çeşitli klinik örneklerle yapılmış olan araştırmalar bulunmaktadır. Her iki testin de solunum yolu dışındaki örneklerde performansları değişmekte, bazı çalışmalarda solunum yolu örneklerinde olduğu kadar yüksek, bazılarında ise düşük bulunmuştur. enzimi ile kesilen kalıp DNA, Escherichia coli DNA polimeraz I’in kesim noktasından başlayarak bir zinciri ayırıp diğeri üzerinde DNA sentezi yapabilme özelliğine dayanmaktadır. Amplikor ve TMA’dan farklı olarak bu testte 16SrRNA hem IS6110, çoğaltıldığından hem de M.tuberculosis kompleks varlığını ve bazı mikobakteri türlerini belirleyebilmektedir. Gamboa ve arkadaşlarının çalışmasında, LCR kan ve kemik iliği aspiratlarının, protein ve konmasında enzimleri kullanıldığı prob hibridizasyon bazlı nükleik denatüre eden ve örnekte bulunan pek çok inhibitör maddeyi elimine eden SDS-NaOH ile işlemlenmesinin optimal koşullarda M. tuberculosis’in sıvı ve ise enfeksiyon ısıya ajanının dayanıklı ortaya DNA ligazın asit çoğaltma yöntemidir. 2. Mikobakterilerin Tür Düzeyinde Tanımlanması katı besiyerlerinde üremesini engellemediği vurgulanmıştır. Lang ve arkadaşlarının MTD ile beyin omurilik sıvısında (BOS) M. tuberculosis’in araştırıldığı çalışmalarında, üretici firmanın önerilerinden farklı olarak örneklerin sodyum dodesil sülfat (SDS)NaOH ile denatüre edilmesi, 10 kat fazla (50 L yerine 500 L) konulması ve cut-off değerinin 30.000 RLU’dan 11.000 RLU’ya indirilmesi ile duyarlılık %83, özgüllük %100, PPD %100, NPD %94 bulunmuştur. Baran ve arkadaşları benzer olarak Amplikor ile BOS’da M. tuberculosis’in araştırıldığı çalışmalarında örneğin 10 kat fazla (100µL yerine 1000µL) konulmasının duyarlılığı arttırdığını bildirmişlerdir. DNA Dizi Analizi, saptanmasında rağmen altın manuel zorluklar PCR florokrom ürünlerinin sekanslama basamakları gerektirir. yatırım işleminden saflaştırılması, didioksi uygulanması DNA ve Amplifikasyon elektroforez teknik Otomatik pahalı işaretli reaksiyonu, olmasına uygulanmalarında ise gerektirmektedir. sonra standart bulunmaktadır. sekanslama mutasyonların ve sekanslama ürünlerine analiz Radyoaktif gibi madde, kemilüminesans veya florometrik maddelerle işaretleme yapılmaktadır. DNA dizi analiziyle, mikobakterilerde tür tayini ve ilaç direncini belirleyen mutasyonlar gibi filogenetik bilgilere ulaşılabilmektedir. Oldukça hızlı ve kesin FDA onayı olan bu testler dışında SDA (strand displacement amplification - zincir ayırma çoğaltması) (BDProbeTec) ve LCR (Ligase Chain Reaction - Ligaz zincir 404 sonuçlar vermesine rağmen pahalı ve zahmetli bir yöntem olduğundan rutin olarak değil araştırma amacıyla kullanılmaktadır. Tüm mikobakteri türlerinin sahip olduğu 65 kDa’luk Tanı Ve İlaç Duyarlılık Testlerinde Moleküler Yöntemlerin Değeri ısı şok proteinin (hsp65) kodladığı gen türlerin tanımlanmasında biyokimyasal testlere bölgesi, türe özgül allelik varyasyonlarla gereksinimi ortadan kaldırmaktadır. Bu DNA mikobakteri problarının türlerinin ayrımında en büyük dezavantajı; her kullanılmaktadır. hsp65 ve 16SrRNA gen seferinde sadece bir mikobakteri türünün test bölgelerinin kullanıldığı dizi analizlerinde edilmesi nedeniyle maliyetinin artmasıdır. Son M.tuberculosis kompleks üyelerinin genetik yıllarda ters hibridizasyon yöntemi olan LiPA benzerliği (Line nedeniyle ayırım mümkün Mikobakterilerin kısa sürede tiplendirilmesi geliştirilen (Restriksiyon PRA enzim enzimleriyle [PCR-REA analizi)] kodlayan hsp65’i genin, yöntemi, restriksiyon kesilmesi temeline dayanmaktadır. Elde edilen paternlerin tür saptama cetveline göre analiz edildiği bu yöntem hibridizasyon basamakları ve asit hedef DNA hibridizasyon dizisi yönteminde, komplementeri olan işaretli prob ile hibridlenmekte ve tanı konmaktadır. Özgüllükleri yüksek fakat duyarlılıkları düşük olan bu yöntemde prob olarak kullanılan moleküllerin örneğe yeterince bağlanması için nükleik asitlerin yeterli miktarda bulunması gerektiğinden özellikle kültürde üreyen mikobakterilerin tanı ve tiplendirmesinde kullanılmaktadır. Otomatize ve yarı otomatize kültür sistemlerinin geliştirilmesi ile daha kısa sürede üretilen mikobakteriler, 1980’li yıllardan beri kullanılmakta olan Accuprobe yöntemi ile doğrulanabilmektedir. erken dönemde M.tuberculosis kompleksi, M.avium kompleksi, M. avium, M. intracellulare, çoğaltıldıktan ile mikobakterilerin yapılabilmektedir. sonra hedef PCR DNA ile dizisi komplementeri olan membran üzerinde yerleştirilmiş olan işaretli problarla hibridizasyona sokularak tek çalışma ile; Mycobacterium sp, M. tuberculosis kompleks, M. kansasii, M. xenopi, M. gordonae, M. avium kompleks, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum ve M. chelonae - abscessus kompleks olarak tanımlanabilmektedir. radyoaktivite içermemektedir. Nükleik Assay) identifikasyonu olmamaktadır. amacıyla probe M.kansasii ve M.gordonae’den oluşan sınırlı sayıda tür için mevcut olan DNA probları, klinik laboratuvarlarda sıklıkla izole edilen bu 3. Mikobakterilerde İlaç Direncinin Belirlenmesi: 1980’li yıllardan itibaren tüm dünyada tüberküloz olgularının artışı ilaç direnci ile birlikte gözlenmiştir. geleneksel İlaç yöntemlerle dirençlerinin saptanması, izolasyonda olduğu gibi zahmetli ve zaman alıcıdır. Moleküler yöntemlerle, dirençten sorumlu mutasyonların gösterilmesi direnci kanıtlarken, dirençli olduğu saptanan fakat mutasyonların gösterilemediği olgular, dirençte başka gen bölge mutasyonları veya başka mekanizmalar olabileceğini düşündürmektedir. Rifampisine dirençli mutasyonlar; genellikle, rpo ’nın 81 bazçiftlik gen bölgesinde nokta mutasyon delesyon ve insersiyonların olduğu gözlenmiş ve bu bölge RRDR (rifampin resistance determining region - rifampisin direncini belirleyen adlandırılmıştır. kullanılan ilk bölge) Tüberküloz basamak olarak tedavisinde ilaçlardan olması, 405 Nuran Esen saptanabilirliği dizisine göre kıvrılmalar nedeniyle özgül yapı nedeniyle araştırmalar ve klinik kullanımda oluşturur. Elektroforez sırasında zincirin özgül diğer yapısı moleküler yöntemlerle antitüberküloz ilaçlardan çok jel gözeneklerinden geçiş hızını belirlenmesine etkilemesi nedeniyle, hastadan elde edilen çalışılmaktadır. Ayrıca rifampisine dirençli izolatın ilaca duyarlı kontrol kökenden farklı izolatların %90’dan fazlasında izoniazid sonuç vermesi o gende mutasyon olduğunu direnci de birlikte bulunduğundan MDRTB göstermektedir. (multi-drug resistant tuberculosis) için bir elektoforez jelinde görülebilmesi için genellikle gösterge düşünülmektedir. radyoaktif bir madde ile işaretleme gereksinim, Drobniewski ve arkadaşları ARB pozitif deneyim gerektirmesi ve uygulama zorlukları örneklerin referans merkeze gönderilerek nedeniyle günlük kullanıma girememiştir. rifampisin direncinin olduğu moleküler yöntemlerle varlığının araştırılması M.tuberculosis ve ardından rifampisin direncinin belirlenmesinin hasta maliyetini düşürdüğünü, MDRTB tanısının erken dönemde konulmasının HIV pozitif olgularda bile yaşam süresini uzattığını bildirmişlerdir. Tek zincirli DNA’nın Heterodupleks analizinde, ilaç direncine neden olan gen bölgesi, hem hastadan izole edilen basilden, hem de ilaca duyarlı olduğu bilinen bir kontrol suşundan PCR ile çoğaltıldıktan o sonra bir tüpte karıştırılıp, önce 95 C’ye kadar ısıtılarak DNA zincirlerinin birbirinden ayrılması, daha sonra oda sıcaklığına dek Direncin belirlenmesinde DNA dizi analizi, soğutularak SSCP conformation birleşmesi sağlanır. Farklı bakteriden geldiği polymorphism-tek zincir biçim çeşitliliği), halde uygunluk gösteren tek zincirler de bir heterodupleks analiz, ters hibridizasyon araya yöntemi (Inno-Lipa, Innogenetics), FRET Eşleşme (fluorescence resonance energy transfer - suşlarda heterodupleksler arasında mutasyon floresans rezonanslı enerji aktarımı) gibi noktasında birleşmenin olmaması nedeniyle moleküler çift (single strand yöntemler kullanılmaktadır. zincirlerin gelerek duyarlı sarmal yeniden eşleşerek heterodupleksler oluşur. bir dirençli yapı suşta bozulur tam, ve zincirdeki Kullanılmakta olan yöntemlerin avantaj ve bükülmeler elektroforez sırasında molekülün dezavantajları bulunmaktadır. mutasyon bulunmayan DNA’dan farklı hızda DNA dizi analizi ile ilaç direncine neden olan mutasyon, delesyon ve insersiyonların saptanması duyarlılığında antimikobakteriyel moleküler altın ilaç standart yürümesine neden olur. Çift zincirlerin etidyum bromür hemen kullanımını kısıtlamaktadır. direncini zincirli DNA, ısı ile denatüre edildiğinde elde edilen tek zincirler içerdikleri nükleotid 406 UV transluminatörde olması rutinde kullanılmaya uygun olmasını sağlamıştır. Ters direncinden sorumlu gen bölgesindeki çift boyanıp gözlenebilir olarak kabul edilmektedir. Yüksek maliyet SSCP yönteminde, PCR ile çoğaltılan ilaç ile Hibridizasyon saptamaya bulunmaktadır. Yönteminin yönelik Nitrosellüloz rifampisin ticari formu membran üzerinde dirençten sorumlu gen bölgesine ait duyarlı ve mutant dizileri içeren problar bulunmaktadır. PCR ile çoğaltıldıktan sonra Tanı Ve İlaç Duyarlılık Testlerinde Moleküler Yöntemlerin Değeri dirençten sorumlu gen bölgelerine ait DNA değişken sayıda tekrarları) gibi yöntemlerin molekülleri bu problar ile hibridizasyona geliştirilmesi ile hız kazanmıştır. sokulduğunda mutant dizilere bağlanırsa dirençli olarak yorumlanır. FRET yönteminde, Kromozomal DNA’nın bölgelerinden PCR sırasında IS6110 restriksiyon tekrar enzimleriyle kesilerek oluşan değişik uzunluktaki parçaların çoğaltılmış DNA molekülüne bağlanan biri agaroz 3’ diğeri 5’ ucu floresans ile işaretli ve çok sonra DNA bantlarının membrana aktarılarak yakın yerleşimli iki DNA prob arasında hibridizasyon enerji aktarımı ile başlangıçta en yüksek IS6110 miktarda floresans izlenirken, tüplerin yavaş kompleks yavaş ısıtılması ile floresansın azaldığı bulunan erime noktaları saptanır. Probun bağlandığı uluslararası standardize edilmiş DNA parmak bölgede gevşek izi protokolunun geliştirilmesini sağlayarak ısısının klinik izolatların genotiplerinin belirlenmesinde düşmesine neden olmaktadır. Bu yöntem kullanılmaktadır. Yaygın olarak kullanılmakla ilaç dirençlerini belirleyen mutasyonların beraber bu yöntemin belirlenmesinde, kopya mutasyon bağlanmaya ve varlığı, erime nokta klinik mikobakterilerin örneklerdeki saptanmasında düzeyinde ve tür tanımlamalarda kullanılmaktadır. jel elektroforezinde yapılması REA esasına yöntemi ile izolatlarının IS6110’un sayısının yürütüldükten dayanan M.tuberculosis kromozomlarında tekrarlanma özelliği, ayırıcı gücü IS6110 beşin üzerinde olduğu izolatlarda yüksek iken, beş ve altındaki M.tuberculosis kompleks tanımlanmasında yetersiz izolatlarının kalmakta bu nedenle epidemiyolojik çalışmalarda başka bir 4. Mikobakterilerde Epidemiyolojik yöntemle Araştırmalar birlikte çalışılmasını gerektirmektedir. Moleküler yöntemlerin ile Üzerinde PGRS (polimorfik GC’den zengin özellikle bölge - polimorfik GC rich sequence) taşıyan kaynağın belirlenmesi, rekombinant bir plazmit olan pTBN12, E.coli reenfeksiyon-reaktivasyon ayrımının DH5 'dan izole edilip çeşitli enzimler ile epidemiyolojik salgınlarda geliştirilmesi araştırmalar, yapılabilmesi, iyatrojenik enfeksiyonların ve kesildikten laboratuvar kullanılmaktadır. Bu prob her genom üzerinde tanımlanması Önceleri kontaminasyonlarının mümkün IS6110 REA olabilmektedir. ve/veya PGRS (polimorfik GC rich sequence - polimorfik GC’den zengin bölge) yöntemleriyle yapılan araştırmalar, son yıllarda spoligotyping (spacer oligonucleotide typing) ve MIRUVNTR (variable number tandem repeats of mycobacterial interspersed repetitive units Mikobakterilerdeki tekrarlayan ünitelerin yaklaşık sonra 30 hibridizasyona kez saflaştırılıp prob tekrarlayan girmekte ve olarak PGRS ile epidemiyolojik çalışmalarda kullanılmaktadır. PCR bazlı spoligotyping yönteminde direkt tekrarlayan kromozomal amplifikasyonu M.tuberculosis ayrımında bölgelerin hedeflenmekte kompleks kullanılmaktadır. ve izolatlarının PCR sonrası ortalama 36 baz çiftlik amplifiye ürünlerin 43 407 Nuran Esen ile IS6110 tekrarlarından bağımsız olan PGRS, hibridize edilmesi ile farklı epidemiyolojik spoligotyping ve MIRU-VNTR yöntemlerinin kökenli izolatlarda bölgeler ve sayılarda IS6110 tekrar sayısının beş ve altında olduğu değişiklik izolatlarda set oligonükleotit içeren membran görülmektedir. Geleneksel yöntemlerle zor olan M. tuberculosis, M. ayırıcı yüksektir. gücü IS6110 MIRU-VNTR REA’den yönteminin ile uygulanmasıyla IS6110 kopya sayısının düşük klinik olduğu M. tuberculosis kompleks izolatlarında örneklerden soyutlanan M. tuberculosis olduğu gibi sayının yüksek olduğu izolatlarda izolatlardan başka parafin bloklarda ve da arkeolojik çalışmalarda izolatlar ayrımı bovis spoligotyping yapılabilmektedir. Bu örneklerde yöntem de denenmiş ve grup çeşitliliği artmaktadır. Yapılan arasındaki farklılığın başarılı sonuçlar alınmıştır. En az 20 kez belirlenmesinde tek yöntem kullanımı değil, tekrar kullanılabilen yöntemlerin örnek birlikte Değerlendirilmesi membranlarda 43 çalışılabilmektedir. ve uygulaması kolay Son yıllarda geliştirilen PCR bazlı moleküler MIRU-VNTR’de her izolat, genomda dağılmış bulunan 12 bağımsız önerilmektedir. Cowan ve arkadaşlarının çalışmasında tüm örneklere IS6110 REA, spoligotyping ve MIRU uygulanmış; nispeten ekonomik bir yöntemdir. yöntemolan kombinasyonu tek başına IS6110 58, spoligotyping 59, MIRU ise 80 ayrı pattern gösterirken, üç yöntemin birlikte kullanılması ile bu değer 112’ye ulaşmıştır. kopya DNA Chip teknolojisi, DNA molekülündeki sayıları ile tiplendirilmektedir. Elliiki ile 77 farklı nükleik asitlerin katı faz üzerinde belirli nükleotit uzunluğunda olan bir ünitelerin sayıları tüm bölgedeki tekrarlayan ünitelerin tekrarlayan bölgelerin düzende yerleştirilmiş oligonükleotitlere bağlanması ile dayanmaktadır. sinyal çoğaltılması ile elde edilen ürün büyüklüğü oluşumu ile belirlenmektedir. Hızlı sonuç vermesi, düşük, kullanımı basit, değerlendirmesi kolay fazla miktarda DNA gerektirmemesi, canlı ve gelecek vadeden bu yöntem önceleri olmayan örneklerde uygulanabilmesi bu sadece gen ekspresyonu ve genomik içeriğin yöntemin avantajlarındandır. Bu yöntem, incelenmesinde IS6110 REA’nden daha hızlı olmasına M.tuberculosis’de IS6110 kopya sayısının ve rağmen uygulanması spoligotyping kadar rifampisin basit değildir kullanılmaya başlanmıştır. 408 esasına bulunan kullanılırken, direncinin son Maliyeti yıllarda belirlenmesinde de Nuran Esen KAYNAKLAR: 1. American Thoracic Society pTBN12-fingerprinting, Workshop, 8. mycobacterial strains isolated from clinical 14. specimens to the species level by polymerase chain Baran Jr J, Riederer KM, Khatib R. Limits of spiked cerebrospinal fluid using the Scand J Infect Dis 2000;32:657-62. 9. Fluit C, Visser MR, Schmitz J, Molecular Microbiol Rev 2001;14:836-871. 10. Gamboa F, Manterola JM, Lonca J et al. Barlow RE, Gascoyne-Binzi DM, Gillespie Detection and identification of mycobacteria by SH. Comparison of variable number tandem amplification of RNA and DNA pretreated blood repeat and bone marrow aspirates by a simple lysis and IS6110-restriction polymorphism IS6110 fragment analyses for Mycobacterium tuberculosis isolates. J Clin Microbiol 2001;39(7):2453-7 method. J Clin Microbiol 1997;35:2124-8. 11. Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A et al. Simultaneous detection for Crawford Microbiol 1997;35:907-14. JT: Variable-number tandem isolates with low copy numbers of IS6110 by using repetitive mycobacterial units, J interspersed Clin Microbiol 2002;40:1592-602. Dale JW, Al-Ghusein H, Al-Hashmi S et al. Mycobacterium tuberculosis with few copies of IS6110. J Bacteriol. 2003;185: 2555-62. Drobniewski FA, Watterson SA, Wilson SM, Harris GS. A clinical, microbiological and economic analysis of a national service for rapid molecular diagnosis of tuberculosis and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J Med Microbiol. 2000; 49: 271-8 Durmaz R: strain diagnosis and epidemiology. J Clin 12. Kivi M, Liu X, Raychaudhuri S, Altman RB, Small PM: Determining the genomic locations of repetitive DNA sequences with a wholegenome microarray: IS6110 in Mycobacterium tuberculosis, J Clin Microbiol 2002;40:2192-8. Evolutionary relationship among strains of the and differentiation of Mycobacterium tuberculosis Cowan LS, Mosher L, Diem L, Massey JP, repeat typing of Mycobacterium tuberculosis 7. analysis, meningitis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. discrimination of high-and low-copy-number 6. enzyme Detection of Antimicrobial Resistance. Clin length 5. reaction-restriction polymerase chain reaction in tuberculosis 2000;1:47-50. 4. Ergin A, Kocagoz T, Us D: Evaluation of 120 Am J Respir Crit Care Med 1997;155:1804- detection of Mycobacterium tuberculosis in 3. (ed): Kitabevleri, İstanbul. 2001:181-190. Association: Rapid diagnostic tests for 2. R Uygulamalı Moleküler Mikrobiyoloji; Nobel Tıp Medical Section of the American Lung tuberculosis. What is the appropriate use? Durmaz 13. Kocagöz T. Mycobacterium tuberculosis için uygulanan fenotipik ve genotipik direnç testleri. 4. Ulusal Mikobakteri Simpozyumu Kitabı. 2002;115-24. 14. Lang AM, Feris-Iglesias J, Pena C et al. Clinical evaluation of the Gen-Probe amplified direct test for detection of Mycobacterium tuberculosis complex cerebrospinal fluid. organisms J Clin in Microbiol 2000;36:2191-4. 15. Mijs W, De Vreese K, Devos A et al. Evaluation Mycobacterium tuberculosis suşlarının genotiplendirilmesi: IS6110 ve of a commercial line probe assay for identification of Mycobacterium species from 2 Nuran Esen liquid and solid culture. Eur J Clin Microbiol resistance Infect Dis. 2002;21:794-802. 1998 update, Tuber Lung Dis 1998;79:3-29. 16. Mikhailovich V, Lapa S, Gryadunov D et al: Identification of in Mycobacterium tuberculosis: 21. Telenti A, Marchesi F, Balz M et al. Rapid rifampin-resistant identification of mycobacteria to the species strains by level by polymerase chain reaction and hybridization, PCR, and ligase detection restriction enzyme analysis. J Clin Microbiol reaction on oligonucleotide microchips, J 1993;31:175-8. Mycobacterium tuberculosis Clin Microbiol. 2001;39:2531-40. 22. Torres MJ, Criado A, Palomares JC, Aznar J: 17. Noordhoek GT, Kolk AH, Bjune G ve ark. Use of real-time PCR and fluorimetry for rapid Sensitivity and specificity of PCR for detection of rifampin and isoniazid resistance- detection of Mycobacterium tuberculosis: a associated blind tuberculosis, J Clin Microbiol 2000;38:3194-9. comparison study among seven laboratories. J Clin Microbiol. 1994;32:27784. mutations in Mycobacterium 23. Woods G. Molecular methods in the detection and identification of mycobacterial infections. 18. Notice to readers: Update: Nucleic Acid Amplification Tests For Tuberculosis. MMWR Weekly.2000; 49:593-4 Arch Pathol Lab Med 1999;123:1002-1005. 24. Yajko DM, Wagner C, Tevere VJ, Kocagoz T et al. Quantitative culture of Mycobacterium 19. Pai S, Esen N, Pan X, Musser JM: Routine tuberculosis from clinical sputum specimens rapid Mycobacterium species assignment and dilution endpoint of its detection by the based on species-specific allelic variaton in Amplicor the 1995;33:1944. 65-kilodalton (hsp65), Arch heat Pathol shock Lab protein Med 1997;121:859-64. 20. Ramaswamy S, Musser JM: Molecular genetic 2 basis of antimicrobial agent PCR assay. J Clin Microbiol
