ayça tez - Ankara Üniversitesi Açık Erişim Sistemi
advertisement
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TOPLUMUMUZDA GÖZ RENGİNİ BELİRLEYEN HERC2 GEN POLİMORFİZMİNİN YAYGINLIĞININ ARAŞTIRILMASI Gözde MASATCIOĞLU DİSİPLİNLERARASI ADLİ BİLİMLER ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. Zeliha KAYAALTI 2012- ANKARA TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TOPLUMUMUZDA GÖZ RENGİNİ BELİRLEYEN HERC2 GEN POLİMORFİZMİNİN YAYGINLIĞININ ARAŞTIRILMASI Gözde MASATCIOĞLU DİSİPLİNLERARASI ADLİ BİLİMLER ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr Zeliha KAYAALTI 2012-ANKARA KABUL VE ONAY iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz v Simgeler ve Kısaltmalar vi Şekiller vii Çizelgeler viii 1. GİRİŞ 1 1.1 1.1.1 1.1.2 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction: PCR) PCR’nin Aşamaları PCR'da Kullanılan Bileşenler 1.1.3 PCR Optimizasyonu 12 1.2 Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP) Yöntemi 14 1.3 İnsan Pigmentasyonunun Biyolojisi 15 1.4 1.4.1 1.4.1.1 1.4.1.2 1.4.1.3 1.4.2 Melaninin Fonksiyonları Melanin Tipleri Ömelanin Feomelanin Nöromelanin Ömelanin ve Feomelanin Oluşum Mekanizmaları (Biyosentezleri) 16 17 17 18 18 18 1.5 1.5.1 Genler ve Özellikleri Membran İlişkili Taşıyıcı Protein Geni (Membrane Associated Transport Protein Gene-MATP) veya Çözünen Taşıyıcı Ailesi 45 Üyesi 2 (Solute carrier family 45 member 2-SLC45A2) Okülokutanöz Albinizm Tip II Geni (Oculocutaneous albinism type II gene-OCA2) HERC2-HECT ve RLD Domainine Bağlı E3 Ubiquitin Protein Ligaz 2 Geni (HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2) 22 1.5.2 1.5.3 2. GEREÇ VE YÖNTEM 5 6 9 24 26 28 31 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.3.1 Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Araç ve Gereçler Deney Protokolü Örneklerin Toplanması 31 31 31 32 32 2.2 2.2.1 2.2.1.1 2.2.1.1.1 2.2.1.1.2 Yöntem HERC2 Gen Polimorfizminin Genotipinin Belirlenmesi Svap Örneklerinden DNA İzolasyonu DNA İzolasyonunda Dikkat Edilecek Hususlar Genomik DNA’nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesi ve %0,5’lik Agaroz Jel Hazırlanması Agaroz Jele Yüklemek İçin Örnek Hazırlanması ve Yürütme Koşulları 32 33 33 34 2.2.1.1.2.1 35 35 iv 2.2.1.1.3 2.2.1.1.3.1 2.2.1.1.3.2 2.2.1.1.4 2.2.1.1.4.1 2.2.1.1.4.1.1 2.2.1.1.4.1.2 2.2.1.1.5 PCR Primerler PCR Bileşenleri ve PCR Programı PCR Ürünü İçin Agaroz Jel Hazırlanması Dra I Restriksiyon Enziminin Özellikleri Dra I Enzim ile Kesim İşlemi Dra I KesimÜrünleri İçin Agaroz Jel Hazırlanması İstatistiksel analizler 3. BULGULAR 36 37 38 40 40 41 41 42 43 3.1.3.1 3.1.4 3.1.5 Toplumumuz Bireylerinde HERC2 Genindeki A/G Tek Nükleotid Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan Analiz Sonuçları Genomik DNA’nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesinin Sonuçları PCR ile HERC2 Genindeki Polimorfizmin Amplifikasyon Sonuçları HERC2 Genindeki Tek Nükleotid Polimorfizminin Amplifiye Edilen Bölgesinin Dra I Restriksiyon Enzimi ile Kesim Sonuçları DNA Örneklerinin Genotiplendirilmesi HERC2 Genindeki A/G Tek Nükleotid Polimorfizminin Genotip Frekansı HERC2 Genindeki A/G Tek Nükleotid Polimorfizminin Alel Frekansı 3.2 Yaş-Genotip ilişkisi 51 3.3 Çalıştığımız Popülasyonun Hardy-Weinberg Dengesinin Tespiti 52 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 43 43 43 45 45 50 51 4. TARTIŞMA 54 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 61 SUMMARY 64 KAYNAKLAR 65 EKLER 72 ÖZGEÇMİŞ 74 v ÖNSÖZ Genetik, uzun yıllardır insanların merakını uyandıran bir bilim dalı olmuştur. Bazı adli vakalarda genetik, olayların çözümünde yardımcı bilim dalı olarak kullanılırken, DNA kimliklendirme ve babalık tayini gibi diğer bazı adli olaylar için ise olayı çözebilecek tek bilim dalı olarak işlev görmektedir. Diğer taraftan fenotip özelliklerin adli vakaların aydınlatılması amacıyla kullanımı son zamanlarda oldukça önem kazanmıştır. Göz renginin bireylerde belirgin fiziksel özelliklerden biri olması, toplumumuzda adli vakaların çözümlenmesinde göz rengini belirleyen genlerdeki polimorfizmlerle ilgili veri tabanının oluşturulmasını gerekli kılmaktadır. Bu tez kapsamında, toplumumuzdaki genotip-fenotip ilişkisini belirlemek amacıyla göz rengini belirleyen HERC2 gen polimorfizminin yaygınlığı araştırılmıştır. Tez çalışmamın belirlenmesi, planlanması ve hazırlanması aşamalarında yol gösteren, üstün yöneticilik vasıflarına sahip ve bu vasıflarıyla bizlere her türlü bilimsel araştırma olanağı sunan, engin görüş ve katkıları ile desteğini her zaman yanımda hissettiğim değerli hocam Ankara Üniversitesi Adli Bilimler Enstitüsü Müdürü, Sayın Prof. Dr. Tülin SÖYLEMEZOĞLU’na, Çalışmamın her aşamasında sunduğu kapsamlı bilgi ve tecrübesinden yararlandığım, değerli fikir ve katkılarıyla araştırmayı her bir detayda titizlikle yönlendiren danışman hocam Sayın Doç. Dr. Zeliha KAYAALTI’na, Laboratuvar çalışmalarındaki değerli yardım ve katkılarından dolayı sevgili hocam Dr. Dilek KAYA’ya, örneklerin toplanmasında ve laboratuvar çalışmalarımdaki yardımından dolayı Bio. Yasemin KARTAL’a teşekkür ederim. Çalışmalarım esnasında her zaman yanımda olan, maddi ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen, annem Necla MASATCIOĞLU, babam Mehmet MASATCIOĞLU, kardeşlerim İlknur, Gülnur ve Tuğrul’a anlayış ve hoşgörülerinden dolayı tüm içtenliğimle teşekkür ederim. vi SİMGELER VE KISALTMALAR A Adenin bp Baz Çifti (base pair) C Sitozin DNA Deoksiribonükleik Asit dNTP Deoksiribonükleozidtrifosfatlar DTT Dithiothreitol EDTA Etilen-diamin-tetra-asetik asit F primer Forward Primer (İleri doğru olan primer) G Guanin HPSF Yüksek Performanslı Tuzsuz-High Performance Salt Free kb Kilobaz PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase chain reaction) R primer Reverse Primer (Aksi yönde olan primer) RE Restriksiyon Endonükleaz RFLP Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi RNA Ribonükleik Asit SDS Sodyum Dodesil Sülfat SNP Tek Nükleotid Polimorfizm (Single Nucleotid Polymorphism) T Timin TBE Tris-Borikasit-Edta TE Tris-Edta vii ŞEKİLLER Şekil 1.1. Tek Nükleotid Polimorfizmi (http://en.wikipedia.org/wiki/Singlenucleotide_ polymorphism) Şekil 1.2. SNP’lerin görülme sıklığı Şekil 1.3. PCR’nin aşamaları Şekil 1.4. PCR programı Şekil 1.5. Taq DNA polimeraz enziminin yapısı Şekil 1.6. Melanin tiplerinin kimyasal yapıları Şekil 1.7. Ömelanin ve feomelanin biyosentezi Şekil 1.8. SLC45A2 geninin 5.kromozom üzerindeki lokalizasyonunun şematik gösterimi Şekil 1.9. OCA2 geninin 15. kromozom üzerindeki lokalizasyonunun şematik gösterimi Şekil 1.10. HERC2 geninin 3 boyutlu yapısı (http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protein_HERC2_PDB_2KEO.png) Şekil 1.11. HERC2 geninin 15. kromozom üzerindeki lokalizasyonunun şematik gösterimi Şekil 2.1. Agaroz jel kuyucuklarına örneklerin yüklenmesi Şekil 2.2. TECHNE TC 512 Thermal Cycle Cihazı Şekil 2.3. Dra I restriksiyon enziminin tanıma bölgesi ile kesim noktasının şematik gösterimi Şekil 3.1. HERC2 genindeki amplifikasyonunun jel görüntüsü Şekil 3.2. Kesme enzimi, kesme bölgesi ve enzimin tanıdığı bölge Şekil 3.3. 226 bp uzunluğundaki PCR ürününün “A/A” genotipli bireylerde, Dra I enzimi ile kesimi ile oluşan oligonükleotid uzunluklarının şematik gösterimi Şekil 3.4. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün homozigot tipik bireylerde, Dra I enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları Şekil 3.5. 226 bp uzunluğundaki PCR ürününün “GG” genotipli bireylerde, Dra I enzimi ile kesimi ile oluşan oligonükleotid uzunluklarının şematik gösterimi Şekil 3.6. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün, DraI enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları Şekil 3.7. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün homozigot tipik, heterozigot ve homozigot atipik bireylerde, Dra I enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları 3 4 8 9 11 17 20 26 27 28 29 36 37 40 44 45 46 46 47 48 49 viii ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Standart bir PCR’da bulunması gereken bileşenler ve miktarları Çizelge 2.1. Amplifikasyonda kullanılan primerler ve özellikleri. Çizelge 2.2. PCR bileşenleri ile stoktaki ve reaksiyondaki konsantrasyonları Çizelge 2.3. HERC2 gen polimorfizmi için PCR şartları Çizelge 2.4. Dra I enzimi ile kesim işlemindeki bileşenler ve reaksiyondaki hacimleri. Çizelge 3.1. PCR’da kullanılan primerler, kromozom üzerindeki lokalizasyonları ve amplifiye edilen bölgenin nükleotid dizilimleri. Çizelge 3.2. HERC2 geninin rs12913832 polimorfizmi ile oluşan genotipler ve Dra I enzimi ile kesim sonucundaki oligonükleotid uzunlukları Çizelge 3.3. Bireylerin HERC2 genindeki A/G tek nükleotid polimorfizminin genotip frekansı Çizelge 3.4. Toplumumuz bireylerinde HERC2 genindeki A/G tek nükleotid polimorfizminin alellerin frekansı. Çizelge 3.5. Bireylerin yaşları ve genotipleri arasındaki ilişki. Çizelge 3.6. Çalışılan popülasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olup olmadığının tespiti. Çizelge 4.1. Türk popülasyonu ile diğer popülasyonlar arasında HERC2 geninin rs12913832 (A/G) polimorfizminin genotip ve alel frekanslarının dağılımının karşılaştırılması 12 38 39 39 41 44 50 50 51 51 52 59 1 1. GİRİŞ Kimliklendirme, babalık tayini ve diğer akrabalık ilişkilerinin belirlenmesi adli bilimler alanı için oldukça önemlidir. Bu ilişkiler belirlenirken insanlar arasında farklılık gösteren özellikler araştırılmaktadır. İlk olarak 1930 yılında Karl Landsteiner’in Nobel Tıp Ödülünü almaya hak kazandığı AB0 kan grupları sistemi babalık ve cinayet davalarında güvenilir birer kanıt olarak kullanılmış, daha sonraki yıllarda teknolojinin gelişimine bağlı olarak eritrosit enzimleri, serum proteinleri, hemoglobin ve lökosit antijenleri (Human Leuokocyte Antigens-HLA) kullanılmıştır. Bu sistemlerle şüpheliyi tespit etmek mümkün hale gelmiş olsa da söz konusu sistemlerin her tür biyolojik materyale uygulanamama gibi çok önemli dezavantajları bulunmaktaydı. 1985 yılında Alec Jeffreys’in multilokus prob kullanarak insan deoksiribonükleik asit (DNA)’inin çok değişken bölgelerini tanımlamasından sonra, adli bilimler alanında insan kan ve dokularından kimlik tespiti (genetik parmak izi çalışması) için DNA’nın polimorfik bölgelerinden yararlanılabileceği anlaşılmıştır. Aynı yıllarda polimeraz zincir reaksiyon tekniğinin (Polymerase Chain ReactionPCR) de keşfedilmesi, moleküler genetik alanında devrim yaratmıştır. Belirli bir DNA bölgesini in vitro (hücre dışı) olarak milyonlarca kez çoğaltmaya yarayan PCR'nin bulunması ile birlikte adli amaçlı kimliklendirme hem daha kolay hem de daha kısa sürede gerçekleşmeye başlamıştır. Tek yumurta ikizleri dışında tüm insanların DNA’sı birbirinden farklıdır. Bu özellik kriminal tanı koymada temel faktördür. Bir diğer önemli özellik ise bir insanın DNA’sının her hücrede birebir aynı olmasıdır. Örneğin, bir insanın kan hücrelerinden alınan DNA örneği, saç, kemik ya da sperm hücresindeki DNA ile aynıdır (Shuller ve ark., 2001; Mozayani ve Noziglia, 2006). PCR tekniğinin eser miktarda bulunan biyolojik materyalden dahi DNA’nın istenen bölgesinin milyonlarca kopyasının yapılmasına imkan vermesi, DNA’nın adli amaçlı kullanımını artırmıştır (Bartlett ve Stirling, 2002; Kobilinsky ve ark., 2005). 2 İnsan genomunda bulunan yaklaşık 3 milyar baz çifti, her biri farklı lokuslarda yer alan 23,000–25,000 geni kodlamaktadır. Protein kodlayan kısım, tüm genomun yaklaşık %3’ünü oluşturmaktadır. Geri kalan kısım protein kodlamaz ve büyük çoğunluğu da tekrar bölgelerinden meydana gelmektedir (James ve Nordby, 2003). Genlerin çoğu “alel” olarak adlandırılan birkaç farklı formda bulunabilmektedir. Bir toplumun genetik yapısındaki varyasyonların (değişimlerin) varlığı “genetik polimorfizm” olarak adlandırılır. Bir lokusun polimorfik olarak adlandırılması için toplum içinde o lokusla ilgili iki veya daha fazla alelin bulunması, polimorfizmin ortaya çıkabilmesi için ise, genomun belirli bir bölgesindeki baz çiftlerinin diziliminde varyasyonlar oluşmalıdır. Diğer taraftan, söz konusu bu değişikliklerin o popülasyon için kalıcı olması ve görülme sıklığının %1'den fazla olması gerekmektedir (Dib, 1996). Polimorfizm gösteren bir gen için her birey, biri anneden diğeri babadan aktarılan iki farklı alel taşıyabilirken, bir popülasyon aynı gen için çok sayıda alele sahip olabilmektedir. Bu genetik polimorfizmler, adli amaçlı DNA analizlerinin temelini oluşturmaktadır. Yapısal olmayan DNA bölgelerinde (intron), özellikle farklı uzunluklarda nükleotid dizilerinin değişik sayıda, art arda tekrarlanmasıyla oluşan bölgeler polimorfizm açısından büyük önem taşımaktadır. Çünkü yapısal gen bölgesinde (ekzon) olabilecek değişiklikler gen ürününün işlevsel bozukluğuna neden olursa, bu değişiklikleri taşıyan bireylerin toplumdan ayırt edilmesiyle sonuçlanabilmektedir. Dolayısıyla, ekzonda gözlenen polimorfizm genellikle popülasyonda bir süreç içinde meydana gelen değişiklikleri tam olarak yansıtmayacağından filogenetik çalışmalarda açıkça ifade edilememektedir. Buna karşılık, introndaki polimorfik değişiklikler çoğunlukla ayırt edilmeye neden olmayacağından o popülasyon için nötral etkilidir ve korunarak varlıklarını sürdürebilmektedirler. Bu nedenle introndaki polimorfizm popülasyonlardaki bireylere yansıyacağından takip edilmesi ve değerlendirilmesi daha kolay ve bilgilendirici olacaktır. En sık görülen polimorfizm çeşidi tek nükleotid polimorfizmidir (Single Nucleotid Polymorphism-SNP) (Şekil 1.1.). SNP’leri içeren genler, toplumda % 1’den daha fazla sıklıkta bulunan alel genler olarak tanımlanır. İnsan genom projesi 3 (Human Genome Project-HGP) çalışmaları sonucunda her insan genomunda DNA’nın %99,9 benzerlik gösterdiği kanıtlanmıştır. Geriye kalan %0,1’lik fark, bireysel genotipik ve fenotipik değişikliklerinden sorumludur. Ortalama her 1000 nükleotidde 1 bulunan SNP’ler insan genomunda en çok gözlenen DNA dizi değişimleridir (Şekil 1.2.). Şekil 1.1. Tek Nükleotid Polimorfizmi (http://en.wikipedia.org/wiki/Single-nucleotide_ polymorphism) 4 Şimdiye kadar 1,8 milyondan fazla SNP tanımlandığı ve haritalandığı tahmin edilmektedir. SNP verileri, Tanı ve risk profillemesi, Aday gen tayini ve haritalama, Polimorfizm testleri ve epidemiyolojik çalışmalar, Farmakogenetik ve fizyolojik genomik, Çevresel uyaranlar ve Adli genetik alanlarında uygulanmaktadır. SNP’ler, genlerde bulunabildikleri gibi genler arası kodlanmayan bölgelerde ve genin kodlanmayan (intron) kısımlarında da meydana gelebilir. Genellikle hastalıklarla ilişkilendirilenleri, gende kodlama yapan (ekzon) bölgelerdedir. SNP’ler, hatalı protein üretimi ile üretilen proteinlerin miktarını değiştirerek genlerin fonksiyonlarını bozabilmektedir (Sherry ve ark., 2000). SNP’ler, tüm insanlar arasındaki genetik varyasyonların % 99,9’unu oluştururlar Şekil 1.2. SNP’lerin görülme sıklığı SNP analizleri için PCR, RFLP gibi teknikler kullanılmaktadır. 5 1.1 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction: PCR) Tüm dünyada genetik yapının çözülmesi, genlerin yerlerinin belirlenip görevlerinin anlaşılması amacıyla birçok çalışma yürütülmektedir. Bu hedefe ulaşmayı kolaylaştırıcı ve zamandan tasarruf sağlayıcı yöntemlerin geliştirilmesi artık zorunlu hale gelmiştir. Geliştirilen bu yöntemlerden en önemlilerinden biri polimeraz zincir reaksiyonu’dur. Polimeraz zincir reaksiyonu, 1985 yılında Kary Mullis tarafından keşfedilmiş ve araştırmacı bu buluşu ile 1993 yılında kimya dalında Nobel Ödülünü kazanmıştır. PCR’nin bulunması moleküler genetik alanında bir devrim olmuştur. PCR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’daki özgül bölgelerin çoğaltılmasını (amplifikasyonunu) sağlayan bir in vitro DNA sentezi yöntemidir. Bu tekniğin geliştirilmesinden sonra birçok organizmada DNA varyasyonu tespit etmek amacıyla yapılan çalışmalarda büyük bir artış olmuştur. Bu yöntemle, bir organizmanın DNA’sında bilinen herhangi bir bölgenin çok hızlı ve başarılı bir şekilde klonlanması sağlanır (Kubista ve ark., 2006). PCR; DNA dizi analizi ve haritalanmasında Genetik hastalıkların teşhisinde ve tanısında Adli tıpta DNA parmak izi analizinde İnsan Genom Projesi araştırmalarında DNA-Protein etkileşimlerinin araştırılmasında Onkogenlerin araştırılmasında Bilinmeyen dizilerin tayininde 6 Toksikogenetik ve farmakogenetik çalışmalarında Evrim araştırmalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Wright ve Wynford-Thomas, 1990; Butler, 2005). 1.1.1 PCR’nin Aşamaları PCR tekniği temelde 3 aşamadan oluşmaktadır. 1- DNA Zincirinin Açılması (Denatürasyon): Amplifiye edilecek DNA (kalıp DNA) 92-95°C gibi yüksek sıcaklık uygulanarak çift sarmal yapısındaki iplikçikleri denatüre edilerek tek sarmal haline getirilir. Amplifiye edilmesi istenilen genomik DNA, biyolojik örneklerden (kuru kan, semen, saç, mumyalanmış kalıntılar ve fosiller vb.) elde edilebilir. İlk denatürasyon basamağı 5-15 dakika gibi daha uzun olmak koşuluyla ve diğer her siklusta 1-2 dakika tutularak tek zincirli DNA oluşması sağlanır. 2- Primerlerin Hedef Bölgelerle Birleşmesi (Annealing): Oligonükleotid primerlerinin (17-30 bazlık) tek zincir haline gelmiş olan DNA zincirinde kendi baz dizilerine karşılık gelen (komplementer) bölgeyle eşlenmesi işlemidir. Bu işlemin gerçekleşebilmesi için denatürasyon sıcaklığının düşürülmesi gerekmektedir. 4070°C’ye düşürülen sıcaklığın belirlenmesinde primerlerin Tm (erime noktası) değerleri etkin rol oynar. Guanin ve Sitozin sayısı arttıkça Tm değeri de arttığı için primerlerin nükleotid içeriği önemlidir. 3- Zincir Uzaması (Primer Extesion-Elongation): Kalıp DNA zincirlerine annealing basamağında bağlanan primerler, ortamdaki polimeraz enzimi ile deoksiribonükleotid trifosfatların (dNTP) varlığında uzatılır. Günümüzde “Thermus aquaticus” termofilik bakterisinden izole edilen ve ısıya dayanıklı Taq polimeraz enzimi kullanılmaktadır. Bu enzimin seçilmesinin nedeni ise 94°C’de inkübe edildikten sonra bile aktivitesini kaybetmemesidir. En yüksek aktivite gösterdiği sıcaklık 72°C olan Taq polimeraz enzimi, primerin serbest 3’-hidroksil ucuna 7 nükleotidleri bağlayarak kalıp DNA boyunca uzama işlemini gerçekleştirmektedir. Bu işlem her zaman DNA’nın 5′ ucundan 3′ ucuna doğru olup, sonuçta kalıp DNA’ya komplementer bir çok kopya elde edilmiş olur. Bu üç basamağın gerçekleşmesi sonucunda her bir döngüde kalıp DNA iki katına çıkmaktadır. 30-40 defa tekrarlanan basamaklarla kalıp DNA teorik olarak 230-240 kez amplifiye edilmiş olur. Bu çoğaltma işlemi, üzerinde çalışılan bölgenin analizinde kolaylık sağlamaktadır (Şekil 1.3) 8 HEDEF DNA 1. PCR bileşenleri 2. Denatürasyon Aşaması 3. Primerin Bağlanması (Annealing) Aşaması 4. Zincirin Uzaması (Primer ExtentionElongation) Aşaması 5. 2n şeklinde çoğaltılmış DNA Şekil 1.3 PCR’nin aşamaları 9 Örnek bir PCR programı Şekil 1.4’te gösterildiği gibidir. Şekil 1.4 PCR programı 1.1.2 PCR'da Kullanılan Bileşenler PCR reaksiyonunda temel olarak bulunması gereken bileşenler; kalıp DNA, düz (Forward-F) ve ters (Reverse-R) primerler, dNTP’ler (A, T, C, G), Taq DNA Polimeraz enzimi, buffer ve magnezyum klorür (MgCl2)’dür (Wilson, 1997). 1) Kalıp DNA PCR yöntemi degrade olmuş DNA ile bile çalışma olanağı sağlarken, nükleer, mitokondriyal, bakteriyal ve plazmid DNA’sı kalıp DNA olarak kullanılabilir. Herhangi bir biyolojik materyalden (kan, kıl, tükürük, tırnak, ter, semen, doku vb.) 10 DNA elde edilebilir. DNA, izolasyon yöntemleri kullanılarak saf halde elde edilmeye çalışılır. Kalıp olarak kullanılacak DNA’nın spektrofotometrede absorbans değerine bakılarak saflığı belirlenebilmektedir. Genomik DNA oda ısısında stabil olsa da daha güvenilir bir şekilde +4°C’de kısa veya orta süreli, -20°C’de ise uzun süreli olarak saklanabilmektedir. 2) F ve R Primerler DNA üzerindeki çoğaltılacak her bir bölge için bir çift (Forward-F ve Reverse-R) primer kullanılmalıdır. PCR’ın en önemli unsurlarundan biri olan primerlerin seçimi oldukça önemlidir. Primerler, sadece tek bir bölgeye komplementer olarak dizayn edilmeli ve DNA üzerinde başka bölgelere bağlanmamasına dikkat edilmelidir. 1730 nükleotid uzunluğunda olmalıdır. Daha kısa veya uzun olması özgüllüğünü kısıtlamaktadır. F ve R primerlerin Tm değerleri birbirine yakın olmalıdır ki bu da GC içeriğine bağlı olarak değişmektedir. Art arda kendi içinde tekrar dizileri olmamalı ve hatta kendi içinde komplementer nükleotidler içermemelidir. Çünkü DNA’ya bağlanması beklenen primerler kendi üzerine katlanır ve saç tokası şekli oluşturabilir (Pusterla ve ark., 2006). 3) dNTP'ler (A, T, C, G) Eşit konsantrasyondaki dATP, dGTP, dCTP ve dTTP karışımıdır. 4) Taq DNA Polimeraz Enzimi Thermus aquaticus adlı termofil bir bakteriden elde edilen ısıya dayanıklı bir enzimdir (Şekil 1.5). Bu DNA polimerazın, PCR reaksiyonlarında hata oranı 1x10­4’tür. Bu enzimin en aktif olduğu sıcaklık 72°C’dir ve saniyede yaklaşık 100 dNTP’yi tanıyarak diziye bağlama yeteneğindedir. Enzimler, protein yapıda oldukları için denatüre olma riskleri oldukça fazladır. Bu nedenle düşük ısıda saklanmaları tercih edilmektedir. Ancak çok düşük sıcaklıkta da donacakları için 11 yine denatüre olma riskleri vardır. Bunu engellemek amacıyla enzim stokları gliserol içinde gelir ve -20°C’de saklanır. Denatürasyon aşaması uzun olan PCR’larda Hot Star Taq DNA Polimeraz enzimleri tercih edilmelidir. Şekil 1.5 Taq DNA polimeraz enziminin yapısı Diğer Bileşenler 5) MgCl2: Taq DNA polimeraz enziminin çalışması için kofaktör olarak görev yapan +2 Mg iyonunun sağlayıcısıdır. 10XBuffer: Taq DNA polimeraz enziminin çalışması için gerekli olan uygun pH şartları sağlar. Standart bir PCR'da bulunması gereken bileşenlerin miktarı Çizelge 1.1.'de belirtilmiştir. 12 Çizelge 1.1. Standart bir PCR’da bulunması gereken bileşenler ve miktarları Bileşen 50 μl’lik Reaksiyon Tüpündeki Konsantrasyon 10X PCR Buffer 1X MgCl2 (25 mM stok çözelti) 1-5 mM dNTP mix Her birinden 0,2 mM Primer 1 0,2-0,5 μM Primer 2 0,2-0,5 μM Taq DNA Polimeraz 1,25-2,5 Unit Genomik DNA 200 ng 1.1.3 PCR Optimizasyonu PCR tekniğinde gün geçtikçe yeni uygulamalar ortaya çıkmaktadır. Bu uygulamaların optimum bir şekilde çalışması için her laboratuvarda yeniden ayarlamaların yapılması gerekmektedir. PCR oldukça hassas bir tekniktir. Farklı PCR cihazlarının kullanımı bile PCR’nin sonucunu etkilemektedir. Optimizasyon işlemi iyi bir şekilde yapılmayan PCR’de bazı problemlerle karşılaşılabilinir (Roux, 2009). Bu problemler; Kontaminasyon PCR alanı, laboratuvardaki diğer alanlardan iyi bir şekilde ayrılmalıdır. PCR’nin kurulumu laminar akışlı kabin içinde gerçekleştirilmelidir. Örnekler arası kontaminasyonu kontrol etmek amacıyla bütün reaksiyon setlerinde negatif kontrol bulunmalıdır. Filtreli uçlar kullanılmalıdır. Kullanılan reaktifler küçük hacimlere bölünerek saklanmalıdır. 13 Enzim konsantrasyonu Taq DNA polimeraz enziminin konsantrasyonu kullanılan kalıp DNA’ya veya primere göre değişebileceği için iyi ayarlanması gerekmektedir. Aksi takdirde, enzim konsantrasyonu düşük olursa elde edilecek ürün miktarı beklenenden az, yüksek olursa özgül olmayan bantlar oluşabilir. dNTP’ler A, G, C ve T bazlarının konsantrasyon içerisindeki miktarları eşit olmalıdır. Konsantrasyonu fazla olduğunda istenilenden farklı dizilerin hatalı bir şekilde ortaya çıkmasına neden olur. Magnezyum Konsantrasyonu Magnezyum konsantrasyonu; primerlerin kalıp DNA’ya bağlanması, denatürasyon sıcaklığı, primer-dimer oluşumları ve enzim aktivitesi gibi PCR’nin temel unsurları üzerine etkilidir. Miktarı fazla olduğunda enzim aktivitesi oldukça artmakta ancak hata yapma oranı da artmaktadır. Az miktarda olduğu zaman enzimin aktivitesi çok yavaşlar ve bağlama işlevini gerçekleştiremez. Primerler Primerlerin konsantrasyonunun yüksek olması yanlış bağlanmasına ve özgül olmayan bantların görülmesine neden olur. Hatta primer-dimer oluşumunu arttırarak elde edilmesi beklenen ürünün daha az olmasına neden olur. Primerlerin uzunluğunun 18-24 baz çifti (bç, base pair-bp) olması idealdir. Daha kısa olduğu zaman özgüllüğünü kaybederek istenmeyen bölgelere de bağlanabilir ve beklenenden farklı bantlar gözlenebilir. Fazla uzun olduğunda ise kendi üzerine katlanmalar (saç tokası-hairpin) gerçekleşebilmektedir. Primerlerin baz dizilişinde GC miktarı ile Tm arasındaki ilişki iyi ayarlanmalıdır. 14 Kalıp DNA Kalıp DNA’da izolasyon işlemine bağlı olarak bazı sorunlar ortaya çıkabilir. DNA fazla degrade olabilir veya izolasyon sırasında kullanılan inhibitörleri (tuz, fenol vb.) içeriyor olabilir. Agaroz jelde kalıp DNA’yı yürüttüğümüzde bu sorunların varlığını kontrol etmiş oluruz. DNA’nın çalışıp çalışmadığını belirlemek amacıyla, bütün reaksiyon setlerinde pozitif kontrol bulundurulmalıdır. Gradient PCR cihazları optimizasyon sürecini kolaylaştırır ve kısaltır. 1.2 Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP) Yöntemi DNA molekülünün belirli fragmanlarını tanıyarak spesifik bölgelerden kesen bakteriyel kökenli restriksiyon enzimlerinin (RE) keşfedilmesi moleküler genetik alanına önemli katkıların yapılmasına olanak sağlamıştır. Restriksiyon enzimi, ilk defa 1970 yılında Hamilton Smith ve Kent Wilcox tarafından izole edilmiş (Roberts ve Macelis, 1991) ve günümüzde özellikle polimorfizm çalışmaları başta olmak üzere, rekombinant DNA teknolojisinde, gen dizilimlerinin belirlenmesinde ve protein üretilmesinde kullanılmaya başlanmıştır. Bakteriler, bakteriyofajlara (bakterileri enfekte ederek çoğalan virüsler) karşı savunma mekanizması olarak çeşitli restriksiyon enzimleri oluştururlar ve yaklaşık sayıları 3000’dir. Restriksiyon enzimleri DNA molekülünü 4-8 baz çiftlik DNA dizilerinden tanıyarak kesim yapmaktadır. RFLP yöntemi, kantitatif özelliklerin haritalanmasına yeni bir yaklaşım getirmiştir. Son yıllarda PCR tekniği ile çoğaltılan ürünlerle çalışma imkanı sağlamıştır. PCR-RFLP yönteminde, polimorfizmin araştırılacağı gen bölgesinin belirli bir kısmı, polimorfizmi içeren bölgeyi de kapsayacak şekilde PCR tekniği ile çoğaltılır. Elde edilen belirli uzunluktaki DNA parçası, araştırılacak polimorfizme özgü olan restriksiyon enzimi ile muamele edilerek kesilir. Kesilen ürünler, DNA 15 parçasının büyüklüğüne göre belirli konsantrasyondaki agaroz jel elektroforezine tabi tutulur. Jel etidiyum bromür ile boyandıktan sonra ultraviolet ışıkta görüntülenerek, polimorfizmin varlığı veya yokluğu tespit edilir. Türleri oluşturan bireyler arasında var olan genetik farklılığın boyutları, seneler öncesine kadar değerlendirilememekteydi. En belirgin fark yaratan dış özelliklerin genetik olarak aktarımı basit bir şekilde algılanıp genetik alanıyla ilgilenmeyen kişiler tarafından bile yorumlandığı sanılmıştır (Robins, 1991). Ancak günümüzde saç, deri ve göz rengi gibi multifaktöriyel aktarımlı olan bazı insan özelliklerinin kompleks olduğu ve incelenmesinin oldukça güç olduğu anlaşılmıştır. Bu özelliklerin adli olayları aydınlatma amacıyla kullanımları gün geçtikçe artmaktadır. Dış görünüşle ilgili karakterlerin (göz, saç, deri vb.) DNA analizleri ile belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalar günümüzde adli bilimlerin önemli ilgi alanlarından biri haline gelmiştir. Bu konuda elde edilecek veriler, olay yerinde bulunan ve şüpheliye ait olabilecek biyolojik örnek DNA’larından elde edilecek verilerle suçlunun fiziksel profilinin belirlenmesine katkı sağlayacaktır. Bunun yanı sıra sözü edilen verilerin toplu ölümlerin olduğu kazalarda da kimlik bilgilerine ulaşmak açısından yararlı olacağı düşünülmektedir. Günümüzde, toplumlara ait gen polimorfizm profillerini belirlemek için yapılan çalışmaların sayısı hızla artmaktadır. Bu konuda en fazla çalışması yapılan ve öngörülen pigmentasyonla ilgili olan fiziki özelliklerdir (Frost, 2006; Rees, 2006; Branicki ve ark., 2007; Tully, 2007; Han ve ark., 2008; van Daal, 2008; Sturm, 2009). En fazla umut veren fiziki özellik ise sıklıkla araştırılan göz rengi ile ilgili olan özelliklerdir (Norton ve ark., 2007; Stokowski ve ark., 2007; Branicki ve ark., 2008; Kayser ve Schneider, 2009; Valenzuela ve ark., 2010). 1.3 İnsan Pigmentasyonunun Biyolojisi Melanin organizmaların çoğunda bulunan bir pigment, melanositler ise melanin üretiminden sorumlu hücrelerdir. Anatomik olarak melanositler deride (epidermisin bazal tabakasında), gözde (retina pigment epiteli ve gözbebeğinin renkli iç zar 16 alanında), saç matriksinde (damarsal alanda), mukoza membranında ve santral sinir sisteminde (beyindeki dokularda ve nöronların içinde) bulunurlar (Jimbow ve ark., 1999). Melanositler; ışık mikroskobu altında saydam olarak görünüp, yüksek farklılaşma özelliğine sahip hücrelerdir. İyi gelişmiş endoplazmik retikulum, mitokondri ve protein sentezi sağlayan golgi aygıtı içerirler. Melanositlerin melanin üretiminde görev aldığı bilinmektedir. Melanositler bulundukları hücreyi güneşin zararlı radyasyon etkisinden korumaktadırlar. Bu korumanın etkinliğini arttırmak için, özellikle vücudun dış yüzeyini kaplayan epitel hücreleri, melanin bakımından oldukça zengindir. 1.4 Melaninin Fonksiyonları Melaninin oynadığı biyolojik rol için birçok teori geliştirilmiştir (Hill, 1992). Ancak işlevi henüz tam olarak açıklanamamıştır. Birçok canlıda çeşitli görevleri bulunmasına rağmen melanin, insanda özellikle göz, saç ve kulakta renk pigmenti olarak rol oynar. Derideki rolü ise, ultraviyole radyasyonuna (UVR) karşı fotokoruma ile sınırlıdır. Melaninin bu fonksiyonları albino bireylerde gözlenmemektedir. Melanin, 300 nm üstündeki (atmosfer yoluyla geçemeyen kısa dalga boyları) elektromanyetik radyasyonun zararlı etkilerine karşı son derece etkili bir güneş korucuyusudur. Melanin tarafından UVR absorpsiyonu ve dolayısıyla koruma, nükleik asit ve proteinlerin hasarının en fazla olduğu kısa dalga boylarında artarken, görülebilir dalga boyunda (400 nm’den büyük) ise azalmaktadır. Morötesi ışınım ya da ultraviyolenin dalga boyu 10-400 nm arasındadır. İnsan gözü 400-700 nm dalgaboyuna duyarlıdır ve bunun dışındaki ışımaları algılamaz. 17 1.4.1 Melanin Tipleri Ömelanin ve feomelanin olmak üzere iki tip melanin bulunmaktadır (Şekil 1.6). Her iki melanin türü de insan saç ve derisinde bulunabilirken, ömelanin bireylerde en çok görülen tipidir ve eksikliğinde albinizm görülmektedir (Rees, 2003). Şekil 1.6 Melanin tiplerinin kimyasal yapıları 1.4.1.1 Ömelanin Ömelanin saç, deri ve areolada bulunmaktadır. Saçın siyah, gri, kahverengi ve sarı renklerde bulunmasını sağlamaktadır. Ömelaninin özellikle koyu tenli bireylerde daha fazla bulunduğu bilinmektedir. Ömelaninin iki farklı tipi vardır. Bunlar; siyah ömelanin ve kahverengi ömelanindir. Diğer pigmentlerin yokluğunda, siyah ömelaninin küçük bir miktarı gri saç rengine, kahverengi ömelaninin küçük bir miktarı ise sarı saç rengine dönüşür. 18 1.4.1.2 Feomelanin Feomelanin de saç ve deride bulunmaktadır. Hem açık tenli hem de koyu tenli bireylerde bulunduğu bilinmektedir. Kızıl saçlı bireyler özellikle büyük miktarlarda feomelanine sahiptir. Güneşin ultraviyole ışınlarına maruz kaldığında, feomelanin karsinojenik olabilir. Melanin tipleri olan ömelanin ve feomelanin dışında bir de nöromelanin bulunmaktadır. 1.4.1.3 Nöromelanin Nöromelanin, beyin çekirdeğinde pigment taşıyan nöronlarda koyu pigment olarak bulunur. İnsanlarda bu çekirdekler doğum sırasında pigmente olmayıp, yetişkin döneme geçişle birlikte pigmentasyon gelişmektedir. Nöromelanin çoğu insanın yaşamı boyunca yüksek seviyelerde bulunurken, çeşitli nörodejeneratif hastalıkların varlığında pigmentli nöronların kaybı görülmektedir. 1.4.2 Ömelanin ve Feomelanin Oluşum Mekanizmaları (Biyosentezleri) İnsan deri rengi, melanosit sayısına göre değil, feomelanin ve ömelaninin kimyasal bileşimi, büyüklüğü, şekli ve dağılımına göre belirlenir. İnsan pigmentasyonundaki farklılıkların, genetik olarak kontrol edilen ve melanin üreten, ömelanin içeriğindeki değişikler sonucu olduğu anlaşılmıştır (Akey ve ark., 2001; Rees, 2003). Melanin oluşumu (melanogenezis), birçok proteinin etkileşimi sonucudur. Melaninin en önemli yapı taşı, tirozin amino asitidir. Hayvanlardaki melanin pigmenti tirozin amino asitlerinin türevleridir. Bu amino asidin, tirozinaz enzimi (tirozinaz; organizmada pigment oluşumundan sorumlu enzim) kontrolünde “Dopa” (dihidroksifenilalanin-dihydroxyphenylalanine) molekülü ile birleşmesiyle melanin 19 sentezinde gerekli olan “Dopakinon” adı verilen monomerler (yapıtaşları) sentezlenir. Bu monomerler de 5,6-Indolkinon’a dönüştürülür. Ömelanin ise buradan polimerizasyon ile elde edilir. Ömelanin biyesentezi için tirozin ve tirozin benzeri protein ile kimyasal dopakinon ile gerçekleşmektedir (Wakamatsu ve Ito, 2002). Bu proteinler de melaninin hücredeki sayı ve özelliğini belirlemektedir (Frudakis ve ark., 2003; Branicki ve ark., 2009). Feomelanin biyosentezi de ömelanin sentezine benzer ancak sistein amino asidi varlığındaki yolakta gerçekleşmektedir. Tirozin amino asidi biyosentetik yoldan ilk olarak tirozinaz enzimi yardımı ile L-DOPA’ya ve hemen ardından dopakinona yükseltgenmesiyle sistein ile beraber sisteinildopa’ya dönüştürülür. Daha sonra yükseltgenme ve polimerizasyon ile feomelanin sentezlenir (Şekil 1.7). Melanin oluşumundan belirtilen proteinler sorumlu olmakla birlikte melaninin olgunlaşmasından da sorumlu birçok protein bulunmaktadır. Diğer birçok kimyasal molekülde olduğu gibi melanin sentezinde de birden fazla gen bölgesi görev almaktadır. Melanin eksikliği nedeniyle görülen albinizm sendromunun farklı tiplerinin oluşu da, melanin sentezinde birden fazla basamak olduğunun bir göstergesidir. 20 Şekil 1.7 Ömelanin ve feomelanin biyosentezi Melanin içeren stromal melanositlerin iris renginin belirlenmesinde temel faktör olduğuna inanılmaktadır. Ancak bu kanıya varılana kadar iris renginin sorumlusunun önceleri, melanosit sayısı, melanositlerin hücredeki dağılımı veya melanositlerin melanin içeriği (ömelanin veya feomelanin) olduğu tartışılmıştır. 21 Fuchs (1913), gözün anterior tabakasındaki koyu pigmentli melanositlerin sayısının iris renginin belirmesini sağladığına inanmaktaydı. Daha sonraki yıllarda, Dietrich (1972), ışık ve elektron mikroskobuyla yaptığı çalışmada aynı sonuca varmıştır. Wolfrum (1922) ve Eagle (1988)’ın çalışmalarında olduğu gibi bu bulguların aksine yapılan çalışmalar olsa da göz rengi, gözün iridial stromasının anterior tabakasındaki melanin üretimi ile belirlenmektedir (Sturm ve Frudakis, 2004). Stroma içindeki melanositler ve gözün anterior tabakaları melanini sitoplazmalarında tutar. Vücudun diğer hücrelerinde ise melanin hücrelerden salınır. Bu durum bebeklerin göz renklerinde değişiklik olurken deri renklerinin sabit kalmasını açıklamaktadır. Avrupa kökenli çoğu bebeğin bir yaşına kadar gözleri açık renklidir. Çocuğun gelişimi sırasında, melanositler yavaş bir şekilde melanin üretmeye başlar. Yaklaşık bir yaşında olan bebeklerin üç yaşına kadar göz renginde değişiklikler meydana gelir. Öte yandan puberte, erken çocukluk, hamilelik ve bazen ciddi travma sonrası (heterokromi gibi), gerçekleşen durumlarda vücuttaki hormonal değişiklikler ve kimyasal reaksiyonlar sonucu göz rengi değişebilmektedir. Göz renkleri kahverengi, yeşil, mavi, gri, ela ve menekşe olarak sınıflandırılabilir. Geleneksel görüş kahverenginin mavi ve yeşile göre dominant olduğu, yeşilin ise maviye göre öncelikli olduğu şeklindedir (White ve RabagoSmith, 2011). Göz rengi ne olursa olsun melanositlerin sayısı değişmez ancak sitoplazmadaki melanin sayısı ve özelliği göz rengini belirleyecektir. Işık gözden geçtiğinde, melanin miktarı fazla ise, görülen ışığın çoğu absorblandığı için göz kahverengi görülecektir. Bu durum pupillerin siyah görülmesini de açıklamaktadır. Tüm görünür ışık retina tarafından absorblanır. Hücrelerde daha az melanin olduğunda ise göz rengi daha açık görünecektir. Kırmızı ve menekşe renkli gözler ise pigment yokluğunun göstergesidir. Kırmızı göz, gözdeki damarların renginin yansıması sonucudur, güçlü mavi rengi oluşturacak şekilde çok az sayıda pigment varsa menekşe renk ortaya çıkar (Sturm ve Frudakis, 2004). 22 Göz renginin geçişi kalıtsaldır (Posthuma ve ark., 2006) ve melanin biyosentezini etkileyen faktörler arasında birçok gen bulunmaktadır (Bennett ve Lamoreux, 2003). 1.5 Genler ve Özellikleri Modern moleküler teknolojinin gelişmesiyle insanda göz, saç ve deri rengini belirleyen birçok önemli genin varlığı tanımlanmıştır. İnsan pigmentasyonu yüksek kalıtım ile poligenik kantitatif özelliktedir. Son zamanlara kadar sadece yedi genin; HERC2 (HECT ve RLD Domainine Bağlı E3 Ubiquitin Protein Ligaz 2 GeniHECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2), Okülokutanöz Albinizm Tip II Geni (Oculocutaneous albinism type II geneOCA2), Melanokortin 1 reseptör geni (Melanocortin 1 receptor gene-MC1R), Agouti sinyal protein geni (Agouti signalling protein gene-ASIP), Membran ilişkili taşıyıcı protein geni (Membrane associated transport protein gene-MATP veya Çözünen taşıyıcı ailesi 45 üyesi 2-Solute carrier family 45 member 2-SLC45A2), Çözünen Taşıyıcı Ailesi 24 Üyesi 5-Altın Gen (SLC24A5: golden mutations), Tirozinaz ve tirozinaz ilgili protein genleri (Tyrosinase and tyrosinase related protein 1 genes-TYRP1), normal sınırlarda insan pigmentasyonu ile ilişkili sık görülen genetik varyantları içerdiği bilinmesine rağmen bu genler dışında birkaç genin varyantlarının da 23 pigmentasyon fenotipleri keşfedilmiştir (Sturm, 2006). Proteinler, insan pigmentasyonunu belirleyen melanogenezde melanozomların olgunlaşması ve melanin üretiminin kontrolünü sağlayan bu genlerin kodlanmasına katkıda bulunmaktadır. Yeni teknolojilerin gelişmesi ile tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) yüz binlercesinin taranması daha kolaylaşmış olup, şimdilerde insan pigmentasyonuyla ilişkili sık görülen genetik varyantların araştırılması mümkün hale gelmiştir (Frazer ve ark., 2007). Genetik özellikleri henüz tam anlamıyla anlaşılamamış olsa da fenotip karakterlerini belirleyen bazıları majör bazıları minör etkili olmak üzere 100’den fazla genin olduğu düşünülmektedir. İnsanda bu genlerin birçoğunun ortologları teşhis edilmiştir. Ancak yalnızca yaklaşık bir düzine gen karakterize edilmiş olup, bunların bazıları hastalık durumuyla ilişkili olmakla birlikte popülasyon grupları içinde veya arasında görülen normal pigment varyasyonuyla ilişkilendirilememiştir (Sturm, 2006). Genler tarafından kodlanan proteinlerin fonksiyonları tam olarak anlaşılmamakla birlikte, insan göz renginin belirlenmesinde HERC2, OCA2 ve MATP/SLC45A2 genlerinin diğerlerine kıyasla daha etkin olduğu bilinmektedir. Birçok çalışma ile OCA2 geninin göz renginde major değişikliğe neden olduğu gösterilmekle birlikte (Eiberg ve Mohr, 1996; Rebbeck ve ark., 2002; Zhu ve ark., 2004; Duffy ve ark., 2007) başka çalışmalarda da HERC2 ve OCA2 göz renginden sorumlu genler olarak gösterilmektedir (Sturm ve ark., 2008; Kayser ve ark., 2008). 24 1.5.1 Membran İlişkili Taşıyıcı Protein Geni (Membrane Associated Transport Protein Gene-MATP) veya Çözünen Taşıyıcı Ailesi 45 Üyesi 2 (Solute carrier family 45 member 2-SLC45A2) Membran ilişkili taşıyıcı protein geni (MATP) olarak da bilinen bu genin resmi adı “çözünen taşıyıcı ailesi 45 üyesi 2” (SLC45A2)’dir. Melanosit denilen özel hücrelerde bulunan bir proteinin yapımında görev aldığı düşünülmektedir. Araştırmalar SLC45A2 geninde genel bazı polimorfizmlerin deri, saç ve göz rengindeki farklılıklar ile ilişkili olabileceğini göstermektedir (Tomita ve Suzuki, 2004; Gerstenblith ve ark., 2010). SLC45A2 geni SLC (çözünen taşıyıcılar) olarak bilinen bir gen ailesinin üyesidir. Bu gen ailesi birçok önemli özellikleri paylaşan bir gen grubudur. Ailedeki tek bir genin sınıflandırılması araştırmacıların genlerin birbirleriyle nasıl bağlantılı olduklarını açıklamalarına yardımcı olmaktadır. SLC45A2 geni 5. kromozomun kısa kolunun 13.2 pozisyonunda (5p13.2) bulunmaktadır (Şekil 1.8). SLC45A2 genindeki 20’den fazla mutasyon, okülokütanöz albinizm tip 4’ten sorumludur (OCA4). Japon popülasyonunda görülen en yaygın SLC45A2 geni mutasyonu, SLC45A2 proteinindeki tek bir amino asitin değişimiyle oluşmaktadır. Özellikle bu mutasyon 157 pozisyonundaki asparajin amino asidi yerine aspartik asidin gelmesiyle oluşmaktadır ve Asp157Asn veya D157N şeklinde ifade edilmektedir. SLC45A2 genindeki genetik materyalde insersiyon (ekleme) veya delesyon (silme-eksilme) ve tek amino asit değişikliğini içeren diğer mutasyonlar, dünya çapında birçok popülasyonda bildirilmiştir. Bu gendeki mutasyonlar melanin üretiminde SLC45A2 protein işlevini azaltmakta ya da ortadan kaldırmaktadır. Bu protein normal pigmentasyonda önemli olduğu için, onun kaybı okülokütanöz albinizm tip 4 (OCA4) ile karakteristik olan deri, saç ve göz rengi değişikliklerine ve görme problemlerine neden olmaktadır. Pigmentasyonda SLC45A2’nin rolü tamamen açık olmamasına rağmen, insanlarda albinizmin bir formuna neden olabilir (Newton ve ark., 2001). 25 Graf ve ark. (2005), hastalık durumuyla ilişkili olmayıp ancak popülasyonlar arasında ve pigmentasyonda normal varyasyonla ilişkili olan SLC45A2’deki iki SNP’yi bildirmişlerdir. 374Leu (374. kodondaki Lösin aminoasiti) sübstitüsyonunun (yerine geçme) görülme sıklığı Asyalılarda (%88,7), Afrika kökenli Amerikalılarda (%58,6) ve Avustralyalı Aborjinlerde (%72,5) beyaz ırka (Caucasians) (%6,6) göre daha yüksek olduğu aynı araştırmacılar tarafından belirtilmiştir. 374Leu mutasyonuna benzer bir model, Glu272Lys (272. kodonda Glutamik asidin Lizin aminoasitine dönüşümü) mutasyonu ile gözlemlenmiştir. Ancak, 272Lys sübstitüsyonu mutasyona sebep olmayabilir, pigmentasyon 374Leu’deki mutasyonla ilişkilidir. Bu mutasyonların işlevsel (fonksiyonel) önemi henüz açığa kavuşturulmamış ancak tirozinkinaz alışverişi MATP ile ilişkilendirilmiş ve Phe374’ün alışverişi değiştirebileceği ifade edilmiştir. Alternatif olarak, bu 374Leu ömelanin üretimi için optimal intramelanozomal pH ile sonuçlanan, proton transportu da içerebilir. MATP geninin iki bölgesinde yer alan rs16891982 ve rs26722 numaralı SNP’ler ile koyu göz renkleri arasında zayıf bir ilişki saptanmıştır (Graf ve ark., 2005). Aday gen yaklaşımları kullanılarak yapılan popülasyon çalışmalarında, bir SLC45A2 geni polimorfizmi koyu renk saç, koyu deri ve melanomdan korunma ile ilişkili bulunmuştur (Nakayama ve ark., 2002; Graf ve ark., 2005; Fernandez ve ark., 2008; Guedj ve ark., 2008). 26 Şekil 1.8 SLC45A2 geninin 5. kromozom üzerindeki lokalizasyonunun şematik gösterimi 1.5.2 Okülokutanöz Albinizm Tip II Geni (Oculocutaneous albinism type II gene-OCA2) OCA2 geni, trans-melanozomal membran proteini “P”’yi kodlar (bu yüzden bu genin önceki adı “P geni” olarak biliniyordu). Bu proteinde, melanin adı verilen pigment üreten melanosit özelleşmiş hücreler yer almaktadır. P proteinin tam olarak işlevi bilinmemesine rağmen, muhtemelen melanin üretimi ve normal pigmentasyon için esastır. Araştırmacılar, bu proteinin ayrıca melanozom göreceli olarak asidik pH düzenlemeye yardımcı olduğuna inanmaktadırlar. Tüm biyolojik proseslerde pH’nın iyi bir şekilde kontrol edilmesi gerekmektedir. OCA2 geni, 15. kromozom üzerinde lokalizedir (Şekil 1.9). Okülokutanöz albinizm tip 2’li bireylerde OCA2 geninde 80’den fazla mutasyon tespit edilmiştir. Albinizmin bu formu olan kişiler genellikle kremsi beyaz deriye, görme bozukluğu olan açık renkli göze, açık sarı, sarışın veya açık kahverengi saçlara sahiplerdir. Tek bir nükleotidde meydana gelen değişiklikler (nükleotid polimorfizmleri) ve küçük delesyonlar olmak üzere OCA2 geninde görülen mutasyonlar birçok 27 popülasyonda sık görülmektedir. OCA2 genindeki mutasyonlar görmeyi etkiler ve saç, deri ve göz pigmentasyonunu azaltarak melaninin normal üretimini bozabilmektedir. Albinizmin bir formundan sorumlu bu gendeki mutasyonlar olsa da, OCA2 normal pigmentasyon varyasyonu ile ilişkili bulunmuştur (Rinchik ve ark., 1993; Lee ve ark., 1995). Arg305Trp polimorfizmi popülasyon pigmentasyonu arasındaki farklar ile ilişkilidir. 305Arg alel %90 gibi bir sıklıkta, siyah derili kişilerde en yaygın iken, 305Trp aleli %83 gibi bir sıklıkta, Beyaz ırklar (Caucasians)’da en yaygın görülür. Ayrıca OCA2 geni polimorfizmlerinin melanoma ile ilişkili olduğu bazı çalışmalarda belirtilmiştir (Jannot ve ark., 2005; Duffy ve ark., 2010). OCA2 geninde R305W (305. kodondaki arjinin amino asidinin, triptofan amino asidine dönüşmesi) ve R419Q (419. kodondaki arjinin amino asidinin glutamin amino asidine dönüşmesi) mutasyonları Avrupalılarda yaygın olarak görülür, ancak bu genle göz rengi arasındaki ilişki tümüyle açıklanabilmiş değildir (Rebbeck ve ark., 2002; Duffy ve ark., 2004; Sturm ve ark., 2008). OCA2’nin kodlanmayan bölgesindeki çok lokuslu haplotipler ile göz renklerinin tonları arasında ilişki bulunmuştur (Duffy ve ark., 2004; Sturm ve ark., 2008). Şekil 1.9 OCA2 geninin 15. kromozom üzerindeki lokalizasyonunun şematik gösterimi 28 1.5.3 HERC2-HECT ve RLD Domainine Bağlı E3 Ubiquitin Protein Ligaz 2 Geni (HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2) Bu gen, çoklu yapısal domainler içeren oldukça büyük proteinlerin bir grubunu kodlayan HERC gen ailesi üyesidir. Bu gendeki genetik varyasyonlar deri, saç ve göz pigmentasyon varyasyonu ile ilişkilidir (Şekil 1.10). Şekil 1.10 HERC2 geninin 3 boyutlu yapısı (http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protein_HERC2_PDB_2KEO.png) HERC2 geni 15. kromozomun uzun kolunun 13. bölgesinde yer almaktadır (Şekil 1.11). HERC2 geni, OCA2’nin yaklaşık olarak 20 kb upstream’inde yer alır (Sulem ve ark., 2007; Eiberg ve ark., 2008; Kayser ve ark., 2008; Sturm ve ark., 2008). HERC2 geninin 5' terminalinde, birbirine yakın bölgelerde bulunan rs12913832 ve rs1129038 numaralı polimorfizmler ile mavi/kahverengi göz rengi arasında istatistiksel olarak oldukça anlamlı ilişki tespit edilmiştir (Eiberg ve ark., 2008; Sturm ve ark., 2008). 29 İnsan HERC2 geni, 4834 amino asit ve 93 ekzon bölgesinden oluşmaktadır. Yapılan geniş genom çalışmalarında saç ve göz pigmentasyonu varyasyonunun belirlenmesinde, birçok SNP’nin varlığı tanımlanmış ve bunlardan mavi göz rengi ile HERC2 genindeki polimorfizm ilişkili bulunmuştur (Sulem ve ark., 2007). Kayser ve ark. (2008), 15q13.1 bölgesindeki HERC2 geninin insan göz rengi ile ilişkili olduğunu tanımlamışlardır. Bu gen ile ilgili yapılan çalışmalar son yıllarda oldukça artmaktadır. Genin işlevi tam olarak tanımlanamamakla birlikte birçok SNP’ye sahiptir ve bu SNP’lerin işlevleri araştırılmaktadır. Şekil 1.11 HERC2 geninin 15. kromozom üzerindeki lokalizasyonunun şematik gösterimi Genetik, uzun yıllardır insanların merakını uyandıran bir bilim dalıdır. Bazı adli vakalarda genetik, olayların çözümünde yardımcı bilim dalı olarak kullanılırken, DNA kimliklendirme ve babalık tayini gibi diğer bazı adli olaylar için ise olayı çözebilecek tek bilim dalı olarak işlev görmektedir. Diğer taraftan fenotip özelliklerin adli vakaların aydınlatılması amacıyla kullanımı son zamanlarda oldukça önem kazanmıştır. Göz renginin bireylerde belirgin fiziksel özelliklerden biri olması, toplumumuzda adli vakaların çözümlenmesinde göz rengini belirleyen genlerdeki polimorfizmlerle ilgili veri tabanının oluşturulmasını gerekli kılmaktadır. 30 Bu tez kapsamında, toplumumuzdaki genotip-fenotip ilişkisini belirlemek amacıyla göz rengini belirleyen HERC2 gen polimorfizminin yaygınlığı araştırılmıştır. 31 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1 Gereçler 2.1.1 Kullanılan Kimyasal Maddeler Restriksiyon enzimi (Dra I) Primerler NEBuffer 4 PCR Buffer, 10X dNTP Mix Agaroz Etidyum bromür 6X loading çözeltisi Saf etanol DNA’s RNA’s free water Hot Star Taq DNA polimeraz Fenol-kloroform-izoamil alkol (25:24:1) Sodyum dodesil sülfat (SDS) Proteinaz K 100 bp ladder Sodyum klorür (NaCl) DTT Tris EDTA Neb (New England Biolab) Alpha DNA, Montreal New England Biolab Qiagen Fermentas Prona Applichem Fermentas Sigma-Aldrich Bome Qiagen Applichem Applichem Fermentas Fermentas Sigma-Aldrich Sigma Merck Sigma 2.1.2 Kullanılan Araç ve Gereçler Jel görüntüleme cihazı Laminar flow kabin Thermal Cycle PCR cihazı Soğutmalı santrifüj Mikro santrifüj Otoklav Su banyosu Syngene Esco Techne Tc 512 Hettich Hettich Nüve Nüve 32 Etüv Su pürifikasyon sistemi Vorteks karıştırıcı Dijital hassas terazi pH metre Yatay elektroforez cihazı Güç kaynağı Mikrodalga fırın Ependorf tüpler (1,5 ml ve 0,2 ml’lik) Otomatik mikro pipetler Pipet uçları (100 l, 1000 l, 5 ml, 10 ml) Manyetik karıştırıcı Steril eldiven Derin dondurucu Cam malzemeler Parafilm Nüve Human UP 900 Scholar-UV Biosan Mettler Toledo Mettler Toledo Scie-Plas Bio-Rad Arçelik Axygen Genuine Ependorf, Rainen Finntip Mirak TopGloves Regal 2.1.3 Deney Protokolü 2.1.3.1 Örneklerin Toplanması Çalışmada Ankara ilinden rastgele seçilen 156 sağlıklı bireyden alınan yanak içi svap örnekleri, kontaminasyonu önlemek amacıyla ayrı ayrı zarflara konularak paketlenmiştir. Zarfların üzerine etiketleme yöntemiyle ayırım sağlanarak numaralandırma yapılmış ve analiz süresine kadar oda koşullarında muhafaza edilmiştir. 2.2 Yöntem Bu tez çalışmasında, insan fenotipik özelliklerinden en belirginlerinden birisi olan göz rengini etkileyen HERC2 genindeki intron 86 rs12913832 SNP’si belirlenmiş ve toplumumuzdaki freakansı araştırılmıştır. 33 2.2.1 HERC2 Gen Polimorfizminin Genotipinin Belirlenmesi 2.2.1.1 Svap Örneklerinden DNA İzolasyonu Gönüllü bireylerden alınan svap örneklerinden nükleer DNA’yı açığa çıkarabilmek amacıyla fenol-kloroform-izoamil-alkol ekstraksiyon yöntemi kullanılmıştır. Bu amaçla; 1. Ependorf tüplerinin içine yanak içi epitel dokusundan alınan svap örnekleri konulmuştur. Pellet üzerine; 45 μl NaCl (1 M), 40 μl SDS (%10’luk), 410 μl TE 7 μl DTT ve 5 μl Proteinaz K eklenerek kısa süreli vortekslenmiştir. 2. 56oC’lik su banyosunda 1,5-2 saat inkübe edilmiştir. 3. İnkübasyon aşaması tamamlandıktan sonra Fenol-kloroform-izoamil alkol karışımından 500 μl ilave edilmiştir. 4. Hazırlanan bu karışımlar 2500 rpm’de 2 dakika santrifüj edilmiştir. 5. Pellet hareket ettirilmeden süpernatan kısmı yeni bir ependorf tüpe alınmış ve pellet fazı atılmıştır. 6. 1000 μl soğuk saf etil alkol ilave edilmiştir. 7. 10000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. 34 8. Alkol oluşan pelete zarar vermeden dikkatli bir şekilde uzaklaştırılmıştır. 9. Oda sıcaklığında %70’lik 500 μl etil alkol ilave edilmiştir. 10. 10000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiştir. 11. Ependorf tüpün içerisinde bulunan tüm alkol dikkatli bir şekilde uzaklaştırılmıştır. 12. Tüpün dibinde kalan alkol de tamamen uçurulduktan sonra 60 μl DNAseRNAse free su ilave edilmiştir. Tüm DNA örnekleri diğer analizlere alınıncaya kadar -20oC’de muhafaza edilmiştir. 2.2.1.1.1 DNA İzolasyonunda Dikkat Edilecek Hususlar 1. DNA çalışmaları için ayrı bir oda oluşturulmalıdır. 2. Tüm solüsyonlar gerektiği şekilde sterilize edilmelidir. 3. Pipet setleri ve otomatik mikro pipetler ayrılmalıdır. 4. Her izolasyon öncesi ve sonrasında kullanılacak çalışma ortamı ve otomatik pipetler alkol ile temizlenmelidir. 5. Proteinaz K -20oC’de muhafaza edilmelidir. 6. %10’luk SDS oda koşullarında muhafaza edilmelidir. 7. NaCl, TE ve Fenol-kloroform +4oC’de muhafaza edilmelidir. 8. Ependorf tüpleri santrifüj edilirken oryantasyonları belirlenerek yerleştirilmelidir. (Peletin görünmediği durumlarda izole edilen DNA’nın yerini tahmin edebilmek için önemli bir husustur). 35 2.2.1.1.2 Genomik DNA’nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesi ve %0,5’lik Agaroz Jel Hazırlanması Svap örneğinden genomik DNA’nın izole edilip edilmediğinin analizi %0,5’lik agaroz jel elektroforezi ile belirlenmiştir. 1. 0,6 g agaroz tartılmış ve 120 ml 1XTBE çözeltisi ile karıştırılmıştır. 2. Hazırlanan karışımın ağzı alüminyum folyo ile kapatılarak üzerine birkaç delik açılarak mikrodalga fırında kaynatılmıştır. 3. Çözelti oda sıcaklığında 50–60oC’ye kadar soğuması için bekletilmiştir. 4. Üzerine 8 μl EtBr (8 mg/ml) ilave edilmiş ve çözelti homojen bir yapı kazanana kadar çalkalanmıştır. 5. Bu karışım jel tarakları yerleştirilmiş jel kalıplarına hava kabarcığı kalmayacak şekilde dökülmüştür. Ayrıca jel üzerinde hava kabarcıkları oluşmuş ise, jel katılaşmaya başlamadan pipet ucu yardımı ile patlatılmıştır. 6. Jelin katılaşması için bir süre oda sıcaklığında bekletilmiştir. 7. Taraklar ve bariyerler dikkatlice çıkarılarak kalıp elektroforez tankına yerleştirilmiştir. Bu sırada jel kuyucuklarının, yürütme tankının katot elektrot tarafına yerleştirilmesine dikkat edilmiştir. 8. Jelin üzerini 2–3 mm kaplayacak miktarda tank içerisine 1XTBE çözeltisi eklenmiştir. 2.2.1.1.2.1 Agaroz Jele Yüklemek İçin Örnek Hazırlanması ve Yürütme Koşulları 1. 15 cm uzunluğunda parafilm kesilerek buz kalıbı üzerine yerleştirilmiştir. 36 2. 1 l 6XJel Loading Buffer ve 5 l DNA örneği parafilm üzerine konulmuş ve homojenizasyon için mikropipet yardımı ile yavaşça karıştırılmıştır. Şekil 2.1. Agaroz jel kuyucuklarına örneklerin yüklenmesi 3. Toplam 6 l karışım dikkatli bir şekilde, jeli delmeden, jel kuyucuklarına yerleştirilmiştir (Şekil 2.1.). 4. Tank kapağı kapatılmış, anot ve katot uçlarının bağlantıları takılmıştır. 5. Güç kaynağı 100 volt ve 70 ampere ayarlanarak, numuneler 45 dakika jel üzerinde yürütülmüştür. 6. UV ışığında, jel görüntüleme cihazında sonuçlar değerlendirilmiştir. 2.2.1.1.3 PCR PCR işlemi TECHNE TC 512 Thermal Cycle cihazı (Şekil 2.2.) ile gerçekleştirilmiş ve aşağıda belirtilen işlemler uygulanarak hedeflenen DNA bölgesinin her biri 235 defa çoğaltılmıştır. Her PCR analizinde kontrol amacıyla, pozitif ve negatif örnekler de kullanılmıştır. 37 Şekil 2.2. TECHNE TC 512 Thermal Cycle Cihazı PCR işleminde kontaminasyonu önlemek amacıyla; 1. PCR ve DNA izolasyonları farklı ortamlarda yapılmıştır. 2. Her analiz öncesi ve sonrasında kullanılacak çalışma ortamı ve otomatik pipetler alkol ile temizlenmiştir. 3. Steril tüpler ile filtreli pipet uçları kullanılmıştır. 4. Amplifikasyon ve enzim kesim işlemleri hava sirkülasyonlu laminar kabin içerisinde yapılmış olup, işlem öncesi ve sonrasında en az 45 dakika UV ışık kaynağı çalıştırılmıştır. 5. Analizler sırasında steril, pudrasız eldivenler kullanılmış ve sık sık eldivenler değiştirilmiştir. 2.2.1.1.3.1 Primerler Amplifikasyon için Forward (F-düz) ve Reverse (R-ters) primerleri kullanılmıştır. Primer çiftinden F primer DNA’nın bir ipliğine bağlanırken, R primer DNA’nın 38 diğer ipliğine bağlanır. Primerlerin bağlanmasıyla hedeflenen bölgenin çoğaltılması başlatılmış olur. Primerler HPSF (Yüksek Performanslı Tuzsuz-High Performance Salt Free) yöntemi ile Montreal’deki Alpha DNA firmasına sentezlettirilmiştir. Kullanılan primerler ve özellikleri Çizelge 2.1.’de (Iida ve ark., 2009) verilmiştir. Çizelge 2.1. Amplifikasyonda kullanılan primerler ve özellikleri. F Primer R Primer 5’-GAGGCCAGTTTCATTTGAGCTTTA-3’ 5’-CACCACTGGTAGTTTTCTTTGCC-3’ 24baz 23baz GC içeriği %41.67 %47.83 Erime Sıcaklığı (Tm) 63.6°C 62.1°C Uzunluk Tm farkı 1.5°C 2.2.1.1.3.2 PCR Bileşenleri ve PCR Programı Standart bir PCR’de; PCR Buffer, MgCl2, dNTP karışımı, Hot Star Taq DNA Polimeraz, F Primer, R Primer ve kalıp DNA bileşenleri bulunmaktadır. Çalışmada kullanılan 25 µl’lik PCR reaksiyonunun bileşenleri, bileşenlerin stok konsantrasyonları, reaksiyondaki miktarları ile reaksiyon karışımındaki final konsantrasyonlarına ait bilgiler Çizelge 2.2.’de verilmiştir. 39 Çizelge 2.2. PCR bileşenleri ile stoktaki ve reaksiyondaki konsantrasyonları BİLEŞEN Stok Konsantrasyon Reaksiyona Konulan Miktar 25 µl’lik Reaksiyon Karışımındaki Final Konsantrasyon 10 X PCR Buffer 10X 5 µl 1X dNTP karışımı 2 mM 5 200 µM F Primer 10 pmol/µl 1 µl 10 pmol R Primer 10 pmol/µl 1 µl 10 pmol Hot Star Taq DNA Polimeraz 5 U/µl 0,25 µl 1,25 U DNA - - ~200 ng Steril H2O - 25 µl’ye tamamlayıncaya kadar - Çalışmada uygulanan PCR programı Çizelge 2.3.’te belirtildiği şekilde gerçekleştirilmiştir. Çizelge 2.3. HERC2 gen polimorfizmi için PCR şartları Sıcaklık (oC) Süre (dakika) Başlangıç denatürasyonu 94 10 Denatürasyon 94 1 Bağlanma 60 1 Uzama 72 1 Son uzama 72 5 4 ∞ Şartlar Siklus sayısı 35 döngü PCR ürünleri, agaroz jel elektroforezinde yürütülünceye kadar -20oC’de muhafaza edilmiştir. 40 2.2.1.1.4 PCR Ürünü İçin Agaroz Jel Hazırlanması PCR ürünleri %1’lik agaroz jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. Bunun için 1,2 gr. agaroz tartılarak 120 ml 1XTBE içerisinde çözülmüştür ve bölüm 2.2.1.1.2’de yapıldığı şekilde işleme devam edilmiştir. 7 μl PCR ürünü ile 1l 6XJel Loading Buffer karıştırılarak jel kuyucuklarına yüklenmiştir. PCR ürünlerinin uzunluğunu belirlemek için 100 bp DNA ladder’ı kullanılmıştır. 1 l DNA ladder’ı, 1l 6XJel Loading Buffer ve 6 l distile su karıştırılarak yükleme yapılmıştır. Jel, 100 Volt ve 70 Amperde 1 saat yürütüldükten sonra sonuçlar UV ışığında, jel görüntüleme sistemi ile değerlendirilmiştir. 2.2.1.1.4.1 Dra I Restriksiyon Enziminin Özellikleri Bu çalışmada, Deinococcus radiophilus bakterisinden elde edilen Dra I restriksiyon enzimi kullanılmıştır. Şekil 2.3. Dra I restriksiyon enziminin tanıma bölgesi ile kesim noktasının şematik gösterimi Dra I enzimi 5’ ucundan TTT dizilimini tanıyarak, 3’ ucundan da AAA dizilimini tanıyarak kesim işlevini gerçekleştirir (Şekil 2.3.). 41 2.2.1.1.4.1.1 Dra I Enzim ile Kesim İşlemi Amplifikasyon ürünün kesimi için reaksiyon karışımı hazırlanmıştır. Reaksiyon bileşenleri, bileşenlerin stok ve final konsantrasyonları Çizelge 2.4.’te belirtildiği gibi yapılmıştır. Çizelge 2.4. Dra I enzimi ile kesim işlemindeki bileşenler ve reaksiyondaki hacimleri. Reaksiyon Karışımındaki Hacimler BİLEŞEN 2 µl NEB4 Buffer DraI Enzim 0,25 µl PCR Ürünü 15 µl dH2O 8 µl İnkübasyon; 37oC’de gece boyu yapılmış ve ürünler analizlerde kullanılıncaya kadar +4oC’de muhafaza edilmiştir. 2.2.1.1.4.1.2 Dra I KesimÜrünleri İçin Agaroz Jel Hazırlanması Kesim ürünleri %2,5’lik agaroz jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. Bunun için 3 gr agaroz tartılarak 120 ml 1XTBE içerisinde çözülmüştür ve bölüm 2.2.1.1.2’de yapıldığı şekilde işleme devam edilmiştir. 7 μl kesim ürünü ile 1l 6XJel Loading Buffer karıştırılarak jel kuyucuklarına yüklenmiştir. Genotiplendirme için marker olarak 100 bp DNA ladder’ı kullanılmıştır. 1 l DNA ladder’ı, 1l 6XJel Loading Buffer ve 6 l distile su karıştırılarak yükleme yapılmıştır. Jel, 100 volt ve 70 amperde 1 saat 45 dakika yürütüldükten sonra sonuçlar, UV ışığında jel görüntüleme sistemi ile değerlendirilmiştir. 42 2.2.1.1.5 İstatistiksel analizler Tüm istatistiksel analizlerde SPSS V16 kullanılmıştır. HERC2 A/G tek nükleotid polimorfizminin frekansları direkt olarak hesaplanmış ve Hardy-Weinberg eşitliğinde Haldane exact testi ile yapılmıştır. Katagorik veriler için χ2 testi, grupların karşılaştırılmasında One-Way Anova testi kullanılmıştır. Tanımlayıcı datalar ortalama ± S.S değeri kullanılarak verilmiştir. p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. 43 3. BULGULAR 3.1 Toplumumuz Bireylerinde HERC2 Genindeki A/G Tek Nükleotid Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan Analiz Sonuçları Bu tez çalışmasında; toplumumuzdaki gönüllü bireylerden alınan 156 ağız içi svap örneğinden elde edilen biyolojik materyal kullanılmıştır. Çalışmaya katılan 156 gönüllünün 78’i (%50) kadın ve 78’i (%50) erkek bireyden oluşmaktadır. Bireylerin yaş ortalaması 40,06±17,83 yıl (Minimum:18, Maksimum:91) olarak hesaplanmıştır. 3.1.1 Genomik DNA’nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesinin Sonuçları Çalışmada kullanılan 156 örneğin tamamı, izolasyon işleminden sonra agaroz jel elektroforezinde tayin edilmiştir. Her bir örneğin DNA’larının izole edildiği görülmüştür. 3.1.2 PCR ile HERC2 Genindeki Polimorfizmin Amplifikasyon Sonuçları HERC2 geni, 15. kromozomun uzun kolunun 13.1 bölgesinde (15q13.1) yer almaktadır. HERC2 geni, OCA2’nin yaklaşık olarak 20 kb upstream’inde lokalize olmuştur ve genin 5' terminaline yakın bölgede bulunan rs12913832 numaralı tek nükleotid polimorfizmi ile ilgili yapılan çalışmalarda mavi/kahverengi göz rengi arasında çok iyi bir ilişki tespit edilmiştir. AA genotipine sahip bireyler homozigot tipik, GG genotipine sahip bireyler homozigot atipik ve AG genotipine sahip bireyler heterozigot olarak karakterize edilmiştir. Kullanılan primerler ile amplifiye edilen bölgenin baz dizilimi Çizelge 3.1.’de gösterilmiştir. 44 Çizelge 3.1. PCR’da kullanılan primerler, kromozom üzerindeki lokalizasyonları ve amplifiye edilen bölgenin nükleotid dizilimleri. Primerler 15. Kromozomda Primerlerin Bağlandığı Nokta F Primer 5’-GAGGCCAGTTTCATTTGAGCTTTA-3’ R Primer 5’-CACCACTGGTAGTTTTCTTTGCC-3’ Amplifiye Edilen Bölge GAGGCCAGTTTCATTTGAGCTTTA aatgtcaagttctgcacgctatcatcacaggggccgagg cttctctttgtttttaattaattgtttttaactgtgagtttatataca cttgaagcagtatacatttagaaatggtctacttgtcgttcttt gattactacccatgagacagtattagtaattctggcctatga aatt GGCAAAGAAAACTACCAGTGGTG Koyu ve altı çizik olan “a” bazı 28365618. noktada bulunan ve A/G değişimini gösteren polimorfik nükleotiddir. Toplumumuz bireylerinde HERC2 genindeki A/G polimorfizmini göstermek amacıyla, bu değişimi de içeren 226 bp’lik bölge amplifiye edilmiştir ve sonuçlar jel görüntüleme sisteminde, UV ışık altında değerlendirilerek fotoğraflanmıştır (Şekil 3.1.). 226 bp M 1 2 3 Şekil 3.1. HERC2 genindeki amplifikasyonun jel görüntüsü (M:100 bp Ladder; 1, 2, 3, 4 ve 5:226 bp PCR ürünü) 4 5 45 3.1.3 HERC2 Genindeki Tek Nükleotid Polimorfizminin Amplifiye Edilen Bölgesinin Dra I Restriksiyon Enzimi ile Kesim Sonuçları HERC2 genindeki intron 86’nın rs12913832 tek nükleotid polimorfizm bölgesini de kapsayacak şekilde çoğaltılan 226 bp’lik PCR ürünündeki polimorfizmi belirlemek amacıyla; Dra I restriksiyon enzimi ile 37oC’de gece boyu inkübe edilmiştir. Şekil 3.2. Kesme enzimi, kesme bölgesi ve enzimin tanıdığı bölge Dra I enzimi 5’ ucundan TTT dizilimini tanıyarak, 3’ ucundan da AAA dizilimini tanıyarak kesim işlevini gerçekleştirir (Şekil 3.2.). 3.1.3.1 DNA Örneklerinin Genotiplendirilmesi Gönüllü bireylere ait DNA örneklerinin genotiplendirilmesi, enzim ile muameleden sonraki jel analizi sonuçları baz alınarak yapılmıştır. Amplifiye PCR Ürünlerinin Kesilmesi ve DNA Örneklerinin Genotiplenmesi kesme sonrası jel analizlerinde üç farklı sonuç gözlemlenmiştir. “AA” homozigot tipik genotipli bireyler Dra I enzimi, 226 bp’lik bölgeyi hem 5’ ucundan TTT dizilimini tanıyarak, hem de 3’ ucundan AAA dizilimini tanıyarak kesimini yapar (Şekil 3.3). Böylece 226 bp’lik 46 amplifikasyon ürünü; 203 bp ve 23 bp’lik iki oligonükleotid parçasına ayrılmış olur. Sonuçlar jel görüntüleme cihazında UV ışık altında fotoğraflanarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.4.). Şekil 3.3. 226 bp uzunluğundaki PCR ürününün “A/A” genotipli bireylerde, Dra I enzimi ile kesimi ile oluşan oligonükleotid uzunluklarının şematik gösterimi 203 bp M 1 2 3 Şekil 3.4. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün homozigot tipik bireylerde, Dra I enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları (M:100 bp Ladder; 1, 2 ve 3 homozigot tipik genotipli bireyler: 203 bp uzunluğundaki oligonükleotid) 47 “GG” homozigot atipik genotipli bireyler Dra I enzimi, 226 bp’lik bölgeyi 5’ ucundan TTT dizilimini tanır, ancak 3’ ucundan AAG dizilimini tanımadığı için kesim işlevini gerçekleştirememektedir (Şekil 3.5). G nükleotidine sahip bireylerde Dra I enzimi kesim yapamaz. Böylece 226 bp’lik amplifikasyon ürünü tek oligonükleotid parçası olarak görülmektedir. Sonuçlar jel görüntüleme cihazında UV ışık altında fotoğraflanarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.5). Şekil 3.5. 226 bp uzunluğundaki PCR ürününün “GG” genotipli bireylerde, Dra I enzimi ile kesimi ile oluşan oligonükleotid uzunluklarının şematik gösterimi 48 226 bp M 1 2 3 Şekil 3.6. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün, DraI enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları (M:100 bp Ladder; 1, 2 ve 3 homozigot atipik genotipli bireyler:226 bp uzunluğundaki oligonükleotid) “AG” heterozigot tipik genotipli bireyler Bu genotipe sahip bireyler tek DNA ipliğinde “A”, diğer DNA ipliğinde “G” nükleotidi taşıdıklarından Dra I enzimi ile kesim sonucunda; bir DNA ipliği “AA” genotipine sahip bireylerde olduğu gibi, 203 bp ve 23 bp olarak iki oligonükleotide ayrılır. Diğer DNA ipliği ise “GG” genotipli bireylerde olduğu gibi 226 bp’lik tek oligonükleotide ayrılır. Dolayısı ile jel görüntüleme cihazı UV ışık altında heterozigot genotiplerin oligonükleotid bantları; 226 bp, 203 bp ve 23 bp olarak görülmektedir (Şekil 3.7). 49 203 bp 226 bp M 1 2 3 4 5 Şekil 3.7. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün homozigot tipik, heterozigot ve homozigot atipik bireylerde, Dra I enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları (M:100 bp Ladder; 1:203 bp AA, 2 ve 3:203-226 bp AG, 4ve 5:226 bp GG genotipli bireyler) 3.1.3.2 Dra I Enzimi ile Kesilen Baz Çiftlerinin Bant Uzunlukları HERC2 genindeki intron 86’nın rs12913832 tek nükleotid polimorfizm bölgesini de kapsayacak şekilde çoğaltılan 226 bp’lik PCR ürünündeki Dra I enzimi ile kesim sonucunda oluşan baz çifti uzunlukları aşağıdaki Çizelge 3.2.’de gösterilmiştir. 50 Çizelge 3.2. HERC2 geninin rs12913832 polimorfizmi ile oluşan genotipler ve Dra I enzimi ile kesim sonucundaki oligonükleotid uzunlukları GENOTİP Dra I enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları Homozigot tipik (AA) 203 bp ve 23 bp Homozigot atipik (GG) 226 bp Heterozigot (AG) 226 bp, 203 bp ve 23 bp 3.1.4 HERC2 Genindeki A/G Tek Nükleotid Polimorfizminin Genotip Frekansı Bireylerin ağız içi svap örnekleriyle yapılan genetik çalışmada, HERC2 genindeki A/G tek nükleotid polimorfizminin toplumumuz bireylerinde genotiplere göre gruplandırılması yapılarak, 156 toplam bireye göre genotip frekansı Çizelge 3.3.’de gösterilmiştir. Çizelge 3.3. Bireylerin HERC2 genindeki A/G tek nükleotid polimorfizminin genotip frekansı Genotip Frekansı (n:156) Polimorfizm n % AA (Homozigot tipik) 54 34.6 AG (Heterozigot) 72 46.2 GG (Homozigot atipik) 30 19.2 51 3.1.5 HERC2 Genindeki A/G Tek Nükleotid Polimorfizminin Alel Frekansı Svap örneklerinden yapılan genetik çalışmada, HERC2 A/G tek nükleotid polimorfizmi ile oluşan alel frekansları (n:312) gruplandırılmış, bireylere ait alel frekansı Çizelge 3.4.’te gösterilmiştir. Çizelge 3.4. Toplumumuz bireylerinde HERC2 genindeki A/G tek nükleotid polimorfizminin alellerin frekansı. Alel Frekansı (n:312) Alel (A/G) n % G 132 42.31 A 180 57.69 3.2 Yaş-Genotip ilişkisi Bu tez çalışmasını oluşturan 156 bireyin yaş ortalaması 40,06 ± 17,83 yıl (Minimum:18, Maksimum:91) olarak hesaplanmıştır. Bu bireylerin genotip dağılımı Çizelge 3.5.’teki gibi tespit edilmiştir. Bireylerin yaşları ve genotipleri arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulunmamıştır. Çizelge 3.5. Bireylerin yaşları ve genotipleri arasındaki ilişki. Genotip n Ortalama GG 30 43,3 ± 17,63 AG 72 42,2 ± 16,32 AA 54 35,4 ± 19,19 Toplam 156 40,1 ± 17,83 52 3.3 Çalıştığımız Popülasyonun Hardy-Weinberg Dengesinin Tespiti Çalışmamızda yapılan istatistiksel analizler sonucunda çalıştığımız popülasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olduğu bulunmuştur. Hardy-Weinberg uygunluk hipotezinin istatistiksel olarak karşılaştırılmasında χ2 testi kullanılmıştır. Bu işlemler sonucunda elde edilen bulgular Çizelge 3.6.’da gösterilmiştir. Çizelge 3.6. Çalışılan popülasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olup olmadığının tespiti. AA (Homozigot tipik) (n) AG (Heterozigot) (n) Gözlenen 54 72 30 156 Beklenen 51,92 76,15 27,92 156 Serbestlik Derecesi 2 GG (Homozigot atipik) (n) χ20,49 0,4645699 Toplam (n) p=0,513* *p>0,05 Bir popülasyonda alel frekansları Hardy-Weinberg dengesinde bulunur. Belirli sabit şartlar altında her iki alelin frekansının ve genotipik oranının stabil kalması durumudur. Bu genetik dengenin sağlanabilmesi için aşağıda belirtilen koşulların olması gerekmektedir. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda tez kapsamında çalışılan popülasyondaki gen ve alel frekansları Hardy-Weinberg dengesine uygun bulunmuştur (χ2=0,464; p=0,513). Popülasyon genetik analizler için yeterli sayıda olmalıdır. a) Mutasyon gözlenmemelidir. b) Popülasyondan dışarı ve içeri fazla sayıda göç olmamalıdır. c) Üreme tamamen rasgele olmalıdır. 53 Hardy-Weinberg dengesi ise; p2 + 2pq + q2 = 1 eşitliği ile hesaplanmalıdır. p: birinci alelin frekansı q: diğer alelin frekansı (Ayala ve Kiger, 1980). 54 4. TARTIŞMA Çağlar boyu insanoğlu içindeki merak duygusuyla kendini keşfetmeye çalışmıştır. Kendini bir diğerinden nelerin farklı kıldığını, üstünlük ve zaaflarının neler olduğunu, nesiller boyu bir özelliğin nasıl diğerine geçtiğini sorgulamıştır. Bununla da kalmayıp gözle görülmeyen gerçekleri aydınlatmaya çalışmışlardır. İnsan Genom Projesi de bu sürecin bir parçasıdır. Genetik yapının aydınlatılması birçok bilinmeyeni aydınlatsa da başka soru işaretlerini gündeme getirmiştir. Genom çalışmalarıyla birçok SNP bölgesi araştırılarak hastalıkla ilişkilerinin bulunması amaçlanmıştır. Ancak çalışmalar ilerledikçe SNP'lerin sadece hastalıklarla ilişkili olmayıp insanların karakteristik özelliklerinin ayrımını sağlayan özelliklere de neden oldukları tespit edilmiştir. Bu kapsamda en öne çıkan özellikler arasında insanların dış görünümünü belirleyenleri olmuştur. Türleri oluşturan bireyler arasındaki genetik farklılığın boyutları, seneler öncesine kadar değerlendirilememekteydi. En belirgin fark yaratan dış görünüş ile ilgili özelliklerin genetik aktarımı basit bir şekilde algılanırken (Robins, 1991), günümüzde saç, deri ve göz rengi gibi multifaktöriyel aktarımlı olan bazı insan özelliklerinin kompleks ve incelenmesinin oldukça güç olduğu anlaşılmıştır. İnsanların fiziksel özelliklerinin belirlenmesi ve bu uygulamanın adli bilimlerde kullanılabilir olması için son yıllarda birçok çalışma yürütülmektedir. İnsanların bu özellikleri, herhangi bir biyolojik materyalinden elde edilen DNA'nın polimorfik bölgelerinden yararlanılarak tespit edilmektedir. Keşfiyle moleküler genetik alanında çığır açan PCR tekniği, istenen bölgenin milyonlarca kopyasının yapılmasına imkan vermesiyle DNA’nın adli amaçlı kullanımını arttırmıştır. Genotipten fenotip karakterleri tahmin edilerek çok fazla şüphelinin olduğu adli olayların aydınlatılması amaçlanmaktadır. Fenotipik özelliklerden ilk bakışta en 55 dikkat çekenlerden birisi de göz renkleridir. Son yıllarda göz rengi ile ilgili yapılan birçok çalışma bulunmaktadır (Jannot ve ark., 2005; Duffy ve ark., 2007; Stokowski ve ark., 2007; Tully, 2007; Branicki ve ark., 2008; Han ve ark., 2008; Branicki ve ark., 2009; Mengel-From ve ark., 2009; Valenzuela ve ark., 2010). Gözün iridial stromasının anterior tabakasındaki melanin üretimi, göz renginin belirleyicisidir (Sturm ve Frudakis, 2004). Melanin organizmaların çoğunda bulunan bir pigment, melanositler ise melanin üretiminden sorumlu hücrelerdir. Anatomik olarak melanositler deride (epidermisin bazal tabakasında), gözde (retina pigment epiteli ve gözbebeğinin renkli iç zar alanında), saç matriksinde (damarsal alanda), mukoza membranında ve santral sinir sisteminde (beyindeki dokularda ve nöronların içinde) bulunurlar (Jimbow ve ark.,1999). Göz rengi Mendelyan kalıtım gösteren bir özellik olarak sınıflandırılmaktadır (Posthuma ve ark., 2006). Kalıtımı araştırıldıkça oldukça kompleks olduğu görülmüştür. Göz rengi hakkındaki geleneksel görüş kahverengi göz renginin mavi ve yeşil renge kıyasla dominant olduğu yönündedir (Redei, 2008). Özellikle göz rengiyle ilişkili bulunan genler HERC2, OCA2 ve MATP/SLC45A2'dir. Bu genler saç rengi, deri rengi gibi diğer fenotip karakterlerinin belirlenmesinde de rol almaktadırlar. Ancak tam olarak işlevlerinin ne olduğu bilinmemektedir. Bu genlerden en çok OCA2 geni çalışılmış olup, bu genin göz rengini belirlediğini gösteren birçok araştırma bulunmaktadır (Rebbeck, 2002; Duffy, 2007; Frudakis, 2007; Eiberg ve Mohr, 1996). Yakın zamanda yapılan yayınlarda HERC2 ve OCA2 genlerindeki polimorfizmlerin araştırıldığı görülmektedir (Zhu ve ark., 2004; Duffy ve ark., 2007). Bu genlerdeki polimorfizmlerin göz renginin belirlenmesinde önemli bir etken oldukları görülmektedir. Kromozom üzerindeki konumları bakımından birbirlerine oldukça yakın olup 15. kromozom üzerinde OCA2 geni 15q11.2-12 bölgesinde ve HERC2 geni de 15q13 bölgesinde yer almaktadır (Eiberg ve ark., 2008; Kayser ve ark., 2008; Sturm ve ark., 2008). 2.600’dan fazla Hollandalı bireyle yapılan linkage analizlerinde Kayser ve ark. (2008) insan iris rengini 15. kromozomun uzun kolunun 13.1 pozisyonunda 56 (15q13.1) lokalize olduğunu belirlemişlerdir. İris renk çeşitliliği ile HERC2 genindeki SNP’ler ve daha az ölçüde de bu genin yakın komşusu olan OCA2 geni birbirinden bağımsız olarak ilişkili bulunmuştur. Yirmi üç Avrupalı popülasyonda, HERC2 rs916977 alel dağılımı iris renk varyasyonu ile istatistiksel olarak ilişkili bulunmuştur (Kayser ve ark., 2008). Aynı araştırmacılar tarafından bu iki gende belirlenen polimorfizmlerin Avrupalı genetik orjini bilinmeyen kişilerin göz rengi fenotipinin tahmininin ilerideki çalışmalar için adli bilimlerde uygulanmasının oldukça yararlı olacağı önerilmektedir. Kayser ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptıkları çalışmada, Hollanda’da bulunan iki ayrı bölgedeki bireylerle Avrupalı, Asyalı (Japon ve Çin) ve Afrikalı bireyler arasında göz rengi ile ilgili genlerdeki farklı SNP’leri araştırmışlar ve SNP frekansları açısından, Avrupalıların Asyalı ve Afrikalılardan oldukça farklı olduğunu tespit etmişlerdir. Başka bir çalışmada ise melanosit hücreleri, Asyalı, Afrika kökenli Amerikalı ve Beyaz ırk (Caucasians) bireylerde karşılaştırılmış ve Asyalılarda toplam melanosit sayısının diğerlerine göre düşük olduğu belirlenmiştir (Albert ve ark., 2003). Son zamanlarda mavi ve kahverengi göz rengi ile HERC2 gen varyasyonları arasında ilişki de gösterilmiştir. rs12913832 ve rs1129038 polimorfizmleri HERC2 geninin 5' terminalinin birbirlerine yakın bölgelerinde bulunur. Bu polimorfizmlerin, mavi/kahverengi göz rengi arasında çok anlamlı bir ilişki tespit edilmiştir (Eiberg ve ark., 2008; Sturm ve ark., 2008). Genel olarak, OCA2 gen ifadesini etkileyen ve insan melanosit spesifik artırıcı unsur olarak HERC2 rs12913832’nin fonksiyonlarını kanıtlayan deneysel çalışmalar yapılmaktadır (Visser ve ark., 2012). OCA2 geninin ekzon bölgesinde göz rengiyle ilişkili R305W ve R419Q polimorfizmleri Avrupalılarda yaygın olarak görülmektedir. Bunların göz rengiyle ilişkileri tam olarak anlaşılamamakla birlikte (Rebbeck ve ark., 2002; Duffy ve ark., 2004; Sturm ve ark., 2008), intron bölgesindekilerle daha anlamlı şekilde ilişkili bulunmuştur. Yapılan geniş genom çalışmalarında (GWAS-Genome Wide Association Study) saç ve göz pigmentasyonu varyasyonunun belirlenmesinde, birçok SNP'nin 57 varlığı tanımlanmış bunlardan mavi göz rengi ile HERC2 genindeki polimorfizm ilişkili bulunmuştur (Sulem ve ark., 2007). Duffy ve ark. (2007), OCA2 geninin ilk intronundaki SNP’lerin insan göz rengi varyasyonlarıyla güçlü ilişkilerinin olduğunu göstermişlerdir. Bu çalışmayı takiben, Sturm ve ark. (2008) OCA2 genin upstream intergenik bölgesine komşu olan HERC2 genindeki göz rengi SNP’lerinin haritalarını tanımlamışlardır. 300 ila 3000 Avrupalı bireyde 92 SNP varlığını tespit ettikleri çalışmada, HERC2 genin intron 86 bölgesindeki tek SNP olan rs12913832 ile OCA2 genlerindeki varyasyonların belirlenerek bireylerin göz renkleri hakkında daha iyi bir tahmin yapılabileceğini belirtmişlerdir. Eiberg ve ark. (2008), Danimarkalı ailelerde mavi ve kahverengi göz rengi ayrımında HERC2 geninin 166 kb’lik aday bölgesinin haritasını tanımlamışlardır. Bu bölgedeki SNP’lerle yaptıkları daha sonraki çalışmalarında ise mavi göz renginin rs1129038 ve rs12913832 bölgeleriyle oldukça güçlü ilişkili olduğunu belirlemişlerdir. İris pigmentasyonunun tahmini için tek bir popülasyondan ziyade karışık popülasyonlarla yapılan birçok adli bilimler çalışması da bulunmaktadır (MengelFrom ve ark., 2010; Spichenok ve ark., 2010; Valenzuela ve ark., 2010; Walsh ve ark., 2010; Pospiech ve ark., 2011). Liu ve ark. (2010), rs12913832'nin göz renginin belirlenmesinde oldukça etkili olduğunu ve Avrupalılar arasında göz rengi varyasyonun açıklanmasını sağladığını bildirmişlerdir. İnsan göz renginin tahmini, kesin suç araştırmalarında iyi sonuç elde edilmesi için bazı adli genetik metotlar uygulanmaktadır. HERC2 genindeki rs1129038 ve rs12913832 SNP bölgelerinin mavi/kahverengi göz rengiyle ilişkili olduğu tanımlanmıştır (Iida ve ark., 2009). Rastgele seçilen 395 Danimarkalı bireyle yapılan çalışmada HERC2, OCA2 ve MATP (SLC45A2) genlerindeki SNP alellerinin çeşitli kombinasyonlarının tahmini araştırılmıştır. HERC2'deki SNP'ler rs1129038 ve/veya rs12913832'nin linkage analizleri gözlemlenmiş olup, insan göz renginin mavi, yeşil ve gri (açık) renkleri 58 olarak bir grup, kahverengi ve ela rengi (koyu) ise diğer grup olmak üzere iki büyük gruba ayrılmıştır (Mengel-From ve ark., 2009). Popülasyonlar kıtalar arası ayrım göstermekle birlikte genetik açıdan da birbirlerinden farklılıklar göstermektedirler. HapMap ve İnsan Genom projeleri çalışmaları sonucu dünyadaki popülasyonların birbirlerinden farklı veya birbirlerine benzer özellikleri tespit edilmeye çalışılmıştır. HapMap'te, HERC2 rs12913832 A/G polimorfizmine ait popülasyon verilerinde ve yaptığımız literatür çalışmalarında, Türk popülasyonunda bu polimorfizmle ilgili herhangi bir çalışma ve sonuç bulunmamaktadır. Türkiye, Asya ve Avrupa kıtaları arasındaki geçiş bölgesidir. Tarih boyunca birçok etnik grup Anadolu'da hüküm sürmüştür. Türk toplumunun heterojen yapısı ve genetik çeşitliliği toplumumuzdaki genotip dağılımını ve alel frekansını araştırmamıza imkan sağlamaktadır (Kayaaltı ve Söylemezoğlu, 2010). Türkiye’nin bu koşullara sahip olmasından dolayı toplumun gen frekanslarını belirleyebilmek oldukça önem kazanmaktadır. Bu tez çalışması, önceki yapılan diğer popülasyon çalışmaları ile karşılaştırılabilen ve Türk toplumunda HERC2 genindeki ekson 86’da yer alan rs12913832 A/G polimorfizminin genotip ve alel frekanslarının belirlendiği ilk araştırmadır. Bu tez çalışmasında Türk popülasyonunda genotip frekansları açısından AA genotipinin (%34,6) GG genotipine (%19,2) göre daha baskın ve alel frekansları karşılaştırıldığında ise, A alel frekansının (%57,7), G alel frekansından (%42,3) daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Çalışmada AA genotipinin Avrupalılara göre frekansının oldukça yüksek olduğunu, ancak Asyalı ve Afrikalı popülasyonlardan da önemli ölçüde düşük olduğu belirlenmiştir. GG genotip frekansının Afrikalı ve Asyalı toplumlarda görülmediği, Avrupalı popülasyonda da bizim toplumumuza göre çok daha yaygın bir şekilde görüldüğü tespit edilmiştir. Asyalı ve Afrikalı toplumların tamamı A alelini taşırken, A alelinin Türk popülasyondaki frekansı Avrupalılara göre daha fazla, G alel frekansı ise daha düşük olarak gözlenmiştir. Sonuç olarak, çalışmamızda Türk toplumunun Asyalı, Afrikalı ve Avrupalılardan HERC2 genindeki A/G polimorfizmi bakımımdan farklılık gösterdiği tespit edilmiştir. Bu polimorfizm araştırması da göstermiştir ki, Türk toplumu Asya ile Avrupa arasında tam bir köprü görevi görmektedir. HapMap çalışmaları sonucunda 59 belirlenen Asyalı, Afrikalı ve Avrupalı popülasyonlarındaki genotip ve alel frekansları dağılımı bu tez çalışmasında elde edilen verilerle birlikte Çizelge 4.1.’de gösterilmektedir. Çizelge 4.1. Türk popülasyonu ile diğer popülasyonlar arasında HERC2 geninin rs12913832 (A/G) polimorfizminin genotip ve alel frekanslarının dağılımının karşılaştırılması Genotip Frekansı (%) Popülasyon Alel Frekansı (%) n AA AG GG A G Türk 156 34,6 46,2 19,2 57,7 42,3 Avrupalı* 120 3,3 35,0 61,7 20,8 79,2 Asyalı* 90 100 - - 100 - Afrikalı* 120 100 - - 100 - (*) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=12913832 HERC2 genindeki rs12913832 A/G polimorfizimiyle ilgili Avrupalılarla yapılan çalışmalarda GG genotipinin renkli gözlülükle kuvvetli bir ilişkisinin olduğu tespit edilmiştir. Dolayısıyla, tez kapsamında GG genotipine sahip bireylerin renkli gözlü olduğu varsayılmıştır. Olay yerinden alınan örneklerden fenotipik özelliklerin tahmin edilmesi amaçlanmaktadır. Böylece fenotipik özellikler için gelecekte uygulanacak potansiyel genetik testlerin adli bilimler için yararlı olacağı düşünülmektedir (Tully, 2007). Genotipin fenotipe nasıl yansıdığı merak uyandırmakla birlikte bu araştırmalardan elde edilen sonuçların ileride yapılacak araştırmalara ışık tutacağı düşünülmektedir. 60 Günümüzde, toplumlara ait gen polimorfizm profillerini belirlemek amacıyla yapılan çalışmaların sayısı hızla artmaktadır. Yapılan çalışmalarda göz rengi ile ilgili genlerin polimorfizmleri, toplumlar arasında çalışılarak frekansları saptanmakta ve böylece toplumlardaki gen varyantları hesaplanarak, toplumların karakteristik özellikleri ve birbirlerine olan genetik yakınlıkları belirlenebilmektedir (Sulem ve ark., 2007). Bu tez çalışmasıyla adli vakaların (şüpheli sayısının çok fazla olduğu durumlarda, toplu ölümlerde, kayıp arama olaylarında vb.) aydınlatılmasında göz rengi polimorfizmi araştırılarak bireylerin göz rengini tahmin etmede yardımcı olabileceği ve göz rengi fenotipinin belirlenerek, bireyi kimliklendirmede fiziksel bir eleme kriteri olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. 61 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Bu çalışmada, toplumumuzdaki 156 gönüllü bireyin HERC2 genindeki intron 86’daki rs12913832 polimorfizmi araştırılmıştır. Toplumumuz bireylerinin (n:156) %34,6’sı homozigot tipik (AA) (n:54), %46,2’si heterozigot (AG) (n:72) ve %19,2’si ise homozigot atipik (GG) (n:30) genotipli olarak tespit edilmiştir. G alel frekansı %42,3 ve A alel frekansı %57,7 olarak hesaplanmıştır. Genotip ve alel frekansları Hardy-Weinberg eşitliğine uygun bulunmuştur. Yürütülen bu tez çalışmasının, daha önce toplumumuzda ve Beyaz ırklarda göz rengi polimorfizmi ile ilgili çalışma bulunmaması açısından önemli olup, yakın gelecekte toplumumuzda göz rengini belirleyen genlerdeki polimorfizmlerle ilgili çalışmalar için veri tabanı oluşturması açısından katkı sağlayacağı düşünülmektedir. Dolayısıyla bu çalışmanın, toplumumuzda göz rengine etkiyen genlerdeki polimorfizmlerin frekanslarının çıkarılması ve göz rengine göre bu polimorfizmlerin belirlenmesi açısından adli olayların aydınlatılmasına yardımcı olması yönünden önemli veriler sağlayacağı düşünülmektedir. Oluşturulması hedeflenen bu veri tabanları özellikle adli bilimlerde biyolojik materyaline ulaşılan şüphelinin ve kimliği belirlenemeyen bireylerin fenotipik özellikleri hakkında bilgi sağlayacaktır. Bu tez çalışması kapsamında elde edilen veriler doğrultusunda genotipin fenotipe yansıması konusunda katkı sağlanmış olup, bu çalışmanın ileride yapılması planlanan çalışmalar için temel oluşturacağı düşünülmektedir. Birçok ülkede genotipi tespit edilen bireyin fenotipik özellikleri belirlenerek adli vakaların aydınlatılması amacıyla kullanılması çalışmaları hızla artmaktadır. Genotipik özellikler populasyonlara göre farklılıklar oluşturduğundan, Türk toplumunda da adli olaylarda fenotipe etkiyen gen varyasyonlarının belirlenmesi ve bu verilerin adli olayların çözümünde kullanılması önerilmektedir. 62 İnsan göz rengindeki genotip-fenotip ilişkilerine ait çalışmaların olması ve bu çalışmalar sonucunda göz rengi fenotipinin kuvvetle tahmin edilebilmesi, saç ve deri rengi gibi diğer insan pigmentasyon özelliklerinin belirlenebilmesinde beklentileri yükseltmekte ve bu konudaki çalışmalar için yol gösterici olmaktadır. 63 ÖZET Toplumumuzda Göz Rengini Belirleyen HERC2 Gen Polimorfizminin Yaygınlığının Araştırılması Bu tez çalışmasında, toplumumuzdaki en belirgin fenotipik özelliklerden göz renginin belirleyicisi olan HERC2 genindeki intron 86’daki rs12913832 A/G polimorfizminin araştırılması amaçlanmıştır. Adli bilimler açısından olay yerinde bulunan biyolojik örneklerden şüpheliye ulaşılmasında çok büyük katkı sağlayan fenotipik özelliklerin belirlenmesi oldukça önemlidir. Bu tez kapsamında, toplumumuzda göz rengine bakılmaksızın rastgele seçilen sağlıklı yaş aralığı 18-91 olan 156 (78 kadın ve 78 erkek) gönüllü bireyden yanak içi svapları alınarak, polimorfizmleri incelenmiştir. İzole edilen DNA’ların HERC2 genindeki polimorfizmi içeren bölgesi PCR tekniği ile çoğaltılarak 226 bp uzunluğundaki oligonükleotid amplifiye edilmiştir. Amplifikasyon ürünleri RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) tekniği ile Dra I restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. Kesilen ve kesilmeyen ürünler %2,5 agaroz jel elektroforezinde ayrımı sağlanarak, ultra viole ışık altında etidyum bromür yardımıyla görüntülenmiştir. HERC2 A/G polimorfizmindeki genotip frekansları %19,2 GG; %46,2 AG ve %34,6 AA olarak tespit edilmiştir. G alel frekansı %42,3 ve A alel frekansı %57,7 olarak hesaplanmıştır. Genotip frekansları Hardy-Weinberg eşitliğine uygun bulunmuştur. Yapılan önceki çalışmalarda, HERC2 geninde araştırılan polimorfizm (rs12913832) popülasyonlar arasında farklılık gösterdiği saptanmıştır. G aleli Asyalı topluluklarda hiç görülmezken, Avrupalılarda oldukça fazla görülmektedir. Bu çalışmanın sonucunda; G alelinin, Türk toplumunda Avrupalılara kıyasla daha az görülmesine rağmen, bu alelin görülme sıklığının oldukça yaygın olduğu gözlemlenmiştir (%42.3). Anahtar Sözcükler: fenotip, genotip, göz rengi, HERC2, polimorfizm. 64 SUMMARY Distribution of HERC2 human iris color gene polymorphism in Turkish population The aim of this study was to investigate the rs12913832 A/G polymorphism located on intron 86 of HERC2 gene which is a marker of eye color and the most prominent phenotypic features of our society. Determination of phenotypic characteristics, which contributes to solve the case from the biological samples at the scene of crime, is very important for forensic sciences. In this study, 156 buccal swab samples (78 female and 78 male) were collected from unrelated healthy volunteers between 18 and 91 years of age who were selected randomly from Turkish population. HERC2 A/G polymorphism was genotyped by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) for the detection of rs12913832 polymorphism. To screen for this polymorphism, a 226 bp fragment was produced with the PCR and the amplified oligonucleotides were cut with Dra I restriction enzyme. Digested and undigested products were separated on a 2.5% agarose gel electrophoresis, visualized by ethidium bromide staining under an ultraviolet illuminator. The genotype frequencies of HERC2 rs12913832 polymorphism were determined as 19.2% for GG, 46.2% for AG and 34.6% for AA genotypes. The frequency of G allele was calculated as 42.3% and of the A allele as 57.7%. The genotype frequencies were consistent with Hardy-Weinberg equilibrium (p<0.05). It is shown that the polymorphism (rs12913832) investigated in HERC2 was different between populations in previous studies. G allele of this polymorphism was not observed in Asian populations, whereas it is quite a lot in Europeans. As a conclusion of this study, although G allele was found less common in Turkish society than in Europeans, the frequency of this allele was observed quite common (42.3%). Key Words: HERC2, eye color, genotype, phenotype, polymorphism 65 KAYNAKLAR AKEY, J.M., WANG, H., XIONG, M. (2001). Interaction between the melanocortin-1 receptor and P genes contributes to inter-individual variation in skin pigmentation phenotypes in a Tibetan population. Hum. Genet., 108(6):516–520. ALBERT, D.M., GREEN, W.R., ZIMBRIC, M.L., LO, C., GANGNON, R.E. HOPE, K.L., GLEISER, J. (2003). Iris melanocyte numbers in Asian, African American, and Caucasian irides. Trans Am Ophthalmol Soc.,101:217-21. AYALA, F. J., KIGER, F. J. (1980). Modern Genetics. Benjamin/Cumming Publishing Company, Inc, California. syf.: 601-605. BARTLETT, J.M.S., STIRLING D. (2002). A Short History of the Polymerase Chain Reaction, Methods in Molecular Biology, Vol. 226: PCR Protocols, Second Edition, pp. 3-6, Humana Press Inc., Totowa, NJ. BENNETT, D., LAMOREUX M.L. (2003). The color loci of mice—a genetic century. Pigment Cell Res., 16:333–344. BRANICKI, W., BRUDNIK, U., KUPIEC, T., WOLAN´SKA-NOWAK, P., WOJASPELC, A. (2007). Determination of phenotype associated SNPs in the MC1R gene. J Forensic Sci , 52:349–354. BRANICKI, W., BRUDNIK, U., DRAUS-BARINI, J., KUPIEC, T., WOJAS-PELC, A. (2008). Association of the SLC45A2 gene with physiological human hair colour variation. J Hum Genet., 53(11-12):966-71. BRANICKI, W., BRUDNIK, U., WOJAS-PELC, A. (2009). Interactions between HERC2, OCA2 and MC1R may influence human pigmentation phenotype. Ann Hum Genet., 73(2):160-70. BUTLER, J. M. (2005). Forensic DNA typing. Biology Technology and Genetics of STR Markers.USA: Elsevier Press, p.: 33-84. DIB, C. (1996). A comprehensive genetic map of the human genom based on 5,264 microsatellites. Nature 380: 152-154. DIETRICH, C.E. (1972). Zur Feinstruktur der Maelanocyten in der menschlichen Iris. Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol, 183:317-333. DUFFY, D.L., BOX, N.F., CHEN, W., PALMER, J.S., MONTGOMERY, G.W., JAMES, M.R., HAYWARD, N.K., MARTIN, N.G., STURM, R.A. (2004). Interactive effects 66 of MC1R and OCA2 on melanoma risk phenotypes. Hum Mol Genet. Feb 15;13(4):447-61. DUFFY, D.L., MONTGOMERY, G.W., CHEN, W., ZHAO, Z.Z., LE, L., JAMES, M.R., HAYWARD, N.K., MARTIN, N.G., STURM, R.A. (2007). A three-single-nucleotide polymorphism haplotype in intron 1 of OCA2 explains most human eye-color. Am J Hum Genet., 80(2):241-52. DUFFY, D.L., ZHAO, Z.Z., STURM, R.A., HAYWARD, N.K., MARTIN, N.G., MONTGOMERY, G.W. (2010). Multiple pigmentation gene polymorphisms account for a substantial proportion of risk of cutaneous malignant melanoma. J. Invest. Dermatol. 130, 520–528. EAGLE, R,C, Jr. (1988). Iris pigmentation and pigmented lesions: an ultrastructural study. Trans Am Ophthalmol Soc, 88:581-687 EIBERG, H., MOHR, J. (1996). Assignment of genes coding for brown eye colour (BEY2) and brown hair colour (HCL3) on chromosome 15q. Eur J Hum Genet., 4(4):237-41 EIBERG, H., TROELSEN, J., NIELSEN, M., MIKKELSEN, A., MENGEL-FROM, J., KJAER, K. (2008). Blue eye color in humans may be caused by a perfectly associated founder mutation in a regulatory element located within the HERC2 gene inhibiting OCA2 expression. Hum Genet, 123, 177–187. FERNANDEZ, L.P., MILNE, R.L., PITA, G., AVILE´ S, J.A., LA´ ZARO, P., BENI´- TEZ, J., RIBAS, G. (2008). SLC45A2: a novel malignant melanoma-associated gene. Hum. Mutat. 29, 1161–1167. FRAZER, K.A., BALLINGER D.G., COX D.R., HINDS, D.A., STUVE, L.L. (2007). A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature, 449: 851– 861. FROST, P. (2006). European hair and eye color A case of frequency-dependent sexual selection? Evolution and Human Behavior 27: 85–103. FRUDAKIS, T., THOMAS, M., GASKIN, Z., VENKATESWARLU, K., CHANDRA, K. S., GINJUPALLI, S. (2003). Sequences associated with human iris pigmentation. Genetics 165, 2071–2083. FUCHS, E. (1913). Normal pigmentierte und albinotische Iris. Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol, 84/85:521. GERSTENBLITH, M.R., SHI, J., LANDI, M.T. (2010). Genome-wide association studies of pigmentation and skin cancer: a review and meta-analysis. Pigment Cell Melanoma Res. 23; 587–606. 67 GRAF, J., HODGSON, R., van DAAL, A. (2005). Single nucleotide polymorphisms in the MATP gene are associated with normal human pigmentation variation. Hum. Mutat. 25, 278–284. GUEDJ, M., BOURILLON, A., COMBADIE` RES, C. (2008). Variants of the MATP ⁄ SLC45A2 gene are protective for melanoma in the French population. Hum. Mutat. 29, 1154–1160. HAN, J., KRAFT, P., NAN, H., GUO, Q., CHEN, C., QURESHI, A., HANKINSON, S.E., HU, F.B., DUFFY, D.L., ZHAO, Z.Z., MARTIN, N.G., MONTGOMERY, G.W., HAYWARD, N.K., THOMAS, G., HOOVER, R.N., CHANOCK, S., HUNTER, D.J. (2008). A genome-wide association study identifies novel alleles associated with hair color and skin pigmentation. PLoS Genet. 4(5):e1000074. HILL, H.Z. (1992). The function of melanin or six blind people examine an elephant. BioEssays 14(1):49–56. IIDA, R., UEKI, M., TAKESHITA, H., FUJIHARA, J., NAKAJIMA, T., KOMINATO, Y., NAGAO, M., YASUDA, T. (2009). Genotyping of five single nucleotide polymorphisms in the OCA2 and HERC2 genes associated with blue-brown eye color in the Japanese population. Cell Biochem Funct. 27: 323–327. JAMES, H.S., NORDBYI J.J. (2003). Forensic Science: An Intraduction to Scientific And Investigative Techniques, pp. 115-134, CRC Press Florida. JANNOT, A.S., MEZIANI, R., BERTRAND, G. (2005). Allele variations in the OCA2 gene (pink-eyed dilution locus) are associated with genetic susceptibility to melanoma. Eur. J. Hum. Genet. 13, 913–920. JIMBOW, K., QUEVEDO, W.C., PROTA G. (1999). Biology of melanocytes. In: Freedberg, I.M., Eisen, A.Z., Wolff, K. et al. eds. Dermatology in General Medicine, 5th edn, Vol. 1. New York: McGraw-Hill,: 192-220. KAYAALTI, Z., SÖYLEMEZOĞLU, T. (2010). Distribution of ADH1B, ALDH2, CYP2E1 *6, and CYP2E1 *7B genotypes in Turkish population. Alcohol. 44(5):415-23. KAYSER, M., LIU, F., JANSSENS, A.C., RIVADENEIRA, F., LAO, O., van DUIJN, K., VERMEULEN, M., ARP, P., JHAMAI, M.M., van IJCKEN, W.F., den DUNNEN, J.T., HEATH, S., ZELENIKA, D., DESPRIET, D.D., KLAVER, C.C., VINGERLING, J.R., de JONG, P.T., HOFMAN, A., AULCHENKO, Y.S., UITTERLINDEN, A.G., OOSTRA, B.A., van DUIJN, C.M. (2008). Three genomewide association studies and a linkage analysis identify HERC2 as a human iris color gene. Am J Hum Genet. 82(2):411-23. KAYSER, M., SCHNEIDER, P.M. (2009). DNA-based prediction of human externally visible characteristics in forensics: Motivations, scientific challenges, and ethical considerations. Forensic Science International: Genetics. 3 (2009) 154–161. 68 KOBILINSKY, L., LIOTTI, T.F., OESER-SWEAT, J. (2005). Forensic DNA Analysis Methods, DNA: Forensic and Legal Applications, pp 70-73, John Wiley & Sons, Inc. KUBISTA, M., ANDRADE, J.M., BENGTSSON, M., FOROOTAN, A., JONÁK, J., LIND, K., SINDELKA, R., SJÖBACK, R., SJÖGREEN, B., STRÖMBOM, L., STÅHLBERG, A., ZORIC, N. (2006). The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27(2-3):95-125. LEE, S.T., NICHOLLS, R.D., JONG, M.T., FUKAI, K., SPRITZ, R.A. (1995). Spritz, Organization and sequence of the human P gene and identification of a new family of transport proteins, Genomics. 26 354–363. LIU, F., WOLLSTEIN, A., HYSI, P.G., ANKRA-BADU, G.A., SPECTOR, T.D., PARK, D., ZHU, G., LARSSON, M., DUFFY, D.L., MONTGOMERY, G.W. (2010). Digital quantification of human eye color highlights genetic association of three new loci. PLoS Genet 6:e1000934. MENGEL-FROM, J., WONG, T.H., MORLING, N., REES, J.L., JACKSON, I.J. (2009). Genetic determinants of hair and eye colours in the Scottish and Danish populations. BMC Genet. 30;10:88. MENGEL-FROM, J., BØRSTİNG, C., SANCHEZ, J. J., EİBERG, H., MORLİNG, N. (2010). Human eye colour and HERC2, OCA2 and MATP. Forensic Science International: Genetics. 4:323–328. MOZAYANI, A., NOZIGLIA, C. (2006). The Forensic Laboratory Handbook Procedures And Practice, Humana Press Inc. NAKAYAMA, K., FUKAMACHI, S., KIMURA, H., KODA, Y., SOEMANTRI, A., ISHIDA, T. (2002). Distinctive distribution of AIM1 polymorphism among major human populations with different skin color. J. Hum. Genet. 47, 92–94. NEWTON, J.M., COHEN-BARAK, O.N., HAGIWARA, J.M., GARDNER, M.T., DAVISSON, R.A., KING, M.H. (2001). Brilliant, Mutations in the human orthologue of the mouse underwhite (uw) gene underlie a new form of oculocutaneous albinism, OCA4, Am. J. Hum. Genet. 69:981–988. NORTON, H.L., KITTLES, R.A., PARRA, E., McKEIGUE, P., MAO, X., CHENG, K., CANFIELD, V.A., BRADLEY, D.G., McEVOY, B., SHRIVER, M.D. (2007). Genetic evidence for the convergent evolution of light skin in Europeans and East Asians. Mol Biol Evol. 24(3):710-22. POSPIECH, E., DRAUS-BARINI, J., KUPIEC, T., WOJAS-PELC, A., BRANICKI, W. (2011) Gene–gene interactions contribute to eye colour variation in humans. J Hum Genet. 56:447–455 69 POSTHUMA, D., VISSCHER, P.M., WILLEMSEN, G., ZHU, G., MARTIN, N.G., SLAGBOOM, P.E., de GEUS, E.J., BOOMSMA, D.I. (2006). Replicated linkage for eye color on 15q using comparative ratings of sibling pairs. Behav Genet. 36(1):12-7. PUSTERLA, J.E.M., LEUTENEGGER, C.M. (2006). Real-Time Polymerase Chain Reaction: A Novel Molecular Diagnostic Tool for Equine Infectious Diseases N. J Vet Intern Med. 20:3–12. REBBECK, T.R., KANETSKY, P.A., WALKER, A.H., HOLMES, R., HALPERN, A.C., SCHUCHTER, L.M., ELDER, D.E., GUERRY, D.P. (2002) gene as an inherited biomarker of human eye color. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 11(8):782-4. REES, J. (2006). Plenty New Under the Sun. Journal of Investigative Dermatology. 126: 1691-1692. REES, J.L. (2003). Genetics of hair and skin color. Annu Rev Genet. 37:67-90. RINCHIK, E.M., BULTMAN, S.J., HORSTHEMKE, B., LEE, S.T., STRUNK, K.M., SPRITZ, R.A., AVIDANO, K.M., JONG, M.T., NICHOLLS, R.D. (1993). A gene for the mouse pink-eyed dilution locus and for human type II oculocutaneous albinism. Nature. 361 72–76. ROBERTS, R.J., MACELIS, D. (1991). Restriction enzymes and their isoschizomers. Nucleic Acids Res. 19:2077-2109. ROBINS, A.H. (1991). The evolution of skin colour. In Biological Perspectives on Human Pigmentation, pp. 187–212. Cambridge: Cambridge Univ. Press ROUX, K. H. (2009). Optimization and Troubleshooting in PCR. Cold Spring Harb Protoc. doi: 10.1101/pdb.ip66 SHERRY, S. T., WARD, M. H., KHOLODOV, M., BAKER, J., PHAN, L., SMİGİELSKİ, E. M., SİROTKİN K. (2000). dbSNP: the NCBI database of genetic variation. Nucl. Acids Res. 29 (1): 308-311. SHULLER, W., FEREDAY L., SHEITHAUER R. (2001). The Interpol Handbook on DNA Data Exchange and Practice, Interpol. SPICHENOK, O., BUDIMLIJA, Z.M., MITCHELL, A.A., JENNY, A., KOVACEVIC, L., MARJANOVIC, D., CARAGINE, T., PRINZ, M., WURMBACH, E. (2010) Prediction of eye and skin color in diverse populations using seven SNPs. Forensic Sci Int. 5:472–478 STOKOWSKI, R.P., PANT, P.V., DADD, T., FEREDAY, A., HINDS, D.A., JARMAN, C., FILSELL, W., GINGER, R.S., GREEN, M.R., van der OUDERAA, F.J., COX, D.R. (2007). A genomewide association study of skin pigmentation in a South Asian population. Am J Hum Genet. 81(6):1119-32. 70 STURM, R.A., FRUDAKIS, T.N. (2004). Eye colour: portals into pigmentation genes and ancestry. Trends. Genet. 20 , 327–332. STURM, R.A. (2006). A golden age of human pigmentation genetics. Trends Genet. 22: 464–468. STURM, R., DUFFY, D., ZHAO, Z., LEITE, F., STARK, M., HAYWARD, N. (2008). A single SNP in an evolutionary conserved region within intron 86 of the HERC2 gene determines human blue-brown eye Color. Am J Hum Genet. 82, 424–431 STURM, R.A. (2009). Molecular genetics of human pigmentation diversity. Hum Mol Genet. 18(R1):R9-17 SULEM, P., GUDBJARTSSON, D.F., STACEY, S.N., HELGASON, A., RAFNAR, T., MAGNUSSON, K.P., MANOLESCU, A., KARASON, A., PALSSON, A., THORLEIFSSON, G. (2007). Genetic determinants of hair, eye and skin pigmentation in Europeans. Nat Genet. 39:1443–1452 TOMITA, Y., SUZUKI, T. (2004). Genetics of pigmentary disorders. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 131C, 75–81. TULLY, G. (2007). Genotype versus phenotype: human pigmentation. Forensic Sci Int Genet. 1(2):105-10. VALENZUELA, R.K., HENDERSON, M.S., WALSH, M.H., GARRISON, N.A., KELCH, J.T., COHEN-BARAK, O., ERICKSON, D.T., MEANEY, J.F, WALSH, B.J., CHENG, K.C., ITO, S., WAKAMATSU, K., FRUDAKIS, T., THOMAS, M., BRILLIANT, M.H. (2010). Predicting phenotype from genotype: normal pigmentation. J Forensic Sci. 1;55(2):315-22. van DAAL, A. (2008). The genetic basis of human pigmentation. Forensic Science International: Genetics Supplement Series 1: 541–543. WAKAMATSU, K., ITO, S. (2002). Advanced Chemical Methods in Melanin Determination. Pigment Cell Res. 15: 174–183. WALSH, S., LINDENBERGH, A., ZUNIGA, S.B., SIJEN, T., de KNIJFF, P., KAYSER, M., BALLANTYNE, K.N. (2010) Developmental validation of the IrisPlex system: determination of blue and brown iris colour for forensic intelligence. Forensic Sci. Int. Genet. 5:467–471. WHITE D, RABAGO-SMITH M. (2011). Genotype–phenotype associations and human eye color J Hum Genet. 56(1):5-7. WILSON, I. G. (1997). Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl. Environ. Microbiol. 63:3741-3751. 71 WOLFRUM, P. (1922). Über den Bau der Irisvorderfläche des enschlichen Auges mit verleichend anatomischen Bemerkungen. Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 109:106-153. WRIGHT, P.A., WYNFORD-THOMAS, D. (1990). The polymerase chain reaction: miracle or mirage? A critical review of its uses and limitations in diagnosis and research. J Pathol. 162(2):99-117. ZHU, G., EVANS, D.M., DUFFY, D.L., MONTGOMERY, G.W., MEDLAND, S.E., GILLESPIE, N.A., EWEN, K.R., JEWELL, M., LIEW, Y.W., HAYWARD, N.K., STURM, R.A., TRENT, J.M., MARTIN, N.G. (2004). A genome scan for eye color in 502 twin families: most is due to a QTL on chromosome 15q. Twin Res. 7(2):197-210. 72 EKLER 73 74 ÖZGEÇMİŞ Bireysel Bilgiler Adı: Gözde Soyadı: MASATCIOĞLU Doğum Tarihi ve Yeri: 1986, ANKARA Uyruğu: T.C. Medeni Durumu: Bekar İletişim Adresi ve Telefonu: A.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Tıp Fakültesi Cebeci Kampusü Dikimevi/ANKARA Tel:0(312) 319 27 34 Eğitimi II- 2011 – Ankara Üniversitesi Adli Bilimler Enstitüsü, Adli Biyoloji Yüksek Lisans 2004 – 2008 Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji ve Mikrobiyoloji Opsiyonu 2000 – 2004 Ankara Ayrancı Lisesi (Yabancı Dil Ağırlıklı) Yabancı Dili: İngilizce III- Mesleki Deneyimi 07/2009-09/2009 Ankara Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi Başkanlığı Moleküler Mikrobiyoloji Araştırma ve Uygulama Laboratuarında Staj IV- Bilimsel İlgi Alanları Uluslararası Bilimsel Toplantılarda Sunulan ve Bildiri Kitabında (Proceedings) Basılan Bildiriler: Tıbbi Biyoloji ve Genetik Derneği ve Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesinin düzenlediği “12. Ulusal Tıbbi Biyoloji ve Genetik Kongresi” ne Oksidatif Stres ve Mitokondriyal DNA Hasarları başlıklı poster bildiri Ege Üniversitesi’nin düzenlediği “13. Ulusal Biyoloji Öğrenci Kongresi” ne İnsan Genom Projesi başlıklı poster bildiri 75 Süleyman Demirel Üniversitesi’nin düzenlediği “12. Ulusal Biyoloji Öğrenci Kongresi” ne Yeni Milenyumun En Yaygın Gıda Kaynaklı Patojeni: Campylobacter jejuni başlıklı poster bildiri V- Aldığı Kurslar ve Katıldığı Programlar 05/2012 Türkiye İlaç ve Tıbbi Cihazlar Kurumu tarafından düzenlenen "Strategic Action Plan for Improving Access to Opioid Medication" adlı konferansa katılım belgesi 03/2012 Artıbel Certification tarafından düzenlenen "GMP (İyi Üretim Uygulamaları) Temel Eğitimi" adlı başarı sertifikası 03/2012 Artıbel Certification tarafından düzenlenen "ISO 22000:2005 Gıda Güvenliği Yönetim Sistemi Temel Eğitimi" adlı başarı sertifikası 03/2012 Artıbel Certification tarafından düzenlenen "KAIZEN (Sürekli İyileştirme) Temel Eğitimi" adlı başarı sertifikası 12/2011 Gazi Üniversitesi Hayvan Etik kurulu onayı ile Gazi Üniversitesi Laboratuar Hayvanları Yetiştirme ve Deneysel Araştırmalar Merkezi Tarafından düzenlenen X. Deney Hayvanları Uygulama ve Etik Kursu Katılım sertifikası 26 Ekim 2011 Tıbbi Biyoloji ve Genetik Derneği ve Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi’nin düzenlediği “Moleküler Biyolojide Yeni Teknolojiler Kursu” Katılım Belgesi 08-11 Eylül 2007 İstanbul Teknik Üniversitesi’nin düzenlediği “Moleküler Biyoloji ve Genetik Öğrenci Kongresi Q-PCR Çalıştayı” Katılım Belgesi
