pulsed-fıeld gel electrophoresıs
advertisement
PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS Bengül Durmaz, Rıza Durmaz PFGE, moleküler tiplendirme yöntemlerinin altın standardı olarak kabul edilmektedir. Bu yöntemde, sıvı veya katı besiyerinde üretilen bakteriler, düşük erime ısılı agaroza karıştırılıp küçük kalıplar içine dökülmektedir. Agaroz içine karıştırılan bakteri hücreleri, deterjan ve enzim yardımıyla parçalanarak (in situ-lysis) DNA izolasyonu yapılmaktadır. PFGE’de bozulmamış DNA gerekli olduğundan, DNA’da kırılmalara yol açabilen geleneksel DNA izolasyonu bu yöntem için uygun değildir. Liziz işlemini takiben agaroz kalıpları iyice yıkanarak veya diyalize edilerek protein ve karbon hidrat gibi kontaminantların uzaklaştırılması sağlanır. Büyük olan kromozomal DNA agaroz jel içinde tutulu kalır. Agaroz içindeki bakteriyel DNA, nispeten az sayıda ve büyük parçalar oluşturan bir restriksiyon enzimi (RE) ile kesime uğratılmaktadır (in situdigestion). Daha sonra içinde kesime uğratılmış DNA parçaları bulunan kalıplar, elektroforez uygulanacak jel içindeki uygun çukurlara yerleştirilmekte ve belirli aralıklarla yönü değiştirilen elektrik akımına tabi tutulmaktadır. Bu tip bir elektrik akımı, 10-800 kilobazlık DNA segmentlerinin net olarak ayırt edilmesine imkan sağlamaktadır. Yöntem, Şekil 1’de özetlenmiştir. Elektroforez sonucunda jel etidyum bromürle boyanarak, her bir izolata ait bant profili görünür hale getirilmektedir 1. Bu bant profilleri bilgisayar programları yardımı ile değerlendirilerek suşların birbirleriyle olan ilişkileri ortaya konulmaktadır. Bilgisayara dayalı analizlerde, incelenen mikroorganizmalara ait PFGE profillerinin saklanması ile “veri bankası” oluşturulabilir. Böylece çalışılan suşların profillerinin, daha önce var olan verilerle karşılaştırılma olasılığı oluşmaktadır 2. PFGE’de yüksek kalitede DNA’nın elde edilmesi oldukça önemlidir. Bu nedenle soğuk tampondaki hücrelerin hızlıca işlenmesi, erimiş agaroza eklemeden önce bakterilerin buzda tutulması ve agaroz kalıpların soğukta tutulması gerekmektedir 3. RE seçerken göz önünde tutulması gereken birçok faktör vardır. Birincisi, bakteriyel DNA’nın G+C içeriğidir. Düşük G+C içerikli DNA'lar (örneğin Staphylococcus aureus), tanıma bölgesi G+C bakımından zengin olan RE (örneğin SmaI) ile muamele edildiğinde yeteri kadar kesilememektedir. İkincisi ise tanıma bölgesi uzun olan enzimler, kısa olanlara kıyasla daha az sayıda kesim parçaları oluştururlar 161 Şekil 1. PFGE’in aşamaları. PFGE yönteminin değişik tipleri bulunmaktadır. En basit tipi “field-inversion gel electrophoresis” dir. Bu sistemde elektrik akımı belirli sürelerde ileri ve geri olmak üzere iki yönde uygulanmaktadır. İleri yönde uygulanan akımın süresi daha uzundur. Yaygın kullanılan tipi ise “contour-clamped homogenous electric field” dir. 162 Bu sistemde altıgen biçiminde 120 derecelik açılarda yerleştirilmiş olan elektrotlardan sabit hızda elektrik akımı gelmektedir 1. Büyük DNA parçalarının agarozda ayrıştırılmasına etki eden çeşitli faktörler vardır. Bunlardan başlıcaları; agaroz konsantrasyonu, tampon konsantrasyonu, sıcaklık, pulse süresi, voltaj ve toplam elektroforez süresidir 3. Yöntemin ayrım gücü oldukça yüksektir. Ancak zaman alıcı ve kompleks bir sistemdir. Ayrıca laboratuvarlar arasında hâlâ standardizasyon problemi vardır 4. Yöntemin uygulanmasında güvenlikle ilgili bazı hususlara dikkat edilmelidir. Bakterilerin işlenmesi aşamasında kontaminasyonu önlemek için azami dikkat gösterilmelidir. Jeli boyamada kullanılan etidyum bromürün güçlü bir mutajen olduğu dikkate alınarak, maske ve eldiven giyilmeli, çevreyi kirletmeden çalışmaya gayret edilmelidir Kontroller Test izolatlarının yanında restriksiyon profilleri çok iyi bilinen bakteriler de kontrol amacıyla kullanılabilir. Böylece; 1) Hücre parçalanması, yıkama ve endonükleaz basamaklarının uygunluğu, 2) Jel ve elektroforez koşulları, 3) Sonuçların tekrarlanabilirliği kontrol edilmiş olur. Jeldeki en az bir çukurda (ideal olanı biri jelin baş tarafındaki, diğeri ortadaki çukurda olmak üzere iki çukurda) moleküler ağırlık standardı kullanılmalıdır. Bu standartlar, delesyon, insersiyon ya da mutasyonlar gibi tek bir genetik olaydan kaynaklanabilecek çok küçük değişikliklerin değerlendirilmesi için yararlı olmaktadır. Lambda ladder' en yaygın kullanılan moleküler ağırlık standardıdır. Restriksiyon profillerinin analizi ve izolatların yakınlık derecelerine göre sınıflandırılması Öncelikle, ortak ya da salgın profili belirlenir. Ortak profil yoksa büyük olasılıkla izolatlar birbirleriyle ilişkisizdir. (Epidemiyolojik olarak ilişkili suşlar arasında ortak profil olmaması nadir bir durumdur). Salgın suşunun profili belirlendikten sonra, buradaki bantların sayı ve boyutları diğer izolatlarınki ile karşılaştırılır. Her bir izolatın profili, salgın suşuyla olan ilişkisine göre sınıflandırılır. PFGE ile elde edilen DNA profillerini yorumlamak ve bunları epidemiyolojik çalışmalarda kullanabilmek için, PFGE profillerinin nasıl karşılaştırılması gerektiğinin ve rastlantısal genetik olayların bu profilleri nasıl değiştirebileceğinin bilinmesi gereklidir. İdeal 163 olarak, salgın suşlarının PFGE profilleri birbirleriyle aynı, epidemiyolojik olarak ilişkisiz suşlarınki ise farklı olması gerekir. Böyle olduğu zaman salgın suşunun tespit edilmesi kolay olur. Ancak, sık olarak nokta mutasyon, insersiyon ve delesyon gibi rastlantısal genetik olaylar, salgın süreci içinde PFGE profilini değiştirebilir. Bu durum, sonuçların değerlendirmesini zorlaştırır. Tenover ve ark. 5 PFGE sonuçlarının yorumlanması için bir sistem önermişlerdir. Bu sistemde bant profillerine bakılarak, izolatların birbirleriyle ilişkilerinin derecelendirilmesi yapılabilmektedir (Tablo 1). 5 Tablo 1. PFGE profillerini yorumlama kriterleri . Katagori Aynı Yakın ilişkili Olası ilişkili Farklı Salgın suşuna kıyasla Salgın suşundan genetik faklılık sayısı farklılık gösteren bant sayısı 0 0 1 2-3/1-3 2 4-6 ≥3 ≥7 Epidemiyolojik yorum İzolat, salgının bir parçası İzolat, salgınla yakın ilişkili İzolat, salgınla olası (possibly) ilişkili İzolat, salgınla ilişkisiz Aynı izolat: Aynı sayı ve boyutlarda bant içeren izolatlar için kullanılır. Bu izolatlar, genetik olarak farksız kabul edilir. Salgın suşu ile aynı profili gösteren izolatlar, epidemiyolojik olarak ilişkilidir. Epidemiyolojik verilerle desteklenen tek bant farklılığının da klonal ilişkiyi gösterdiği kabul edilmektedir 6. Yakın ilişkili izolat: Salgın suşu ile aralarında 2-3 bant farkı olan izolatlar için kullanılır. İzolat salgın suşuyla yakından ilişkili olarak değerlendirilir ve epidemiyolojik olarak, salgının bir parçası olma olasılığı yüksektir. Bu farklılık, bir nokta mutasyon veya bir insersiyon ya da bir delesyon gibi tek bir genetik olayla ilişkilidir. Örneğin yeni bir restriksiyon bölgesi oluşturan spontan bir mutasyon, restriksiyon parçasını daha küçük iki parçaya ayırır. Orijinal büyük parçanın eksikliği bir bant farkına, yeni oluşan daha küçük iki parça da ek olarak iki bant farkına neden olur. Başka bir ifade ile test izolatıyla salgın suşu arasında üç bantlık bir fark oluşur (Şekil 2, Tablo 2). Bazı türlere ait suşların zaman içinde tekrar tekrar kültürleri yapıldığında ya da aynı hastadan arka arkaya izole edildiğinde ikiüç bantlık bir değişiklik gösterdiği de kaydedilmiştir. Muhtemelen ilişkili izolat: Salgın suşları ile aralarında 4-6 bant farkı olan izolatlar için kullanılr. Bu değişim, iki bağımsız 164 genetik değişikliğin (insersiyon/delesyon ya da restriksiyon bölgelerinin kazanımı veya kaybı) sonucu olarak ortaya çıkmaktadır. Bu tarz bir değişiklik, uzun bir zaman sürecinde (≥6 ay) veya çok sayıda hastanın olduğu büyük salgınlarda toplanan izolatlar arasında gözlenmiştir. Epidemiyolojik yönden, bu izolat, salgın suşuyla olası (possible) ilişkili olarak değerlendirilir. Bu izolatlar salgın suşuyla aynı genetik soydan (lineage) olabilirler, ancak genetik olarak yakın ilişkili değildirler. Epidemiyolojik olarak ilişkili olma ihtimalleri daha azdır. 5 Tablo 2. Genetik olayların PFGE profilleri üzerindeki etkisi . Yeni bir restriksiyon bölgesinin oluşmasıyla sonuçlanan nokta mutasyon⇒ Yeni profilde, salgın profilinde bulunan bir bant olmayacak ve salgın profilinde olmayan iki yeni ve daha küçük bant olacak; iki küçük bandın boyutlarının toplamı, yaklaşık olarak büyük bandın boyutu kadar olacaktır. Bu değişim, üç bantı farklı profil olarak ortaya çıkacaktır (Şekil 2, B). Bir restriksiyon bölgesinin kaybıyla sonuçlanan nokta mutasyon ⇒ Yeni profil, salgın suşunda olmayan, daha büyük bir banta kazanırken iki küçük bantı kaybetmiş olacak. Bu değişim de üç bandı farklı profil olarak gözlenecektir (Şekil 2, C). Restriksiyon parçası içine restriksiyon bölgesi bulunmayan yeni bir DNA insersiyonu ⇒ Yeni profil, salgın profiliyle aynı sayıda banta sahip olacak. Ancak, büyüklüğü farklı (daha büyük) yeni bir bant bulunacaktır (Şekil 2, D). Bir banttan içinde restriksiyon bölgesi bulunmayan parçanın delesyonu ⇒ Yeni profil, büyük bir parçası eksik buna karşılık, yeni, küçük boyutta bir banda sahip olacak. Bu değişim iki bandı farklı profil olarak görülecektir (Şekil 2, E). Şekil 2. Değişik genetik olayların PFGE profiline yansıması. A, salgın suşu profili; B, yeni bir restriksiyon bölgesinin eklenmesi; C, bir restriksiyon bölgesinin kaybolması; D, bir parçanın içine restriksiyon bölgesi bulunmayan yeni bir DNA insersiyonu; E, bir 5 parçadan DNA’nın delesyonu .(* kazanılan bant; o, kaybedilen bant) 165 Genetik olarak muhtemelen ilişkili olan ancak salgın suşuyla epidemiyolojik bağlantısı olmayan izolatlar, plazmit fingerprinting gibi diğer tiplendirme yöntemleriyle farklılık gösterme eğilimindedirler. İlişkisiz izolatlar: Bu izolatların DNA’sında, üç ya da daha fazla genetik olay sonucu oluşan değişikliklere bağlı olarak, salgın suşundan yedi ya da daha fazla bant farkı gözlenmektedir. Epidemiyolojik olarak, salgın suşuyla ilişkisiz oldukları kabul edilir. Bu kriterler kullanılırken dikkate alınması gereken belirli hususlar vardır 5. PFGE ile en az 10 ayrı bant oluşmuşsa bu kriterler güvenle kullanılabilir. Daha az sayıda bant tespit edildiğinde kriterlerin güvenilirliği ve ayırt etmedeki yeterliliği bilinmemektedir. Kriterler, genetik değişimin sınırlı olduğu düşünülen küçük ve lokal çalışmalar için belirlenmiştir. Hastanelerde ya da toplumdaki potansiyel salgınlarla ilgili epidemiyolojik çalışmalar sırasında kısa bir zaman sürecinde (1-3 ay) alınmış izolatlar için kullanılabilir. Bir yıl ya da daha uzun sürede toplanan, geniş mikroorganizma popülasyonlarıyla yapılan çalışmalar için uygun değildir. Bu öneriler, tiplendirme çalışmaları için sınırlı zamanı ve kaynağı olan ve suşları tek bir restriksiyon endonukleaz kullanarak analiz edecek laboratuvarlar için düzenlenmiştir. Uzun zaman sürecinde toplanmış izolatlar arasındaki potansiyel ilişkiyi araştıran referans laboratuvarları, çok sayıda enzim ve analiz yöntemi kullananlar bu kriterleri modifiye etmelidirler. Sonuçların rapor edilmesi Salgın suşlarına ait DNA restriksiyon profilleri genelde ‘tip A’ olarak rapor edilir. Salgın suşunun profili ile yakın ya da muhtemel ilişkili profiller, ‘tip A’nın alt tipleri olarak değerlendirilip tip A1, tip A2,.., şeklinde salgın suşundan çok farklı olan ve ilişkisiz olarak sınıflandırılan profiller ise tip B, tip C ,. olarak gösterilir. PFGE; Salmonella 7, Neisseria gonorrhoeae 8, metisiline dirençli Staphylococcus aureus 4,9, Acinetobacter baumannii 10, Escherichia coli 11 gibi birçok gram-pozitif ve gram-negatif bakterinin tiplendirilmesinde güvenle kullanılmıştır. Vankomisine dirençli enterokoklar, S. aureus, S. epidermidis, Acinetobacter türleri ve Pseudomonas aeruginosa suşlarının tiplendirilmesinde, bu yöntemin ayrım gücünün, diğerlerinden daha üstün olduğu belirtilmiştir 2,4,10,12. 166 Farklı bakteri türlerinin PFGE analizi için yararlı olduğu saptanmış restriksiyon enzimleri ve oluşturulan DNA bant sayıları Tablo 3’de gösterilmiştir. 5 Tablo 3. PFGE uygulanmış bakteri örnekleri . Bakteriler Gram pozitifler Enterocuccus spp Clostridium difficile C. perfringens Staphylococcus aureus Streptococcus spp (Grup A,B) S. pneumoniae Gram negatifler Acinetobacter baumannii Escherichia coli Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Salmonella spp Shigella spp Vibrio cholerae RE Yaklaşık bant sayısı Bant büyüklüğü (kb) SmaI SmaI SmaI SmaI CspI SmaI SmaI 15-20 10-15 12 15-20 10-15 15-20 10-19 5-400 10-900 45-1460 10-700 30-500 5-500 20-300 SmaI ApaI NotI SfiI SfiI SpeI XbaI NotI XbaI NotI 20-40 20-30 12-15 15-20 7-10 20-25 40-50 40-50 15-23 20-30 5-300 10-300 10-1000 10-700 50-700 10-700 10-30 5-400 10-700 10-400 Kaynaklar 1. Swaminathan B, Matar GM. Molecular typing methods. In: Persing DH, Smith TF, Tenover FC, White TJ. (eds). Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications. ASM Press, Washington DC 1993: 26-50. 2. Olive DM, Bean P. Principles and applications of methods for DNAbased typing of microorganisms. J Clin Microbiol 1999; 37: 1661-9. 3. Maslow JN, Slutsky AM, Arbeit RD. Application of pulsed-field gel electrophoresis to molecular epidemiology. In: Persing DH, Smith TF, Tenover FC, White TJ. (eds). Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications. ASM Press, Washington DC 1993: 56372. 4. Tang Y-W, Waddington MG, Smith DH, et al. Comparison of protein A gene sequencing with pulsed-field gel electrophoresis and epidemiologic data for molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2000; 38: 1347-51. 5. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA retriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33: 2233-9. 6. Smith D, Willshaw G, Stanley J, Arnold C. Genotyping of verocytotoxin-producing Escherichia coli 0157: Comparison of isolates of a prevalent phage type by fluorescent amplified-fragment 167 7. 8. 9. 10. 11. 12. lenght polymorphism and pulsed-field gel electrophoresis analyses. J Clin Microbiol 2000; 38: 4616-20. Old DC, Rankin SC, Crichton PB. Assessment of strain relatedness among Salmonella serotypes Salinatis, Duisburg, and Sandiego by biotyping, ribotyping, IS200 fingerprinting, and pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 1999; 37: 1687-92. Looveren MV, Ison CA, Ieven M, et al. Evaluation of the discriminatory power of typing methods for Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol 1999; 37: 2183-8. Grady R, Desai M, O’Neill G, Cookson B, Stanley J. Genotyping of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus phage type 15 isolates by fluorescent amplified-fragment lenght polymorphism analysis. J Clin Microbiol 1999; 37: 3198-203. Marcos MA, Jimenez de Anta MT, Vila J. Correlation of six methods for typing nosocomial isolates of Acinetobacter baumannii J Med Microbiol 1995; 42:328-35. Preston MA, Johnson W, Khakhria R, Borczyk A. Epidemiologic subtyping of Escherichia coli serogroup O157 strains isolated in Ontario by phage typing and pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 2000; 38: 2366-8. Sloos JH, Dijkshoorn L, Vogel L, van Boven CPA. Performance of phenotypic and genotypic methods to determine the clinical relevance of serial blood isolates of Staphylococcus epidermidis in patients withsepticemia. J Clin Microbiol 2000; 38: 2488-93. 168
