Tüberkuloz tanısında tüberküloz laboratuvarının rolü

advertisement
21. Yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu ve II. Tüberküloz Laboratuvar Tanı Yöntemleri Kursu, Samsun
TÜBERKÜLOZ TANISINDA TÜBERKÜLOZ LABORATUVARININ
ROLÜ : TANI VE İLAÇ DUYARLILIK TESTLERİNDE RUTİN
LABORATUVAR YÖNTEMLERİNİN DEĞERİ
Y. Doç. Dr. Cüneyt Özakın, Prof. Dr. Suna Gedikoğlu
Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları Anabilim Dalı, Bursa
Yirminci yüzyılda tüberküloz ile savaşta
aşama laboratuarlar, hasta örneklerinde
oldukça önemli mesafeler alınmış olmasına
sadece mikroskopik inceleme ile asit ve
karşın, dünyamızda hala her yıl 2 ila 3
alkaliye dirençli bakteri (ARB) varlığını
milyon
yaşamını
araştırmaktan sorumlu iken, 2. aşama
yitirmektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık
laboratuvarlarda bu işleme kültür ve M
üçte biri Mycobacterium tuberculosis ile
tuberculosis
enfekte kabul edilmektedir.
mikobakterilerden ayırt edilmesi eklenmiştir.
Tüberkülozdan korunmanın en etkin yolu
En
hastalığın
tedavi
düşünülmüş olan 3. aşama laboratuvarlar
edilmesidir. Tüberkülozun ön tanısı klinik
ise diğer laboratuarların işlemlerine ek
verilere dayanmakla birlikte, kesin tanı
olarak, M tuberculosis complex dışındaki
laboratuvar
mikobakterilerin
insan
bu
erken
hastalıktan
tanınması
yöntemlerle
ve
konulmaktadır.
üst
complex’in
düzey
identifikasyonu
örneklerinde gösterilmesi ve izolasyonu ile
duyarlılıklarının
sağlanır.
görevlendirilmiştir.
tanı,
Etkenin
tanısı
etkenin
izolasyonu
yanında
hastalığın
epidemiyolojik
laboratuvar
tür
hasta
Laboratuvar
diğer
ve
olarak
düzeyinde
tüberküloz
ilaçlarına
çalışılması
Ülkemiz
değerlendirildiğinde,
bu
DSÖ’nün
ile
açıdan
önerdiği
değerlendirmeye ve etkenin duyarlılığının
laboratuvar derecelendirmesine benzer bir
belirlenmesine de olanak sağlamaktadır.
yapılanmanın,
Duyarlılığın
Savaşı
belirlenmesi
yönlendirilmesi
de
açısından
tedavinin
oldukça
Daire
Bakanlığı
Verem
Başkanlığına
bağlı
laboratuvarlarda mevcut olduğunu, birçok
Üniversite hastanesi, özellikle eğitim veren
önemlidir.
Tüberkülozun
Sağlık
tanısı
laboratuvarlarının
için
rutin
yapılanması
çalışan
Dünya
bazı
Devlet
ihtisaslaşmış
Sağlık Örgütü (DSÖ) tarafından belirlenmiş
laboratuvar
olup, bu 3 aşamadan oluşmaktadır. Birinci
söyleyebiliriz.
ve
SSK
hastaneleri
hastanelerin
hizmeti
3.
ile
aşama
verdiklerini
Cüneyt Özakın, Suna Gedikoğlu.
Tüberküloz
tanısı
için
tüberküloz
Direkt preparat hazırlama aşaması, aerosol
yapılan
oluşturan bir işlem olması nedeniyle çalışan
işlemler; direkt mikroskopik inceleme, kültür
personel ve çevreyi korumak için güvenlik
ve sonrasında identifikasyon ile primer
kabini
tüberküloz ilaçlarına duyarlılık testleridir.
preparat
Direkt Mikroskopik İnceleme:
işleminden
Mikroskop ile hasta örneğindeki tüberküloz
kalabileceği unutulmamalıdır. EZN boyama
basillerinin
yönteminin
laboratuvarlarında
rutin
olarak
saptanması,
tüberküloz
içinde
yapılmalıdır.
65-75°C’da
sonra
her
Hazırlanan
kurutulmalı,
da
hafta
tespit
basilin
pozitif
canlı
bir
suş,
hastalığının tanısını koymak için en hızlı, en
florokrom boya yönteminin ise her hafta
ucuz ve pratik bir yöntemdir. Tüberküloz
pozitif ve negatif suşlar ile çalışılarak kalite
basilinin ikiye bölünme süresi ortalama 18
kontrolü yapılmalıdır.
saat olduğundan, kültür ile üretilerek izole
edilmesi
uzun
zaman
almaktadır.
Bu
nedenle de tüberküloz için mikroskopik tanı
Kültür Yöntemleri:
günümüze
kadar
korumuştur.
Tüberküloz tanısı için laboratuvara oldukça
Hasta
örneklerinden
hazırlanan
değişik özelliklere sahip klinik örnekler
önemini
preparatlara, değişik boyama yöntemleri
gelmektedir.
uygulanmakta
ile
örnekler olup bu örnekler sadece santrifüj
değerlendirilmektedir. En yaygın kullanılan
edildikten sonra oluşan çökelti uygun kültür
boyama yöntemi asit fast boya yöntemi olan
ortamlarına aktarılır. Steril olmayan örnekler
Erlich-Ziehl
öncelikle
ve
Neelsen
mikroskop
(EZN)
boyama
Örneklerin
bazıları
homojenizasyon
steril
ve
yöntemidir. EZN ile boynamış bir preparatta
dekontaminasyon
en az 300 mikroskop sahası tarandıktan
geçirilerek (tercihen N asetil L-sistein ve
sonra negatif olduğuna karar verilmelidir.
NaOH ile) yine bakterinin yoğunlaşmasını
300 mikroskop alanında saptanan 1-2 basil
sağlamak amacı ile soğutmalı santrifüjde
şüpheli olarak değerlendirilirken 100 alanda
3000g’de 20 dakika çöktürme yapılarak,
1-9 basil görülmesi (+), 10 alanda 1-9 basil
oluşan çökelti mikobakterinin izolasyonu
görülmesi
basil
sağlanmak için uygun kültür ortamlarına
görülmesi (+++) olarak değerlendirilirken
aktarılır. DSÖ, mikobakterilerin izolasyonu
her alanda 10’dan fazla basilin görülmesi
amacıyla sıvı ve katı özellikte iki ayrı
(++++)
tüberküloz
(++),
olarak
her
alanda
1-9
yorumlanmalıdır.
Bol
besi
aşamalarından
yerinin
beraber
basilin
kullanılmasını önermektedir. Bu uygulama
incelenmesine olanak sağlayan, bu nedenle
ile mikobakteri izolasyon oranlarını artırmak
örnekte az sayıda bulunan bakterinin bile
hedeflenmektedir.
saptanabildiği, değerlendirmenin daha hızlı
Konvansiyonel
ve kolay olarak yapılabildiği diğer bir
izolasyonu amaçıyla kullanılan besiyerleri
boyama yöntemi, florokrom boya (Auramin)
özelliklerine
yöntemidir. Auramin boyama yöntemi ile
olarak
pozitif saptanan örneklerin EZN boyama
Middlebrook 7H9 ve Dubos Tween albumin
yöntemi ile teyit edilmesi önerilmektedir.
sıvı besiyeri örnek verilebilir. Katı özellikteki
miktarda
398
hasta
örneğinde
olarak
mikobakteri
göre sıvı ve katı besiyerleri
ayrılabilir.
Sıvı
besiyerlerine,
Tüberküloz Tanısında Tüberküloz Laboratuvarının Rolü : Tanı ve İlaç Duyarlılık Testlerinde Rutin Laboratuvar
Yöntemlerinin Değeri
besiyerleri de, yumurta bazlı ve agar bazlı
(floresan esaslı sistem), BACTEC 9000 MB
besiyerleri olmak üzere ikiye ayrılabilir.
Sistemi
Yumurta bazlı besiyerleri bütün yumurta
BacT/ALERT
veya yumurta sarısı, patates unu, tuz ve
(kolorimetrik esaslı sistem), Dio-TK Scan
gliserol
Kültür Sistemi (katı özellikte kolorimetrik
içermektedir.
Yumurta
bazlı
(flouresans
MB
esaslı
sistem),
(MB/BacT)
Sistemi
besiyerlerine, Löwenstein-Jensen besiyeri,
esaslı sistem) dir.
Petragnani besiyeri ve American Trudeau
Yapılan
Society besiyeri, agar bazlı besiyerlerine ise
konvansiyonel yöntem ile 24.1 gün gibi bir
Middlebrook 7H10 ve Middlebrook 7H11
sürede M tuberculosis’in %79’u
örnek olarak verilebilir.
edilebilirken, BACTEC 460 TB ile bu süre
Günümüzde; tüberküloz basilinin daha hızlı
ortalama 15.2 gün, BACTEC MGIT 960 ile
üremesini ve üremenin erken dönemde
ise ortalama 14.4 güne kadar kısalmaktadır.
tespit edilmesini sağlamayı amaçlayan,
Konvansiyonel solid besiyerleri ile BACTEC
‘hızlı
460 TB’nin birlikte kullanılması ile izolasyon
sonuç
veren
mikobakteri
kültür
sistemleri’
laboratuvarlarının
rutinleri
oranları
çalışmalar
%97
göstermektedir
düzeylerine
ki,
izole
çıktığı
ifade
izole
ettiği
arasına girmiştir. Bu sistemlerde kullanılan
edilmektedir.
besi yerlerinin içerikleri oldukça zengindir
İdentifikasyon :
ve mikobakterilerin üreme şansını artırmak
Tüberküloz
amaçlanmaktadır.
mikobakterinin, M tuberculosis complex (M
Sistemlerin
bir
diğer
laboratuvarı
amacı, gerçekleşen mikobakteri üremesini
tuberculosis,
erken dönemde saptamaktır. Bu değişik
Mycobacterium africanum, Mycobacterium
mekanizmalar
microti ve Mycobacterium cannetti) mi
ve
indikatörler
ile
kültür
otomatize
bovis,
yoksa MOTT (Mycobacteria other than M
sağlanmaktadır.
Hızlı
Mycobacterium
sistemleri
sistemler
manuel
veya
veya
radyometrik,
tuberculosis)
mi olduğunu rutin
ayırabilmelidir.
Bu
amaçla
kord
olarak
faktör
floresan, kolorimetrik olarak gruplanabilir.
oluşumu, MacConkey agarda, kanlı agarda
Bilgisayar
süregen
üreme testi, NAP (p-nitro-α-acetylamino-β-
değerlendirme yapan gelişmiş otomatize
hydro-xypropiophenone) testi gibi testler
kültür sistemlerinde üremenin saptanması
yanısıra
bireysel değerlendirmeden uzaklaştırılarak,
Pirazinamidaz
testi,
Thiophene-2
bilgisayar sistemleri ile daha standart ve
karboksilik
hidrazid
testi
objektif
biyokimyasal
destekli
hale
ve
getirilmiştir.
Hızlı
kültür
Katalaz
asit
testi,
test
Niasin
testi,
birçok
kullanılmaktadır.
Bu
sistemlerinde ağırlıklı olarak sıvı besiyerleri
biyokimyasal testlerin bir arada kullanılması
kullanılmakla
beraber,
katı
ile sağlanacak identifikasyon oldukça zor ve
besiyerlerinin
de
sistemler
zaman alıcı olduğundan rutinde birkaç test
bifazik
kullanıldığı
ve
alanı
M tuberculosis complex ve MOTT’ların
bulmuş olan bu hızlı kültür sistemleri;
ayırımı için kullanılmaktadır. Hızlı kültür
BACTEC 460 TB Sistemi (radyometrik
sistemlerinin
esaslı
izolasyonu
mevcuttur.
Ülkemizde
sistem),
kullanım
BACTEC
Mycobacteria
Growth Indicator Tube (MGIT) 960 Sistemi
çoğunda,
yanı
tanımlanmaları
sıra,
da
mikobakterilerin
tür
düzeyinde
yapılabilmektedir.
399
Cüneyt Özakın, Suna Gedikoğlu.
BACTEC
460TB’de
NAP
testi
ile
M
Konvansiyonel yöntemlere Cannetti, Rist ve
tuberculosis complex ve MOTT ayırımı
Grosset’in 1963’de tanımladıkları Orantı
yapılabilmektedir.
(proporsiyon)
düzeyindeki
MOTT’ların
ayırımları
için
tür
günümüzde
tarafından
yöntemi,
1957’de
tanımlanan
Oranı
tiplendirme
1961’de
tanımladığı
İdentifikasyon işlevini süregen olarak yapan
(absolute
concentration)
rutin laboratuvarlarda identifikasyon için
olarak verilebilir. Bu yöntemler arasında
kullanılan tüm testler, her gün en az bir
Orantı yöntemi, halen daha kullanılan,
pozitif suş ile çalışılarak kalite ve kontrolü
mikroskopik olarak ARB pozitif bulunan
yapılmalıdır.
klinik
Duyarlılık Testleri :
üremenin saptandığı kültürden çalışmaya
Center for Diseases Control and Prevention
imkan sağlayan ve majör tüberküloz ilaçları
(CDC),
yanı sıra minör ilaçlar içinde uygulanma
her
hastadan
kullanılmaktadır.
izole
edilen
complex’in
tuberculosis
M
primer
yöntemi
örneğinden
imkanı
ve
Direnç
biyokimyasal yöntemler yerine moleküler
yöntemleri
(ratio)
Mitchisson
Mutlak
Derişim
yöntemi
direkt
olan
Meissner’in
örnek
olarak
bir
veya
yöntemdir.
antitüberküloz ilaçlara duyarlılık testinin
Laboratuvarlarımızda
yapılmasının
bildirmektedir.
kullanım alanı bulan hızlı kültür sistemleri
Mikobakteriler için uygulanan duyarlılık test
ile izolasyon-identifikasyon yanı sıra majör
yöntemlerini konvansiyonel ve hızlı kültür
tüberküloz ilaçlarının duyarlılık testlerini de
besi yerleri ile yapılan duyarlılık testleri
çalışılabilmektedir. Hızlı kültür sistemleri ile
olarak iki bölümde incelemek mümkündür.
duyarlılık
Konvansiyonel duyarlılık test yöntemleri,
sürelerde
ilaç
BACTEC
ilave
yerlerinde,
üremesinin
gerektiğini
edilmiş
M
klasik
kültür
tuberculosis
inhibe
olup
besi
testleri
giderek
4-12
gün
yaygın
gibi
kısa
değerlendirilebilmektedir.
460
TB,
MGIT
960
ve
suşlarının
BacT/ALERT MB’nin yanı sıra Dio-TK Scan
olmadığının
kültür sistemleri majör tüberküloz ilaçlarının
Bu
duyarlılığının
amaçla sıklıkla Löwenstein Jensen ve
sistemleridir.
Middlebrook besi yerleri kullanılır. Besi
Tüberküloz tedavisinde kullanılan ilaçların
yerlerine eklenen ilaç miktarını belirlerken,
duyarlılıklarını rutin çalışan laboratuvarlar
mikobakterilerin üremesinin inhibe ettiği
her hafta duyarlı bir suş ile duyarlılık
serum
testlerini
değerlendirilmesi
esasına
konsantrasyonu
Konvansiyonel
dayanır.
esas
duyarlılık
alınır.
testlerinin
bilinen
çalışıldığı
tekrarlamalıdır.
standart
suşlar
hızlı
Ayrıca
ile
de
kültür
dirençi
kontrol
dezavantajı, kullanılan ilaçların besi yerinin
yapılarak kalite değerlendirilmelidir.
içeriğindeki
bağlanma
Rutin tüberküloz tanı laboratuvarları ayrı bir
eğiliminde olmaları, ilaç ilave edilen besi
mekanda yer almalıdır. Çalışılan örneklerin
yerinin hazırlığı aşamasında ısıya maruz
sayısı, pozitiflik oranı ve örneğin içerdiği
bırakılma gibi işlemler nedeniyle ilaçın
basil miktarı laboratuvarın bulaş riskini
serbest ve aktif miktarının değişmesi ve
belirlemektedir.
duyarlılığın test edilmesi için ortalama 21
riskini azaltmak için 3. düzeyde
gün gibi bir süreye ihtiyaç
önlemlerinin alınmalı ve sürdürülmesine
400
bazı
maddelere
olmasıdır.
Laboratuvarların
bulaş
güvenlik
Tüberküloz Tanısında Tüberküloz Laboratuvarının Rolü : Tanı ve İlaç Duyarlılık Testlerinde Rutin Laboratuvar
Yöntemlerinin Değeri
özen gösterilmelidir. Laboratuvarda,
iki
6.
Kocagöz T. Mycobacterium tuberculosis için
aşamalı kapı sistemi, tek yönlü hava
uygulanan fenotipik ve genotipik direnç
akımının sağlanması, yüzey ve yerlerin
testleri. 4. Ulusal Mikobakteri Simpozyumu
31 Ekim - 2 Kasım 2002 Abant. Simpozyum
dezenfeksiyona dayanıklı materyal ile kaplı
olması önerilmektedir.
Bulaş riskini azaltmak için laboratuvar
Kitabı, 115-124.
7.
Özakın C. Tüberküloz kültüründe kullanılan
yeni
yöntemler.
4.
Ulusal
Mikobakteri
işlemleri bir program ve düzen içinde
Simpozyumu 31 Ekim- 2 Kasım 2002 Abant.
sürdürülmelidir.
Simpozyum Kitabı, 49-56.
yapılması
Bulaş
gerekenler
önceden
Çalışan
personelin
belirlenmelidir.
tüberküloz
açısından
çalışanlarına
durumunda
göre
diğer
3-5
8.
Türkiye’de
olduğu unutulmamalı ve düzenli sağlık
taramaları yanı sıra hizmet içi eğitimlerine
de önem verilmelidir.
kontrolü
için
Savaşı Daire Başkanlığı Yayını, Ankara,
genel
populasyona göre 100 kat fazla risk altında
tüberkülozun
başvuru kitabı. T.C. Sağlık bakanlığı Verem
laboratuvar
kat,
Özkara Ş, Aktaş Z, Özkan S, Ecevit H.
2003.
9.
Somoskovi A, Kodmon C, Lantos A, Bartfai
Z,
Taması
L,
Füzy
J,
Magyar
P
:
Comparison of recoveries of Mycobacterium
tuberculosis using the automated BACTEC
MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB
system, and Löwenstein-Jensen Medium, J
KAYNAKLAR:
1.
Alpaslan
Clin Microbiol 2000; 38:2395-7.
A.
Mikobakterilerin
tiplendirilmesinde klasik ve yeni yöntemler.
XXX. Türk Mikrobiyoloji Kongresi Kitabı
Kemer-Antalya 30 Eylül- 5 Ekim 2002 1382.
Good
RC.
Diagnostic
mycobacteriology laboratory practices. Clin
Infect Dis 1995;2:291-9.
11. Wayne LG. Cultivation of Mycobacterium
tuberculosis for research purpose. Bloom
Drobniewski FA, Caws M, Gibson A, Young
BR
D.
Protection,
Modern
laboratory
diagnosis
of
(ed).
Tuberculosis:
Pathogenesis,
and
ASM
Control,
press,
Washington DC. 1994:73-109.
12. Woods
3:141-7.
GL.
Susceptibility
testing
for
Dye C, Scheele S, Dolin P, Pathania V,
mycobacteria. Clin Infect Dis 2000;31:1209-
Raviglioni
15.
tuberculosis:
4.
MT,
140.
tuberculosis. The Lancet Infect Dis 2003;
3.
10. Shinnich
MC.
Global
estimated
burden
of
incidance,
13. WHO. Laboratory services in Tuberculosis
prevalence, and mortality by country. JAMA
Control
Part
I.
Organization
1999; 282: 677-686.
Manangement 1998 (WHO/TB/98.258).
and
Hana BA, Ebrahimzadeh A, Eliot LB, et al.
Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT
960 system for recovery of mycobacteria. J
Clin Microbiol 1999;37:748-52.
5.
Heifets LB, Good RB. Current laboratory
methods for the diagnosis of tuberculosis.
In:
Blood
BR,
ed.
Tuberculosis:
Pathogenesis, Protection, and Control. ASM
press, Washington DC. 1994:85-110.
401
Download