T.C. EGE ÜNøVERSøTESø SAöLIK BøLøMLERø ENSTøTÜSÜ
advertisement
T.C. EGE ÜNøVERSøTESø SAöLIK BøLøMLERø ENSTøTÜSÜ DOXORUBøSøN'E BAöLI KARDøOTOKSøSøTEDE RESVERATROL'UN ETKøLERøNøN HøSTOLOJøK OLARAK øNCELENMESø Doktora Tezi Dr. Onur ORAL DANIùMAN Prof. Dr. Ayúegül UYSAL øZMøR 2008 2 T.C. EGE ÜNøVERSøTESø SAöLIK BøLøMLERø ENSTøTÜSÜ DOXORUBøSøN'E BAöLI KARDøOTOKSøSøTEDE RESVERATROL'UN ETKøLERøNøN HøSTOLOJøK OLARAK øNCELENMESø Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Doktora Tezi Dr. Onur ORAL DANIùMAN Prof. Dr. Ayúegül UYSAL øZMøR 2008 3 4 5 Bu tez; Karakter, ilke ve de÷er yargılarını Hayatım boyunca örnek aldı÷ım ve Hakkını asla ödeyemeyece÷im, Sevgili Babam Yalçın ORAL’ a øthaf edilmiútir… 6 ÖNSÖZ Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Doktora e÷itimim boyunca ve tezimin hazırlanma aúamalarında her türlü yardım ve deste÷ini hep yanımda hissetti÷im Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Baúkanı Prof. Dr. Mine Yurtseven’e, Doktora e÷itim programım boyunca; bilimsel düúünce sistemati÷i çerçevesinde Histoloji ve Embriyoloji biliminin önem ve de÷erini kavramamı sa÷layan Prof. Dr. Ayúegül Uysal ve Prof. Dr. Meral Baka’ ya, Tezimin konusunun saptanmasından, araútırmaların ve deneysel çalıúmaların son anına kadar ve özellikle yazım aúaması süresince sürekli yardım ve katkısını esirgemeyen Danıúman Hocalarım Prof. Dr. Ayúegül Uysal ve Doç. Dr. Gülperi Öktem’ e, Doktora e÷itimim süresi boyunca yapmıú oldu÷umuz ortak çalıúmalarda eme÷ini hiç eksik etmeyen ve birlikte çalıúmaktan onur duydu÷um, mesleki ve bilimsel açıdan çok kazanımlarım oldu÷u çalıúma arkadaúlarım Doç. Dr. Hüseyin Aktu÷, Yrd. Doç. Dr. Utku Ateú, Yrd. Doç. Dr. Altu÷ Yavaúo÷lu, Dr. Serap Uslu, Dr. Yi÷it Uyanıkgil ’ e ve úu an isimlerini sayamadı÷ım di÷er Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı laboratuar çalıúanlarına ve bu tezin oluúmasındaki bilimsel laboratuar katkılarını daima hatırlayaca÷ım ve multidisipliner olarak yürüttü÷ümüz çalıúmalarda kendileriyle paylaútı÷ım seçkin çalıúma ortamı içerisinde ilgi, sevgi ve desteklerini hep yanımda hissetti÷im ve özverili çalıúmalarını asla esirgemeyen Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Ö÷retim Üyelerinden Prof. Dr. Eser Sözmen’e, Çocuk Onkoloji Bilim dalı ö÷retim üyesi Doç. Dr. Mehmet Kantar’a ve eme÷i geçen tüm Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi çalıúanlarına ve østanbul I Üniversitesi Çapa Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Ö÷retim Üyelerinden Prof. Dr. Ayhan Bilir’e, Tezimin hazırlık aúamasından, son noktasına kadar sınırsız özveri ve saygın eme÷ini esirgemeyen; sadece mesleki ve bilimsel açıdan de÷il fakat aynı zamanda etik anlamda da çok úeyler ö÷rendi÷im ve bütün tez çalıúmalarım boyunca de÷erli mesleki bilgi ve deneyimlerinden yararlandı÷ım ve özellikle lise yıllarımdan itibaren Hekimlik sanatına ilgi duymama neden olan kuzenim, Dr. Behçet Uz Çocuk Hastanesi Patoloji Laboratuarı doktorlarından Patolog Doç. Dr. Ragıp Ortaç’ a, Doktora E÷itim programı kapsamında göstermiú oldu÷u destek, katkı ve anlayıú için Ege Üniversitesi Sa÷lık Bilimleri Enstitüsü Baúkanı Prof. Dr. Cemal Eronat ve Sa÷lık Bilimleri Enstitü Sekreteri Melike Örk ve özverili kadrosuna, Ve özellikle sonsuz özveri ve sevgiyle úekillenen mutlu ve huzurlu aile ortamıyla bizlerin yetiúmesinde en önemli rolü üstlenen aileme ve tezin basım aúamasındaki destekleri için kardeúim Gazeteci-Yazar U÷ur Oral’a yürekten teúekkürlerimi sunarım. Dr. Onur ORAL øZMøR, Mart 2008 II øÇøNDEKøLER Sayfa No ÖNSÖZ……………………………………………………………………….............I øÇøNDEKøLER……………………………………………………………............III TABLOLAR DøZøNø………………………………………………………...........VI GRAFøKLER DøZøNø……………………………………………………............VII ùEKøLLER DøZøNø………………………………………………………..........VIII RESøMLER DøZøNø………………………………………………………….........IX BÖLÜM I GøRøù 1.1. ARAùTIRMANIN AMACI……………..............…….……………….........1 1.2. GENEL BøLGøLER 1.2.1. Kalp Histolojisi ve Embriyolojisi….……………………….……........3 1.2.2. Antrasiklinler……………………………………….……………......10 1.2.3. Doksorubisin’in Kardiyotoksisitesi…………………….………........13 1.2.3.1. Akut Kardiyotoksisite …………………………………….…….......14 1.2.3.2. Kronik Kardiyotoksisite ………………………………….………....15 1.2.3.3. Latent Kardiyotoksisite …………………………………….….........15 1.2.4. Nitrik Oksit ........................................................................................20 1.2.5. Resveratrol …………………………………………………….........23 1.2.5.1. Resveratrol’ün Antioksidan Etkileri…………………………….......23 III Sayfa No 1.2.5.2 Resveratrol’ün Estrojenik Etkileri ……………………………..........28 1.2.5.3. Resveratrol’ün Biyolojik Etkileri……………………………............29 1.2.5.4. Resveratrol’ün Yan Etkileri…………………………………............31 BÖLÜM II GEREÇ VE YÖNTEM………………………………………………….................34 2.1. Iúık Mikroskobu Takip Yöntemi.........................................................37 2.2. Hematoksilen Eosin Boya Hazırlanması.............................................38 2.3. ømmünohistokimyasal Boyamalarda Takip øúlemleri.........................40 2.4. Elektron Mikroskop Takip øúlemleri...................................................42 2.5. Nitrit-Nitrat Düzeyi Ölçümleri............................................................46 BÖLÜM III BULGULAR 3.1. A÷ırlık Ölçüm Bulguları……………………………..……….….....….........48 3.2. . 3.3. Iúık Mikroskobu Histolojik De÷erlendirme…………………….....…...........50 3.4 eNOS ømmünohistokimyasal De÷erlendirmesi …….....………….…...........51 3.5 Nitrit Düzeyleri Ölçümü.................................................................................53 3.6 Nitrat Düzeyleri Ölçümü................................................................................53 3.7 Total Nitrit-Nitrat Düzeyleri Ölçümü.............................................................54 3.8 Yarı ønce Toluidin Mavisi Boyama Sonuçları................................................55 3.9 Elektron Mikroskop De÷erlendirme...............................................................55 p53 ømmünohistokimyasal De÷erlendirmesi…………………….................51 IV BÖLÜM IV Sayfa No TARTIùMA 4.1. Antrasiklinler ve Doksorubisin …………………………...........……...…....84 4.2. Doksorubisin’in Toksik Etkileri…………………………….......……...........85 4.3. Doksorubisin’in Kardiotoksisitesi………………………………...................85 4.4. Nitrik Oksit (NO)……………………………………………….......….........87 4.5. Resveratrol’ün Antioksidan Yapısı……………………………......…...........90 BÖLÜM V SONUÇLAR..............................................................................................................95 BÖLÜM VI ÖZET VE ABSTRACT 6.1. ÖZET……………………………………………………………….…..........97 6.2. ABSTRACT…………………………………………………………............99 BÖLÜM VII KAYNAKLAR………………………………………………………………........101 ÖZGEÇMøù………………………………………………………………............119 V TABLOLAR DøZøNø Tablo No Sayfa No 1. Gruplar ………………………………...............................................35 2. A÷ırlık Ölçüm De÷iúiklikleri …………………….............................49 VI GRAFøKLER DøZøNø Grafik No Sayfa No 1. Deney Gruplarının Ortalama A÷ırlık De÷iúim Grafi÷i.................50 2. Grupların p53 Ortalamaları...........................................................52 3. Grupların eNOS Ortalamaları.......................................................52 4. Gruplarda Kalp Dokusu Nitrit Düzey Ölçümleri..........................53 5. Gruplarda Kalp Dokusu Nitrat Düzey Ölçümleri..........................54 6. Kalp Dokusu Total Nitrit – Nitrat Düzey Ölçümleri.....................54 VII ùEKøLLER DøZøNø ùekil No Sayfa No 1. Doksorubisin’in Kimyasal Yapısı...................................................................10 2. Resveratrol’ün øzomerik Formları: Trans ve Gis............................................25 3. Trans-resveratrol’ün Metabolizasyonu...........................................................26 4. Resveratrol’ün Endoplazmik Retikulum Üzerinden Hücre Kineti÷ine Etkisi...............................................................................................................28 VIII RESøMLER DøZøNø Resim No Sayfa No 1. Doksorubisin, Resveratrol, DMSO ve SF uygulaması……….................36 2. Kapalı eter uygulamasıyla anestezi iúlemi…………………....................37 3. 1. Grupta myokard hücreleri. (x40, HE)....................……………...........56 4. 2. Grupta hasarsız myokard dokusu. (x40, HE)........................................56 5. 3. Grupta myokard dokusunda nekroz odakları. (x40, HE)......................57 6. 4. Grupta myokardial hasar izlenmedi. (x40, HE)....................................57 7. 5. Grupta myokard dokusunda patoloji gözlenmemiútir. (x40, HE).........58 8. 6. Grupta myokard hasarı gözlenmemiútir. (x40, HE)..............................58 9. 1. Grupta myokard hasarı gözlenmemiútir. (x100, HE)............................59 10. 2. Grupta myokard liflerinde hasar saptanmadı.(x100, HE) ....................59 11. 3. Grupta myokardial nekroz oda÷ı. (x100, HE).......................................60 12. 4. Grupta kalp kası hücrelerinde hasar izlenmedi. (x100, HE).................60 13. 5. Grupta myokardial hasar saptanmamıútır. (x100, HE)..........................61 14. 6. Grupta myokard lifleri. (x100, HE).......................................................61 15. 1. Grupta p53 pozitif hücre izlenmemektedir. (x40, DAB)......................62 16. 2. Grupta az sayıda hücrede p53 pozitifli÷i (x40, DAB)..........................62 17. 3. Grupta myokard hücrelerinde yüksek oranda nükleer p53 boyanması. (x40, DAB)............................................................................63 18. 4. Grupta myokard hücrelerinde düúük oranda p53 pozitifli÷i. (x40, DAB)................................................................................................63 19. 5. Grupta düúük p53 pozitifli÷i. (x40, DAB)............................................64 20. 6. Grupta az sayıda p53 pozitif myokard hücresi. (x40, DAB).................64 21. 1. Grupta p53 pozitif hücre izlenmemektedir. (x100, DAB)....................65 22. 2. Grupta az sayıda p53 pozitifli÷i. (x100, DAB).....................................65 IX RESøMLER DøZøNø Resim No Sayfa No 23. 3. Grupta yüksek p53 pozitifli÷i gösteren alan. (x100, DAB)..................66 24. 4. Grupta myokard hücrelerinde düúük oranda p53 pozitifli÷i. (x100, DAB)..............................................................................................66 5. Grupta myokard dokusunda 2 adet p53 pozitif hücre. (x100, DAB)..............................................................................................67 25. 26. 6. Grupta 2 Adet p53 pozitif hücre ve yo÷un immünreaktivite. (x40, DAB)................................................................................................67 27. 1. Grupta eNOS pozitif hücre izlenmemektedir. (x40, DAB)...................68 28. 2. Grupta eNOS pozitifli÷i saptanmadı. (x40, DAB)................................68 29. 3. Grupta endotel hücrelerinde eNOS pozitifli÷i. (x40, DAB).................69 30. 4. Grupta endotel hücrelerinde eNOS pozitifli÷i saptanmadı. (x40, DAB)................................................................................................69 31. 5. Grupta endotel hücrelerinde eNOS negatifli÷i. (x40, DAB).................70 32. 6. Grupta eNOS pozitifli÷ine rastlanmamıútır.(x40, DAB)......................70 33. 1. Grupta eNOS pozitifli÷i saptanmadı. (x100, DAB)..............................71 34. 2. Grupta endotel hücrelerinde eNOS negatifli÷i. (x100, DAB)...............71 35. 3. Grupta endotel hücrelerinde eNOS pozitifli÷i. (x100, DAB)...............72 36. 4. Grupta endotel hücrelerinde eNOS negatifli÷i. (x100, DAB)...............72 37. 5. Grupta endotel hücrelerinde eNOS negatifli÷i. (x100, DAB)...............73 38. 6. Grupta myokard hücrelerinde eNOS pozitif hücre saptanmamıútır. (x40, DAB)................................................................................................73 39. 1. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................74 40. 2. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000)....................................74 41. 2. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................75 X RESøMLER DøZøNø Resim No Sayfa No 42. 3. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................75 43. 3. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................76 44. 3. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................76 45. 4. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................77 46. 4. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................77 47. 5. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................78 48. 5. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................78 49. 6. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................79 50. 6. Grupta kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000).....................................79 51. 1. Grupta elektron mikroskop yapısı. (x15000)........................................80 52. 1. Grupta elektron mikroskop yapısı. (x6000)..........................................80 53. 2. Grupta elektron eikroskop yapısı. (x15000)..........................................81 54. 2. Grupta elektron mikroskop yapısı. (x10000)........................................81 55. 3. Grupta elektron mikroskop yapısı. (x15000).......................................82 56. 3. Grupta elektron mikroskop yapısı. (x7500).........................................82 57. 3. Grupta elektron mikroskop yapısı. (x7500).........................................83 58. 4. Grupta elektron mikroskop yapısı. (x15000).......................................83 XI BÖLÜM I GøRøù 1.1. ARAùTIRMANIN AMACI Doksorubisin kanser tedavisinde sık kullanılan antrasiklin türevi kemoterapötik bir ajandır. Ancak kardiyotoksik yan etkileri tedavide kullanımını sınırlandırmaktadır. En fazla görülen toksik etki kalp, sinir sistemi, böbrekler ve intestinal sistemlerde ortaya çıkmaktadır. Kardiyotoksisitenin etiopatogenezindeki en güncel teori serbest oksijen radikallerinin zararlandırıcı etkisidir. Kardiyotoksik etkiler serbest oksijen radikallerinin tetikledi÷i bir takım mekanizmalar ile oluúmaktadır ve bu süreçte eNOS aracılı÷ıyla oluúturulan NO önemli bir rol oynamaktadır. Doksorubisinin radikallerinin hücre zararlandırıcı üzerindeki etkisi, etki lipid mekanizmaları peroksidasyonu, serbest hücre içi oksijen ++ Ca düzeylerindeki de÷iúiklik, sitokin aktivitesinin ortaya çıkması ve nükleik asit yapısına girerek H ba÷larını koparması ile karakterizedir. Bu olumsuz etkilerin bir sonucu olarak kalp kası hücrelerinde nekroz ve apopitozise kadar uzanan hasarlar meydana gelmektedir. Resveratrol polyphenol phytoalexin (trans–3.5.4-trihydroxy stilbene) yapısında olup, son yıllarda araútırılmaya baúlanan do÷al bir maddedir. Resveratrolün antioksidan, antiproliferatif, antiinflamatuar etkileri çok sayıda araútırmaya konu olmaktadır. Doksorubisinin kardiyotoksik etkisinin reaktif oksijen türevleri üzerinden gerçekleúti÷i göz önüne alındı÷ında, bu sistemi inhibe edici resveratrol gibi antioksidan maddelerin, bu yan etkiyi azaltmada etkin bir rol oynayabilece÷i akla gelmektedir. Bu araútırmada doksorubisin ile akut kardiotoksisite oluúturulmuú sıçanlara resveratrol verilerek toksik etkinin azaltılıp azaltılamayaca÷ının olası etkilerinin araútırılması amaçlanmıútır. Doksorubisinin kardiyotoksik etkisi histolojik düzeyde ıúık ve elektron mikroskobik olarak incelenmiú; kardiyotoksik etki mekanizmalarında rol oynayan NO’in oluúumunda görevli eNOS ve apopitozis mekanizmalarından birinde yer alan p53’ün rolü immünohistokimyasal olarak ortaya konmaya çalıúılmıú, nitrit ve nitrat düzeyleri biyokimyasal incelemelerle de÷erlendirilmiútir. Bu çalıúmanın amacı, kanserde yaygın olarak kullanılan doksorubisin tedavisini kısıtlayan bir yan etki olan kardiyotoksisitenin, resvarotrolün antioksidan yapısından kaynaklanan mekanizmalarla hücre hasarını azaltmaya yönelik etkisini araútırmak sıçanlarda ve doksorubisin kardiyotoksitesini histolojik boyutta inceleyip resveratrolün kemoterapi destek tedavisinde kullanılabilirli÷ini araútırmaktır. 2 1.2. GENEL BøLGøLER: 1.2.1. KALP HøSTOLOJøSø VE EMBRøYOLOJøSø Kalp, düzenli bir pompa olarak çalıúmak üzere katlanmıú, duvarı kalınlaúmıú bir endotel tüpüdür. Kalp, sistemik kan basıncının esas elamanıdır. Duvarında 3 tabaka bulunup; øçten dıúa do÷ru aúa÷ıdaki úekilde yapılanmıútır (58, 62): l) Endokardium 2) Miyokardium 3) Epikardium Endokardium kan ile temas eder, myokardium kontraksiyon yapan tabaka olup, epikardium ise içinde kalbin yerleúti÷i perikardiumun visseral yapra÷ıdır. Ço÷u araútırmacı endokardiumu damarların intima tabakası ile miyokardı T. media ve epikardı T. adventisya ile homolog kabul eder (62). Endokardium: Atrium ve ventriküllerin içini döúeyen parlak, ince bir membrandır. Atriumlarda (özellikle sol atriumda) kalın, ventriküllerde daha incedir. Bu nedenle atrium içinde beyaz renkte, ventriküllerde ise alttaki kalp kasının rengini aksettirdi÷inden kırmızı renkte görülür. Kan damarlarının kalbe girip çıktı÷ı yerlerde intima tabakası ile devam eder. Endokardiumda bulunan subtabakalar içten dıúa do÷ru úöyledir (58): a) Endotel örtüsü: Poligonal veya yassı, tek sıralı hücrelerden oluúmaktadır. b) Subendotelial tabaka: Ço÷u yerde ince olup kollajen ve az miktarda elastik fibril ile fibroblast bulunan gevúek ba÷ dokusundan oluúur. c) Subendokardial tabaka: Endokardiumun en kalın tabakasıdır. Çok sayıda elastik fibrıl ve de÷iúik miktarda düz kas bantları bulunur. Chorda tendinea ve musculus papillares'de subendokardial tabaka yoktur. Endokardiumu myokardiuma ba÷lar. øçinde uyarım iletici sisteme ait Purkinje demetleri, sinirler ve kan damarları 3 bulunur. Endokardiumun di÷er tabakalarında kapiller damarlar bulunmaz. Bu kısımlar kalbin içinden geçen kan ile beslenirler (31, 62). Myokardium: Çizgili kalp kası liflerinin iúlevsel bir sinsisyumu olup, kalp kasının; atrium kası, ventrikül kası ile özelleúmiú uyarıcı ve iletici kas lifleri olmak üzere üç ana tipini oluúturur. Özelleúmiú kalp kası hücreleri, atrial natriüretik faktörü sentezlemektedirler. Atriyalnatriüretik faktör, atrial kardiyositlerin gerildiklerinde salgılanarak hem diürezi hem de idrarla sodyum atılımını uyaran bir pepdiddir (58). Kalp kası liflerinin düzenlenmesi ve myokardiumun kalınlı÷ı kalbin de÷iúik bölgelerinde farklıdır. Kalp kası atriumlarda en ince sol ventrikülde ise en kalındır. Atriumun dıú bölümündeki kaslar transvers ya da oblik seyirlidir. Her iki atriumu da dıútan sarar. Atriumun iç bölümündeki kaslar ise her iki atriumda birbirinden ba÷ımsız olarak, dıú tabaka kaslarıyla da dik açı yapacak biçimde seyrederler. En içteki kas bantları atriumun aurikula bölümünde bir kabartı yapar (M. pectinatum). Kaslar dıútan içe do÷ru giderek yo÷unlaúırlar (31). Ventriküllerdeki kaslar de÷iúik yönlerde seyrederek birçok tabakalar yaparlar. Yetiúkinde kompakt bir kitle oluúturan kas fibrilleri embriyoda süngerimsi bir a÷ úeklindedir. Ventrikül boúlu÷unun duvarında, birçok embriyonik kas fibrilleri, endokardiumla örtülü olarak bulunurlar. Bunlara "Trabekula Carnea" adı verilir (56, 62). Ventrikülde myokard içinde elastik fibriller az miktardadır. Atriumda kas fibrilleri arasında her yerde elastik fibrıl a÷ı yer alır. Bu elastik fibriller epikard ve endokardta ki elastik fibrillerle, ayrıca büyük venlerin duvarındaki elastik fibrille devam eder. En içteki kalp kasları kalbin fibröz iskeletine tutunmaktadır (62). 4 Kalp øskeleti: Kalp yapılarını destekleyen, kalp kası ve kalp kapaklarının ba÷landı÷ı kompakt fibröz ba÷ dokusudur. Bölümleri: 1- Septum membranaceum 2- Trigonum fibrosum 3- Annuli fibrosi Septum Membranaceum: Septum interventrikülarenin fibröz bölümüdür. Yapısındaki kollajen fibriller aponevroz’a benzer úekilde çok düzenli da÷ılım oluúturur (31,111). Trigonum Fibrosum: Annulus fibrozaların arasını ve ostium atrioventrikülare sinistrum ile aort arasındaki aralı÷ın sol köúesini dolduran iki üçgen úeklindeki sıkı ba÷ dokusu ve fibröz kıkırdak nodüllerden oluúmuútur (31,111). Annuli Fibrosi: Aorta, A. pulmonalis ve atrioventriküler kanal çevresinde bulunur. Baúlıca sıkı ba÷ dokusu, kollajen ve elastik fibriller ve az miktarda ya÷ dokusundan oluúmuútur (31, 111). Annuli ve trigoniumdaki ba÷ dokusunda kondroid doku (kıkırda÷a benzer doku) adaları bulunur. Kondroid doku hücreleri kıkırdak gibi küre biçimlidir, ara maddede bazik anilin boyaları ve HE ile koyu renkte boyanır. Kollajen fibrilleri içerir, elastik fibrıl bulunmaz (62). Epikardium: Perikardın visseral yapra÷ını oluúturan, seröz bir membrandır. Dıúa bakan yüzeyi tek sıralı, yassı poligonal hücrelerden oluúan bir epitel tabakası ile örtülüdür. Bu epitele mezotel denir. Hücrelerin apikal yüzeylerinde mikrovilluslar görülür. Bunlar ileri derecede rezorbsiyon gücüne sahip olan seröz membranların rezorpsiyon yüzeyini artırmaya yararlar. Mezotel hücreleri kalbin fonksiyonel hacim de÷iútirmeleri ile ilgili olarak úekil de÷iútirirler (31). 5 Mezotel altında elastik fibril, kan damarları ve sinirleri içeren lamina propria olarak adlandırılan ince bir ba÷ dokusu bulunur. Lamina proprianın altında ise subepikardium tabakası bulunur. Kan damarı, sinirler ve de÷iúik miktarda ya÷ dokusunu içeren bir tabakadır. Kalbi kuúatan ya÷ dokusu genellikle bu tabakada birikmiútir. Özellikle atriumda A-V bileúkeye yakın bölümde ya÷ birikimi belirgindir (31, 111). Kalbi dıútan saran perikard kesesinin visseral yapra÷ı (epikardium) gibi parietal yapra÷ı da seröz bir membrandır. Mezotel ile örtülü kollajen, elastik fibrıl, fibroblast ve makrofajlardan oluúan bir ba÷ dokusu yapısındadır. Parietal perikard fibröz ba÷ dokusu yapısındadır ve yo÷un kollajen fibrilleri içerir (111). Kalbin gevúeyip ve kasılması sırasında epikard ve parietal perikard yapraklarının düz ve nemli yüzleri birbiri üzerinde serbestçe kayar. E÷er bu yapraklar birbirine yapıúırsa ve aralarındaki mesafe daralırsa (perikarditis’te) kalp hareketleri önemli derecede sınırlanır (62, 111). KALP KASI Kalp kası primer kalp tüpünü oluúturan endotel çevresindeki splanknik mezodermden geliúir. Zincirsi uzantılar halinde dizilen mezoderm hücreler ço÷unlukla dallanırlar ve böylelikle kalp sıkı bir örgü demeti halinde meydana gelmiú olur (56). Olgun kalp kası hücreleri yaklaúık 80 mikron uzunluk, 15 mikron geniúlikte olup ve enine çizgilenen bantlaúma gösterirler. Kalp kası hücrelerinde 1 veya 2 soluk boyanan merkez yerleúimli çekirdek bulunur. Kas lifleri arasında, bol kan ve lenf damarlarıyla sinirleri içeren, retikulum liflerinden zengin gevúek ba÷ dokusu görülmektedir.Kalp kasında düzensiz aralıklar ile kalp hücrelerinin zincirlerini çaprazlayan koyu boyanan transvers çizgiler bulunmaktadır. Hücrelerin birleúme bölgelerinde diskus interkalaris adında ba÷lantı kompleksleri gözlenir. Bu basamaksı 6 ba÷lantılarda transvers ve lateral bölüm olarak adlandırılan 2 farklı bölge disklerde baúlıca 3 ba÷lantı kompleksi vardır. Fascia adherens, diskin transvers bölümlerinde özelleúmiú membran çıkıntılarıdır, terminal sarkomerler de aktin flamentleri için kanca görevi görür ve aynı zamanda yarı-Z bantları olarak da bilinirler. Macula adherens (desmosomlar) sabit kasılma esnasında hücreleri birbirine ba÷lar. Gap junctionlar (neksus) komúu hücreler arasında iyonik süreklili÷i sa÷lar ve bu sayede hücre zincirindeki kasılma sinyali hücreler arasında dalga halinde yayılır (56). Kalp kasında T tübül sistemi ve sarkoplazmik retikulum iyi geliúmemiútir. Yan anastomoslarla birbirine ba÷lanarak a÷ yapan uzunlamasına duran tübüller bulunmaktadır. Bu tübüllerin uçları geniúleyerek T tübüllerine yaslanır. T tübülleri sarkolemmanın hücre içine yaptıkları girintilerden oluúur; Z çizgileri hizasındadır (56). Kalp hücrelerinde çok sayıda mitokondryon bulunmaktadır. Bunlar sitoplazmanın %40’ından fazlasını oluúturur, sarkolemma altında ve oldukça düzenli diziler halinde bulunan miyofilaman demetlerin arasında yer alırlar. Kristaları sık ve çok sayıdadır. Kalp kasının devamlı aerobik metabolizmaya ihtiyaç duyması nedeniyle kalbin ana yakıtları olan ya÷ asitleri lipoproteinlerle kalp kası hücrelerine taúınır, ya÷ asitleri, kalp kası hücrelerinde trigliseridler halinde depolanır. Hücrelerde stres hali durumunda glikoza çevrilmek üzere glikojen depolanmaktadır (56, 111). Kalbin atım gücü ve sayısı otonom sinir sisteminin kontrolü altındadır. Uyarının iletilmesi farklılaúmıú olan özel kalp kası hücrelerinden yapılmıú bir sistem ile sa÷lanır ve bu sistem sayesinde kalbin kendi kendine kasılabilmesi mümkün olur. Uyarıyı oluúturup ileten kas dokusunun yapısı normal kalp kasından farklıdır. Bu liflerde miyofibriller azdır; ço÷unlukla sarkolemmaya yakın (periferik) yerleúimlidir. Bu hücrelerde glikojen bol miktarda bulunmaktadır. Uyarıyı oluúturan sinoatriyal ve 7 atriyoventriküler dü÷ümlerdeki kas hücreleri kısa, mekik úeklinde ve çapları normal kas lifinin yarısı kadardır (56). Atriyal ve ventriküler kaslar arasında yapısal farklılıklar bulunmaktadır. Her ikisinde de miyoflamentlerin düzenlenmesi birbirine benzemesine karúın artiyal kaslarda daha az sayıda T tübüllerine rastlanır ve hücreler daha küçüktür. Membranla sınırlı granüllerin sa÷ atrium kas hücrelerinde daha fazladır. Bu atrial granüller atrial natriüretik faktör veya atriopeptin olarak bilinen bir hormonun öncüsüdür. Bu hormon sodyum ve su kaybında böbrekler üzerinde etki gösterir ve antidiüretik hormon ya da aldesteronun karúıtı olarak iúlev görür (56, 58). Otonomik sistemin parasempatik ve de sempatik fibrilleri kalbi innerve eder. Sino-atrial ve A-V dü÷ümlere yakın bölgelerde ganglionik sinir hücreleri ve sinir fibrilleri vardır (dü÷üm içinde yer almazlar) (56, 58). Kalp normalde sinirsel ya da di÷er dıú uyaranlarla uyarılmadan ritmik kotraksiyon yapmaktadır, ancak otonomik sistemle hızı de÷iúebilir. Sempatik sinirlerin uyarılması kalbin ritmini hızlandırılır, parasempatik uyarılma kalbi yavaúlatır (56, 111). KALP EMBRøYOLOJøSø Kardiovasküler sistem, embriyoda fonksiyon gösteren ilk sistemdir. Primordial kalp ve damar sistemi embriyojenik geliúimin üçüncü haftasının ortalarında belirir. Kardiovasküler sistem (kalp, kan damarları ve kan hücreleri) mezodermal tabakadan geliúir. Baúlangıçta bir çift olmalarına ragmen, geliúimin 22. gününde bu iki tüp kıvrılarak;içte bir endokardial tüp ve çevresinde de myokardial bir örtüden meydana gelen tek bir kalp tüpü oluútururlar (81, 96). 21. günde,uzayan kalp tüpünde, bo÷umlanma ve geniúlemeler dikkat çekicidir. Bunlar, trunkus arteriosus, bulbus kordis, ventrikül, atrium ve sinus venozustur. Trunkus arterious, kranial olarak, aorta arkuslarının çıktı÷ı aortik kese ile 8 devam eder. Geniú sinus venosus, sırasıyla; koriyon, vitellüs kesesi ve embryondan umblikal, vitellin venleri alır (96, 115). Kalp, 4. ile 7. haftalar arasında bilinen 4 boúluklu yapısına kavuúur. Kalp dördüncü haftanın baúında çalıúmaya baúlar. Bu erken kalp geliúimi; kendi besin ve oksijen ihtiyacını sadece difüzyon yoluyla daha fazla karúılamayan embriyo için gereklidir (81, 115). Kalp geiúiminin ilk belirtisi üçüncü haftada, endoteliyal kordon çiftinin,anjiyoblastik kordonların, belirmesidir. Bu kordonlar kanalize olarak endokardiyal kalp tüplerini oluútururlar ve bunlar daha sonra birlúerek üçüncü haftanın sonlarında tübüler kalbi yapar. Kalp 22 – 23. günde atmaya baúlar. Embryonik endodermden bir indüktif etkiyle kalbin erken oluúumunu uyarır (81,96). Kalp uzayıp e÷im yaparken, giderek,perikard boúlu÷una invagine olur. Baúlangıçta kalp,bu boúlu÷un dorsal duvarından ön ba÷ırsak splaknoplörik mezodermin oluúturdu÷u dorsal mezokardium ile asılı durur ve bu dorsal mezokardiumun merkezi kısmı kısa zamanda dejenere olur. Dejenere olan dorsal mezokardium transvers ya da oblik perikard sinusü meydana getirir. Bu sinus, perikard boúlu÷unun sa÷ ve sol taraflarının iliúkisini sa÷lar. Kalp tüpü böylelikle, yalnızca kranial ve kaudal sonlarıyla perikard boúlu÷una yapıúırlar (81, 96). Kalpteki septum oluúumu, kısmen atrioventiküler kanalda (atrioventriküler yastıklar) ,kısmen de konotrunkal bölgedeki (konotrunkal úiúkinlikler) endokardiyal yastık dokusunun geliúimine ba÷lıdır. Yastık dokusunun yerleúimi nedeniyle, birçok kardiyak malformasyon, anormal yastık dokusu morfegenezine ba÷lıdır (96, 115). 9 1.2.2. ANTRASøKLøNLER Antrasiklin’ler 1960’larda kullanılmaya baúlanan bir antineoplastik ilaç grubudur. Çok çeúitli etki mekanizmaları oldu÷u için karsinom ve sarkom, hematolojik neoplazilere karúı kullanılabilirli÷i göz önüne alındı÷ı takdirde önemi ortaya çıkmaktadır. Antrasiklin molekülü, kırmızı renk veren ve bir aminoúekere ba÷lı olan tetrasiklik nukleus’tan oluúur. Antrasiklin halkası lipofiliktir; ancak halka sisteminin çözünmüú olan ucu, aminoúekerlere bitiúik olan ve hidrofilik bir merkez meydana getiren bol miktarda hidroksil grup içerir. Bu molekül ise amfoteriktir. Halka fenolik gruplarının asidik fonksiyonlarını ve úeker amino grubunun temel fonksiyonlarını içerir (ùekil: 1) (80). ùekil 1: Doksorubisinin kimyasal yapısı (80). Hem hücre membranlarıyla hem de plazma proteinleriyle birleúebilir. Antrasiklinlerin, hücre membranı ile do÷rudan etkileúmek suretiyle sitotoksik etkilerini gösterebilmeleri mümkündür (80). Doksorubisinin kötü huylu hücreler ve çeúitli organlar üzerindeki sitotoksik etkisinin, doksorubisinin nükleotid baz interkalaksiyonu ve hücre membranındaki lipid fraksiyonları ile birleúmesi sonucunda oldu÷u düúünülmektedir (10). Nükleik asitlere ve hücresel membranlara ilave olarak, 10 antrasiklinler tarafından oluúturulan sitotoksik aktivite, ayrıca hücrelerin sitoplazmik iskelet proteinlerini de etkilemektedir (80). Özellikle çocukluk ve adolesan ça÷da, kanser hastalı÷ının tedavisinde sıklıkla kullanılan ve tedavi gücü yüksek ajanların baúında antrasiklinler, yani daunorubisin, doksorubisin ve idarubisin gelmektedir (119). Bu grup dahilinde idarubisin ve daunomisinin kullanımı akut lösemilerle sınırlı olmasına ra÷men doksorubisin akut lösemiler, lenfomalar, kemik ve yumuúak doku tümörleri, Wilms tümörü, nöroblastom ve hepatoblastom gibi neoplazilerde sıklıkla kullanılmaktadır (107). Kemik ili÷i, saç folikülü, epitel ve kanser hücreleri gibi hızla ço÷alan hücreler, topoizomeraz II-transkripsiyon inhibitörü olan bu ilaca karúı en hassas olan hücrelerdir. Yani, DNA’ya eklenen doksorubisin, kovalent bir enzim-DNA intermediyat kompleksini stabilize eder ve böylece DNA kırılmalarının yeniden birleúmesini önler. ønterkalasyon nükleotid ço÷almasını, DNA aktivitesini ve RNA polimerazlarını inhibe etmektedir. Topoizomeraz II etkileúiminin, doksorubisinin sitosidal aktivitesinin önemli bir mekanizması oldu÷u düúünülmektedir (10). Doksorubisin hücre iskelet kasında miyofibril demetlerinin yo÷unlu÷unda azalma (49), Z-Disk yapısında de÷iúim, aktin flamanlarda düzensizlik ve depolimerizasyon gibi olaylara sebep olurlar (12, 65). Doksorubisin ayrıca sıçanlarda neonatal kalp kası hücrelerinde siklooksigenaz (COX) aktivitesini indükte etmektedir (63). Bu olay, COX–2 geni ekspresyonuna ba÷lıdır (99). COX–2 promoter’i inflamatuar ya da akut faz geninin tepki elementlerini içerir (130). COX–2 ayrıca mRNA stabilitesi modülasyonu ile düzenlenir (72, 99). COX-2’nin pek çok hücre çeúidinde apopitozise karúı koruyucu 11 oldu÷u görülmüútür (73, 99). COX-2’nin inhibe edilmesi, doksorubisin tarafından hasara u÷rayan hücrelerin apopitozisine neden olmuútur. Doksorubisinin COX–2 enzimi üzerinden araúidonik asit metabolizması üzerinde etkili olması prostoglandinlerin bu kemoteropatik ajanın yan etkilerini azaltmada kullanılabilirli÷i ortaya çıkartmaktadır (63). Doksorubisinin toksik etkilerinin fazla olması ve çok çeúitli yan etkilerinin varlı÷ı ilacın kullanımını kısıtlayan en önemli faktörlerdir. Uzun süreli doksorubisin kullanımına ba÷lı toksik etkilerin detaylı mekanizmaları henüz tamamen anlaúılamamıútır. Çeúitli çalıúmalarda doksorubisinin serbest oksijen radikallerine yardım etti÷i, ATPase, cAMP ve lipid peroksidasyonun toksik etkilerin ortaya çıkmasında baúrolü oynadı÷ı ortaya konmuútur. Doksorubisinin baúlıca metaboliti + + + olan doksorubisinol, Na K ATPase, Mg2 ATPase ve Ca2+ATPase’in güçlü bir inhibitörüdür (42). Ayrıca doksorubisin ve metabolitleri, deneysel modellerde bakteriyel sistemler, memeli kültür hücreleri, diúi Sparague-Dawley sıçanları üzerinde mutajenik ve karsinojenik özellikler göstermiútir. ønsanlarda ve deney hayvanlarında her iki cins için de, fertilite üzerindeki muhtemel yan etkileri yeterince de÷erlendirilmemiútir (28). Akut non-lenfositik lösemilerin bazen, de÷iúik neoplazilerin doksorubisin içeren çoklu ilaç tedavisinden birkaç yıl sonra görülebildi÷i bildirilmiútir (49). Hayvan araútırmalarında deneysel tümörlerde, immünosupresyon, geciken ya da ilerleyen kardiyak toksisite gibi çeúitli toksik etkilerin indükte edilmesi, bütün canlılarda myelosupresyon, sıçanlarda ve köpeklerde testis atrofisi gibi yan etkiler tespit edilmiútir (118). 12 1.2.3. DOKSORUBøSøN’øN KARDøYOTOKSøSøTESø Doksorubisinin kardiyotoksisite mekanizması; serbest reaktif oksijen radikallerinin formasyonu, direkt DNA hasarı veya DNA onarımının bozulması ve antijen sa÷layıcı hücrelerin neden oldu÷u immunolojik reaksiyonların indüksiyonu olarak özetlenebilir (29, 38, 129). Hücre seviyesinde Cu (II) ve Fe (III) azaltılması yolu ile meydana gelen doksorubisin kardiyotoksisitesi serbest radikal oluúumunda etkilidir (2). Doksorubisinin apopitozisi indükte etti÷i hücre kültürlerinde sıçanlarda invivo modellerinde gösterilmiútir (130). Miyokardiyal apopitozisin akut ve kronik miyosit kaybının yaygın bir mekanizması oldu÷u öne sürülmektedir (88, 100, 101). Ayrıca, Billingham ve di÷erlerinin klasik araútırmasında, küçülmüú fokal kardiyomiyositlerin apopitozis tipi hücre morfolojisi ile miyofibriler lizis arasında iliúki oldu÷u belirtilmiútir (12). ønsanda doksorubisinin histopatolojik etkileri otopsi ve endomiyokardiyal biyopsi ile incelenmiútir. Otopside mikroskobik olarak incelenen miyokardiyal bölümlerde, interstitial ödemi olan kardiyak hücrelerde bariz bir vakuolar dejenerasyon görülmüútür. Viral kardiyomiyopatideki de÷iúim tanımlarına karúı olarak inflamatuar de÷iúim yoktur. Elektronmikroskobik olarak, sarkoplasmik retikulumun yayılması ve úiúmesi yüzünden hücre içi vakuol oluúmaktadır. Toplam doksorubisin dozu arttıkça bu de÷iúimlerin sıklı÷ı ve úiddeti de artmaktadır (114). Kardiyotoksisitede miyokard liflerindeki primer patolojik de÷iúiklikler, destrüksiyon (kas lifi nekrozu, apopitozis), miyofibrillerin kaybı ve sarkoplazmik vakuolizasyondur (11). øki tip miyokardiyal hasar vardır. Birincisi miyofibriller 13 kayıptır. Bu durumda mitokondri küçüktür ve bozulmadan korunmaktadır. økincisi vakuolar dejenerasyondur, en erken belirtisi sarkoplazmik retikulumda yayılmadır ve bunu takiben úiúme ve birleúme meydana gelir. Her iki lezyon da ilerleyerek mitokondrinin ölümüne sebep olur ve bu noktada mitokondri úiúerek dejenere olur (11). Klinik bulgular ıúı÷ında birçok kemoteropatik ilaçta oldu÷u gibi antrasikline ba÷lı kardiyotoksisiteyi üç kategoride inceleyebilmek mümkündür (39). 1.2.3.1. AKUT KARDøYOTOKSøSøTE Akut kardiotoksisite, doksorubisin infüzyonundan sonra geri dönüúümlü olarak miyokardiyal fonksiyonun depresyonu olarak açıklanabilir. Doksorubisinin kesilmesinden sonra durumda düzelme gözlenir. Günümüz kanser tedavi protokollerinde hastalarda böyle bir toksisitenin görülme sıklı÷ı %1’in altındadır. ølk hafta içinde miyokardiyal kontraktilitede azalma görülür (106). Nadiren de olsa konjestif kalp yetmezli÷i oluúabilir. Çok az görülse de, akut dönemde ciddi aritmiler ventriküler ve supraventriküler taúikardiler, miyokarditperikardit sendromu ve aynı zamanda sol ventrikül fonksiyonlarında ani düúme de kaydedilebilir. Miyelosupresyon, mukozit, bulantı, kusma, diyare ve alopesi gibi bazı durumları antrasiklinlerin akut toksisiteleri arasında sayılmaktadır. Bunun yanında nadiren de olsa özgül olmayan EKG de÷iúiklikleri de bildirilmektedir. Söz konusu tablonun ve durumun en ciddi úeklinde ise perikarditle iliúkili olarak hızlı baúlangıçlı konjestif yetmezlik bulunmaktadır. Ço÷u zaman akut asemptomatik kardiyak de÷iúiklikler kalıcı de÷ildir ve daha sonraki antrasiklin uygulamalarına engelleyici bir etkide bulunmamaktadır (39, 128). 14 1.2.3.2. KRONøK KARDøYOTOKSøSøTE Kronik kardiotoksisite erken ve geç baúlangıçlı olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Bu sınıflandırmada kriter, baúlangıcın terapi sonrasında bir yıl içinde mi yoksa bir yıldan fazla zaman içinde mi ortaya çıktı÷ıdır. Ancak bu sınıflandırma, her iki durumda da belirtiler aynı oldu÷u için fazla klinik de÷er taúımaz. Erken baúlangıçlı kronik progresif antrasiklin kardiyotoksisitesi antrasiklin sa÷altımının bitimini takip eden 1 yıl içinde gözlenir (39). Bazı risk faktörleri gündeme gelebilir. ùöyle ki antrasiklin tedavisinin kesilmesine ra÷men persistan olabilmesi ya da progresyon içine girmesi de ihtimal dahilindedir. Çocuklardaki uygulamalarda dilate veya daha sık olarak restriktif tip kardiyomiyopati dikkat çekmektedir. Geç baúlangıçlı progresif sa÷altımının kesilmesinden en az 1 yıllık latent döneminden sonra görülmeye baúlanır (39). 1.2.3.3. LATENT KARDøYOTOKSøSøTE Latent kardiotoksisite, hiçbir sol ventrikül disfonksiyonu veya aritmi bulguları saptanamazken klinik bulgular ortaya çıkmaya baúlar. Sıklıkla progresif olarak restriktif veya dilate kardiyomyopati geliúmesi ile karakterlidir. Geç kardiyak toksisite açısından güvenilir antrasiklin dozu bilinmemekle beraber düúük dozların da etkili olabilece÷i iddia edilmektedir (39, 128). Malign kemik tümörü sa÷altımını bitiren olgularda yapılan bir çalıúmada geç kardiyotoksisiteyi saptamada ekokardiyografide sol ventrikül posterior duvar kalınlı÷ının ölçülmesinin duyarlı bir yöntem oldu÷u vurgulanmıútır (93). Antrasiklinlere ba÷lı kardiyotoksisiteyi ortaya koymak için de÷iúik laboratuar yöntemleri bulunmaktadır. En duyarlı ve do÷rudan tanı yöntemi endomiyokardiyal 15 biyopsidir (11). Ancak invaziv, pahalı ve teknik donanım gerektirdi÷inden pratikte kullanımı son derece kısıtlıdır. Ekokardiyografik incelemeler ve radyonükleer sineanjiografiler, düúük kümülatif dozlarda fonksiyonel anormallikleri saptayabilir (82). Bir baúka laboratuar çalıúmasında MUGA (Multiple Gated Acquisition) sintigrafisinin, adriamisin kardiyotoksisitesini, düúük dozlarda bile yakalayabilece÷i ve sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu ile miyokardiyal hareketlerdeki bozulmayı gösterebilece÷i iddia edilmiútir (2). Çocuklarda gecikmeli kardiyak toksisitenin belli bir riski vardır çünkü doksorubisin tarafından indükte edilen kardiyomiyopati çocuk büyüdükçe miyokardiyal geliúimi zayıflatır ve sonuçta erken yetiúkinlikte konjestif kalp yetmezli÷ine neden olabilir (66). Antrasiklin uygulama úeklinin rölatif olarak kardiyotoksisite geliútirme riskini artırdı÷ı konusunda kanıtlar bulunmaktadır. Geniú osteosarkom serilerinde doksorubisinin kümülatif olarak 480 mg/m2 4–6 saatlik infüzyon uygulanmasından 1– 12 hafta sonra % 4 oranında ciddi düzeyde klinik kardiyotoksisite geliúti÷i bildirilmiútir (67). Ortalama 341 mg/m2 doksorubisini 20 dakikalık infüzyonla alan 113 kanserli çocukta ise % 13 oranında kardiyak disfonksiyon geliúti÷i ve bunların yarısının progresyon sonucu kalp yetmezli÷inden kaybedildi÷i bildirilmiútir (32). Aynı araútırmacılar doksorubisini 2 saat veya 72 saat infüzyonla uyguladıkları 97 çocukta ise kardiyotoksisiteyi % 1 oranında bildirmiúlerdir (9). Çocuklarda kardiyak toksisite riski yüksek olup özellikle 5 yaúın altında olanlarda daha belirgindir (63, 95, 122). Kümülatif doksorubisin dozu ne kadar fazla ise kızlardaki etkilenmenin o kadar belirgin oldu÷u gözlenmiútir (69). Wilms tümörlü kızlarda konjestif kalp yetmezli÷i için rölatif risk 4,5 olarak bildirilmektedir (7). 16 øzlem süresi arttıkça, kardiyak sorunlarla ilgili bulguların arttı÷ı bilinmektedir (69, 93). Bu artıútan geç baúlangıçlı kardiyotoksisite geliúen hastalar sorumlu tutulmaktadır. Klinik gözlemler dıúında, sürekli veya bolus infüzyonla doksorubisin alan çocuklarda yapılan bir çalıúmada kardiyak troponin T düzeylerinde yükselmeler oldu÷u ve kardiyak hasarın, sürekli infüzyon uygulanan grupta düúük doksorubisin konsantrasyonları ile de önlenemedi÷i vurgulanmıútır (70). Bolus veya infüzyonla uygulanan antrasiklin sa÷altımının geç dönemde yan etkilerini inceleyen geriye dönük bir çalıúmada, bolus alan grupta ekokardiyografiyle % 20 kardiyak disfonksiyon saptanırken, infüzyon alan grupta bu oran % 11 bulunmuútur. Ancak iki grup arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıútır (43). Benzer bulgu, 1 saat ile 48 saat doksorubisin infüzyonunu araútıran bir çalıúmada da saptanmıú, infüzyon süresinin ilerleyici subklinik toksisiteyi engelleyemedi÷i gösterilmiútir (68). Antrasiklinler dıúında mitoksantron, yüksek doz siklofosfamid, amsakrin, bleomisin ve vinkristin de kardiyotoksisiteye katkıda bulunabilmektedir (4, 39). NWTS çalıúmalarında Wilms tümör için sol üst kadran ıúınlamasının rölatif riski 1,8 kat artırdı÷ı görülmüútür ama eú zamanlı mediasten ıúınlaması ve antrasiklin uygulamasının kardiyotoksisiteyi artırdı÷ı geniú olarak kabul edilen bir görüú olmasına karúın bu konuda kesinlik yoktur (7). Sa÷altımdan önce veya sa÷altım aralarında bu de÷erlendirmeler yapılmakla beraber, optimal tarama yönteminin ne oldu÷u ve alınacak sonuca göre nasıl doz modifikasyonu yapılması gerekti÷i de tam bilinmemektedir (50, 71, 110). 17 Bu nedenle gizli kalmıú kardiyotoksisiteyi belirlemek için yeni göstergelere de gereksinim vardır. Günümüzde antrasiklinin kardiyak toksisitesini önlemek için güncel yaklaúımlar úu úekilde açıklanabilir; ilaç uygulama úemalarının de÷iútirilmesi, miyokardı koruyacak ilaçların aynı anda uygulanması, daha az toksik antrasiklin analoglarının ve yeni morfolino antrasiklin türevlerinin geliútirilmesi úeklindedir (8, 21). Haftalık düúük doz uygulamalarıyla veya 6–96 saatlik infüzyonlarla, antitümör etki azalmadan plazmada düúük antrasiklin konsantrasyonları sa÷lanabilir ve kardiyotoksisitenin azaltılabilece÷i bildirilmektedir (1, 24, 48, 64, 103). En çok ümit veren kardiyoprotektif ajan, úelatlayıcı deksrazoksandır ( ICRF– 187). Preklinik çalıúmalar, ilacın antrasiklin kardiyotoksisitesini bloke etme yetene÷inde oldu÷unu göstermiútir (102). Yapılan araútırmalarda klinik ve subklinik kardiyak toksisitenin konjestif kalp yetmezli÷i, nükleer sintigrafilerde sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunun azalması ve endomiyokardiyal biyopsi bulgularının deksrazoksanla belirgin olarak azaldı÷ını göstermiútir (102, 108). Deksrazoksanın kardiyoprotektif etkisi çocuklarda da randomize bir çalıúmada gösterilmiútir (124). Bu grup ilaçların ekstravaze olması durumunda ise önemli ölçüde lokal doku hasarı ve derin a÷ır ülserasyonlar gündeme gelebilmektedir. Bununla birlikte, radyoterapi sırasında kullanılmaları halinde ise antrasiklinler baúta deri, karaci÷er, özofagus, akci÷er ve kalpte oluúan reaksiyonları potansiyelize etme etkisine sahiptirler (102). Cerrahi müdahalelerde ve adjuvant kemoterapik ajanların artan kullanımı yüzünden, daha fazla hastanın kardiyotoksik dozda doksorubisin alması muhtemeldir. Bunlar göz önüne alındı÷ında, risk faktörlerini tanımlama, daha fazla dozu tolere 18 edebilecek hastalar hakkında tahmin yürütme ve mümkünse kardiyomiyopatiyi engelleme konularına duyulan ihtiyaç aúikâr olmaktadır. Doksorubisin kardiyomiyopatinin önlenmesi için, pek çok araútırmacı, doksorubisinin kalp üzerindeki zararlı etkilerinin mekanizmasını destekleyen kuramlara dayanarak, farmakolojik veya egzojen maddelerin kullanımı ya da di÷er yaklaúımlar ile hasar derecesini minimize etmeye çalıúmıúlardır (83). Üzerinde en çok durulan ajanlardan biri tokaferol, yani E vitaminidir. E vitamini farmakolojik ve fizyolojik özeliklerinin yanı sıra serbest radikalleri yok eder. Tavúan ve sıçanlarda E vitamini eksikli÷i, doksorubisin kaynaklı kardiyak lezyonların histopatolojik etkilerine benzer bir miyopatiye yol açar (83). Yakın zamanda Van Vleet ve Ferrans yaptıkları araútırmada E vitamini takviyesinin, doksorubisin ile tedavi edilmiú tavúanların yaúamını uzattı÷ını ancak kardiyomiyopatiden korunmak için sadece çok yüksek dozların iúe yaradı÷ını bildirmiúlerdir (117). E vitamini invitro olarak doksorubisinin indükte etti÷i serbest radikal ve malondialdehyde oluúumunu azaltmaktadır (113). Son olarak, tavúanlarda yapılan uzun dönemli doz araútırmasına göre, Breed ve arkadaúları çok yüksek dozlardaki vitaminin bile kardiyomiyopatiye karúı koruyucu etkisinin olmadı÷ını bildirmiúlerdir (16). Yani, hayvan çalıúmaları yüksek dozda E vitaminin etkileri hakkında çeliúkili sonuçlar sunmuútur. Ancak çalıúmalardan gelen iyi sonuçlardan bazıları olan belirgin toksisite azlı÷ı ve doksorubisinin kemoterapi aktivitesinin de÷iúim göstermemiú olması gözlemleridir ve bu sonuçlar, bu tip çalıúmaların insanlar üzerinde de yapılması için teúvik edici olmuútur. Doksorubisinin hücresel hasarında, DNA yapısını bozması yanı sıra apopitozisi indüklemesi ve serbest oksijen radikalleri üzerinden oluúturdu÷u toksik etki baúrolü 19 oynamaktadır. Serbest oksijen radikallerinden biri olan nitrik oksitin (NO) kardiovasküler sistem patolojilerindeki rolü birçok çalıúmada ortaya konmuútur (40). Garner ve arkadaúlarının bir çalıúmasında doksorubisine ba÷lı kardiyak toksisitede nitrik oksitin sorumlu oldu÷una dair sonuçlar mevcuttur (36). Bu bakıú açısından de÷erlendirildi÷inde lipit peroksidasyonunun engellenmesi ve NO sentezinin azaltılması doksorubisinin myokardial toksisitesini hafifletebilir. Nitrik oksit ve serbest oksijen radikalleri oluúumunu inhibe eden birçok maddenin toksik etkileri önlemedeki rolü çalıúma konusu olmaktadır (40). Doksorubisinin sitotoksik etkisi kısmen molekülün yapısındaki quinone iskeletine ba÷lıdır. Doksorubisinin yapısındaki quinone, bir serbest radikal olan NADPH-sitokrom p–450 tarafından semiquinone çevrilerek serbest oksijen radikalleri oluúumuna neden olur (117). Hanan ve arkadaúlarının bir çalıúmasında 10 mg/kg doksorubisin verilmiú sıçanlarda kalp kasında serbest oksijen radikalleri ve NO düzeylerinin normalin 8 katı düzeylere ulaútı÷ı bildirilmektedir (44). 1.2.4. NøTRøK OKSøT Nitrit Oksit (NO) arjinin amino asidinin guanidin grubunda yer alan, nitrojen atomu ile moleküler oksijenin reaksiyona girmesi sonucu oluúan, lipid ve suda çözünen kısa ömürlü serbest bir radikaldir. Organizmanın birçok iúlevinde ve birçok hastalık durumunda rol alır. Hemen hemen her hücre tarafından üretilir ve her hücre üzerine de etkinlik gösterir. Bu nedenle, nitrik oksit genel aracı bir moleküldür. Endothelium-derived relaxing factor (EDRF) olarak da bilinen nitrik oksit, birçok organ sisteminde mevcuttur (84, 91). NO’ in oluúumunu katalize eden enzim olan nitrikoksit sentaz (NOS) fizikokimyasal ve kinetik özelliklerine göre yapısal ve indüklenebilir olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır. Ayrıca bu enzimin üç tip 20 izoformu bulunmaktadır. Bunlar endotel hücrelerinde eNOS, nöronlarda nNOS ve indüklenebilir form olarak da iNOS úeklinde bulunmaktadır. Sırasıyla kromozom 12 ve 16 tarafından kodlanan, nNOS ve eNOS fizyolojik úartlarda, ilgili reseptörlerin uyarılmasına cevap olarak aktif hale geçerler ve bunun için de Ca ++ 'a ihtiyaç duyarlar, bu nedenle yapısal NOS olarak adlandırılırlar (19). eNOS ve nNOS, asetilkolin ve bradikinin gibi hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu artıran ajanlarca aktiflenir. Nöronlardan ve endotelyal hücrelerden izole edilen kantitatif NOS'in sentez süresi kısa ve üretilen NO miktarı çok düúüktür. Bunun nedeni, hücre içi iyonize kalsiyum konsantrasyonu azalmaya baúladı÷ı anda, enzimin inaktif duruma geçmesidir (85). Hücrede eNOS membrana ba÷lı bulunurken nNOS sitozolde bulunur. Di÷erlerinin aksine, hücre içinde bulunmayan iNOS, kromozom 7 tarafından kodlanır (46, 79). Makrofajlar ve di÷er ba÷ıúıklık hücrelerinde bulunur ve sitokinlerce uyarılır. Bu izoforma ayrıca immünolojik NOS da denilmektedir. Özellikle bakteri lipopolisakkaritleri ve interferon gama (IFNg) ile uyarılan makrofajlar bol miktarda NO üretirler. Bu úekilde iNOS ile üretilen NO sentezi saatlerce hatta günlerce devam edebilir (47, 75). iNOS vasıtasıyla üretilen makrofaj kaynaklı NO, bakteri, parazit ve tümör hücreleri üzerine sitotoksik etki yaparken, DNA ve RNA virüslerinin bazılarının yayılmasını da önlemektedir (86). Vücutta nitrik oksit konsantrasyonu düzenli olarak düúük seviyede dalgalanmalar göstermekte ve eNOS ve nNOS tarafından kontrol edilmektedir. Bu iki enzimin sentezi posttranskripsiyonel seviyede kontrol edilirken, iNOS uygun uyarılara yanıt olarak sentezlenmektedir. Enfeksiyon, enflamasyon veya vasküler travma durumlarında iNOS’un üretti÷i nitrik oksit seviyesi, fizyolojik sınırların oldukça üstündedir. Bu durum, hücresel süperoksit anyon varlı÷ında ileri derecede 21 toksik olan peroksit nitrit molekülünün oluúmasına neden olur ve bunun sonucunda da lipid peroksidasyonu, DNA fragmantasyonu, plazma antioksidanlarının azalması, protein hasarı ve endotelyal düz kas gevúemesinin engellenmesi gibi nedenlerle hücresel hasar oluúabilmektedir (13). Sonuç olarak, di÷er serbest oksijen radikalleri her konsantrasyonda zararlı iken, NO düúük konsantrasyonlarda kan basıncı ve sindirim sisteminin düzenlenmesinden, konak savunması ve özgül olmayan immüniteye kadar birçok önemli fizyolojik olayların düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Di÷er bir deyiúle, nitrik oksit düúük seviyede hücresel fonksiyonları pozitif olarak etkilerken, yüksek konsantrasyonlarda hücre üzerinde toksik etkiler yaratmaktadır (13). NO, proinflamatuar veya antiinflamatuar etkileriyle de akut ve kronik inflamasyonda önemli bir role sahiptir. NO oldukça reaktif bir molekül oldu÷unu peroksinitrit oluúumu yoluyla oksidan etki gösterdi÷ini ve bu oksidan özelli÷i ile bakterisid ve tümör hücrelerine karúı sitotoksik etki de bulundu÷u ve savunma sisteminin bir parçası olarak görev yaptı÷ı çeúitli çalıúmalarda ortaya konmuútur (84, 89). NO’in mast hücre aktivasyonunu inhibe edici etkileri ile ilgili yapılan çalıúmalarda; sıçanlara kimyasal NO uygulanması sonucunda, mast hücre degranülasyonu ve mast hücre ba÷ımlı vasküler endotelyuma lökosit adezyonunda inhibisyon meydana geldi÷i gösterilmiútir (78). Ayrıca NO’in nöroblastoma hücrelerinde p53 aracılı÷ı ile apopitozisi indükleyici etkisi gösterilmesine ra÷men aynı zamanda apopitozis gerçekleúmesinde rol oynayan kaspazlar olarak bilinen enzimlerin aktivasyonlarını engelleyerek 22 apopitozisi engelledi÷i de bildirilmiútir. Doksorubisinin toksik etkisinde apopitozisin varlı÷ı NO’in bu mekanizmadan sorumlu olabilece÷ini düúündürmektedir (123). NO’in çok yüksek konsantrasyonlarda endotel hücreleri, düz kas hücreleri, hepatositler ve fibroblast gibi çok farklı hücre tiplerinde sitotoksik etkiye sahip oldu÷u ve poliaminlerin sentezinde görevli ornitin dekarboksilaz enzimini inhibe ederek hücre proliferasyonunu azalttı÷ı gösterilmiútir (109). C Vitamini, E vitamini, glutatyon, selenyum gibi antioksidan maddelerin serbest oksijen radikallerinin toksik etkilerini azaltmada kullanılabilirli÷i birçok araútırmaya konu olmaktadır. Bu grup içersinde yer alan polifenoller, antisiyaninler, fenolik asitler, stilbenler ve flavinoidleri içeren geniú bir antioksidan aileyi oluúturmaktadır. Bu bileúikler reaktif hidroksil grubu bulunan aromatik bir halka içeren fenilaleninlerden köken alır (34). 1.2.5. RESVERATROL Stilbenlerin alt grubunda yer alan resveratrol 3.5.4'-hidroksistilbene yapısındadır. Resveratrolün trans ve cis olmak üzere iki izomerik formu vardır (18) (ùekil 2). Trans izomeri do÷ada daha yo÷un bulundu÷undan daha çok çalıúmaya konu olmuú ve resveratrol 3.5.4'-trans-hidroksistilbene olarak adlandırılmaktadır (41). 1.2.5.1. RESVERATROLÜN ANTøOKSøDAN ETKøLERø Resveratrolun antioksidan etkisinin çeúitli yönleri son 15 yılda pek çok araútırmaya konu olmuútur (77). Daha önce de anlatıldı÷ı gibi doksorubisin serbest oksijen radikalleri üzerinden etkili olmaktadır. Doksorubisinin bu potansiyel gücü aynı zamanda önemli bir yan etkisi 23 olan kardiotoksisitede de baúrolü oynamaktadır.Resveratrolün bu yan etkiyi azaltmadaki olası etkinli÷i umut verici olarak düúünülmektedir (105). Trans izoformu üzüm, fıstık, bö÷ürtlen ve kurutulmuú Polygonum cuspidatum kökü gibi daha geniú bir bitki yelpazesinde rastlanmıú olup Cis- ve trans- resveratrol, Polygonium cuspidatum’da mevcuttur (45). Resveratrol asmada yani Vitis vinifera da bulunur. Ayurvedik bitki ilacı olan darakchasava’nın baúlıca bileúeni Vitis vinifera’dır ve bu yüzden resveratrol içerir ve kardiotonik olarak ayurvedik ilaçlarda kullanılır (45). Resveratrol moleküler toplanması, hidroksil grupların “flip-flop” hareketi ile oluúan ve kırılan H ba÷larının oldu÷u yerde bir hidrojen ba÷ a÷ı göstermektedir. Bu hareket sayesinde H ba÷ı zinciri boyunca en fazla üç hidroksil hidrojen atomu transfer olabilmektedir. Hidrojen atomlarının transferi, resveratrol molekülü hareketlili÷ini açıklamakta ve bu molekülün biyolojik sistemlerdeki kimyasal reaksiyonlar ile iliúkisine iúaret etmektedir (22). Trans-resveratrolun, insanlarda oral yolla alındı÷ında iyi absorbe edildi÷i görülmesine ra÷men biyolojik toleransı, hızla metabolize ve elimine edilmesi nedeniyle nispeten düúüktür (18) (ùekil: 2). Trans-RSV’nin biyomedikal özellikleri arasında antikarsinojenik, antiinflamatuar, antioksidan ve di÷er etkiler bulunur (ùekil: 3) (35, 104, 121). 24 ùekil 2 - Resveratrolün izomerik formları: trans ve gis (18) 25 ùekil 3 - Trans-resveratrolün metabolizasyonu (35) Resveratrolün süperoksit anyon üzerinde ciddi bir inhibe edici özelli÷i vardır. Ayrıca, lipopolisakkaritler ya da forbol esterleri tarafından stimüle edilen makrofajların hidrojen peroksit üretimini de inhibe eder. Lipopolisakkaritler veya forbol esterleri tarafından indükte edilen ya da superoksite ve hidrojen peroksite maruz kalma nedeniyle ortaya çıkan araúidonik asit salınımı da azalttı÷ı belirtilmiútir. (76). Resveratrolun temizleyici aktivitesi gösterilmiútir ve yakın zamanda glutatyon koruyucu aktivitesine de sahip oldu÷u tespit edilmiútir. Resveratrol, forbol esterleri tarafından stimüle edilen lipopolisakkarit ve makrofaj tarafından üretilen ROS formasyonunu baskılar (76). 26 Resveratrol, test tüpünde serbest radikalleri ve di÷er oksidanları etkin bir úekilde nötralize etmektedir ve düúük yo÷unluktaki lipoprotein (LDL) oksidasyonunu engellemektedir (33,112). Resveratrol ile yapılan tedavi amino asit salınımını azaltmanın yanı sıra, kökeninde O2– ve H2O2 maruz kalma ile stimüle edilen cyclooxygenase–2 (COX–2) etkisizleútirilmesinde de etkilidir (73). COX–2, prostaglandin (PG) sentezi sa÷layan bir enzimdir. Prostaglandin akümülasyonu inflamasyon, a÷rı ve ateúe neden olur. Bu yüzden, resveratrol ile COX–2 regülasyonu sayesinde inflamatuar tepkilerin regülasyonu da mümkün olabilir (17, 76) Bakır iyonlarının mevcut oldu÷u durumlarda resveratrol DNA fragmantasyonunu ilerletti÷ini gösteren kanıtlar vardır. øndirgeyici ajanlarının mevcut oldu÷u durumlarda resveratrolun güçlü bir antioksidasyon etkisi vardır. Bir indirgeyici ajan olarak hareket eden resveratrol, DNA-ba÷lı bakır (II) iyonları ile hidroksil radikalleri (HO-) oluúumunu ilerletir (18). Resveratrol, glutathione sisteminde, glutathione disulfide oluúumunu inhibe ederek HO- oluúumunu baskılar. Böylelikle, resveratrolun indirgeyici madde varlı÷ında güçlü bir antioksidan oldu÷u öngörülmektedir. Jang ve Surh resveratrolun oksijen ara basamak türevlerini inhibe edebilece÷ini ve hücrenin apopitotik ölümünü zayıflatabilece÷ini göstermiúlerdir (52). Resveratrolun oral alımından sonra insanlarda dolaúımdaki ve hücre içi seviyesinin, C vitamini, E vitamini ve glutathione gibi di÷er önemli antioksidanların dolaúımdaki ve hücre içi seviyelerinden çok daha düúük olması muhtemeldir. Hatta dolaúımdaki resveratrolün ço÷unlu÷unu oluúturan resveratrol metabolitlerinin antioksidan aktivitesi, resveratrolün kendi antioksidan aktivitesinden bile daha düúük olabilir (121). 27 1.2.5.2 RESVERATROLÜN ESTROJENøK ETKøLERø Resveratrolun estrojenik ve anti-estrojenik aktivitesi son derece ilgi çekici bir özelli÷e sahiptir. Resveratrolun kimyasal yapısı sentetik östrojen agonisti, diethylstillbestrole benzer. Bu durum, resveratrolün östrojen agonisti gibi iúleyebilece÷ine iúaret eder. Resveratrolün kardiovasküler koruma sa÷lamada yardımcı olacak östrojenik etkilerinin oldu÷unu gösteren baúka kanıtlar da vardır. Diethylstilbestrole yapısal bir benzerlik gösteren trans-resveratrol farklı test sistemlerinde de÷iúken östrojen reseptörü affinite dereceleri olan bir phytoöstrojendir. Ancak, resveratrol hücre kültürlerinde yapılan deneylerde bazı úartlarda östrojen agonisti gibi bazı úartlarda östrojen antagonisti gibi hareket etmiútir (ùekil: 4) (15). ùekil 4 - Resveratrolün Endoplazmik Retikulum üzerinden hücre kineti÷ine etkisi (15). 28 ùu anda görünen resveratrolun, hücre tipine, östrojen reseptör izoformuna (ER alfa ya da ER beta) ve endojen östrojen mevcudiyetine ba÷lı olarak östrojen agonisti veya antagonisti gibi hareket etme potansiyelinin oldu÷udur (15). Son olarak, resveratrolün doz-ba÷ımlı bir kullanımda herpes simpleks virüs tip 1 ve 2’ye karúı aktivite gösterdi÷i tespit edilmiútir. Resveratrolun viral üreme döngüsü baúlangıcında kritik bir ilk iúlemi bozdu÷u görülmüútür (37). Bu konuda daha fazla araútırmaya ihtiyaç vardır. 1.2.5.3. RESVERATROLÜN BøYOLOJøK ETKøLERø Resveratrolün görüldü÷ü gibi kanser önlenmesinde biyolojik aktivitesi çok büyüktür. Resveratrol ba÷lantılı antikanser ilaçlarının immün stimüle edici etkileri hakkında henüz baúlangıç seviyesinde olan bazı bulgular vardır. Süperoksit ve hidrojen peroksit gibi reaktif oksijen türleri aerobik ortamlı hücrelerde devamlı olarak ço÷alırlar. Hücre ortamını oksidize eden ROS akümülasyonu, hücre büyümesi ve tümör oluúumu ile iliúkilendirilmektedir (5). Genellikle in vitro olan bazı araútırmada resveratrol tümör oluúumunu, promosyonunu ve ilerlemesini inhibe edici etkiler göstermiútir. Daha önce de÷indi÷imiz gibi, resveratrolun antiproliferatif aktivitesi, memeli hücrelerinde ribonucleotide reductase ve DNA sentezi inhibe edici yetisine ba÷lanmaktadır (3). Vücutta bulunan bazı bileúenler sitokrom P540 enzimleri tarafından metabolize edilene kadar karsinojenik de÷ildirler (26). Resveratrol bazı sitokrom P540 enzimlerinin oluúum ve aktivitelerini engelleyerek, aktif halde olan bu karsinojenlere maruz kalmayı azaltabilir ve böylece kanseri önlemeye yardımcı olabilir (23, 26). Vücut dıúında kültüre edilen hücrelere 29 eklendi÷inde resveratrolun insanlarda meme, prostat, mide, kolon, pankreas ve tiroid kanser hücrelerinin ço÷almasını engelledi÷i tespit edilmiútir (3). Resveratrolun insan metabolizmasındaki durumunu inceleyen araútırmaların öne sürdü÷üne göre, çok yüksek dozlarda alınacak resveratrol bile kültür hücrelerinde elde edilen etkilerin insanlarda görülebilmesi sa÷layacak hücre de÷erlerine ulaúamayabilir (121). Resveratrolün kanser önleyici aktivitesini bildiren raporlardan bu yana, resveratrolun apopitozis indüksiyonu etkisi ve oksidatif DNA hasarına karúı koruma etkileri derinlemesine incelenmiútir (20, 35, 53). Ayrıca ikinci faz biotransformasyon enzimlerinin aktivitesinin arttırılması ile toksik ve kardiojenik olan kimyasalların atılmasına yardımcı olmaktadır. Resveratrolün kültür hücrelerinde ikinci faz enzimi NADP-H: quionine reductase’ın oluúum ve aktivitesini arttırdı÷ı da gözlemlenmiútir (52). DNA onarımı söz konusu oldu÷unda, DNA’daki hasar onarılamayacak durumda ise hücre apopitozise yönlendirilir ve sonrası bu iúlemin aktivasyonu için, hücre döngüsü (cell cycle) geçici olarak durabilir (127). Kötü hücre döngüsü düzeni (cell cycle regulation) mutasyonların ço÷almasına yol açabilir. Resveratrolün, kültür hücrelerinde yaratılmıú kanser hücrelerine eklendi÷inde hücre devri duraklamasına yardımcı oldu÷u tespit edilmiútir. Bilindi÷i gibi kanser hücreleri hızla ço÷alırlar ve apopitozise u÷rayarak sinyallerine cevap verme yetisini kaybederler (20). Resveratrolun bazı kanser hücrelerinde ço÷almayı engelledi÷i ve apopitozise yardım etti÷i tespit edilmiútir. Resveratrolun hem meme karsinomu, hem de lösemi hücrelerinde apopitotik hücre ölümü indükte etti÷i belirtilmiútir (52). 30 Kanser hücreleri matriks metalloproteinaz adındaki enzimlerden yardım alarak sa÷lıklı dokuları istila ederler. Resveratrolun en azından bir matriks metalloproteinaz türünün aktivitesini engelleyebildi÷i tespit edilmiútir (126). Resveratrolun tümör baúlangıcı ve ilerlemesi gibi hücresel olayları inhibe etti÷i tespit edilmiútir. Bunun yanında ribonucleotide reductase, DNA polymeraz, insan memesinde bulunan epitel hücredeki COX–2 transkripsiyonu ve ornitin dekarboksilaz aktivitesini de inhibe etmektedir (59). Resveratrolun siklooksigenaz (COX) ve lipoksigenaz gibi pek çok inflamasyon enzimi üzerinden angiogenezisi in vitro olarak engelledi÷i bilinmektedir (59). Resveratrolun, kültür endoteliyal hücrelerde eNOS aktivitesini stimüle etti÷i tespit edilmiútir (122). eNOS, vasküler endoteliyal hücreler ile NO oluúumunu katalize eden bir enzimdir. NO, arteriyel geniúleme (vasodilation) sa÷lamak için gerekli olup zayıf bir NO ba÷ımlı vazodilatasyonunun kardiyovasküler hastalık riskini arttırdı÷ı düúünülür (30). 1.2.5.4. RESVERATROLÜN YAN ETKøLERø Resveratrolun yan etkilerinden bahsetmek gerekirse, toksik oldu÷u ya da insanlarda yan etkiye yol açtı÷ına dair bir bilgi yoktur. Bunun yanı sıra yapılan kontrollü klinik deney sayısı ise çok azdır. Yapılan deneylerden örnek vermek gerekirse sıçanlarda vücut a÷ırlı÷ının 300 mg/kg fazlasına kadar alınan oral resveratrol dozları hiç bir yan etkiye neden olmamıútır (27, 55). Teorik olarak, yüksek dozda resveratrolün (örne÷in destekleyiciler ile) warfarin (Coumadin) gibi antikoagulan ilaçlarla ve clopidogrel (Plavix), dipyridamole 31 (Persantine), non-steroidal antiinflamatuar ilaçlar (NSAID’ler), aspirin ve di÷erleri gibi anti-trombosit ilaçlar ile beraber alınmasının kanama riskini arttırması mümkündür. Cytochrome P450 3A4 ile metabolize edilen ilaçlarda resveratrolun sitokrom P450 3A4 (CYP3A4) aktivitesini in vitro engelledi÷i bildirilmiútir (94). ønsanlardaki etkileúimi bilinmemesine ra÷men, yüksek dozda resveratrol alımının biyolojik toleransı ve CYP3A4 ile yo÷un ilk geçiú metabolizasyona u÷rayan ilaçların toksitesini artırması beklenir. CYP3A4 tarafından metabolize edildi÷i bilinen ancak bu listeyle sınırlı kalmayan ilaçların bazıları HMG-CoA redüktaz inhibitörleri (atorvastatin, lovastatin ve simvastatin), anti-aritmik ajanları (amiodarone), HIV proteaz inhibitörleri (saquinivir), immün baskılayıcıları (cyclosporine ve tacrolimus), antihistaminler (terfenadine), benzodiazepineler (midazolam ve triazolam) ve erektil bozukluk tedavisinde kullanılan (sildenafil) gibi ilaçlardır (94). Hayvan ve sınırlı sayıda insan deneyinden anlaúıldı÷ı üzere, resveratrol mideye ulaúmasının ardından gastrointestinal sistem tarafından emilir. Ancak absorbe ediliúinin verimlili÷i gibi da÷ılımının, metabolize edilmesinin ve atılmasının verimlili÷i de bilinmemektedir (116). Resverartolun de÷iúik formlarındaki farmokineti÷inin anlaúılması için daha fazla araútırmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Hem in vivo hem in vitro karsinojenik adımları zorlaútırma, hatta engelleme özelli÷inin oldu÷u kanıtlanmıútır. Günümüzde resveratrolun çeúitli doku, organ ve deney hayvan modellerinde farklı tepkileri düzenledi÷i bilinmektedir (105). Resveratrolun bazı aktiviteleri çeliúkili olmuú ve olmaya devam etmektedir. Heyecanlandırıcı gerçeklerden biri bu bileúenin günlük tüketilen pek çok meyve ve sebzede bulunmamasına ra÷men, çözülebilen hali ile kırmızı úarapta bulunuyor 32 olmasıdır. Di÷er resveratrol kaynakları üzüm, fıstık, bö÷ürtlen, Brüksel lahanasının bazı çeúitleri ve beslenmeye yardımcı takviyelerdir (45). Resveratrol içeren kırmızı úarap ve kırmızı üzüm özleri ve di÷er polifenoller de beslenmeye yardımcı ürünler olarak sunulmaktadır Hindistan, Japonya ve Çin’de geleneksel tıp yöntemlerinde resveratrol yıllardır antioksidan, antimutajen ve antiinflamatuar olarak kullanılmaktadır (104). Ne var ki, resveratrolün bütün potansiyeli gelecekte yapılacak klinik araútırmalar ile anlaúılabilecektir. Yakın zamanda resveratrolün, hücre kültürü ve hayvan modellerinde kanser yayılmasını engelleyici ve hayat süresini uzatıcı potansiyelini bildiren raporlar sunulmuútur ve bu raporlar resveratrole olan bilimsel ilgiyi artırmaya devam ettirmektedir (35, 52). 33 BÖLÜM II GEREÇ VE YÖNTEM Araútırmada kullanılan sıçanlar Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Üretme Çiftli÷inden temin edilerek, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıútır. Araútırma, Ege Üniversitesi Deneysel Cerrahi Anabilim Dalı Laboratuarı, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Farmakoloji Anabilim Dalı ve Biyokimya Anabilim Dalı, Dr. Behçet Uz Çocuk Hastalıkları ve Cerrahisi E÷itim ve Araútırma Hastanesi Patoloji Laboratuar’ında gerçekleútirilmiútir. Deney Hayvanları: Bu çalıúmada 50 adet 8–10 haftalık, a÷ırlıkları 170–240 gram olan Wistar albino sıçan kullanılmıútır. Hayvanlar deneysel tıp merkezi laboratuarının standart koúulları olan 22±5 ºC sıcaklıkta, %50±20 ba÷ıl nem ortamında 12 saat karanlık 12 saat aydınlık evrede tutulup standart sıçan yemi ve çeúme suyu ile beslendi. Deney hayvanları 6 gruba ayrılarak aúa÷ıda belirtilen deneysel iúlemler uygulandı (Tablo: 1): Grup 1: [Kontrol grubu, n=5]: Gerekli cilt antisepsisi yapıldıktan sonra 2 cc serum fizyolojik (SF) intraperitoneal olarak verildi. Grup 2: [Resveratrol grubu, n=10]: 10 mg/kg resveratrol Dimetilsülfoksid içinde çözdürülerek intraperitoneal olarak uygulandı. 34 Grup 3: [Doksorubisin grubu, n=9]: 20 mg/kg doksorubisin tek doz intraperitoneal olarak uygulandı. Grup 4: [Doksorubisin+Resveratrol grubu, n=9]: 20 mg/kg doksorubisin ve DMSO içinde çözülmüú olarak 10 mg/kg resveratrol aynı zamanda uygulandı. Grup 5: [Doksorubisin+3-Resveratrol grubu, n=7]: 20 mg/kg doksorubisin uygulamasından 3 gün sonra DMSO içinde çözülmüú olarak 10 mg/kg resveratrol uygulaması yapıldı. Grup 6: [DMSO grubu, n=5]: 2 cc DMSO intraperitoneal olarak verildi. Grup 1: Kontrol grubu (SF verilen grup) Grup 2: Resveratrol verilen grup Grup 3: Doksorubisin verilen grup Grup 4: Doksorubisin ve resveratrol aynı anda verilen grup Grup 5: Doksorubisinden 3 gün sonra resveratrol verilen grup Grup 6: DMSO çözücü verilen grup Tablo 1: Gruplar 35 Resim 1: Deney hayvanlarına intraperitoneal olarak doksorubisin, resveratrol, DMSO ve SF uygulanması Doksorubisin: Deva firmasının piyasada satılan Adriablastina isimli ilacının 10 mg’lık flakonları kullanıldı. Resveratrol: Cayman Chemical Company (1180 E. Ellsworth Rd. Ann Arbor MI USA)’den satın alınarak kullanıldı. Dimethylsulfoxide (DMSO): Sigma Chemical Co. (St Louis, Missouri, USA)’dan satın alınarak resveratrolü çözdürmek amacıyla kullanıldı. Deneysel iúlemler sırasında teknik nedenlerle 5 adet sıçan öldü÷ünden deney dıúında bırakıldı. 36 Resim 2: Sıçanların kapalı eter uygulaması ile sakrifiye edilerek otopsiye baúlanması Sıçanların a÷ırlıkları deney baúında ve sonunda olmak üzere 2 kez tartılarak a÷ırlık ölçümleri kaydedildi. Deney gruplarındaki tüm sıçanlar 7. günün sonunda kapalı eter uygulaması ile anestezi iúleminden sonra sakrifiye edilip otopsileri yapıldı. Çıkarılan kalplerin sol yarıları alınarak histolojik incelemeye alındı (Resim: 1,2). Histolojik inceleme: Sol yarıları disseke edilmiú olan kalpler 2 gün % 10 tamponlanmıú formaldehit içersinde bekletilerek tespit edildi. Daha sonra 3 mm kalınlıkta olacak úekilde vertikal eksende örnekler elde edilerek doku takip iúlemine alındı. Doku takip cihazında (øntelsint RV1) dereceli alkol, ksilol ve parafin istasyonlarından oluúan iúlemler sonucunda dokular parafine gömüldü. 2.1. IùIK MøKROSKOBU TAKøP YÖNTEMø: 1. % 80 alkol 2 saat 2. % 95 alkol I 2 saat 3. % 95 alkol II 1 saat 37 4. Absolu alkol (% 100) I 1 saat 5. Absolu alkol II 2 saat 6. Xylol I 20 dk 7. Xylol II 20 dk 8. Xylol III 20 dk 9. Parafin I 45 dk 10. Parafin II 1 saat 11. Parafin III 1 saat Parafin bloklardan elde edilen 5 mikron kalınlı÷ındaki kesitler bir tanesi rutin boyama için, di÷er 3 tanesi ise polilizinli olmak üzere 4 lam’a alındı. Rutin preparatlar Hematoksilen Eozin (HE), lizinli preparatlar ise p53 ve eNOS antikorları ile immünohistokimyasal boyama için ayrıldı. 2.2. HEMATOKSøLEN EOSøN BOYA HAZIRLANMASI VE BOYAMA TEKNøöø: Hematoksilen solüsyonu: Hematoksilen, kristal 5 gr % 95 alkol 50 cc Amonyum 100 gr Distile su 1000 cc Mercuric oxide 2.5 gr Asid Alkol: % 70 alkol 1000 cc HCl 10 cc 38 Amonyaklı Su: Distile su 1000 cc Amonyak 1–2 cc Eosin Solüsyonu: Eosin Y, % 3 sudaki solüsyonu 100 cc % 95 alkol 125 cc Distile su 375 cc Hematoksilen Eosin Boyama Tekni÷i: 1. Prepratlar 60 ºC ayarlı etüvde 3 saat bekletildi. 2. Deparafinizasyon Xylol I 10 dk 3. Deparafinizasyon Xylol II 15 dk 4. Absolu alkol I 5 dk 5. Absolu alkol II 5 dk 6. % 95 alkol 5 dk 7. % 80 alkol 5 dk 8. Distile su 5 dk 9. Hematoksilen 4 dk 10. Çeúme suyu 2 dk 11. Asit-alkol 2 kez batır-çıkar 12. Çeúme suyu 2 kez batır-çıkar 13. Amoyaklı su 2 kez batır-çıkar 14. Çeúme suyu 2 kez batır-çıkar 15. Distile su 3 dk 16. Eozin 1 dk 17. % 95 alkol 2 dk 39 18. Absolu alkol 2 dk 19. Absolu alkol II 2 dk 20. Kurutma 21. ùeffaflandırma xylol I 5 dk 22. ùeffaflandırma xylol II 5 dk 23. Lam üzerine entellan damlatma 24. Lamel ile kaplama ve kurutma Iúık mikroskobunda HE boyalı kesitler histolojik olarak incelendi. Histolojik incelemede; kas liflerini boyanma farkı, fibril düzensizlikleri, hidropik dejeneresans, apopitozis, nekroz ve yangısal hücre infiltrasyonu açısından de÷erlendirilmeleri yapıldı. % 10’ dan fazla myofibrilde hidropik dejeneresans, % 10’ dan fazla apoptotik hücre varlı÷ı, en az 3 yan yana myofibrilin nekrozu ve polimorf nüveli lökosit toplulukları incinme (toksik etki) olarak kabul edildi. 2.3. øMMÜNOHøSTOKøMYASAL BOYAMALARDA KULLANILAN TAKøP VE BOYAMA øùLEMLERø: Primer antikor olarak p53 için DO–7 + BP53–12 klonu (Labvision, Fremont, US), eNOS için pS1179 klonu (Zymed, California, USA) kullanıldı. Konsantre primer antikor p53 için 1/400, eNOS için 1/250 dilüsyon ile çalıúıldı. Universal kit olarak iúaretli Avidin-biotin peroksidaz metodu (LSAB) (Dako, Denmark) ile yapılan immünohistokimyasal boyamanın detayı aúa÷ıdaki úekildedir: 1. Parafin bloklardan distile suya kadar getirilen kesitler PBS’de (Phosphat Buffer Solution) 1 saat 2. % 3 H²O² 5 dk 40 3. Çeúme suyunda yıkama 4. PBS 5 dk 5. Blokan antikor 10 dk 6. PBS 5 dk 7. 0.001 mol/L EDTA solution (pH 8.5) içersinde mikrodalga fırında (400 W) 20 dk kaynatma ve 20 dk so÷utma 8. PBS 5 dk 9. Primer antikor 2 saat 10. PBS 5 dk 11. Biotinylated sekonder antikor 45 dk 12. PBS 5 dk 13. Streptavidin/peoksidaz kompleksi 45 dk 14. PBS 5 dk 15. Diaminobenzidine tetrahyrocloride (DAB) 5 dk renklendirme 16. Çeúme suyu 5 dk 17. Meyer Hematoksilen 2 dk zıt boyama 18. Çeúme suyu 2 dk 19. % 80 alkol 2 dk 20. % 95 alkol 2 dk 21. Absolü alkol 2 dk 22. Kurutma 23. Entellan ile lamel kapama ømmünohistokimyasal boyama sonucunda 3 büyük büyütme alanında (x400; Nikon E400) p53 antikoru ile pozitif boyanan myofibril nükleuslarının sayısı saptanarak yüzde hesabına geçilerek kantitatif, eNOS için ise kahverengi boyanan 41 alanlar bulunması pozitif kabul edilerek semikantitatif olarak de÷erlendirmesi yapılmıútır. HE ve immünohistokimyasal boyama yapılan preparatlardaki demonstratif alanlar Nikon Coolpix 4500 ile incelenmiú ve foto÷rafları çekilmiútir. 2.4. ELEKTRON MøKROSKOP TAKøP øùLEMLERø: 1. %2,5 ‘luk fosfat tamponlu gluteraldehit içinde immersiyon tespiti sa÷landı (minimum) 2 saat. 2. Tespit edilen parçalar fosfat tamponuna alındı. 3. Post fiksasyon için 1:1 oranında osmium tetroksid (OsO4)+Milloning tamponu eklendi. 4. 1,5–2 saat. Parçalar temiz bir tüpe aktarıldı. 5. Üzerine milloning tamponu eklenerek bekletildi. 6. %50 Alkol 15 dakika. 7. %50 Alkol 15 dakika. 8. %70 Alkol 25 dakika. 9. %95 Alkol 25 dakika. 10. %100 Alkol 30 dakika. 15 dakika. 11. %100 Alkol 15’er dakika serilerinden geçirildi. 12. Parçaların dehidrasyonu sa÷landıktan sonra, 13. 1:1 oranında %100 Alkol-propilen oksit 50 dakika, 14. Saf propilenoksit 30 dakika. 15. Saf propilenoksit 30 dakika bekletildi. 16. Örnekler temiz tüplere alındı. 17. 2:1 oranında propilenoksit-epon karıúımında bekletildi. 60 dakika. 18. 1:2 oranında propilenoksit-epon karıúımında bekletildi. 60 dakika. 19. Sonrasında parçalar, 42 20. Epon karıúımına (DMP-30’suz) alınarak bir gece (parçalar tüpün dibine çökene kadar) buzdolabında +4°C’de bekletildi. Parçalar daha sonra, 21. %1,5-2 oranında DMP-30 ihtiva eden epon içerisinde Beem G360-1 piramidal kapsüllere gömüldü. 22. 37°C’de etüvde 24 saat bekletildi. 23. Etüvün ısısı 45°C’ye yükseltildi. 24 saat. 24. Etüvün ısısısı 60°C ye yükseltildi. 24 saat. 25. Parçalar en az 10 gün oda ısısında laboratuarda bekletilerek epon blokların tam olarak sertleúmesi sa÷landı. 26. Reichert, Austria Nr.313864 ultramikrotom aracılı÷ıyla kalp dokusunun yarı ince kesitleri alındı ve toluidin mavisi ile boyanarak Olympus BX51 marka ıúık mikroskobu ile incelenerek de÷iúik büyütmelerde foto÷rafları çekildi. 27. ønce kesitler bakır gridler üzerine alınarak uranil asetat kurúun sitrat sitrat boyaması yapıldı. Transmisyon elektron mikroskobu (Zeiss EM 9) ile çeúitli büyütmelerde incelenerek elektron mikrografları çekilerek de÷erlendirmesi yapıldı. Elektron mikroskop takibinde kullanılan fiksatifler ve tamponların hazırlanması: Gluteraldehit fiksatifi (Milloning fiksatifi): Milloning tamponu: A: 13,36 gr. NaHPO4.H2O 300 ml. B: 15,36 gr NaOH 300 ml. C: 32,4 gr sukroz 300 ml. D: 207,5 ml A solüsyonu+42,5 ml B solüsyonu Tampon solüsyonu, 25 ml C solüsyonu üzerine 25 ml D solüsyonu eklenip total hacim distile su ile 500 ml’ye tamamlanarak (pH:7,2-7,4) hazırlandı. Sonuçta; 43 %25’lik ticari gluteraldehit solüsyonundan %2,5’lik gluteraldehit fiksatif için, üzerine Milloning tamponundan 1:9 oranında karıútırılarak çalıúma solüsyonu elde edildi. Osmium tetroksid fiksatifi: Stok solüsyonunun hazırlanmasında kullanılacak úiúenin koyu kahverengi, geniú a÷ızlı ve kapa÷ının sıkıca kapanıyor olması ve iúleme baúlamadan önce úiúenin iyice temizlenmesi gerekmektedir. 100 cc’lik önceden dikkatle temizlenmiú úiúe bir gece sülfirik asitte bekletildi. Daha sonra distile su ile iyice yıkanıp etüvde kurutuldu. Osmium tetroksid ampulü önceden temizlendi ve bir ucu ampul testeresi ile çizildi. Bu úekilde ampul 1 saat sülfirik asitte bekletildikten sonra distile su ile yıkandı. ùiúenin içerisine 50 cc distile su konulduktan sonra bir pens yardımıyla tutulan ampul benzen alevinde ısıtıldı ve so÷umadan úiúenin içerisine atılıp kırılması sa÷landı. Kullanımdan bir gün önce hazırlanması gereken osmium tetroksit çözeltisi tüm kristallerin iyice erimesi için bir gün oda ısısında bekletildi. Hazırlanan %2’lik osmium tetroksit çözeltisi açık sarı renkte ve berrak görünüúlü olup +4C’de haftalarca saklanabilmektedir. Tuzlu fosfat tamponu: 0,663 gr. NaH2PO4.H2O 4,04 gr.Na2HPO4.7H2O 8,78 gr. NaCl 1000 ml. Distile suda eritilip pH:7,4 alabilmesi için 1N NaOH solüsyonu damlatılarak hazırlandı. Fiksatif için OsO4 stok solüsyonu ve tuzlu fosfat tamponu 1:1 oranında karıútırılarak postfiksasyon için OsO4 fiksatifi elde edildi. 44 Elektron mikroskobu için kullanılan boyaların hazırlanması ve boyama metodları: Toluidin mavisi boyama yöntemi: Stok solüsyon: Toluidin mavisi 0,1 gr. Borax 1 gr. Distile su 50 cc. Hazırlanan karıúım bir gün bekletildi. Çalıúılaca÷ı zaman stok solüsyondan 25 cc alınarak üzerine 25 cc distile su ilave edilerek 1:1 oranında dilue edildi. Kesitler 65˚C-95˚C’deki etüvde 1-2 dakika tutularak boyandı Uranil asetat hazırlanması: Uranil asetat 3,75 gr. Distile su 50 cc. 50 cc kaynatılmıú so÷utulmuú distile suda uranil asetat konarak 15 dk. karıútırıldı. Üzeri parafin ile kapatılarak 2 saat buzdolabında bekletildi. Stok solusyondan 5 cc. Alınarak 5 cc. Etanolde 1800 devirde so÷uk santrifüj yapıldı. Diúçi mumunda damla üzerine kesitler ters konarak 5 dk. boyanması sa÷landıktan sonra distile su ile yıkandı ve kurumaya bırakıldı. Kurúun boyası hazırlanması: Kurúun nitrat 1,33 gr Sodyum sitrat 2,137 gr. 30 cc. Kaynatılmıú suya konarak karıútırıldı. 8 cc. 1 N NaOH eklendi. Toplam hacim 50 ml. Distile suya tamamlanarak stok solusyon hazırlandı. So÷utmalı santrifüjde 1800 devirde 20 dk. santrifüj yapıldı. Diúçi mumu ile kaplı petri kutusunun bir kenarına NaOH parçası kondu 20 dk. bekletildi. Distile su ile yıkandı. Zeiss EM 9 transmisyon elektron mikroskobunda incelendi (6, 60). 45 2.5. NøTRøT-NøTRAT DÜZEYLERøNøN ÖLÇÜMÜ: Nitrit düzeylerinin ölçümü: Doku nitrit tayini Griess reaksiyonunu temel alan kolorimetrik yöntemle çalıúılmıútır (14). Nitritin asit ortamda sülfanilamid ile diazotizasyona u÷ratılması sonucu diazonyum tuzu oluúmaktadır. Bu tuz daha sonra N-etilendiamin ile eúleúerek 540 nm dalga boyunda kırmızı bir bileúik oluúturmaktadır. Nitrat ise sülfanilamid ile diazotizasyona u÷ramadı÷ı için öncelikle nitrite indirgenmeli daha sonra Griess reaksiyonuna sokulmalıdır. Doku homojenatına eúit miktarda deproteinize edici çözelti eklendikten sonra 3000 devirde 15 dakika santrifüj edilir. Elde edilen süpernatanttan 0.5 ml alınarak üzerine 0.5 ml Griess çözeltisi eklenir. 10 dakika sonra oluúan renk 540 nm dalga boyunda spektrofotometrede köre karúı okunur. Nitrit de÷erleri çizilen standart grafikten hesaplanır (mikromol/mgr protein). Nitrat düzeylerinin ölçümü: Dokularda nitrat miktarlarının tayini için ‘nitrat redüktaz’ yöntemi kullanılmıútır (14). Nitrat redüktaz enzimi aracılı÷ı ile β-NADPH, NADP’ye yükseltgenir. Bu reaksiyon sırasında β-NADPH kullanımına ba÷lı miktardaki azalma 340 nm dalga boyunda ölçülmektedir. øúlemlere baúlamadan önce doku homojenatlarının eúit miktarda deproteinizasyon çözeltisi ile deproteinize edilmesi gerekmektedir. 3000 g’de 15 dakika santrifüj edilen örneklerin süpernatantı ayrılmakta ve nitrat tayini için kullanılmaktadır. øúlemler tamamlandıktan sonra örnekler karanlık bir ortamda oda sıcaklı÷ında 90 dk bekletildikten sonra spektrofotometrede 340 nm’de distile suya karúı okunur. Sonuçlar mikromol/mg protein olarak verilir. 46 Total nitrit-nitrat (NO) düzeyinin hesaplanması: Griess reaksiyonu ile tayin edilen doku nitrit düzeyi ile ölçülen doku nitrat düzeyi toplandı÷ında bulunan sonuç bize total nitrit-nitrat (NOx) düzeyini vermektedir. Sonuçlar mikromol/mg protein olarak verilmiútir. Kalp dokusunda nitrit, nitrat ve total nitrit-nitrat düzeyleri Anova, Mann-whitney U analizleri yapılarak grafiklerde de÷erlendirilmiútir. østatiksel analizler: Histopatolojik de÷erlendirmeler ile elde edilen sonuçlar SPSS 11,5 software programında parametrik de÷iúkenler için Pearson korelasyon, nonparametrik de÷iúkenler için ise Mann-Whitney U karúılaútırma testi ile istatistiksel olarak de÷erlendirilmiútir. østatistiksel anlam açısından p de÷erinin 0.05’ten küçük olması esas alınmıútır. 47 BÖLÜM III BULGULAR 3.1. AöIRLIK ÖLÇÜM BULGULARI Deney hayvanlarından 7. günün sonundan önce ölen 5 tanesi sonuçlarda standardı sa÷lama amacıyla çalıúma dıúı bırakılmıútır. Söz konusu ölen sıçanlardan 3 tanesi Grup 5’te (önce doksorubisin 3 gün sonra resveratrol uygulanan grup), biri Grup 4’te (doksorubisin+resveratrol grubu), biri ise Grup 3’te (doksorubisin uygulanan grup) yer almakta idi. Sıçanların 7 gün sonraki vücut a÷ırlık de÷iúimleri hesaplandı÷ında doksorubisin alan tüm sıçanlarda kilo kaybı gözlenmiútir. Kontrol grubunda (Grup 1) ortalama 10 ± 7,07 gr, Grup 2’de ise ortalama 14 ± 8,43 gr a÷ırlıkta artıú dikkati çekmektedir. En fazla kilo kaybı ortalama 53 ±12,53 gr ile Grup 5’de olup, bunu 49 ± 20,27 gr ile Grup 4, 38 ± 19,86 gr ile Grup 3 ve 16 ± 11,40 gr ile Grup 6 izlemiútir. Deney hayvanları gruplarının ortalama a÷ırlık de÷iúiklikleri Grafik 1’de verilmiútir. østatistiksel olarak Pearson korelasyon testinde a÷ırlık de÷iúimleri açısından gruplar arasında anlamlı bir fark saptanmıútır (p=0,000) (Tablo: 2). 48 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Grup SF KONTROL SF KONTROL SF KONTROL SF KONTROL SF KONTROL RESVERATROL 1 RESVERATROL 2 RESVERATROL 3 RESVERATROL 4 RESVERATROL 5 RESVERATROL 6 RESVERATROL 7 RESVERATROL 8 RESVERATROL 9 RESVERATROL 10 DOXORUBøSøN 1 DOXORUBøSøN 2 DOXORUBøSøN 3 DOXORUBøSøN 4 DOXORUBøSøN 5 DOXORUBøSøN 6 DOXORUBøSøN 7 DOXORUBøSøN 8 DOXORUBøSøN 9 DMSO 1 DMSO 2 DMSO 3 DMSO 4 DMSO 5 RESVE + DOXO 1 RESVE + DOXO 2 RESVE + DOXO 3 RESVE + DOXO 4 RESVE + DOXO 6 RESVE + DOXO 7 RESVE + DOXO 8 RESVE + DOXO 9 RESVE + DOXO 10 DOXO - - > RESVE 1 DOXO - - > RESVE 2 DOXO - - > RESVE 3 DOXO - - > RESVE 4 DOXO - - > RESVE 5 DOXO - - > RESVE 6 DOXO - - > RESVE 7 Lab. No 1 2 3 4 5 15 16 17 18 19 20 27 22 23 24 38 39 11 14 40 12 13 41 42 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 49 50 37 43 44 45 46 47 48 Baúlangıç Bitiú 220 230 240 250 200 210 230 230 190 210 220 250 200 210 180 190 190 190 170 180 160 180 210 220 210 220 210 230 200 220 200 170 210 180 190 130 190 120 200 160 210 210 200 170 170 130 200 160 210 190 180 180 260 230 200 180 190 180 210 160 190 150 210 150 190 170 220 180 210 120 200 140 180 150 200 150 230 160 200 150 170 130 180 130 180 130 180 140 190 120 Tablo 2: A÷ırlık ölçüm de÷iúiklikleri. 49 20 10 0 Ortalama -10 a÷ırlık -20 de÷iúimleri -30 (gr) -40 -50 -60 1 Deney Hayvan Grupları Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 Grup 5 Grup 6 Grafik 1: Deney gruplarının ortalama a÷ırlık de÷iúim grafi÷i, 3.2. IùIK MøKROSKOBUNDA HøSTOLOJøK DEöERLENDøRME Kalp dokusunda hasar bulguları en fazla yalnızca doksorubisin alan grupta gözlenmiú olup, bu grup içersinde en çok saptanan lezyon, 4 sıçanda gözlenen myokard nekrozu olmuútur (Resim: 5, 11). Bu gruptaki 2 deney hayvanında yaygın olarak kalp kası hücrelerinde vakuoler dejeneresans ve 2. sıçanda ise yaygın apopitozis tespit edilmiútir. Bir sıçan ise histopatolojik olarak normal de÷erlendirilmiútir. Kontrol grubundaki (Grup 1) tüm sıçanlarda histopatolojik olarak kayda de÷er bir bulgu saptanmazken (Resim: 3, 9), resveratrol uygulanan Grup 2 (Resim: 4, 10) ve DMSO verilen Grup 6’daki birer sıçanda myokardial hücrelerde apopitozis 50 dikkati çekmiútir (Resim: 8, 14). Histopatolojik olarak kalp kası hasarlanması açısından gruplar karúılaútırıldı÷ında Grup 1 ile Grup 3 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmiútir (p=0,02). Grup 3 ile Grup 4 (Resim: 6, 12) ve Grup 3 ile Grup 5 (Resim: 7, 13) arasında kalp kası hasarlanması açısından istatistiksel bir fark saptanmamıútır (p>0,05). Aynı úekilde kontrol grubu, resveratrol ve DMSO grubu arasında da istatistiksel bir fark gözlenmemiútir. 3.3. p53 øMMÜNOHøSTOKøMYASAL DEöERLENDøRMESø p53 yüzdeleri açısından de÷erlendirildi÷inde ortalama % 6 pozitif hücre ile doksorubisin uygulanan Grup 3 en yüksek grup olup, bunu % 4 hücre pozitifli÷i ile Grup 4 izlemektedir. Gruplara göre p53 ortalamaları Grafik 2’de verilmiútir. Grafikte gruplar arasında ortalamalar açısından belirgin bir fark dikkati çekmektedir. Nonparametrik MannWhitney testinde Grup 3 ile Grup 5 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmektedir (p=0,006). Ayrıca Grup 1 ile Grup 3 karúılaútırıldı÷ında da benzer úekilde istatistiksel bir anlam taúıyan fark ortaya çıkmaktadır (p=0,021) (Resim : 15–26). 3.4. eNOS øMMÜNOHøSTOKøMYASAL DEöERLENDøRMESø eNOS immünohistokimyasal boyamalarında damar endotellerinde ve perivasküler kalp kası liflerinde pozitiflik saptanmıútır. eNOS pozitif boyanması kontrol grubu ile doksorubisin grubu karúılaútırıldı÷ında sınırda bir istatistiksel farklılık gösterdi÷i saptanmıútır (p=0,044). Gruplara göre eNOS ortalamaları Grafik 3’te verilmiútir. Grup 1 (kontrol), Grup 2 (resveratrol) ve Grup 6 (DMSO) gruplarında birer sıçan dıúında eNOS pozitifli÷i gözlenmemiútir. Grup 3 ile Grup 5 arasında da eNOS pozitifli÷i açısından anlamlı bir fark bulundu÷u dikkati çekmektedir (p=0,015) (Resim : 27-38). 51 7 6 5 4 3 Mean P53 2 1 0 kontrol doksorubisin resveratrol dox-->res res+dox dmso GRUP Grafik 2: Grupların p53 ortalamaları 1,0 ,8 ,6 Mean eNOS ,4 ,2 0,0 kontrol doksorubisin resveratrol res+dox dox-->res dmso GRUP Grafik 3: Grupların eNOS ortalamaları 52 3.5. NøTRøT DÜZEYLERø ÖLÇÜMÜ: Kalp dokusu nitrit bulguları istatistiksel olarak anlamlı bulunmamakla birlikte, Grup 2’nin Grup 1’ göre daha düúük oldu÷u, doksorubisin verilen Grup 3’e göre önce doksorubisin sonra resveratrol verilen grupta Grup 5’te hafif bir azalma bulunmuútur (Grafik: 4). Nitrit 40 n=5 n=9 n=13 38 n=6 n=4 5 6 m m o l/g r n=9 36 34 32 30 1 2 3 4 Gruplar (ortalama ± std hata) Grafik 4: Gruplarda kalp dokusu nitrit düzey ölçümleri. 3.6. NøTRAT DÜZEYLERø ÖLÇÜMÜ: Nitrat düzeylerinin gruplar arasında kalp dokusu incelemelerinde kontrol grubu Grup 1’e göre Grup 2 resveratrol grubunda artıúla birlikte, gruplar birbirleri ile karúılaútırıldı÷ında istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıútır. Resveratrol ve DMSO grupları birbirine yakın de÷erler göstermiútir (Grafik: 5). 53 Nitrat 800 n=6 n=13 m m ol/gr 700 n=9 600 500 n=5 n=3 n=9 400 300 1 2 3 4 5 6 Gruplar (ortalama ± std hata) Grafik 5: Gruplarda kalp dokusu nitrat düzey ölçümleri. 3.7. TOTAL NøTRøT-NøTRAT DÜZEYLERø ÖLÇÜMÜ: Tüm gruplar arasında total nitrit-nitrat (NOx)/gram doku düzeyleri istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar saptanmamakla birlikte Grup 2’ye göre Grup 3’te azalma, Grup 3’e göre Grup 4 ve 5’te artma bulunmuútur (Grafik: 6). Total nitrit-nitrat (NOx )/ gram doku 800 n=6 n=13 mmol/gr 700 n=3 n=9 600 n=5 n=9 500 400 300 1 2 3 4 5 6 Gruplar (ortalama ± std hata) Grafik 6: Gruplarda kalp dokusu total nitrit-nitrat düzey ölçümleri. 54 3.8. YARI øNCE TOLUøDøN MAVøSø BOYAMA SONUÇLARI Epon bloklardan elde edilen yarı ince kesitlere uygulanan toluidin mavisi boyaması sonucu ıúık mikroskobik olarak de÷erlendirildi. Grup I kontrol SF, (Resim: 39). Grup 6 DMSO (Resim : 49, 50) ve Grup 2 Resveratrol (Resim : 40, 41) gruplarında sıçan kalp kasına ait normal morfolojik bulgulara rastlandı. Doxorubisin uygulanan Grup 3’te yer yer fokal sitoplazmik vakuolizasyon ve myofibriler kayıpların bulundu÷u myokardial dejenerasyon alanları saptandı (Resim : 42-44). Resveratrol ve doxorubisin uygulanan gruplarda ise söz konusu myokardial dejenerasyon alanlarında kısmen azalma saptandı (Resim : 45-48). 3.9. ELEKTRON MøKROSKOP DEöERLENDøRME Alınan ince kesitlerde elektronmikroskobik incelemelerde, kontrol grubunda düzgün görünümlü kas lifleri senkron yapıda olup izotrop ve anizotrop bölgeleri ile birlikte sarkomer yapıları bulundu. Miyofibriller arasında bol mitokondri yapısı gözlendi. Diskus interkalarislerin düzgün yapıda oldukları saptandı. ønterkalar disk yapılarının komúu hücrelerin Z çizgileri ile devam etti÷i gözlendi (Resim: 51, 52). Resveratrol grubunda ise normal morfolojik görünümlü olmakla beraber bazı mitokondrion yapısında krista kaybı ve hasarı görüldü. Ayrıca mitokondri çaplarındaki de÷iúim ile birlikte bazı bölgelerde daha sık bulundu÷u görüldü (Resim: 53, 54). Doksorubisin verilen grup elektron mikroskobik kalp kası incelemelerinde ise farklı bölgelerde miyofibril yapısında de÷iúik morfolojik anormallikler görüldü. Bazı miyofibrillerin Z membranlarında senkronizasyon bozuklu÷u ve hücreler arasında diskus interkalaris düzensizlikleri gözlendi (Resim: 55-57). Doksorubisin ve Resveratrol grubunda; miyofibril düzensizlikleri, düzensiz band yapısı ve bazal membran bozuklukları görüldü. Ayrıca mitokondrilerde hem hacimsel artıú hem de membran ve krista hasarı izlenmektedir (Resim : 58). 55 Resim 3: Kontrol grubunda myokard hücrelerinde belirgin bir patoloji gözlenmemiútir (x40, HE). Resim 4: Resveratrol grubunda myokardial hasar gözlenmemiútir (x40, HE). 56 Resim 5: Doksorubisin grubunda myokard dokusunda nekroz odakları (x40, HE). Resim 6: Grup 4 sıçanlarında rutin histolojik incelemede kayda de÷er patoloji gözlenmemiútir (x40, HE). 57 Resim 7: Grup 5 sıçanların myokard dokusunda patoloji gözlenmemiútir (x40, HE). Resim 8: DMSO uygulanmıú sıçanlarda myokard hasarı gözlenmemiútir (x40, HE). 58 Resim 9: Kontrol grubu sıçanlarından birinde hasarsız myokard dokusu (x100, HE). Resim 10: Resveratrol grubunda büyük büyütmede myokard liflerinde hasar gözlenmemiútir (x100, HE). 59 Resim 11: Büyük büyütmede doksorubisin grubunda myokardial nekroz oda÷ı (x100, HE). Resim 12: Büyük büyütmede grup 4 sıçanlarda kalp kası hücrelerinde kayda de÷er de÷iúiklik gözlenmemiútir (x100, HE). 60 Resim 13: Grup 5 sıçanlarda myokardial hasar gözlenmemiútir (x100, HE). Resim 14: DMSO uygulanmıú sıçanlarda özellik göstermeyen myokard lifleri (x100, HE). 61 Resim 15: Küçük büyütmede kontrol grubunda p53 pozitif hücre gözlenmemiútir (x40, DAB). Resim 16: Resveratrol grubunda az sayıda hücrede p53 pozitifli÷i (x40, DAB). 62 Resim 17: Doksorubisin grubunda myokard hücrelerinde yüksek oranda nükleer p53 boyanması (x40, DAB). Resim 18: Grup 4 sıçanlarında myokard hücrelerinde grup 3'e göre daha düúük oranda p53 pozitifli÷i (x40, DAB). 63 Resim: 19: Grup 5 sıçanlarda son derece düúük p53 pozitifli÷i gözlenmiútir (x40, DAB). Resim 20: Grup 6 sıçanlardan birinde az sayıda p53 pozitif myokard hücresi (x40, DAB). 64 Resim 21: Kontrol grubunda p53 pozitif boyanmıú hücre gözlenmemiútir (x100, DAB). Resim 22: Büyük büyütmede Resveratrol grubunda az sayıda p53 pozitifli÷i (x100, DAB). 65 Resim 23: Doksorubisin grubunda en yüksek p53 pozitifli÷i gösteren alan (x100, DAB). Resim 24: Grup 4 sıçanlarında myokard hücrelerinde düúük oranda p53 pozitifli÷i (x100, DAB). 66 Resim 25: Grup 5 sıçanlardan birinin myokard dokusunda gözlenen yalnızca iki adet p53 pozitif hücre (x100, DAB). Resim 26: En az yo÷un immünreaktivitenin gözlendi÷i Grup 6 sıçanlardan birinde iki adet p53 pozitif hücre (x40, DAB). 67 Resim 27: Kontrol grubunda eNOS boyanması (x40, DAB). Resim 28: Resveratrol grubunda eNOS boyanması (x40, DAB). 68 Resim 29: Doksorubisin grubunda endotel hücrelerinde eNOS pozitifli÷i (x40, DAB). Resim 30: Grup 4 sıçanlarında endotel hücrelerinde eNOS boyanması (x40, DAB). 69 Resim 31: Grup 5 sıçanlarda endotel hücrelerinde eNOS boyanması (x40, DAB). Resim 32: Grup 6 sıçanlarda myokard dokusunda eNOS (x40, DAB). 70 Resim 33: Kontrol grubunda endotel hücrelerinde eNOS boyanması (x100, DAB). Resim 34: Resveratrol grubunda endotel hücrelerinde eNOS boyanması (x100, DAB). 71 Resim 35: Doksorubisin grubunda endotel hücrelerinde eNOS pozitifli÷i (x100, DAB). Resim 36: Grup 4 sıçanlarında endotel hücrelerinde eNOS boyanması (x100, DAB). 72 Resim 37: Grup 5 sıçanlarda endotel hücrelerinde eNOS boyanması (x100, DAB). Resim 38: Grup 6 sıçanlarda myokardta eNOS boyanması (x40, DAB). 73 Resim 39: Grup 1, SF Kontrol grubu kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). Resim 40: Grup 2, Resveratrol grubu kalp dokusu x1000). 74 (Toluidin mavisi, Resim 41: Grup 2, Resveratrol grubu kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). Resim 42: Grup 3, Doksorubisin grubu kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). (Ok: myofibriler dejenerasyon, yıldız: sitoplazmik vakuolizasyon ) 75 Resim 43: Grup 3, Doksorubisin grubu kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). (yıldız: sitoplazmik vakuolizasyon ) Resim 44: Grup 3, Doksorubisin grubu kalp dokusu. (Toluidin mavisi, x1000). 76 Resim 45: Grup 4, Doksorubisin+Resveratrol grubu kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). Resim 46: Grup 4, Doksorubisin+Resveratrol grubu kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). 77 Resim 47: Grup 5, Doksorubisin 3 gün sonra Resveratrol uygulanan grup kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). Resim 48: Grup 5, Doksorubisin 3 gün sonra Resveratrol uygulanan grup kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). 78 Resim 49: Grup 6, DMSO verilen grup kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). Resim 50: Grup 6, DMSO verilen grup kalp dokusu (Toluidin mavisi, x1000). 79 Resim 51: Grup 1, Kontrol grubu elektron mikroskop yapısı (x15000). Resim 52: Grup 1, Kontrol grubu elektron mikroskop yapısı (x6000). 80 Resim 53: Grup 2, Resveratrol grubu elektron mikroskop yapısı (x15000). Resim 54: Grup 2, Resveratrol grubu elektron mikroskop yapısı (x10000). 81 Resim 55: Grup 3, Doksorubisin grubu elektron mikroskop yapısı (x15000). Resim 56: Grup 3, Doksorubisin grubu elektron mikroskop yapısı (x7500). 82 Resim 57: Grup 3, Doksorubisin grubu elektron mikroskop yapısı (x7500). Resim 58: Doksorubisin+Resveratrol grubu elektron mikroskop yapısı (x15000). 83 BÖLÜM IV TARTIùMA VE SONUÇ 4.1. ANTRASøKLøNLER VE DOKSORUBøSøN Antrasiklinler günümüzde lösemi/lenfoma, çocukluk ça÷ı solid tümörleri, yumuúak doku, osteosarkom, meme ve over tümörlerinde yaygın olarak tedavi rejimleri içersinde yer almaktadır (119). Çeúitli doz modifikasyonları yapılmasına ra÷men antrasiklinlerin yan etkileri halen bir sorun olmaya devam etmekte ve kemoterapinin kısıtlanmasına neden olmaktadır. Antrasiklin esas yapısındaki küçük de÷iúiklikler ile elde edilen yeni türev ilaçların da bu konuda çözüm olmadı÷ı çeúitli çalıúmalarda gözlenmektedir (107). Günümüzde bu grup ilaçlar içersinde en potent ve aynı zamanda yan etkileri en fazla olan doksorubisindir. Doksorubisinin yapısında yer alan OH serbest uçları toksisitenin daha úiddetli olmasında önemli bir paya sahip oldu÷u düúünülmektedir (12). Antrasiklin uygulama úeklinin rölatif olarak toksisite geliútirme riskini artırdı÷ı konusunda kanıtlar bulunmaktadır. Geniú osteosarkom serilerinde doksorubisinin kümülatif olarak 480 mg/m2 4–6 saatlik infüzyon uygulanmasından 1– 12 hafta sonra % 4 oranında ciddi düzeyde klinik toksisite geliúti÷i bildirilmiútir (106). Ortalama 341 mg/m2 doksorubisini 20 dakikalık infüzyonla alan 113 kanserli çocukta ise % 13 oranında kardiyak disfonksiyon geliúti÷i ve bunların yarısının progresyon sonucu kalp yetmezli÷inden kaybedildi÷i bildirilmiútir (128). Aynı araútırmacılar doksorubisini 2 saat veya 72 saat infüzyonla uyguladıkları 97 çocukta ise kardiyotoksisiteyi % 1 oranında bildirmiúlerdir (93). øzlem süresi arttıkça, toksisite ile ilgili bulguların arttı÷ı bilinmektedir (42). Bu artıútan geç baúlangıçlı toksisite sorumlu tutulmaktadır. Klinik gözlemler dıúında, sürekli veya bolus infüzyonla 84 doksorubisin alan çocuklarda yapılan bir çalıúmada kardiyak troponin T düzeylerinde yükselmeler oldu÷u ve kardiyak hasarın, sürekli infüzyon uygulanan grupta düúük doksorubisin konsantrasyonları ile de önlenemedi÷i vurgulanmıútır (70). Sonuç olarak görülmektedir ki doz modifikasyonları doksorubisinin toksik etkilerini ortadan kaldırmamaktadır. 4.2. DOKSORUBøSøNøN TOKSøK ETKøLERø Doksorubisinin toksik etkileri in vitro ve in vivo olarak birçok çalıúmada ortaya konmuútur. En fazla toksik etki kalpte, sinir sisteminde, böbrekler ve intestinal sistemlerde ortaya çıkmaktadır. Bu toksik etkiler içersinde en ciddi ve en çok incelenmiú olan kardiotoksik etkidir. Tavúan ve sıçanlar üzerinde yapılan ve doksorubisinin toksik etkilerini ortaya koyan pek çok deneysel çalıúmada deney süresi sonunda deney hayvanlarında belirgin kilo kaybı gözlenmektedir (118). Bizim çalıúmamızda da 7. gün sonunda tüm doksorubisin alan sıçanlarda ço÷u kaúeksi düzeylerinde ifade edilebilen kilo kayıpları gözlendi. Ciddi kilo kayıplarının intestinal, renal ve kardiyak toksisitenin bir sonucu oldu÷u Cummings ve arkadaúlarının yaptı÷ı çalıúmada ortaya konmuútur (28). Bu çalıúmada kontrol grubu ve doksorubisin almamıú gruplarda hafifçe kilo artıúı gözlenmiú olup, tüm doksorubisin alan gruplarda kilo kayıpları saptanmıútır. 4.3. DOKSORUBøSøNøN KARDøOTOKSøSøTESø Doksorubisine ba÷lı kardiotoksisitenin morfolojik bulguları gerek hayvan deneyleri gerekse çok sınırlı klinik uygulamalara ra÷men, endomyokardial biyopsiler ile araútırılmaya çalıúılmıútır. Iúık mikroskobik düzeyde en hafif de÷iúikli÷in myokard hücrelerinde úiúme ve boyanma özelliklerinde de÷iúme olarak ifade edilmektedir (73). Bu de÷iúikli÷i kas liflerinin organizasyonunda 85 bozulma, intrasitoplazmik vakuolizasyon, apopitozis, nekroz ve polimorf nüveli lökosit infiltrasyonu izlemektedir (113). Sahna ve arkadaúları gibi bazı araútırmacılar çalıúmalarında bu histopatolojik de÷iúiklikleri skorlayarak hasar úiddetini derecelendirmeye yönelik çalıúmalarda bulunmuúlardır (97). Bu çalıúmada nekroz, yaygın apopitozise u÷ramıú hücre kümeleri ve yaygın sitoplazmik vakuolizasyon, hücrenin boyanma farkları ve dizilimindeki disregülasyon hasarlanma (toksisite) kriteri olarak kullanılmıútır. Doksorubisin kardiotoksisitesinde ortaya çıkan ultrastrüktürel de÷iúiklikler Billingham ve arkadaúlarının birçok çalıúmasında ortaya konmuú olup, sellüler ödem, mitokondrial deformasyon, glikojen depolarında azalma, miyofibriler yapılarda bozulma ve son aúamada da nükleus parçalanması úeklinde özetlenebilir (11). Morfolojik de÷iúiklikleri kriter almayan çalıúmalarda gerek kanda gerekse dokuda LDH, CPK ve troponin gibi biyokimyasal parametrelerin de÷erlendirildi÷i görülmektedir. Bu hücre içi enzimlerin sitoplazmik disregülasyon ve hücre parçalanması sonucunda oluútu÷u bilinmektedir (116). Doksorubisinin hücre üzerindeki etki mekanizmaları serbest oksijen radikallerinin zararlandırıcı etkisi baúta olmak üzere, lipid peroksidasyonu, hücre içi ++ Ca düzeylerinde de÷iúiklik, vazoaktif amin salınımının artıúı, sitokin aktivitesini ortaya çıkarması ve nükleik asit yapısına girerek H ba÷larını koparması úeklinde özetlenebilir. Bu mekanizmaların ço÷u, birbiri içine giren etkileúimlerin yarattı÷ı karmaúık bir dizi fizikokimyasal reaksiyonlara neden olmaktadır (12). Doksorubisinin etkinli÷inin önemli bir bölümünden NADPH sitokrom p–450 ve NADH dehidrogenaz enzimleri ile oluúturulan semiquinin serbest radikali sorumlu tutulmaktadır. Semiquinin oksijenle reaksiyona girerek süperoksit, hidrojen peroksit, hidroksil radikalleri ve nitrik oksit ile kompleks yapılar oluúturur. Lipid peroksidasyonu ve 86 membran hasarlarından bu mekanizma sorumlu tutulmaktadır. Doksorubisine ba÷lı kardiotoksisitede lipid peroksidasyon ürünlerinin artmıú olması ve serbest oksijen radikali oluúumunda görev alan, süperoksit dismutaz ve nitrik oksit sentaz gibi enzimlerin yüksek düzeylerde bulunması bu görüúü kanıtlayan ipuçlarını oluúturmaktadır (83). Hanan ve arkadaúlarının bir çalıúmasında 10mg/kg doksorubisin verilmiú sıçanlarda kalp kasında serbest oksijen radikalleri ve NO düzeylerinin normalin 8 katı düzeylere ulaútı÷ı bildirilmektedir (44). 4.4. NøTRøK OKSøT (NO) Serbest oksijen radikallerinden biri olan NO kardiyovasküler sistem patolojilerindeki rolü birçok çalıúmada ortaya konmuútur. Özellikle kardiyovasküler sistem üzerinde en etkili serbest oksijen radikali oldu÷u bilinen NO arjinin amino asidinin guanidin grubunda yer alan, nitrojen atomu ile moleküler oksijenin reaksiyona girmesi sonucu oluúan kısa ömürlü serbest bir radikaldir (91). NO oluúumunda rol alan en önemli enzim olan NOS’un doku da÷ılımı farklılıklar göstermektedir. Bunlar endotel hücrelerinde eNOS, nöronlarda nNOS ve indüklenebilir form olarak da iNOS úeklinde bulunmaktadır (47). Doksorubisin kardiotoksisitesinde hangi NOS izoformunun baúrolü oynadı÷ı oldukça tartıúmalıdır. Barnabe ve arkadaúları, sıçan kalp kası hücre kültürlerindeki in vitro çalıúmasında eNOS’un esas rolü oynadı÷ını bildirirken; 2004 yılında yayınlanan makalesinde Fogli eNOS ve nNOS’ un bu konuda bir rolü olmadı÷ı ve asıl baúrol oyuncusunun iNOS oldu÷unu iddia etmiúlerdir (95). Bu görüúünü de eNOS ve nNOS’ un yapısal enzimler olmasına ra÷men iNOS’ un enfeksiyon, hipoksi, sitokinler vb. etkenler ile indüklenebildi÷i temeline dayandırmaktadır (19). 87 Araútırmamızda doku düzeyinde eNOS’ un kalp kasındaki morfolojik ipuçlarını kullanılarak doksorubisin toksisitesindeki rolü ortaya konmaya çalıúılmıútır. ømmünohistokimyasal boyamalarda endotel hücrelerinde ve perikapiller ba÷ dokusu hücrelerinde pozitif boyanma saptadık. Kontrol grubu ve yalnızca doksorubisin alan grup karúılaútırıldı÷ında ilaç alan grupta eNOS pozitifli÷inin istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulunuúu doksorubisine ba÷lı kardiotoksitede eNOS’ un rolü oldu÷unu destekler niteliktedir. Bizim düúüncemiz iNOS’ un etkisinin olabilece÷i ancak, eNOS’ un etkinli÷inin bu konuda göz ardı edilemeyece÷i úeklindedir. ømmünohistokimyasal çalıúmalar kısmen subjektif kriterlere dayandı÷ından bu konuda eNOS ve iNOS ölçümleri ile yapılan kantitatif çalıúmalara da ihtiyaç vardır. Ayrıca doksorubisinin hücre membran potansiyelini bozarak oluúturdu÷u hücre Ca ++ ++ pompasında aksama, sitozolik Ca düzeylerinde artıúa neden ++ olmaktadır. Sitozolik Ca düzeylerinin NOS’ un aktivitesinde önemli bir rol ++ oynadı÷ı bilinmektedir (63). Özetle yüksek hücre içi Ca düzeyleri NOS aktivitesinin devamlı yüksek düzeyde olmasına neden olmaktadır. Yapılan çalıúmalarda NO’in özellikle lipid peroksidasyonu ve apopitozisin indüklenmesinde tetik mekanizmayı oluúturdu÷u düúünülmektedir (36). Genel olarak apopitozis oluúumunda iki yol bulunmaktadır; birinci yol TNFalfa gibi sitokinler ile aktiflenen ekstrensek; ikincisi ise mitokondri ile iliúkili intrensek yoldur (35). NO ve di÷er serbest oksijen radikalleri hücre apopitozisinde rol oynayan kaspaz enzim sisteminde ve dolaylı olarak apopitoziste görevli protein sentezinde birbirini tetikleyen aktifleúmeye yol açtı÷ı düúünülmektedir (123). Aspartik asidin bir substratı olan ve sistein proteaz ailesinden olan kaspaz sistemi apopitozis sürecinde ana mekanizma düzenleyicisidir. Kaspaz sistemi birer domino 88 taúı úeklinde birbirlerini aktive ederek apopitozis ile iliúkili proteinlerin oluúmasına neden olmaktadır. Ekstrensek yolda bir apopitozis proteini olan p53 önemli bir basama÷ı oluúturmaktadır (40). Mitokondriye ba÷lı intrensek yolda ise benzer bir basama÷ı sitokrom c oluúturmaktadır. Fogli ve arkadaúlarının sıçanlar üzerindeki in vivo çalıúmalarında 20 mg/kg doksorubisin enjeksiyonundan sonra sitokrom c düzeylerinin arttı÷ını göstermiúlerdir ve aynı araútırmacılar, doksorubisin kardiotoksisitesinde ekstrensek apopitozis yola÷ının etkili olmadı÷ını savunmaktadır (95). Nithipongvanitch ve arkadaúlarının çalıúmasında doksorubisinin kardiomyositlerde nükleer ve mitokondrial p53 birikimine neden oldu÷u ortaya konmuú olup, bu durumun redoksa ba÷lı mekanizmalar ile regüle edildi÷i gözlenmektedir (86). Maejima Y, ve arkadaúları da p53'ün, doksorubisin verilmiú sıçan kardiomyositlerinde erken yaúlanma bulgularının ortaya çıkmasında ana protein oldu÷unu ortaya koymuúlardır (74). Biz de bu konuya ıúık tutabilmek amacıyla immünohistokimyasal olarak gruplar arası p53 pozitif hücre yüzdelerini karúılaútırdık. Bu çalıúmada istatistiksel olarak kontrol grubu ve doksorubisin alan grup arasında anlamlı bir fark gözlenmiútir. Bizim çalıúmamızda da doksorubisinin sıçan kardiomyositlerinde immünohistokimyasal olarak p53 pozitif hücre yüzdesini arttırdı÷ı ortaya çıkmaktadır. Bu sonuç doksorubisinin neden oldu÷u apopitozisde p53'ün önemli bir rol oynadı÷ını ortaya koymakatdır. Doksorubisinin kardiotoksik etkisinin en önemli bölümü reaktif oksijen türevleri üzerinden baúlatılan çeúitli mekanizmalar ile gerçekleúti÷i göz önüne alındı÷ında, bu sistemi inhibe edici antioksidan maddelerin, bu yan etkiyi gidermede etkin olabilece÷i akla gelmektedir. øn vitro ve in vivo birçok çalıúmada çeúitli antioksidan maddelerin bu konudaki etkinli÷i araútırma konusu olmuútur (16). 89 Günümüzde doksorubisin yan etkilerini önlemeye yönelik olarak kullanılan tek FDA onaylı ilaç dexrazoxane dır. Ancak bu ilacın antineoplastik aktiviteyi azaltması, kemik ili÷i ve deride karsinojenik geliúime neden olması kullanılabilirli÷ini azaltmaktadır. Pentoksifilin, aminoguanidine, amifostin, melatonin, E vitamini, C vitamini, Trolox, n-Asetilsistein gibi medikal ilaçlar da bu konuda çalıúılmıú olup, etkinlikleri konusunda literatürde çok çeliúkili sonuçlar vardır (22). Konu ile ilgili medikal ilaçların çeliúkili ve yetersiz olması araútırmacıları baúka arayıúlara yönlendirmiútir. Bu konuda geleneksel uzak do÷u tıp uygulamalarından yola çıkılarak çeúitli do÷al maddelerin etkinli÷i araútırılmıútır. Epigallocatechin, Quarcetin, Carcuma longa, Morus alba, Piper rostratum, kefir ve sarımsak gibi do÷al elde edilebilen birçok madde antioksidan etkinli÷inden yararlanılarak doksorubisin toksisitesini önleme amaçlı kullanılmıútır (105). Spekülatif bazı makaleleri göz ardı edecek olursak do÷al kaynaklı ürünlerdeki sonuçları da çok çeliúkilidir. 4.5. RESVERATROLÜN ANTøOKSøDAN YAPISI Biz de bu çalıúmamızda daha önceleri antioksidan aktivitesi çeúitli yayınlar ile ortaya konmuú olan üzüm kabu÷u, da÷ çile÷i ve fıstıkta olukça bol bulunan stilbene ailesinden olan resveratrolün doksorubisinin sitotoksik etkilerini azaltmada in vivo olarak etkinli÷ini araútırdık. Resveratrolün gerek antioksidan yapısı gerekse apopitozis mekanizmalarındaki düzenleyici rolünün, söz konusu olan kardiotoksiteyi azaltmada etkili oldu÷u düúünülmektedir (121). Resveratrolün moleküler toplanması, hidroksil grupların “flip-flop” hareketi ile oluúan ve kırılan H ba÷larının oldu÷u yerde bir hidrojen ba÷ a÷ı göstermektedir (18). Bu hareket sayesinde H ba÷ı zinciri boyunca en fazla üç hidroksil hidrojen 90 atomu transfer olabilmektedir. Hidrojen atomlarının transferi, resveratrol molekülü hareketlili÷ini açıklamakta ve bu molekülün biyolojik sistemlerdeki kimyasal reaksiyonlar ile iliúkisine iúaret etmektedir (76). Resveratrolün superoksit anyon üzerinde ciddi bir inhibe edici özelli÷i vardır. Ayrıca, lipopolisakkaritler ya da forbol esterleri tarafından stimüle edilen makrofajların hidrojen peroksit üretimini de inhibe eder (112). Sıçanlara tek doz 10 mg/kg intraperitoneal olarak resveratrol verilerek yapılan çalıúmamızda resveratrolün tek baúına verildi÷i deney hayvanlarında kontrol grubuna göre her hangi bir farklılık saptanmamıútır. Resveratrolü çözmek amacıyla kullanılan DMSO’nun etkisini gözden kaçırmamak amacıyla oluúturulan ve yalnızca DMSO verilen Grup 6’ da morfolojik düzeyde kardiyak hasar gözlenmemiútir. Yapılan bir çalıúmada sıçanlara uygulanan 300 mg/kg gibi yüksek dozlarda bile toksik bir etki geliúmedi÷i bildirilmektedir. Literatürde bu güne kadar yayınlanmıú bir toksik etki saptanmamıútır. Çalıúmamızda doksorubisin ile birlikte ve doksorubisin uygulamasından 3 gün sonra resveratrol verilen Grup 4 ve Grup 5’de kalp dokusunda zararlanmanın devam etti÷i ve istatistiksel olarak yalnızca doksorubisin verilen Grup 3’ten farklılık göstermedi÷i saptanmıútır. Sonuç olarak resveratrolün doksorubisin kardiotoksisitesini önlemede morfolojik bazda yeterli olmadı÷ını saptadık. Dudka ve arkadaúları da doksorubisin kullanarak oluúturdukları sıçan modelinde NADPHsitokrom p–450 düzeylerine bakarak resveratrolün antioksidan etkisinin ve kardiotoksisite önlemedeki etkinli÷inin kabul edilebilir olmadı÷ı sonucuna varmıúlardır (54). Aynı sonuç Chun ve arkadaúları tarafından da 1999 yılında E. Coli hücre membranı kullanılarak ortaya konmuútur (25). Resveratrolun insan metabolizmasındaki durumunu inceleyen araútırmaların öne sürdü÷üne göre, çok yüksek dozlarda alınacak resveratrol bile kültür hücrelerinde 91 elde edilen etkilerin insanlarda görülebilmesini sa÷layacak hücre de÷erlerine ulaúamayabilir (121). Pratik olarak bu kadar yüksek doz resveratrolün uzun süre kullanımı olanaksız gibi gözükmektedir. østatiksel sonuçlarımızda dikkat çeken verilerden biri de Grup 3 ile Grup 5 arasındaki eNOS pozitifli÷indeki farklılıktır. Grup 3’ de eNOS pozitifli÷i daha fazla deney hayvanlarında saptanmıútır. Aynı istatistiksel farkın Grup 3 ile Grup 4 arasında görülmemesini açıklamak zordur. Bu farklılık, gruplardaki deney hayvanları sayısının azlı÷ından kaynaklanan rasgele bir sonuç olabilir. Spekülatif bir bakıú açısından ise resveratrolün antioksidan etkisi doksorubisin tarafından inhibe edilmekte; doksorubisinin serbest oksijen türevleri üzerinden olan etkinli÷i ortadan kalktıktan veya azaldıktan sonra resveratrolün antioksidan etkisi belirmektedir. Resveratrolün apopitozis mekanizmalarında özellikle p53 ve siklinler üzerinden etkili oldu÷u konusunda bilgiler bulunmaktadır (112). Ancak bizim çalıúmamızda p53 immünohistokimyasal boyanma yüzdeleri açısından gruplar arasında bir fark bulunmamıútır. Ancak bu konuda kesin bir yargıya varmak için deney hayvanları sayımızın az oldu÷unu düúünüyoruz. Melatoninin doksorubisine ba÷lı kardiyotoksisiteyi önlemesi ile ilgili sıçan kalp dokusunda yapılan çalıúmada elektron mikroskobik incelemeler sonucu, 45 mg/kg doksorubisin uygulanan gruba ait kalp dokusunda sellüler ödem, mitokondriyal deformasyon, glikojende azalma, myofibriler yapıda bozulma saptandı÷ı ve sonrası melatoninin uygulamasının kalp hasarına karúı koruyucu etkilerinin bulundu÷u elektron mikroskobik olarak gösterilmiútir (90). 92 Yine bir baúka fare elektron mikroskobik çalıúmada 4 mg/kg doksorubisine karúı Spirulinanın etkileri araútırılmıú ve elektron mikroskobik de÷erlendirmelerinde miyofibriler kayıp, mitokondriyal úiúme, sitoplazmada vakuolizasyon ve sarkoplazmik sistemde dilatasyon saptanırken; Spirulina uygulanması sonrası intrasitoplazmik vakuolizasyonun azaldı÷ı bildirilmiútir (57). Lebrecht ve ark. ise, doksorubisine ba÷lı insan kalbinde radikal-ba÷lı mitokondriyal disfonksiyon ve dokuya özgün mitokondriyal DNA (mtDNA) lezyonlarını araútırmıú ve otopsi insan kalp kası materyallerinde kalp kasında mitokondriyal elektron yo÷un depozitlere rastlanmıútır. Doksorubisinin di÷er antrasiklinlerin tersine mtDNA mutasyonlarını indükledi÷i ve insan kalp kasında mtDNA içeri÷inin azaldı÷ını ortaya koymuúlardır (61). Çalıúmamızda elektron mikroskobik incelemeler sonucu ise, Doksorubisin verilen grup elektron mikroskobik incelemelerde miyofibril yapısında de÷iúik morfolojik anormalliklerle birlikte seyreden dejenerasyon alanları saptandı. Doksorubisin gruplarında mitokondriyal hasar ile birlikte, miyofibrillerin Z membranlarındaki senkronizasyonun bozuldu÷u, hücreler arasında diskus interkalaris düzensizliklerinin bulundu÷u gözlendi. Doksorubisin ile birlikte Resveratrol uygulanan gruplarda ise, yarı ince kesitlerde myokardial dejenerasyon alanlarında nispeten azalma saptandı. Sonuç olarak 20 mg/kg tek doz intraperitoneal olarak doksorubisin uygulanması sıçanlarda kardiotoksisite oluúturmaktadır. Deney hayvanlarında ileri derecede a÷ırlık kaybı toksik etkinin bir göstergesidir. Kardiotoksik etki, kalp kası hücrelerinde nekroz, yaygın apopitozis ve yaygın sitoplazmik vakuolizasyon ile karakterlidir. Doksorubisinin kardiotoksik etkileri serbest oksijen radikallerinin tetikledi÷i bir takım mekanizmalar ile oluúmaktadır. Bu süreçte eNOS aracılı÷ı ile 93 oluúturulan NO önemli bir rol oynamaktadır (122). Doksorubisine ba÷lı kardiotoksisitede p53 üzerinden çalıúan apopitotik mekanizmalar yeterince etkin de÷ildir. Antioksidan bir madde olan resveratrol doksorubisinin kardiotoksik etkisini önlemede çok baúarılı bulunmamakla birlikte yarı ince yapıda ileriye dönük umut verebilecek yapısal de÷iúimlere rastlanmıútır. Bu nedenle resveratrolün; deney hayvan sayısı arttırılarak yapılacak yeni çalıúmalarda in vivo etkisinin kalitatif ve kantitatif araútırılmasına devam edilmelidir. 94 BÖLÜM V SONUÇLAR 1- 20mg/kg tek doz intraperitoneal olarak doksorubisin uygulanması sıçanlarda kardiotoksisite oluúturmaktadır. 2- Sıçanlarda ileri derecede kilo kaybı toksik etkinin bir göstergesidir. 3- Kardiotoksik etki, kalp kası hücrelerinde nekroz, yaygın apopitozis ve yaygın sitoplazmik vakuolizasyon ile karakterlidir. 4- Doksorubisine ba÷lı kardiotoksisitede p53 üzerinden çalıúan apopitotik mekanizmalar önemli bir rol oynamaktadır. 5- Doksorubisinin kardiotoksik etkileri serbest oksijen radikallerinin tetikledi÷i bir takım mekanizmalar ile oluúmaktadır. Bu süreçte eNOS aracılı÷ı ile oluúturulan NO önemli bir rol oynamaktadır. Doksorubisin uygulamasından üç gün sonra resveratrol verildi÷inde immünohistokimyasal olarak eNOS pozitifli÷i anlamlı olarak farklı bulunmuútur. Biyokimyasal olarak nitrit ve nitrat düzeyleri araútırıldı÷ında, sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmamakla birlikte nitrit düzeyinde, doksorubisin sonrası resveratrol verilen grupta hafif bir azalma görülmüútür. 6- Doksorubisin uygulanan gruptaki sıçanların kalp dokularından hazırlanmıú yarı ince kesitlerde yaygın myokardiyal dejenerasyon alanları dikkat çekmiútir. Fakat doksorubisin uygulaması sonrası resveratrol verilen grupta, miyokardiyal dejenerasyon alanlarında nispeten azalma oldu÷u saptanmıútır. Yapılan elektron mikroskobik incelemelerde sadece doksorubisin verilen grupta kalp dokusunda 95 mitokondriyal hasar senkronizasyonun ile bozuldu÷u birlikte, ve miyofibrillerin hücreler arasındaki Z membranlarındaki diskus interkalaris düzensizliklerinin bulundu÷u gözlenmiútir. 7- Antioksidan bir madde olan resveratrol, doksorubisinin kardiyotoksik etkisini önlemede kesin baúarısı gösterilememekle birlikte; deney hayvanlarının sayısını arttırarak, kısa ve uzun dönem sonuçlarına yönelik kalitatif ve kantitatif de÷erlendirmenin yapılması ve apopitotik mekanizmalardaki moleküllere yönelik araútırmaların yapılması yararlı olacaktır. 96 BÖLÜM VI ÖZET 6.1. DOXORUBøSøN'E BAöLI KARDøOTOKSøSøTEDE RESVERATROLÜN ETKøLERøNøN HøSTOLOJøK OLARAK øNCELENMESø Yaygın uygulama alanı olan antineoplastik ilaçlardan olan antrasiklinlerin, erken ve geç dönem kardiotoksik etkileri nedeni ile klinik kullanımları sınırlanmaktadır. Bu grup ilaçlar içersinde en etkili ve toksik etkisi en fazla olan doksorubisindir. Doksorubisin toksik etkilerinin önemli bir kısmını serbest oksijen radikalleri üzerinden gerçekleútirmektedir. Sıçanlar üzerinde invivo olarak yapılan bu çalıúmada antioksidan bir madde olan resveratrolün bu toksik etkiyi azaltabilece÷i öngörülmüútür. Deney hayvanları; kontrol, tek doz 10 mg/kg intraperitoneal olarak resveratrol uygulanan, tek doz 20 mg/kg doksorubisin uygulanan, doksorubisin ile birlikte resveratrol uygulanan, tek doz doksorubisinden 3 gün sonra tek doz resveratrol uygulanan ve resveratrol çözücüsü olan DMSO uygulanan olmak üzere 6 gruba ayrıldı. Kardiotoksik etki histopatolojik olarak de÷erlendirildi. Grupların p53 ve eNOS pozitiflikleri immünohistokimyasal olarak çalıúıldı, nitrit, nitrat düzeyleri araútırıldı ve elektron mikroskobik görüntülerle ince yapıda incelemeler yapıldı. Tüm tek doz doksorubisin alan gruplarda kaúektik düzeyde kilo kayıpları gözlenmiútir. Gruplar arasında kilo de÷iúimleri açısından hayli anlamlı bir fark mevcuttur. Kalp kası hasarı en fazla yalnızca doksorubisin alan grupta gözlenmiú olup, en sık rastlanan bulgu nekrozdur. Kalp kası hasarlanması açısından gruplar 97 karúılaútırıldı÷ında kontrol grubu ile yalnızca doksorubisin alan grupta istatistiksel anlamda bir fark gözlenmiútir (p=0,02). Doksorubisin ile birlikte resveratrol ve doksorubisin uygulamasından 3 gün sonra resveratrol alan gruplar arasında fark gözlenmemiútir. eNOS pozitifli÷i endotel hücrelerinde ve perivasküler myositlerde gözlenmiútir. eNOS pozitifli÷i açısından kontrol grubu ile doksorubisin grubu karúılaútırıldı÷ında; sınırda istatistiksel fark saptanmıútır. Doksorubisin ile doksorubisinden 3 gün sonra uygulanan resveratrol grubu arasında da anlamlı bir fark dikkati çekmiútir. p53 pozitif hücre yüzdesi açısından Grup 1 ve Grup 3 ile Grup3 ve Grup 5 arasında istatistiksel bir anlam bulunmuútur. Biyokimyasal olarak nitrit düzeylerinde; doksorubisinden üç gün sonra resveratrol verilen Grup 5’te, sadece doksorubisin uygulanan Grup 3'e göre hafif azalma görülmüútür. Elektron mikroskobik olarak doksorubisin verilen Grup 3’te yaygın myokardiyal dejenerasyon saptanmıútır. Ancak, doksorubisinden üç gün sonra resveratrol verilen Grup 5’te myokardiyal dejenerasyon alanlarında nispeten azalma oldu÷u gözlenmiútir. Sonuç olarak, 20 mg/kg tek doz intraperitoneal olarak doksorubisin uygulanması sıçanlarda kardiotoksisite oluúturmaktadır. Kardiotoksik etki, kalp kası hücrelerinde nekroz, yaygın apopitozis ve yaygın sitoplazmik vakuolizasyon ve yaygın miyokardiyal dejenerasyon ile karakterlidir. Doksorubisinin kardiotoksik etkileri serbest oksijen radikallerinin tetikledi÷i bir takım mekanizmalar ile oluúmaktadır. Bu süreçte eNOS aracılı÷ı ile oluúturulan NO önemli bir rol oynamaktadır. Doksorubisine ba÷lı kardiotoksisitede p53 üzerinden çalıúan apopitotik mekanizmalar söz konusudur. Bir antioksidan olan resveratrol uygulanan dozlarda doksorubisinin kardiotoksik etkisini önlemede düúük oranda etkili bulunmuútır. Anahtar Sözcükler: Antrasiklinler, Doksorubisin, NO, p53, Resveratrol, eNOS, ønce Yapı, Nitrat, Nitrit. 98 ABSTRACT 6.2. THE HISTOLOGICAL STUDY ON THE EFFECTS OF RESVERATROL ON THE CARDIOTOXICITY DUE TO DOXORUBICIN Clinical practice of antracyclines, a widely used antineoplastic agent, is limited due to the risk of a early or late life-threatening cardiotoxicity. Among the group antracyclines, the most effective and the most toxic is doxorubicin. Doxorubicin is suggested to perform exert its most serious side effects by free oxygen radicals. In this in vivo experiment on rats, resveratrol is predicted to decrease this toxic side effect. The study consisted of six groups; Group 1: control group; Group 2: a single dose of resveratrol given as 10 mg/kg intraperitoneal; Group 3: a single dose of doxorubicin given as 20 mg/kg doxorubicin; Group 4: a single dose of resveratrol and doxorubicin given at the same time; Group 5: a single dose of resveratrol given 3 days after doxorubicin administration; Group 6: a single dose of DMSO which is used as a solvent for resveratrol. Doxorubicin-induced cardiotoxicity evaluated histopathologically has been and also p53 and eNOS positivity had been determined by immunohistochemical applications. Nitrite and nitrate levels were have been measured and electron microscopic ultrastructure studies have been done. In all doxorubicin given groups a severe loss of weight has been observed. The differences among the weight measures within six groups were significant. Cardiotoxicity was observed mostly in the groups given doxorubicin; the most frequently observed sign is necrosis. When the groups were compared for cardiotoxicity; there was a slight difference between the control and the group given doxorubicin (p=0,02). No difference has been observed between resveratrol and a 99 single dose of resveratrol given 3 days after doxorubicin administration. eNOS positivty has been observed in the endothelial cells and perivascular myocytes. A significant difference was observed between control group and doxorubicin given group for eNOS positivity. A significant difference was observed between doxorubicin given at the same time and a single dose of resveratrol given 3 days after doxorubicin administration. Among the groups, the percentage of p53 positivity was significant. As biochemical evaluation; the nitrite level of Group 5 was decreased as ceomepared to Group 3. In electron microscopy; diffuse myocardial degeneration has been determined in Group 3. Nevertheless, in Group 5, a decrease in myocardial degeneration has been observed comparatively. As a result, a single dose of doxorubicin given as 20 mg/kg doxorubicin leads to cardiotoxicity in rats. Cardiotoxicity is characterized by necrosis, diffuse apoptosis and diffuse cytoplasmic vacuolization. The pathogenesis of doxorubicin-induced cardiotoxicity is revealed by the mechanisms triggered by free radicals. In this process: NO produced by eNOS plays a great role. The apoptotic mechanisms in doxorubicin-induced cardiotoxicity are suficiently effected by p53 protein. Resveratrol, as an antioxidant with the given doses seems less effective in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Key words : Antracyclines, Doxorubicin, NO, p53, Resveratrol, eNOS, Ultrastructure, Nitrate, Nitrite. 100 BÖLÜM VII KAYNAKLAR 1. Ackland, SP., Ratain, MJ., Vogelzang, NJ. (1989). ‘Pharmacokinetics and pharmacodynamics of long-term continous-infusion doxorubicin.’ Pharmacol Ther 45: 340-7. 2. Agarwala, S., Kumar, R., Bhatnagar, V., Bajpai, M., Gupta, KD., Mitra, DK. (2000). ‘High incidence of adriamycin cardiotoxicity in children even at low cumulative doses: Role of radionuclide cardiac angiography.’ J Ped Surg 35 (12) : 1786-89. 3. Aggarwal, BB., Bhardwaj, A., Aggarwal, RS., Seeram, NP., Shishodia, S., Takada, Y. (2004). ‘Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies.’ Anticancer Res. 24 (5A) :2783-2840. 4. Anak, S., Karakaú, Z., Eker, Ömero÷lu, R., Yalman, N., Bilgen, H., Özgenç, S., Gediko÷lu, G. (1999). ‘Cardiac findings in children following bone marrow transplantation.’ Turk J Haematol 16 (1) : 11-5. 5. Asensi, M., Medina, I., Ortega, A., Carretero, J., Bano, MC., Obrador, E., Estrela, JM. (2002). ‘Inhibition of cancer growth by resveratrol is related to its low bioavailability.’ Free Radic Biol Med. 33 (3) :387-98. 6. Ateú, U. (2002). ‘Proestrus döneminde uygulanan aspirinin preimplantasyon dönemindeki sıçan endometriyumuna etkisinin histolojik olarak incelenmesi.’ Ege Üniversitesi Sa÷lık Bilimleri Enstitisü Doktora Tezi. 101 7. Bacci, G., Ferrari, S., Bertoni, F., Ruggieri, P., Picci, P., Longhi, A., Casadei, R., Fabbri, N., Forni, C., Versari, M., Campanacci, M. (2000). ‘Long-term outcome for patients with non-metastatic osteosarcoma of the extremity treated at the Instituto Ortopedico Rizzoli according to the Instituto Ortopedico Rizzoli/Osteosarcoma-2 protocol: An updated report.’ J Clin Oncol; 18: 4016-27. 8. Basser, RL., Gree, MD. (1993). ‘Strategies for prevention of anthracycline cardiotoxicity.’ Cancer Treat Rev ; 19: 57-77. 9. Berrak, SG., Ewer, MS., Jaffe, N., Pearson, P., Ried, H., Zietz, HA., Benjamin, RS. (2001). ‘Doxorubicin cardiotoxicity in children: reduced incidence of cardiac dysfunction associated with continous-infusion schedules.’ Oncol rep; 8(3): 611-4. 10. Bielack, SS., Ertmann, R., Winkler, K., Landbeck, G. (1989). ‘Doxorubicin: effect of different schedules on toxicity and antitumor efficacy.’ Eur J Cancer Clin Oncol; 25: 873-82. 11. Billingham, ME., Bristow, MR. (1984). ‘Evaluation of anthracycline cardiotoxicity: predictive ability and functional correlation of endomyocardial biopsy.’ Cancer Treat Symp; 3: 71-6. 12. Billingham, M., E., Mason, J., W., Bristow, M.,. R., and Daniels, J., R. (1978). ‘Anthracycline cardiomyopathy monitored by morphologic changes.’ Cancer Treat. Rep., 62: 865–872. 13. Bivalacqua, TJ., Champion, HC., Hellstrom, WJG. (2002). ‘Implications of nitric oxide synthases isoforms in the pathophysiology of Peyronie's disease.’ Int J Imp Res; 14; 345-352. 102 14. Bories, PN., Bories, C. (1995). ‘Nitrate determination in biological fluids by an enzymatic one-step assay with nitrate reductase.’Clin Chem 41 (6), 904-907. 15. Bowers, JL., Tyulmenkov, VV., Jernigan, SC., Klinge, CM. (2000). ‘Resveratrol acts as a mixed agonist/antagonist for estrogen receptors alpha and beta.’ Endocrinology; 141 (10) :3657-3667. 16. Breed, JGS., Zimmerman, ANE., Dormans, JAMA., et al. (1980). ‘Failure of the antioxidant vitamin E to protect against Adriamycin-induced cardiotoxicity in the rabbit.’ Cancer Res; 40:2033-2038. 17. Brito, P., Almeida, LM., Dinis, TC. (2002). ‘The interaction of resveratrol with ferrylmyoglobin and peroxynitrite; protection against LDL oxidation.’ Free Radic Res; 36(6):621-631. 18. Burkitt, MJ., Duncan, J. (2000). ‘Effects of trans-resveratrol on copper-dependent hydroxyl-radical formation and DNA damage: evidence for hydroxyl-radical scavenging and a novel, glutathione-sparing mechanism of action.’ Arch Biochem Biophys. 381 (2) : 253-63. 19. Busse, R., Fleming, I., Schini, VB. (1995). ‘Nitric oxide formation in the vascular Wall: regulation and functional implications.’ Curr Top Microbial Immunol; 196: 718. 20. Cadenas, S., Barja, G. (1999). ‘Resveratrol, melatonin, vitamin E, and PBN protect against renal oxidative DNA damage induced by the kidney carcinogen KbrO 3.’ Free Radic Biol Med. 26 (11-12) : 1531-37. 21. Carlson, RW. (1992). ‘Reducing the cardiotoxicity of the anthracyclines.’ Oncology; 6: 95-107. 103 22. Caruso, F., Tanski, J., Villegas-Estrada, A., Rossi, M. (2000). ‘Structural basis for antioxidant activity of trans-resveratrol: ab initio calculations and crystal and molecular structure.’ J Agric Food Chem. 52(24): 7279-85. 23. Chen, ZH., Hurh, YJ., Na, HK., et al. (2004). ‘Resveratrol inhibits TCDD-induced expression of CYP1A1 and CYP1B1 and catechol estrogen-mediated oxidative DNA damage in cultured human mammary epithelial cells.’ Carcinogenesis; 25 (10) :20052013. 24. Chlebowski, RT., Parloy, WS., Pugh, RT. (1980). ‘Adriamycin given as a weekly schedule without a loading course-clinically effective with reduced incidence of cardiotoxicity.’ Cancer Treat Rep; 64 : 47-51. 25. Chun, YJ., Kim, MY. and Guengerich, FP. (1999). ‘Resveratrol is a selective human cytochrome P450 1A1 inhibitor.’ Biochem Biophys Res Commun 262:20–24. 26. Ciolino, HP., Yeh, GC. (1999). ‘Inhibition of aryl hydrocarbon-induced cytochrome P-450 1A1 enzyme activity and CYP1A1 expression by resveratrol.’ Mol Pharmacol; 56 (4) : 760-767. 27. Crowell, JA., Korytko, PJ., Morrissey, RL., Booth, TD., Levine, BS. (2004). ‘Resveratrol-associated renal toxicity.’ Toxicol Sci.; 82 (2) : 614-619. 28. Cummings, J., Anderson, L,. Willmott, N., Smyth, JF. (1991). ‘The molecular pharmacology of doxorubicin in vivo.’ Eur J Cancer ; 27 : 532. 29. Dorr, R., T. (1996). ‘Cytoprotective agents for anthracyclines.’ Semin, Oncol.,23 (Suppl. 8) : 23–34. 30. Duffy, SJ., Vita, JA. (2003). ‘Effects of phenolics on vascular endothelial function.’ Curr Opin Lipidol; 14 (1) : 21-27. 104 31. Eroschenko, Victor P./Çev. Ed. Demir Ramazan (2001). Di Fiore Histoloji AtlasıFonksiyonel øliúkileriyle;dokuzuncu baskıdan çeviri; Palme Yayıncılık; 176-193,82120. 32. Ewer, MS., Jaffe, N., Ried, H., Zietz, HA., Benjamin, RS. (1998). ‘Doxorubicin cardiotoxicity in children: comparison of a consecutive divided daily dose administration schedule with single dose (rapid) infusion administration.’ Med Pediatr Oncol; 31(6): 512-5. 33. Frankel, EN., Waterhouse, AL., Kinsella, JE. (1993). ‘Inhibition of human LDL oxidation by resveratrol.’ Lancet; 341 (8852) : 1103-1104. 34. Fremont, L. (2000). ‘Biological effects of resveratrol.’ Life Sci; 66 (8) : 663-673. 35. Fulda, S., Debatin, KM. (2004). ‘Sensitization for anticancer drug-induced apopitozis by the chemopreventive agent resveratrol.’ Oncogene. 23(40): 6702-11. 36. Garner, AP., Paine, MJI., Crespo, IR., Chinje, EC., Montellano, POD. (1999). ‘Stratford IJ, et al. Nitric oxide synthases catalyze the activation of redox cycling and bioreductive anticancer agents.’ Cancer Res; 59:1929-34. 37. Gehm, BD., McAndrews, JM., Chien, PY., Jameson, JL. (1997). ‘Resveratrol, a polyphenolic compound found in grapes and wine, is an agonist for the estrogen receptor.’ Proc Natl Acad Sci U S A ; 94 (25) : 14138-14143. 38. Gianni, L., and Myers, C., E. (1992). ‘The role of free radical formation in the cardiotoxicity of anthracycline.’ In: F., M., Muggia, M., D., Green, and J., L., Speyer (eds.), Cancer Treatment and the Heart, pp. 9–46. Baltimore: The John Hopkins University Press. 105 39. Giantris, A., Abdurrahman, L., Hinkle, A., Asselin, B., Lipshultz, SE. (1998). ‘Anthracycline-induced cardiotoxicity in children and young adults.’ Clin Rev in Oncol/Hematol; 27: 53-68. 40. Giardino, I., Fard, AK., Hatchell, DL., Brownlee, M. (1998). ‘Aminoguanidine Inhibits Reactive Oxygen Species Formation, Lipid Peroxidation, and OxidantInduced Apopitosis.’ Diabetes; 47: 1114-1120. 41. Goldberg, DM., Tsang, E., Karumanchiri, A., Diamandis, E., Soleas, G., Ng, E. (1996). ‘Method to assay the concentrations of phenolic constituents of biological interest in wines.’ Anal Chem. 68 (10) : 1688-94. 42. Gottlieb, SL., Edmiston, A., Haywsood, J. (1981). ‘Late doxorubicin cardiotoxicity.’ Chest; 78: 880-882 43. Gupta, M., Steinheirz, PG., Cheung, NK., Steinherz, L. (2003). ‘Late cardiac after bolus versus infusion anthracycline therapy for childhood cancers.’ Med Pediatr Oncol; 40: 343-47. 44. Hanan, M., Abd, El-Gawad., Maha, M., El-Sawalhi. (2004). ‘Nitric oxide and oxidative stress in brain and heart of normal rats treated with doxorubicin: Role of aminoguanidine’ Journal of Biochemical and Molecular Toxicology; 18 (2) : 69-77. 45. Hendler, SS., Rorvik, DR. (2001). ‘eds. PDR. for Nutritional Supplements.’ Montvale: Medical Economics Company, Inc. 46. Hibbs, JB., JR., Taintor, RR., Vavrin, Z., and Rachlin, EM., (1998). ‘Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule.’ Biochem Biophys Res Commun; 157: 87-94. 106 47. Hibbs, JB., Jr. (1992). ‘Overview of cytotoxic mechanism and defence of intrasellüler environment againts microbeses.’ In: Moncada, S., Marletta, MA., Hibbs, JB., Jr., eds. ‘The biology of nitric oxide: Enzimology, biochemistry and immünology.’ London: Portland Press: 2 : 201-6. 48. Hortobagyi, GN., Frye, D., Buzdar, AU. (1989). ‘Decreased cardiac toxicity of doxorubicin administered by continous intravenous infusion in combination chemotherapy for metastatic breast cancer.’ Cancer; 63: 37-45. 49. Jaenke, R., S. (1974). ‘An anthracycline antibiotic-induced cardiomyopathy in rabbits.’ Lab. Investig., 30: 292–304. 50. Jakacki, RI., Larsen, RL., Barber, G. (1993). ‘Comparison of cardiac function tests after anthracycline therapy in childhood.’ Cancer ; 72: 2739-45. cer Study Group Pediatrics 1992; 89: 942-9. 51. Jang, JH., Surh, YJ. (2003). ‘Protective effect of resveratrol on beta-amyloidinduced oxidative PC12 cell death.’ Free Radic Biol Med. 34(8):1100-10. 52. Jang, M., Cai, L., Udeani, GO., et al. (1997). ‘Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes.’ Science; 275 (5297) : 218-220. 53. Jang, M., Cai, L., Udeani, GO., Slowing, KV., Thomas, CF., Beecher, CW., Fong, HH., Farnsworth, NR., Kinghorn, AD., Mehta, RG., Moon, RC., Pezzuto, JM. (1997). ‘Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes.’ Science. 275 (5297) :218-20. 54. Jaroslaw, Dudka., Jadwiga, Jodynis-Liebert, Elzbieta, Korobowicz, Franciszek, Burdan, Agnieszka, Korobowicz, Justyna, Szumilo, Edyta, Tokarska, Robert, 107 Klepacz, Marek, Murias. (2005). ‘Activity of NADPH-cytochrome P-450 reductase of the human heart, liver and lungs in the presence of (-)-epigallocatechin gallate, quercetin and resveratrol: an in vitro study: Basic Clin Pharmacol Toxicol.’ 97 (2) :74-9 15998352. 55. Juan, ME., Vinardell, MP., Planas, JM. (2002). ‘The daily oral administration of high doses of trans-resveratrol to rats for 28 days is not harmful.’ J Nutr;132 (2) : 257-260. 56. Junquira, L. Carlos, Carneiro J, Kelley O.R. (2003) Basic Histology Text and Atlas;A Lange Medical Book,tenth edition: 226-230, 206-208. 57. Khan, M., Shobha, J.C., Mohan, IK., et al. (2005). “Protective effect of Spirulina against doxorubicin-induced cardiotoxicity”. Phytotherapy Research;19 (12) :10301037. 58. Kierszenbaum, Abraham L./ Çev. Ed. Demir Ramazan (2006). Histoloji ve Hücre Biolojisi Patolojiye Giriú,Palme Yayıncılık: 321-324. 59. Klinge, CM., Blankenship, KA., Risinger, KE., et al. (2004). ‘Resveratrol and estradiol rapidly activate MAPK signaling through estrogen receptors alpha and beta in endothelial cells.’ J Biol Chem. 60. Köktürk, ø. (1967). ‘Elektron mikroskop vegenel araútırma metodları’ øzmir Bornava Ege Üniversitesi Matbaası, 53, 54, 68, 69, 108 – 113, 115, 116. 61. Lebrecht, D., Kokkori, A., Ketelsen, U., Setzer, B., and Walker, A., U. (2005). “Tissuespecific mtdna lesions and radicalassociated mitochondrial dysfunction in human hearts exposed to doxorubicin”. The Journal of Pathology 207 (4), 436-444. 108 62. Leeson Thomas S., Leeson Roland C., Paparo Anthony A. (1998).Text /Atlas of Histology:W.B.Saunders Company: 322-324. 63. Lefrak, E., A., Pitha, J., Rosenheim, S., Gottlieb, J., A., A. (1973). ‘Clinicopathologic analysis of Adriamycin cardiotoxicity.’ Cancer (Phila.), 32: 302– 314. 64. Legha, SS., Benjamin, RS., Mackay, B. (1982). ‘Reduction of doxorubicin cardiotoxicity by prolonged continous intravenous infusion.’ Ann Intern Med; 96: 133-9. 65. Lewis, W., and Gonzales, B. (1986). ‘Anthracycline effects on actin and actincontaining thin filaments in cultured neonatal rat myocardial cells.’ Lab. Investig., 54: 416–423. 66. Lipshultz, SE., Colan, SD., Gelber, RD., Perez-Atayde, AR., Sallan, SE., Sanders, SP. (1991). ‘Late cardiac effects of doxorubicin therapy for acute lymphoblastic leukemia in childhood.’ N Engl J Med; 324 (12): 808-15. 67. Lipshultz, SE., Grenier, MA. (1999). ‘Doxorubicin-induced cardiomyopathy.’ N Eng J Med; 340 (8): 653. 68. Lipshultz, SE., Giantris, AL., Lipsitz, SR., Dalton, VK., Asselin, BL., Barr, RD., Clawell, LA., Hurwitz, CA., Moghrabi, A., Samson, Y., Schorin, MA., Gelber, RD., Sallan, SE., Colan, SD. (2002). ‘Doxorubicin administration by continous infusion is not cardioprotective’: The Dana-Farber 91-01 Acute Lymphoblastic Leukemia Protocol. J Clin Oncol: 20(6): 1677-82. 109 69. Lipshultz, SE., Lipsitz, SR., Mone, SM., Goorin, AM., Sallan, SE., Sanders, SP., Orav, EJ., Gelber, RD., Colan, SD. (1995). ‘Female sex and higher drug dose as risk factors for late cardiotoxic effects of doxorubicin therapy for childhood cancer.’ New Engl J Med; 332: 1738-43. 70. Lipshultz, SE., Rifai, N., Sallan, SE. (1997). ‘Predictive value of cardiac troponin T in pediatric patients at risk for myocardial injury.’ Circulation; 96: 2641-8. 71. Lipshultz, SE., Sanders, SP., Goorin, AM., Krischer, JP., Sallan, SE., Colan, SD. (1994). ‘Monitoring for anthracycline cardiotoxicity.’ Pediatrics; 93(3): 433-7. 72.Liskovic, N., and Singal, P., K. (1997). ‘Lipid lowering: an important factor in preventing Adriamycin-induced heart failure.’ Am. J. Pathol., 150: 727–734. 73.Lockard, V., G., and Bloom, S. (1993). ‘Trans-cellular desmin-lamin B intermediate filament network in cardiac myocytes.’ J. Mol. Cell. Cardiol., 25: 303– 309. 74. Maejima, Y., Adachi, S., Ito, H., Hirao, K., Isobe, M. (2007). ‘Induction of premature senescence in cardiomyocytes by doxorubicin as a novel mechanism of myocardial damage.’ Aging Cell. 75. Marletta, MA. (1994). ‘Approaches toward selective inhibition of nitric oxide synthase.’ J. Med Chem 37: 1899-907. 76. Martinez, J., Moreno, J. J. (2000). ‘Effect of resveratrol, a natural polyphenolic compound, on reactive oxygen species and prostaglandin production.’ Biochem Pharmacol. 59(7):865-70. 110 77. Meng, X., Maliakal, P., Lu, H., Lee, MJ., Yang, CS. (2004). ‘Urinary and plasma levels of resveratrol and quercetin in humans, mice and rats after ingestion of pure compounds and grape juice.’ J Agric Food Chem; 52 (4):935-942. 78. Metcalfe, DD., Baram, D., Mekori, YA. (1997). ‘Mast cells.’ Physiol Rev; 77: 1033- 79. 79. Mohaupt, MG., Elzie, JL., Ahn, KY., Clapp, WL., Wilcox, CS., Kone, BC. (1994). ‘Differential expression and induction of mRNAs encoding two inducible nitric oxide synthases in rat kidney.’ Kidney Int; 46: 653-65. 80. Molinari, A., Calcabrini, A., Crateri, P., and Arancia, G. (1990). ‘Interaction of anthracyclinic antibiotics with cytoskeletal components of cultured carcinoma cells (CG5).’ Exp. Mol. Pathol., 53: 11–33. 81. Moore K., Persaud T.V.N.,(Çeviri Editörleri: Yıldırım M., Okar ø., Dalçık H.). (2002). ønsan Embriyolojisi, altıncı baskıdan çeviri; Nobel Tıp Kitapevleri, Ankara; 349-365. 82. Myers, CE. (1993). ‘Anthracyclines and DNA intercalators.’ In: Holland J, Frei E, et al, eds.Cancer medicine. Philadelphia: Lea and Febiger: 764. 83. Myers, CE., McGuire, WP., Liss, RH., et al. (1977). ‘Adriamycin: The role of the lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response.’ Science; 197: 165-167. 84.Nathan, C. (1992). ‘Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells.’ FASEB; 6: 3051-64. 85. Nathan, C., Xie, QW. (1994). ‘Nitric oxide synthases: roles, tolls, controls.’ Cell; 78: 915-8. 111 86. Nithipongvanitch, R., Ittarat, W., Cole, MP., Tangpong, J., Clair, DK., Oberley, TD. (2007). ‘Mitochondrial and nuclear p53 localization in cardiomyocytes: redox modulation by doxorubicin (Adriamycin)?’ Antioxid Redox Signal, 9 (7):1001-8. 87. Nussler, AK., Billiar, TR. (1993). ‘Inflammation, immünoregulation and inducible nitric oxide synthase.’ J Leukoc Biol (USA); 54 (2): 171-8. 88. Olivetti, G., Abbi, R., Quaini, F., Kajstura, J., Cheng, W., Nitahara, J. A., Quaini, E., di Loreto, C., Beltrami, C., A., Krajewski, S., Reed, J. C., and Anversa, P. (1997). ‘Apopitosis in the failing human heart.’ N. Engl. J. Med., 336: 1131–1141. 89. Ozkan, M., Dweik, R. (2001). ‘Nitric Oxide and Airway Reactivity.’ Clin Pulm Med; 8:199-206. 90. Öz, Eser., Erbaú, Deniz., Sürücü, H., Düzgün, Ersel. (2006). ‘Prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity by melatonin.’ Molecular and Cellular Biochemistry, Volume 282, Numbers 1-2, pp. 31-37(7) 91. Palmer, RMJ., Ferrige, AG., Moncada, S. (1987). ‘Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor.’ Nature;327:524-26 92. Piver, B., Berthou, F., Dreano, Y., Lucas, D. (2001). ‘Inhibition of CYP3A, CYP1A and CYP2E1 activities by resveratrol and other non volatile red wine components.’ Toxicol Lett.; 125 (1-3) : 83-91. 93.Postma, A., Bink-Boelkens, MT., Beaufort-Krol, GC., Kengen, RA., Elzenga, NJ., Schasfoort-van, Leeuwen, MJ., Schraffordt, Koops, H., Kamps, WA. (1996). ‘Late cardiotoxicity after treatment for a malignant bone tumor.’ Med Pediatr Oncol; 26 (4): 230-7. 112 94. Regev-Shoshani, G., Shoseyov, O., Kerem, Z. (2004). ‘Influence of lipophilicity on the interactions of hydroxy stilbenes with cytochrome P450 3A4.’ Biochem Biophys Res Commun; 323 (2) : 668-673. 95. S., Fogli, P., Nieri, and M.,C., Breschi. (2004). ‘The role of nitric oxide in anthracycline toxicity and prospects for pharmacologic prevention of cardiac damage.’ Fed Am Soc Exp Biol J 18, pp. 664–675. 96. Sadler, T.W., (Çeviri Editörü: Prof. Dr. A.Can Baúaklar). (1996). Langman’s Medikal Embriyoloji, yedinci baskıdan çeviri; Palme Yayıncılık; 175-188. 97. Sahna, E., Parlakpinar, H., Ozer, M., K., Ozturk, F., Ozugurlu, F., Acet, A. (2003). ‘Melatonin protects against myocardial doxorubicin toxicity in rats.’ role of physiological concentrations, Volume 35, Number 4, pp. 257-261 (5) 98. Sallan, SE., Clavell, LA. (1984). ‘Cardiac effects of anthracyclines used in the treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia: a 10-year experience.’ Semin Oncol; 11 (suppl 3): 19-21. 99. Saraste, A. (1999). ‘Morphologic criteria and detection of apopitozis.’ Herz, 24: 189–195. 100. Saraste, A., Pulkki, K., Henriksen, K., Kallajoki, M., Parvinen, M., and VoipioPulkki, L-M. (1997). ‘Apopitosis in human acute myocardial infarction.’ Circulation, 95:320–323. 101. Saraste, A., Pulkki, K., Kallajoki, M., Heikkila¨, P., Laine, P., Mattila, S., Nieminen, M. S., Parvinen, M., and Voipio-Pulkki, L-M. (1999). ‘Cardiomyocyte 113 apopitozis and progression of heart failure to transplantation.’ Eur. J. Clin. Investig., 29: 380–386. 102. Seifert, CF., Nesser, ME., Thompson, DF. (1994). ‘Dextrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity.’ Ann Pharmacother; 28: 1063-72. 103.Shapira J, Gotfried M, Lishner M, Ravid M. (1990). ‘Reduced cardiotoxicity of doxorubicin by a 6-hour infusion regimen. A prospective randomized evaluation.’ Cancer; 65: 870-3. 104. Shigematsu, S., Ishida, S., Hara, M., Takahashi, N., Yoshimatsu, H., Sakata, T., Korthuis, RJ. (2003). ‘Resveratrol, a red wine constituent polyphenol, prevents superoxide-dependent inflammatory responses induced by ischemia/reperfusion, platelet-activating factor, or oxidants.’ Free Radic Biol Med. 34(7):810-7. 105. Soleas, GJ., Diamandis, EP., Goldberg, DM. (1997). ‘Resveratrol: a molecule whose time has come? And gone?’ Clin Biochem; 30 (2) : 91-113. 106. Solymar, L., Marky, I., Mellander, L. (1988). ‘Echocardiographic findings in children treated for malignancy with chemotherapy including adriamycin.’ Pediatr Hematol Oncol; 5: 209-16. 107. Sorensen, K., Levitt, G., Bull, C., Chessells, J., Sullivan, I. (1997). ‘Anthracycline dose in childhood acute lymphoblastic leukemia: issues of early survival versus late cardiotoxicity.’ J Clin Oncol; 15: (1): 61-8. 108. Speyer, JL., Gree, MD., Zeleniuch-Jacquotte, A. (1992). ‘ICRF-187 permits longer treatment with doxorubicin in woman with breast cancer.’ J Clin Oncol; 10: 117-27. 114 109. Stadler, J., Billiar, TR., Curran, RD. (1991). ‘Effect of exogenous and endogenous nitric oxide on mitochondrial respiration of rat hepatocytes.’ Am J Physiol; 260:C910-6. 110. Steinherz, LJ., Graham, T., Hurwitz, R. (1993). ‘Guidelines for cardiac monitoring of children during and after anthracycline therapy: report of the cardiology committee of the Children's can44. Jakacki RI, Larsen RL, Barber G. Comparison of cardiac function tests after anthracycline therapy in childhood.’ Cancer; 72: 2739-45. cer Study Group. Pediatrics 1992; 89: 942-9. 111. Stevens, A., Lowe, S, James. (1997). ‘Human Histology, Mosby, second edition’147-158. 112. Stojanovic, S., Sprinz, H., Brede, O. (2001). ‘Efficiency and mechanism of the antioxidant action of trans-resveratrol and its analogues in the radical liposome oxidation.’ Arch Biochem Biophys.; 391 (1) : 79-89. 113. Stuart, MJ., DeAlarcon, PA., Oski, FA. (1978). ‘Inhibition of Adriamycin (ADR) induced lipid peroxidaticn by a-tocopherol (a-T) and acetyl salicylic acid (ASA) (abstr).’ Pediatr Res; 12:474. 114. Sulzuki, T., Kanda, H., Kawai, Y., et al. (1979). ‘Cardiotoxicity of anthracycline antineoplastic drugs-Clinicopathological and experimetntal studies.’ Jpn Circ J; 43:100t)-1008. 115. ùeftalio÷lu A. (1998). Genel ve Özel ønsan Embriyolojisi; üçüncü baskı, Meteksan Basın Yayın, Ankara; 381-405. 115 116. Unverferth, B., J. Magorien, R. D., Balcerzak, S. P., Leier, C. V., and Unverferth, D. V. (1983). ‘Early changes in human myocardial nuclei after doxorubicin.’ Cancer (Phila.), 52 : 215–221. 117. Van Vleet, JF., Ferrans, VJ. (1980). ‘Evaluation of vitamin E and selenium orotection against chronic Adriamycin toxicity in rabbits.’ Cancer Treat Rep; 64:315317. 118. Von Hoff, DD., Layard, MW., Basa, P. (1979). ‘Risk factors for doxorubicininduced congestive heart failure.’ Ann Intern Med; 91:710. 119. Von Hoff, DD., Rozencweig, M., Layard, MW. (1977). ‘Daunomycin-induced cardiotoxicity in children and adults: a review of 110 cases.’ Am J Med; 62: 200. 120. Vora, J., Khaw, B.A., Narula, J., & Boroujerdi, M. (1996). ‘Protective effect of butylated hydroxyanisole on adriamycin-induced cardiotoxicity.’ J. Pharm. Pharmacol., 48, 940-944. 121. Walle, T., Hsieh, F., Delegge, MH., Oatis, JE. Jr., Walle, UK. (2004). ‘High absorption but very low bioavailability of oral resveratrol in humans.’ Drug Metab Dispos;32 (12):1377-1382. 122. Wallerath, T., Deckert, G., Ternes, T., et al. (2002). ‘Resveratrol, a polyphenolic phytoalexin present in red wine, enhances expression and ac tivity of endothelial nitric oxide synthase.’ Circulation;106 (13):1652-1658. 123. Wang, X., Zalcenstein, A., Oren, M. (2003). ‘Nitric oxide promotes p53 nuclear retention and sensitizes neuroblastoma cells to apopitozis by ionizing radiation.’ Cell Death Differ; 10 : 468-76. 116 124. Wexler, LH., Andrich, MP., Venzon, D., Berg, SL., Weaver-McClure, L., Chen, CC., Dilsizian, V., Avila, N., Jarosinski, P., Balis, FM., Poplack, DG., Horowitz, ME. (1996). ‘Randomized trial of the cardioprotective agent ICRF-187 in pediatric sarcoma patients treated with doxorubicin.’ J Clin Oncol; 14 (2): 362-72. 125. Wong, KY., Lampkin, BC. (1983). ‘Anthracyclin toxicity.’ Am J Pediatr Hematol Oncol; 5: 93-7. 126. Woo, JH., Lim, JH., Kim, YH., et al. (2004). ‘Resveratrol inhibits phorbol myristate acetate-induced matrix metalloproteinase-9 expression by inhibiting JNK and PKC delta signal transduction.’ Oncogene; 23 (10) : 1845-1853. 127. Yang, SH., Kim, JS., Oh, TJ., et al. (2003). ‘Genome- scale analysis of resveratrol-induced gene expression profile in human ovarian cancer cells using a cDNA microarray.’ Int J Oncol; 22 (4):741-750. 128. Zalewska-Szewczyk, B., Lipiec, J., Bodalski, J. (1999). ‘Late cardiotoxicity of anthracyclines in children with acute leukemia.’ Klin Padiatr; 211 (4):356-9. 129. Zhang, J., Clark, J. R., Herman, E. H., and Ferrans, V. J. (1993). ‘Dendritic cells in the hearts of spontaneously hypertensive rats treated with doxorubicin with or without ICRF- 187.’ Am. J. Pathol., 142: 1916–1926. 130. Zhang, J., Clark, J. R., Herman, E. H., and Ferrans, V. J. (1996). ‘Doxorubicininduced apoptozis in spontaneously hypertensive rats: differential effects in heart, kidney and intestine, and inhibition by ICRF-187.’ J. Mol. Cell. Cardiol., 28: 1931– 1943. 117 ÖZGEÇMøù 25.07.1965 tarihinde, øzmir’de do÷dum. ølkokulu Karúıyaka Cumhuriyet ølkokulu’nda , orta ve lise e÷itimimi ise, Bornova Anadolu Lisesi’nde tamamladım. 1992 yılında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden Tıp Doktoru Unvanı ile mezun oldum. 1992 – 1993 yılları arasında øtalya’da, Udine Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Do÷um Ana Bilim Dalı’nda Uzmanlık e÷itimine baúladım, fakat o yıllarda ülkemizde yürürlükte olan Mecburi Hizmet Yasası gere÷i 1993’de Do÷u Hizmeti Yükümlülü÷ü nedeniyle geri döndüm. 2001 yılında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı’nın açmıú oldu÷u Doktora sınavını kazanarak adı geçen ana bilim dalında doktora e÷itimine baúladım ve halen aynı ana bilim dalında tez bitirme aúamasındayım Aynı zamanda øzmir øl Sa÷lık Müdürlü÷ü’ne ba÷lı Konak Gültepe 12. No’lu Ana Çocuk Sa÷lı÷ı Merkezi’nde pratisyen hekim olarak görev yapmaktayım. 118
