21. Yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu ve II. Tüberküloz Laboratuvar Tanı Yöntemleri Kursu, Samsun TÜBERKÜLOZ TANISINDA TÜBERKÜLOZ LABORATUVARININ ROLÜ : TANI VE İLAÇ DUYARLILIK TESTLERİNDE RUTİN LABORATUVAR YÖNTEMLERİNİN DEĞERİ Y. Doç. Dr. Cüneyt Özakın, Prof. Dr. Suna Gedikoğlu Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları Anabilim Dalı, Bursa Yirminci yüzyılda tüberküloz ile savaşta aşama laboratuarlar, hasta örneklerinde oldukça önemli mesafeler alınmış olmasına sadece mikroskopik inceleme ile asit ve karşın, dünyamızda hala her yıl 2 ila 3 alkaliye dirençli bakteri (ARB) varlığını milyon yaşamını araştırmaktan sorumlu iken, 2. aşama yitirmektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık laboratuvarlarda bu işleme kültür ve M üçte biri Mycobacterium tuberculosis ile tuberculosis enfekte kabul edilmektedir. mikobakterilerden ayırt edilmesi eklenmiştir. Tüberkülozdan korunmanın en etkin yolu En hastalığın tedavi düşünülmüş olan 3. aşama laboratuvarlar edilmesidir. Tüberkülozun ön tanısı klinik ise diğer laboratuarların işlemlerine ek verilere dayanmakla birlikte, kesin tanı olarak, M tuberculosis complex dışındaki laboratuvar mikobakterilerin insan bu erken hastalıktan tanınması yöntemlerle ve konulmaktadır. üst complex’in düzey identifikasyonu örneklerinde gösterilmesi ve izolasyonu ile duyarlılıklarının sağlanır. görevlendirilmiştir. tanı, Etkenin tanısı etkenin izolasyonu yanında hastalığın epidemiyolojik laboratuvar tür hasta Laboratuvar diğer ve olarak düzeyinde tüberküloz ilaçlarına çalışılması Ülkemiz değerlendirildiğinde, bu DSÖ’nün ile açıdan önerdiği değerlendirmeye ve etkenin duyarlılığının laboratuvar derecelendirmesine benzer bir belirlenmesine de olanak sağlamaktadır. yapılanmanın, Duyarlılığın Savaşı belirlenmesi yönlendirilmesi de açısından tedavinin oldukça Daire Bakanlığı Verem Başkanlığına bağlı laboratuvarlarda mevcut olduğunu, birçok Üniversite hastanesi, özellikle eğitim veren önemlidir. Tüberkülozun Sağlık tanısı laboratuvarlarının için rutin yapılanması çalışan Dünya bazı Devlet ihtisaslaşmış Sağlık Örgütü (DSÖ) tarafından belirlenmiş laboratuvar olup, bu 3 aşamadan oluşmaktadır. Birinci söyleyebiliriz. ve SSK hastaneleri hastanelerin hizmeti 3. ile aşama verdiklerini Cüneyt Özakın, Suna Gedikoğlu. Tüberküloz tanısı için tüberküloz Direkt preparat hazırlama aşaması, aerosol yapılan oluşturan bir işlem olması nedeniyle çalışan işlemler; direkt mikroskopik inceleme, kültür personel ve çevreyi korumak için güvenlik ve sonrasında identifikasyon ile primer kabini tüberküloz ilaçlarına duyarlılık testleridir. preparat Direkt Mikroskopik İnceleme: işleminden Mikroskop ile hasta örneğindeki tüberküloz kalabileceği unutulmamalıdır. EZN boyama basillerinin yönteminin laboratuvarlarında rutin olarak saptanması, tüberküloz içinde yapılmalıdır. 65-75°C’da sonra her Hazırlanan kurutulmalı, da hafta tespit basilin pozitif canlı bir suş, hastalığının tanısını koymak için en hızlı, en florokrom boya yönteminin ise her hafta ucuz ve pratik bir yöntemdir. Tüberküloz pozitif ve negatif suşlar ile çalışılarak kalite basilinin ikiye bölünme süresi ortalama 18 kontrolü yapılmalıdır. saat olduğundan, kültür ile üretilerek izole edilmesi uzun zaman almaktadır. Bu nedenle de tüberküloz için mikroskopik tanı Kültür Yöntemleri: günümüze kadar korumuştur. Tüberküloz tanısı için laboratuvara oldukça Hasta örneklerinden hazırlanan değişik özelliklere sahip klinik örnekler önemini preparatlara, değişik boyama yöntemleri gelmektedir. uygulanmakta ile örnekler olup bu örnekler sadece santrifüj değerlendirilmektedir. En yaygın kullanılan edildikten sonra oluşan çökelti uygun kültür boyama yöntemi asit fast boya yöntemi olan ortamlarına aktarılır. Steril olmayan örnekler Erlich-Ziehl öncelikle ve Neelsen mikroskop (EZN) boyama Örneklerin bazıları homojenizasyon steril ve yöntemidir. EZN ile boynamış bir preparatta dekontaminasyon en az 300 mikroskop sahası tarandıktan geçirilerek (tercihen N asetil L-sistein ve sonra negatif olduğuna karar verilmelidir. NaOH ile) yine bakterinin yoğunlaşmasını 300 mikroskop alanında saptanan 1-2 basil sağlamak amacı ile soğutmalı santrifüjde şüpheli olarak değerlendirilirken 100 alanda 3000g’de 20 dakika çöktürme yapılarak, 1-9 basil görülmesi (+), 10 alanda 1-9 basil oluşan çökelti mikobakterinin izolasyonu görülmesi basil sağlanmak için uygun kültür ortamlarına görülmesi (+++) olarak değerlendirilirken aktarılır. DSÖ, mikobakterilerin izolasyonu her alanda 10’dan fazla basilin görülmesi amacıyla sıvı ve katı özellikte iki ayrı (++++) tüberküloz (++), olarak her alanda 1-9 yorumlanmalıdır. Bol besi aşamalarından yerinin beraber basilin kullanılmasını önermektedir. Bu uygulama incelenmesine olanak sağlayan, bu nedenle ile mikobakteri izolasyon oranlarını artırmak örnekte az sayıda bulunan bakterinin bile hedeflenmektedir. saptanabildiği, değerlendirmenin daha hızlı Konvansiyonel ve kolay olarak yapılabildiği diğer bir izolasyonu amaçıyla kullanılan besiyerleri boyama yöntemi, florokrom boya (Auramin) özelliklerine yöntemidir. Auramin boyama yöntemi ile olarak pozitif saptanan örneklerin EZN boyama Middlebrook 7H9 ve Dubos Tween albumin yöntemi ile teyit edilmesi önerilmektedir. sıvı besiyeri örnek verilebilir. Katı özellikteki miktarda 398 hasta örneğinde olarak mikobakteri göre sıvı ve katı besiyerleri ayrılabilir. Sıvı besiyerlerine, Tüberküloz Tanısında Tüberküloz Laboratuvarının Rolü : Tanı ve İlaç Duyarlılık Testlerinde Rutin Laboratuvar Yöntemlerinin Değeri besiyerleri de, yumurta bazlı ve agar bazlı (floresan esaslı sistem), BACTEC 9000 MB besiyerleri olmak üzere ikiye ayrılabilir. Sistemi Yumurta bazlı besiyerleri bütün yumurta BacT/ALERT veya yumurta sarısı, patates unu, tuz ve (kolorimetrik esaslı sistem), Dio-TK Scan gliserol Kültür Sistemi (katı özellikte kolorimetrik içermektedir. Yumurta bazlı (flouresans MB esaslı sistem), (MB/BacT) Sistemi besiyerlerine, Löwenstein-Jensen besiyeri, esaslı sistem) dir. Petragnani besiyeri ve American Trudeau Yapılan Society besiyeri, agar bazlı besiyerlerine ise konvansiyonel yöntem ile 24.1 gün gibi bir Middlebrook 7H10 ve Middlebrook 7H11 sürede M tuberculosis’in %79’u örnek olarak verilebilir. edilebilirken, BACTEC 460 TB ile bu süre Günümüzde; tüberküloz basilinin daha hızlı ortalama 15.2 gün, BACTEC MGIT 960 ile üremesini ve üremenin erken dönemde ise ortalama 14.4 güne kadar kısalmaktadır. tespit edilmesini sağlamayı amaçlayan, Konvansiyonel solid besiyerleri ile BACTEC ‘hızlı 460 TB’nin birlikte kullanılması ile izolasyon sonuç veren mikobakteri kültür sistemleri’ laboratuvarlarının rutinleri oranları çalışmalar %97 göstermektedir düzeylerine ki, izole çıktığı ifade izole ettiği arasına girmiştir. Bu sistemlerde kullanılan edilmektedir. besi yerlerinin içerikleri oldukça zengindir İdentifikasyon : ve mikobakterilerin üreme şansını artırmak Tüberküloz amaçlanmaktadır. mikobakterinin, M tuberculosis complex (M Sistemlerin bir diğer laboratuvarı amacı, gerçekleşen mikobakteri üremesini tuberculosis, erken dönemde saptamaktır. Bu değişik Mycobacterium africanum, Mycobacterium mekanizmalar microti ve Mycobacterium cannetti) mi ve indikatörler ile kültür otomatize bovis, yoksa MOTT (Mycobacteria other than M sağlanmaktadır. Hızlı Mycobacterium sistemleri sistemler manuel veya veya radyometrik, tuberculosis) mi olduğunu rutin ayırabilmelidir. Bu amaçla kord olarak faktör floresan, kolorimetrik olarak gruplanabilir. oluşumu, MacConkey agarda, kanlı agarda Bilgisayar süregen üreme testi, NAP (p-nitro-α-acetylamino-β- değerlendirme yapan gelişmiş otomatize hydro-xypropiophenone) testi gibi testler kültür sistemlerinde üremenin saptanması yanısıra bireysel değerlendirmeden uzaklaştırılarak, Pirazinamidaz testi, Thiophene-2 bilgisayar sistemleri ile daha standart ve karboksilik hidrazid testi objektif biyokimyasal destekli hale ve getirilmiştir. Hızlı kültür Katalaz asit testi, test Niasin testi, birçok kullanılmaktadır. Bu sistemlerinde ağırlıklı olarak sıvı besiyerleri biyokimyasal testlerin bir arada kullanılması kullanılmakla beraber, katı ile sağlanacak identifikasyon oldukça zor ve besiyerlerinin de sistemler zaman alıcı olduğundan rutinde birkaç test bifazik kullanıldığı ve alanı M tuberculosis complex ve MOTT’ların bulmuş olan bu hızlı kültür sistemleri; ayırımı için kullanılmaktadır. Hızlı kültür BACTEC 460 TB Sistemi (radyometrik sistemlerinin esaslı izolasyonu mevcuttur. Ülkemizde sistem), kullanım BACTEC Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) 960 Sistemi çoğunda, yanı tanımlanmaları sıra, da mikobakterilerin tür düzeyinde yapılabilmektedir. 399 Cüneyt Özakın, Suna Gedikoğlu. BACTEC 460TB’de NAP testi ile M Konvansiyonel yöntemlere Cannetti, Rist ve tuberculosis complex ve MOTT ayırımı Grosset’in 1963’de tanımladıkları Orantı yapılabilmektedir. (proporsiyon) düzeyindeki MOTT’ların ayırımları için tür günümüzde tarafından yöntemi, 1957’de tanımlanan Oranı tiplendirme 1961’de tanımladığı İdentifikasyon işlevini süregen olarak yapan (absolute concentration) rutin laboratuvarlarda identifikasyon için olarak verilebilir. Bu yöntemler arasında kullanılan tüm testler, her gün en az bir Orantı yöntemi, halen daha kullanılan, pozitif suş ile çalışılarak kalite ve kontrolü mikroskopik olarak ARB pozitif bulunan yapılmalıdır. klinik Duyarlılık Testleri : üremenin saptandığı kültürden çalışmaya Center for Diseases Control and Prevention imkan sağlayan ve majör tüberküloz ilaçları (CDC), yanı sıra minör ilaçlar içinde uygulanma her hastadan kullanılmaktadır. izole edilen complex’in tuberculosis M primer yöntemi örneğinden imkanı ve Direnç biyokimyasal yöntemler yerine moleküler yöntemleri (ratio) Mitchisson Mutlak Derişim yöntemi direkt olan Meissner’in örnek olarak bir veya yöntemdir. antitüberküloz ilaçlara duyarlılık testinin Laboratuvarlarımızda yapılmasının bildirmektedir. kullanım alanı bulan hızlı kültür sistemleri Mikobakteriler için uygulanan duyarlılık test ile izolasyon-identifikasyon yanı sıra majör yöntemlerini konvansiyonel ve hızlı kültür tüberküloz ilaçlarının duyarlılık testlerini de besi yerleri ile yapılan duyarlılık testleri çalışılabilmektedir. Hızlı kültür sistemleri ile olarak iki bölümde incelemek mümkündür. duyarlılık Konvansiyonel duyarlılık test yöntemleri, sürelerde ilaç BACTEC ilave yerlerinde, üremesinin gerektiğini edilmiş M klasik kültür tuberculosis inhibe olup besi testleri giderek 4-12 gün yaygın gibi kısa değerlendirilebilmektedir. 460 TB, MGIT 960 ve suşlarının BacT/ALERT MB’nin yanı sıra Dio-TK Scan olmadığının kültür sistemleri majör tüberküloz ilaçlarının Bu duyarlılığının amaçla sıklıkla Löwenstein Jensen ve sistemleridir. Middlebrook besi yerleri kullanılır. Besi Tüberküloz tedavisinde kullanılan ilaçların yerlerine eklenen ilaç miktarını belirlerken, duyarlılıklarını rutin çalışan laboratuvarlar mikobakterilerin üremesinin inhibe ettiği her hafta duyarlı bir suş ile duyarlılık serum testlerini değerlendirilmesi esasına konsantrasyonu Konvansiyonel dayanır. esas duyarlılık alınır. testlerinin bilinen çalışıldığı tekrarlamalıdır. standart suşlar hızlı Ayrıca ile de kültür dirençi kontrol dezavantajı, kullanılan ilaçların besi yerinin yapılarak kalite değerlendirilmelidir. içeriğindeki bağlanma Rutin tüberküloz tanı laboratuvarları ayrı bir eğiliminde olmaları, ilaç ilave edilen besi mekanda yer almalıdır. Çalışılan örneklerin yerinin hazırlığı aşamasında ısıya maruz sayısı, pozitiflik oranı ve örneğin içerdiği bırakılma gibi işlemler nedeniyle ilaçın basil miktarı laboratuvarın bulaş riskini serbest ve aktif miktarının değişmesi ve belirlemektedir. duyarlılığın test edilmesi için ortalama 21 riskini azaltmak için 3. düzeyde gün gibi bir süreye ihtiyaç önlemlerinin alınmalı ve sürdürülmesine 400 bazı maddelere olmasıdır. Laboratuvarların bulaş güvenlik Tüberküloz Tanısında Tüberküloz Laboratuvarının Rolü : Tanı ve İlaç Duyarlılık Testlerinde Rutin Laboratuvar Yöntemlerinin Değeri özen gösterilmelidir. Laboratuvarda, iki 6. Kocagöz T. Mycobacterium tuberculosis için aşamalı kapı sistemi, tek yönlü hava uygulanan fenotipik ve genotipik direnç akımının sağlanması, yüzey ve yerlerin testleri. 4. Ulusal Mikobakteri Simpozyumu 31 Ekim - 2 Kasım 2002 Abant. Simpozyum dezenfeksiyona dayanıklı materyal ile kaplı olması önerilmektedir. Bulaş riskini azaltmak için laboratuvar Kitabı, 115-124. 7. Özakın C. Tüberküloz kültüründe kullanılan yeni yöntemler. 4. Ulusal Mikobakteri işlemleri bir program ve düzen içinde Simpozyumu 31 Ekim- 2 Kasım 2002 Abant. sürdürülmelidir. Simpozyum Kitabı, 49-56. yapılması Bulaş gerekenler önceden Çalışan personelin belirlenmelidir. tüberküloz açısından çalışanlarına durumunda göre diğer 3-5 8. Türkiye’de olduğu unutulmamalı ve düzenli sağlık taramaları yanı sıra hizmet içi eğitimlerine de önem verilmelidir. kontrolü için Savaşı Daire Başkanlığı Yayını, Ankara, genel populasyona göre 100 kat fazla risk altında tüberkülozun başvuru kitabı. T.C. Sağlık bakanlığı Verem laboratuvar kat, Özkara Ş, Aktaş Z, Özkan S, Ecevit H. 2003. 9. Somoskovi A, Kodmon C, Lantos A, Bartfai Z, Taması L, Füzy J, Magyar P : Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and Löwenstein-Jensen Medium, J KAYNAKLAR: 1. Alpaslan Clin Microbiol 2000; 38:2395-7. A. Mikobakterilerin tiplendirilmesinde klasik ve yeni yöntemler. XXX. Türk Mikrobiyoloji Kongresi Kitabı Kemer-Antalya 30 Eylül- 5 Ekim 2002 1382. Good RC. Diagnostic mycobacteriology laboratory practices. Clin Infect Dis 1995;2:291-9. 11. Wayne LG. Cultivation of Mycobacterium tuberculosis for research purpose. Bloom Drobniewski FA, Caws M, Gibson A, Young BR D. Protection, Modern laboratory diagnosis of (ed). Tuberculosis: Pathogenesis, and ASM Control, press, Washington DC. 1994:73-109. 12. Woods 3:141-7. GL. Susceptibility testing for Dye C, Scheele S, Dolin P, Pathania V, mycobacteria. Clin Infect Dis 2000;31:1209- Raviglioni 15. tuberculosis: 4. MT, 140. tuberculosis. The Lancet Infect Dis 2003; 3. 10. Shinnich MC. Global estimated burden of incidance, 13. WHO. Laboratory services in Tuberculosis prevalence, and mortality by country. JAMA Control Part I. Organization 1999; 282: 677-686. Manangement 1998 (WHO/TB/98.258). and Hana BA, Ebrahimzadeh A, Eliot LB, et al. Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT 960 system for recovery of mycobacteria. J Clin Microbiol 1999;37:748-52. 5. Heifets LB, Good RB. Current laboratory methods for the diagnosis of tuberculosis. In: Blood BR, ed. Tuberculosis: Pathogenesis, Protection, and Control. ASM press, Washington DC. 1994:85-110. 401