Are You suprised ?

Süleyman Demirel Üniversitesi Yaşam Dergisi 2010;2(2):01-03
1
Araştırma Makalesi
Oncorhynchus mykiss ile Salmo salar L. Balık Türlerinin SDS-PAGE
Elektroforezi Yöntemi ile Protein Bantlarının Karşılaştırılması
Meryem ATEġ1, Serdal ÖĞÜT2, Ġsmail ġEN3, Burçin AĢkım GÜMÜġ4, Mümin POLAT5
1,3
Süleyman Demirel Üniversitesi, Deneysel ve Gözlemsel Öğrenci Araşırıma ve Uygulama Merkezi-Isparta
Süleyman Demirel Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü-Isparta
4
Gazi Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü-Ankara
5
Süleyman Demirel Üniversitesi, Isparta Sağlık Hizmetleri Meslek YüksekOkulu-Isparta
2
ÖZET
Alabalık, dünyanın birçok ülkesinde olduğu gibi ülkemizde de 1970’li yıllardan beri yetiĢtiriciliği baĢarılı bir Ģekilde uygulanan
bir balık türüdür. Alabalık türleri içinde yoğun ve yaygın yetiĢtiriciliği yapılan en önemli tür gökkuĢağı alabalığıdır. Yine
Salmonidae familyasında bulunan somon (Salmo salar) ise özellikle Norveç ve Ġskoçya'da ciddi miktarlarda üretilmektedir.
Bu çalıĢmada, ülkemizde yetiĢtirilen alabalık (Oncorhynchus mykiss) ile aynı familyadan olan ve Norveç’ten ithal edilen
Atlantik somonunun (Salmo salar) sodyum dodesil sülfat poli-akrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemiyle protein
profilleri ve protein kaliteleri araĢtırılmıĢtır. Protein bant profillerine göre Salmo salar balığının alabalığa göre daha yoğun
protein bantlarına sahip olduğu tespit edilmiĢtir.
Anahtar Kelimeler: Oncorhynchus mykiss, Salmo salar, protein, SDS-PAGE, Bradford.
SDÜ Yaşam Dergisi 2010;2(2):01-03
SUMMARY
The Comparison of the Protein Bands in Two Fish Species, Oncorhynchus mykiss and Salmo Salar Using the SDSPAGE Electrophoresis
ABSTRACT
The trout has been successfully aquacultured in our country since 1970s just as in many countries around the world. The
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) is one of the most densely and widespread aquacultured speckled trout species.
Salmo salar (Salmon) as a member of the family Salmonidae has been aquacultured in big amounts especially in Norway
and Scotland.
In this study, the protein profiles and protein quality of the (Oncorhynchus mykiss) which is being aquacultured in our
country and Salmo salar which is being imported from Norway were determined by the sodium dodesil sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). We determined that Salmo salar has denser protein bands than Oncorhynchus
mykiss has, according to the protein files of these two fish species.
Key Words: Oncorhynchus mykiss, Salmo salar, protein, SDS-PAGE, Bradford
GİRİŞ
Son yıllarda artan dünya nüfusu, insan beslenmesinde
önemli bir yeri olan hayvansal kökenli protein kaynaklarının
yetersizliğine neden olmakta, bu protein açığını en iyi
derecede ve ucuz bir Ģekilde gidermede yararlanılacak
kaynakların baĢında gün geçtikçe önem kazanan su ürünleri
gelmektedir.(1) Özellikle balık eti beslenme değeri ve protein
(2)
kalitesi bakımından mükemmel bir besindir.
GökkuĢağı alabalığı ve atlantik somonu Salmonidler
arasında en önemli kültür balıklarıdır.(3) GökkuĢağı alabalığı,
dünyanın birçok ülkesinde olduğu gibi ülkemizde de ilk ele
alınan ve 1970’li yıllardan beri yetiĢtiriciliği baĢarılı bir
(4)
Ģekilde uygulanan bir balık türüdür.
Yine Salmonidae
familyasında bulunan somon (Salmo salar) ise 1970'li
yılların baĢlarında geliĢtirilen çiftlikte balık yetiĢtirme
teknolojisi sayesinde özellikle Norveç ve Ġskoçya'da ciddi
miktarlarda üretilmeye baĢlanmıĢtır.
Ülkemizin, taze ve dondurulmuĢ balık ithalatı, 1993’te 5,3
milyon ton olup, bu ithalatın büyük bir kısmını somon,
(5)
bakalorya ve sardalya balıkları oluĢturmaktadır.
Balık
etinin yapısı balık türleri, yaĢları, türler arasındaki büyüklük
farkları, yağ içerikleri ve proteinlerinin özellik ve miktarları
gibi bir çok faktör tarafından etkilenmektedir.(6)
Bu çalıĢmada, ülkemizde yetiĢtirilen alabalık (Oncorhynchus
mykiss) ile aynı familyadan olan ve Norveç’ten ithal edilen
Atlantik somonunun (Salmo salar) sodyum dodesil sülfat
poli-akrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemiyle
protein profilleri ve protein yoğunlukları araĢtırılmıĢtır. Ayrıca
Bradford yöntemi ile toplam protein miktarları karĢılaĢtırılmıĢtır.
Materyal ve Metod
Bu araĢtırmada materyal olarak Isparta civarında üretimi
yapılan gökkuĢağı alabalığı ile aynı familyadan olan ticari
olarak satılan ve ülkemize dondurulmuĢ olarak gelen Norveç
somonu kullanılmıĢtır. Balıklar soğukta muhafaza edilerek
laboratuara getirilmiĢ ve -20°C de muhafaza edilmiĢtir.
Balıkların genel protein bant profillerini incelemek ayrıca
aynı familyadan olan somon ve gökkuĢağı alabalığının
protein profillerinde benzerlik ve farklılıkları ortaya koymak
için sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi
(SDS-PAGE) kullanılmıĢtır. ÇalıĢmada BioRad marka mini
Süleyman Demirel Üniversitesi Yaşam Dergisi 2010;2(2):01-03
8
vertikal sodyum dodesil sülfat (SDS)-polyakrilamid jel
elektroforezi (PAGE) cihazı kullanılmıĢtır.
Standart BSA Çözeltisi Derişim Serisi
Protein Ekstraksiyonu
2. 75 μg/mL BSA çözeltisine 2 mL bradford çözeltisi.
SDS-PAGE’de kullanılacak olan örnekler önce ekstrakte
edilip proteinlerine ayrılmıĢ ve jellere bu ekstrakt enjekte
edilmiĢtir. Ekstraksiyon iĢlemi Dyer ve ark., nın yöntemine
(7)
göre yapılmıĢtır. Bunun için 10 gr balık örneği tartılıp
üzerine % 10’luk sodyum dodesil sülfat (SDS), % 1’lik 2merkaptoethanol ve 1 M Tris-HCl ilave edilip, sonikatör
yardımıyla homojenize edilmiĢtir. Ardından 1 gece -20 °C de
bekletilmiĢtir. Ekstrakte edilen örnekler daha sonra 5000
rpm de 4 °C’de 20 dakika soğutmalı santrifüj ile santrifüj
edilmiĢtir. Üstte kalan süpernatant alınarak aynı Ģekilde
santrifüj iĢlemi tekrarlanmıĢtır.
3. 50 μg/mL BSA çözeltisine 2 mL bradford çözeltisi.
1. 100 μg/mL BSA çözeltisine 2 mL bradford çözeltisi.
4. 25 μg/mL BSA çözeltisine 2 mL bradford çözeltisi.
5. 12,5 μg/mL BSA çözeltisine 2 mlL bradford çözeltisi.
Örnekler 1 mL protein ekstraksiyonu + 2 mL bradford
çözeltisi ilave edilerek spektrofotometrede 595 nm’de
ölçülmüĢtür.
BSA standardına ait kalibrasyon grafiği
0,24
Elektroforez İşlemi
Absorbans (595 nm)
Elektroforez iĢlemi Laemmli’nin metoduna göre % 10’luk
(8)
polyakrilamid jel ile yapılmıĢtır. Bu amaçla % 10’luk ayırma
jeli % 5’lik yığma jeli hazırlanmıĢtır. Elektroforez iĢlemi 100
V ile 2 saat yürütülmüĢtür. Ayrıca jel boyama iĢlemi Porzio
(9)
ve Pearson’ın yöntemine göre gerçekleĢtirilmiĢtir. Jel, %
3.5’luk perklorik asit içinde 2 saat yıkanıp daha sonra yine %
3.5’luk perklorik asit içinde % 0.04 Coomassie Blue R–250
çözülerek hazırlanan boya ile boyanmıĢtır. Jelde dağılım
gösteren proteinlerin molekül ağırlıklarının hesaplanmasında molekül ağırlıkları bilinen standart proteinler ile
molekül ağırlıkları bilinmeyen örnek proteinler tamamen aynı
Ģartlarda ve aynı jel konsantrasyonunda elektroforez
iĢlemine tabii tutulmuĢtur. Proteinlerin moleküler kütlesini
belirlemek için myosin (192,775 kDa), β-galaktosidaz
(117,905 kDa), bovin serum albumin (99,261 kDa), ovalalbumin (54,145 kDa), karbonik anhidraz (37,783 kDa),
soybean tripsin inhibitör (29,460 kDa), lysozim (20,198 kDa)
ve aprotinin (7,441 kDa) içeren SDS-PAGE standardı
(BioRad-161-0318) kullanılmıĢtır. Jel biolab uvi-tec marka
görüntüleme cihazi ile görüntülenmiĢtir.
y = 0,0012x + 0,1153
R2 = 0,9981
0,22
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0
20
40
60
80
100
120
Konsantrasyon ppm (µg/ml)
Grafik 1. BSA standardına ait kalibrasyon grafiği
Bulgular
Oncorhynchus mykiss ve Salmo salar balık türlerinin protein
bant içerikleri ġekil 1’de, toplam protein miktarları ise Tablo
1’de görülmektedir.
Bradford Yöntemi ile Protein Miktarının Tayini
Bradford yöntemi Coomasie brillant blue R-250 boyasının
farklı konsantrasyonlardaki proteinlere bağlanarak, değiĢik
renk Ģiddetinde mavi renkli çözeltiler ortaya koymasından
(10)
yararlanılarak geliĢtirilmiĢtir.
Mavi rengin oluĢmasında
proteinin aminoasit bileĢimi önemlidir. Boyanın özellikle
arjinin gibi bazik amino asitlere ve bazı aromatik amino
asitlere bağlanma eğiliminde olduğu gösterilmiĢtir.
Dolayısıyla bu yöntemde proteinin primer yapısının önemi
vardır. Yöntemde boyaya bağlanmıĢ protein 595 nm dalga
boyunda maksimum absorbans verir.
Bradford Testi İçin Standart Eğrinin Hazırlanması
1 mg/mL standart bovine serum albumin (BSA) % 0,9’luk
NaCl içinde çözülerek hazırlanmıĢtır. Bradford çözeltisi; 25
mg Coomasie brillant blue G–250, 12.5 mL % 95 etanolde
çözündürülüp, 25 mL % 85 fosforik asit (H3PO4) eklenir. Bu
boya çözeltisi 250 mL’ye tamamlanır. Kullanılacağı zaman 5
kere sulandırılır. Whatman no.1 filtreden geçirilirek cam
ĢiĢede oda sıcaklığında saklanır (Grafik 1).
Şekil 1. Oncorhynchus mykiss ve Salmo salar balık türlerine
ait protein profillerinin molekül ağırlıklarına göre dağılımı.
M: Marker, A: Alabalık (Oncorhynchus mykiss), S: Somon
(Salmo salar).
Süleyman Demirel Üniversitesi Yaşam Dergisi 2010;2(2):01-03
Tablo 1. Bradford yöntemine göre her iki balık türünün toplam
protein miktarları.
Balık Türleri
Onchorhyncus mykiss
Salmo salar
21.98
31.78
Protein (%)
TARTIŞMA ve SONUÇ
Protein bant profillerine göre Salmo salar’ın Oncorhynchus
mykiss’e göre daha yoğun protein bantlarına sahip olduğu
tespit edilmiĢtir. 99 kDa’luk büyüklükte Salmo salar 2 bant
sergilerken Oncorhynchus mykiss’te bu bantlar görülmemiĢtir. 54 ve 35 kDa’luk büyüklüklerde somon (Salmo salar)
daha yoğun bir bant sergilerken GökkuĢağı alabalığında
(Oncorhynchus mykiss) bu bantlar daha az görülmektedir.
32, 25 ve 20 kDa’luk büyüklüklerde GökkuĢağı alabalığında
(Oncorhynchus mykiss) var olan bantlar somon (Salmo
salar)’da görülmemiĢtir.
Bradford yöntemine göre toplam protein miktarlarına
bakıldığında somon (Salmo salar) % 31,78 gr toplam protein
içerirken GökkuĢağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) %
21,98 gr toplam protein içerdiği belirlenmiĢtir.(10)
Balık etindeki protein miktarı % 15-20, karbonhidrat miktarı
ise % 1-2 arasında değiĢmektedir. Ayrıca balık eti yağda
eriyen vitaminler ve mineral madde bakımından da
zengindir.(11)
Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDSPAGE) en yaygın olarak kullanılan protein elektroforez
tekniğidir. Bu metodda, örnek hazırlama tamponuna bir
miktar anyonik bir deterjan olan SDS eklenir. SDS, örnekteki
protein moleküllerinin etrafında boĢluk kalmayacak Ģekilde
bir katman oluĢturur. Sonuçta her molekül, homojen bir
Ģekilde, (-) yükle kaplanmıĢ olur. Poliakrilamid, polimerizasyondan önce akrilamid içeriği değiĢtirilerek porozitesi
kolaylıkla değiĢtirilebilen inert bir destek materyalidir.
Elektroforetik ayırmada sadece etkin moleküller kütleye
bağlıdır ve jeldeki moleküler elek doğrultusunda ayrıĢma
gerçekleĢir. Bu yöntem daha çok proteinlerin molekül
ağırlıklarının saptanmasında, protein saflığının kontrolünde,
proteinleri fraksiyonlamada, saf proteinin alt yapısının
(12,13)
incelenmesinde kullanılmaktadır.
Michalezyk ve Surowka’nın çalıĢmasında alabalık filetoları
üzerine tuz ve Ģeker karıĢımının serpilmesiyle oluĢturulan
gravad balık ürününün soğukta muhafazası sırasında
proteinlerinde meydana gelen değiĢimler incelenmiĢ ve
saklama koĢulları ile ilgili önerilerde bulunulmuĢtur. (14)
Morzel ve ark. SDS-PAGE yöntemi ile yaptıkları çalıĢmada
Salmo salar filetolarında yoğun protein bantları
(15)
belirlemiĢtir.
Fagan ve ark. farklı zamanlarda atlantik
somonlarının etlerinde yaptıkları SDS-PAGE ile benzer
yoğunlukta protein bantları belirlemiĢlerdir. En önemli
farklılıkları protein profillerinin 30 ve 14.5-kDA bölgelerinde
belirlemiĢlerdir.(16)
9
Sonuç olarak, hem SDS-PAGE hem de Bradford toplam
protein analizi sonuçları Salmo salar’ın Oncorhynchus
mykiss’ten daha fazla ve daha çeĢitli protein profili
sergilediğini göstermektedir.
KAYNAKLAR
1. AngiĢ S, Oğuzhan P, Atamanalp M. Soğuk TütsülenmiĢ ve
Mangalda PiĢirilmiĢ GökkuĢağı Alabalığı (Oncorhynchus
mykiss)’nda Duyusal Kalite Kriterlerinin KarĢılaĢtırılması. E.Ü.
Su Ürünleri Dergisi, 2006;23(1/3):337-8.
2. Aslan E. KızartılmıĢ ve TütsülenmiĢ Tilapia (Oreochromis
niloticus)’ların Duyusal Analizi. Fen Bil. Enst, Çukurova Üniv,
1999;20.
3. Krogdahl A, Sundby A, Olli JJ. Atlantic salmon (Salmo salar)
and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) digest and
metabolize nutrients differently. Effects of water salinity and
dietary starch level. 2004;229:335-60.
4. Korkmaz K. Selenometiyonin katkılı yem ile beslenen
gökkuĢağı alabalığının (Oncorhynchus mykiss) buzda
depolanması esnasında protein kalitesi ve lipit oksidasyonunda
meydana gelen değiĢimler. Fen Bil. Enst, Çukurova Üniv, 2007;
37s.
5. DPT, Sekizinci BeĢ Yıllık Kalkınma Planı: Su Ürünleri ve Su
Ürünleri Sanayi Özel Ġhtisas Komisyonu Raporu, 2001:142.
6. Hultmann L, Rustad T. Iced storage of Atlantic salmon (Salmo
salar) - effects on endogenous enzymes and their impact on
muscle proteins and texture. Food Chemistry, 2004;87:31-41.
7. Dyer WJ, Fench HV, Snow JM. Proteins in fish muscle. 1.
Extraction of protein fraction in fresh fish. Journal of Fisheries
Research Board of Canada, 1950;7:585.
8. Laemmli UK. Cleavage of stuctural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.
1970;277:680-5.
9. Porzio, M.A., Pearson, A.M. Improved resolution of myofibrillar
proteins with sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta, 1977;409(1):27-34
10. Bradford M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation
of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of
Protein-Dye Binding. Anal Biochem.1976;72:248-54.
11. Anonim. Sofradaki dost balık, BroĢür. Tarım ve KöyiĢleri
Bakanlığı Koruma ve Kontrol Gen. Müd. Yay, 2001;6.
12. Ünlüsayın M, Erdilal L, Çağatay T. Balık proteinlerinin
saflaĢtırılmasında kullanılan son yöntemler. Journal of Fisheries
Sciences. 2009;3(4):298-309.
13. Janson JC, Ryden L. Protein Purification-Principles, High
Resolution Methods and Applications. Wiley-VCH, New York.
1998;695.
14. Michalezyk M., Surowka K. Changes in protein fractions of
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) gravads during
production and storage. Food Chemistry. 2007;104:1006-13.
15. Morzel M, Fransen NG, Arendt EK. Defined starter cultures
used for fermentation of salmon fillets. J. Food Sci.
1997;62:1214-7,1230.
16. Fagan MS, Ring NO, Ryan R, Cotter D, Whelan K, Evilly UM. A
biochemical study of mucus lysozyme, proteins and plasma
thyroxine of Atlantic salmon (Salmo salar) during smoltification.
Aquaculture. 2002;222:287-300.
Yazarla İletişim Adresi
Serdal ÖĞÜT
Süleyman Demirel Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi,
Gıda Mühendisliği Bölümü-Isparta
[email protected], [email protected]