tc istanbul üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü danışman doç.dr

advertisement
T.C.
ĐSTANBUL ÜNĐVERSĐTESĐ
SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
( YÜKSEK LĐSANS TEZĐ )
K562 HÜCRELERĐNDE DOKSORUBĐSĐNE KARŞI
GELĐŞEN DĐRENCE NĐTRĐK OKSĐTĐN ETKĐSĐ
SĐBEL ÜLKÜ
DANIŞMAN
DOÇ.DR. LEMAN YALÇINTEPE GÜNEŞTUTAR
BĐYOFĐZĐK ANABĐLĐM DALI
BĐYOFĐZĐK PROGRAMI
ĐSTANBUL-2014
ii
TEZ ONAYI
iii
BEYAN
Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına
kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri
akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün
bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine
aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici
bir davranışımın olmadığı beyan ederim.
iv
ĐTHAF
Sevgili eşime, değerli aileme ve tüm dostlarıma ithaf ediyorum.
v
TEŞEKKÜR
Bu tez çalışmasının yürütülmesinde mesleki bilgi ve birikimleri ile sonsuz
desteğini esirgemeyen ve beni aydınlatan Biyofizik Anabilim Dalı öğretim üyelerinden
başta tez danışmanım Sayın Doç. Dr. Leman Yalçıntepe Güneştutar‘a ve yüksek lisans
eğitimim boyunca beni destekleyen Đstanbul Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı
başkanı Sayın Prof. Dr. Rüstem Nurten’e teşekkürlerimi sunarım. Bu süreçte birlikte
olmaktan büyük mutluluk duyduğum tüm Biyofizik Anabilim Dalı çalışanlarına ve
Đstanbul Üniversitesi DETAE Đmmunoloji A.D. Akım Sitometri Laboratuarından Sayın
Abdullah Yılmaz’a teşekkür ederim.
Bu çalışma, Đstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından
desteklenmiştir. Proje No:31613
vi
ĐÇĐNDEKĐLER
TEZ ONAYI .................................................................................................................... ĐĐ
BEYAN........................................................................................................................... ĐĐĐ
ĐTHAF.............................................................................................................................ĐV
TEŞEKKÜR..................................................................................................................... V
ĐÇĐNDEKĐLER ...............................................................................................................VĐ
1. TABLOLAR LĐSTESĐ................................................................................................ĐX
ŞEKĐLLER LĐSTESĐ ....................................................................................................... X
SEMBOLLER / KISALTMALAR LĐSTESĐ .................................................................XĐ
ÖZET ............................................................................................................................ XĐĐ
ABSTRACT................................................................................................................. XĐĐĐ
1.GĐRĐŞ VE AMAÇ.......................................................................................................... 1
2. GENEL BĐLGĐLER ...................................................................................................... 3
2.1. Kanser ........................................................................................................................ 3
2.2. Kanser Hücre Bölünmesi ........................................................................................... 4
2.3. Hücre Siklusu ve Kanser............................................................................................ 4
2.4. Apoptoz...................................................................................................................... 6
2.4.1. Apoptoz Mekanizması ............................................................................................ 7
2.5. Antikanser Đlaçların Sınıflandırılması........................................................................ 8
2.5.1. Alkilleyici Ajanlar .................................................................................................. 8
2.5.2. Antimetabolitler ...................................................................................................... 8
2.5.3. Bitkisel Alkaloidler ................................................................................................. 9
2.5.4. Hormonlar ve Hormon Antagonistleri .................................................................... 9
2.5.5. Sitotoksik Antibiyotikler......................................................................................... 9
2.5.6. Topoizomeraz Đnhibitörleri ................................................................................... 10
2.5.7. Protein Kinaz Đnhibitörleri .................................................................................... 11
2.5.8. Diğer bileşikler ..................................................................................................... 11
2.6. Antikanser Đlaçların etki Mekanizmaları…………………………………………..11
2.7. Kanser Hücresinin Geliştirdiği Direnç Mekanizmaları ........................................... 12
2.7.1. P-glikoprotein (P-gp, ABCB1) ............................................................................. 15
2.8. Nitrik Oksit (Endotel Kaynaklı Gevşetici Faktör) ................................................... 18
vii
2.8.1. Nitrik Oksitin Etki Mekanizması .......................................................................... 21
2.8.2. Nitrik Oksit ve Kanser .......................................................................................... 22
3. GEREÇ VE YÖNTEM ............................................................................................... 24
3.1. GEREÇLER............................................................................................................. 24
3.1.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler ........................................................... 24
3.1.2. Çalışmada Kullanılan Kitler ................................................................................. 24
3.1.3. Çalışmada Kullanılan Cihazlar ............................................................................. 24
3.1.4. Çalışmada Kullanılan Çözeltiler ........................................................................... 25
3.2. YÖNTEMLER ......................................................................................................... 26
3.2.1. Hücre Kültür Çalışmaları ...................................................................................... 26
3.2.2. Hücrelerin Dondurulması ve Çözülmesi............................................................... 26
3.2.3. Sitotoksisite deneyi ............................................................................................... 26
3.2.4. Hücrelerin Doksorubisin ile Muamele Edilmesi .................................................. 27
3.2.5. K562S ve K562D Hücrelerin Antikorlar ile Boyanması ...................................... 27
3.2.6. K562S ve K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Floresan
Mikroskop ile Görüntülenmesi ................................................................................... 28
3.2.7. K562S ve K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Spektroflorimetre
ile Belirlenmesi ............................................................................................................... 28
3.2.8. K562S ve K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Akım Sitometre ile
Belirlenmesi .................................................................................................................... 28
3.2.9. K562S ve K562D Hücrelerinde Doksorubusin Varlığında Apoptoz.................... 28
3.2.10. K562S ve K562D Hücrelerinde NO Vericisi (SNAP) Varlığında Apoptoz..... 29
4. BULGULAR............................................................................................................... 30
4.1. Doksorubisinin Doz Bağımlı Sitotoksik Etkisi........................................................ 30
4.2. K562D Hücrelerinin Verapamil Varlığında ve Yokluğunda Rho123 …………….31
ile Boyanması ................................................................................................................. 31
4.3. K562S ve K562D Hücrelerin P-GP, CD38, CD34 ve MRP-1 Yüzey Belirteçleri .. 33
ile Boyanması ................................................................................................................. 33
4.4. K562S ve K562D Hücrelerin P-gp, CD38, CD34 ve MRP-1 Yüzey Belirteçleri ... 35
ile Karşılaştırılmalı Boyanması ...................................................................................... 35
4.5. K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Spektroflorimetre ile ............. 36
Belirlenmesi .................................................................................................................... 36
4.6. K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Akım Sitometresi ile ............. 37
viii
Belirlenmesi .................................................................................................................... 37
4.7. K562S Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Akım Sitometresi ile.............. 38
Belirlenmesi .................................................................................................................... 38
4.8. K562S ve K562D Hücrelerinin NO Varlığında Apoptoz Analizleri ....................... 39
4.9. K562D Hücrelerinin NO, Doksorusin ve Verapamil Varlığında Akım .................. 40
Sitometre ile Apoptoz Analizleri .................................................................................... 40
4.10. K562S Hücrelerinin NO Varlığında Akım Sitometre ile Apoptoz Analizleri ...... 41
5. TARTIŞMA ................................................................................................................ 42
KAYNAKLAR ............................................................................................................... 46
ÖZGEÇMĐŞ .................................................................................................................... 52
ix
1. TABLOLAR LĐSTESĐ
TABLO 2-1. NO SENTEZLEYEN ENZĐM ĐZOFORMLARI . .................................... 20
TABLO 3-2. DOKSORUBĐSĐNE KARŞI DĐRENCĐN GELĐŞTĐĞĐ DOZ DEĞERLERĐ
........................................................................................................................................ 27
x
ŞEKĐLLER LĐSTESĐ
ŞEKĐL 2-1. DOKSORUBĐSĐNĐN MOLEKÜLER YAPISI. .......................................... 10
ŞEKĐL 2-2. ĐLAÇ DĐRENÇ MEKANĐZMALARININ BAZILARI.............................. 13
ŞEKĐL 2-3. ĐLAÇ DĐRENCĐNĐN TEMEL MOLEKÜLER MEKANĐZMALARI ........ 14
ŞEKĐL 2-4. P-GLĐKOPROTEĐN POMPASININ YAPISI ............................................ 15
ŞEKĐL 2-5. P-GP POMPASI VE ĐNHĐBĐTÖRLERĐNĐN AKTĐVĐTESĐ ...................... 17
ŞEKĐL 2-6. L-ARJĐNĐN-NĐTRĐK OKSĐT YOLU ......................................................... 18
ŞEKĐL 2-7. NĐTRĐK OKSĐT (NO) KAYNAKLARI VE OLUŞUMU . ........................ 19
ŞEKĐL 4-1. MTT TESTĐ. ............................................................................................... 30
ŞEKĐL 4-2. K562D HÜCRELERĐNĐN RHO123 VARLIĞINDA IŞIK VE FLORESAN
MĐKROSKOBU GÖRÜNTÜLERĐ. ............................................................................... 32
ŞEKĐL 4-3. K562D HÜCRELERĐNDE P-GP, CD34, CD38 VE MRP-1 YÜZEY
BELĐRTEÇLERĐ ĐLE BOYANMIŞ HÜCRELERĐN AKIM SĐTOMETRESĐ
GÖRÜNTÜLERĐ. ........................................................................................................... 33
ŞEKĐL 4-4. K562D HÜCRELERĐNDE P-GP, CD34, CD38 VE MRP-1 YÜZEY
BELĐRTEÇLERĐNĐN KARŞILAŞTIRMALI GÖRÜNTÜLERĐ................................... 35
ŞEKĐL 4-5. K562D HÜCRELERĐNDE VERAPAMĐL VARLIĞINDA (■) VE
YOKLUĞUNDA (♦) RODAMĐNĐN HÜCRE DIŞINA SIZMASININ
SPEKTROFLORĐMETRĐK ÖLÇÜMLERĐ. .................................................................. 36
ŞEKĐL 4-6. K562D HÜCRELERĐNĐN RODAMĐN VE VERAPAMĐL VARLIĞINDA
ĐNKÜBASYONLARI SONRASINDAKĐ AKIM SĐTOMETRĐ ANALĐZLERĐ. .......... 37
ŞEKĐL 4-7. K562S HÜCRELERĐNĐN RODAMĐN VE VERAPAMĐL VARLIĞINDA
ĐNKÜBASYONLARI..................................................................................................... 38
ŞEKĐL 4-8. K562 S VEK562 D HÜCRELERĐNĐN NO VARLIĞINDA APOPTOZ
GÖRÜNTÜLERĐ. ........................................................................................................... 39
ŞEKĐL 4-9. K562D HÜCRELERĐNĐN NO, DOKSORUBĐSĐN VE VERAPAMĐL
VARLIĞINDA APOPTOZ GÖRÜNTÜLERĐ. . ............................................................ 40
ŞEKĐL 4-10. K562S HÜCRELERĐNĐN NO, DOKSORUBĐSĐN VE VERAPAMĐL
VARLIĞINDA APOPTOZ GÖRÜNTÜLERĐ. . ............................................................ 41
xi
SEMBOLLER / KISALTMALAR LĐSTESĐ
NO
Nitrik Oksit
KML
Kronik Miyeloid Lösemi
K562S
Doksorubisine duyarlı eritro lösemi hücre soyu
K562D
Doksorubisine dirençli eritro lösemi hücre soyu
SNAP
S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine
eNOS
Endotelyal nitrik oksit sentaz
iNOS
Đndüklenebilen nitrik oksit sentaz
nNOS
Nöronal nitrik oksit sentaz
P-gp
P Glikoprotein
MRP
Çoklu ilaç direnciyle ilişkili protein
DNA
Deoksiribonükleik asit
RNA
Ribonükleikasit
ATP
Adenozintrifosfat
ADP
Adenozindifosfat
GTP
Guanozintrifosfat
sGMP
Siklik guanozin monofosfat
TNFα
Tümör nekroz faktör alfa
VEGF
Vasküler endotelial büyüme faktör
KT
Kemoterapi
RT
Radyoterapi
pmol
Pikomol
nmol
Nanomol
Rho 123
Rodamin 123
GST
Glutatyon-S-transferaz
xii
ÖZET
Ülkü, S. K562 Hücrelerinde Doksorubisine Karşı Gelişen Dirence Nitrik Oksitin
Etkisi, Đstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik Anabilim Dalı.
Yüksek Lisans Tezi. Đstanbul. 2013
Hematoljik kanserlerde antikanser ilaçların kullanımı hala en etkili tedavi
yöntemidir. Ancak tedavi sırasında hastalık tekrarlayabilmektedir. Tedaviye henüz dahil
edilmemiş ilaçlara karşı çapraz direnç gelişebilmektedir. Bir kısım kemoterapötik ilaçlar
bazı kanser hücrelerinde olumlu sonuç verirken diğer kanser hücrelerinde etkileri sınırlı
kalabilir. Bu nedenle farklı sitotoksik maddelerin, farklı hücrelerdeki etkilerinin tam
olarak aydınlatılması oldukça önemlidir. ABC taşıyıcı protein ailesi, apoptozun
(programlı hücre ölümü) baskılanması, çoğalmanın artması, ilaç hedef etkileşimindeki
değişiklikler, ilaç inaktivasyonu gibi sebepler sitotoksik ajanlara karşı direncin
gelişimine sebep olmuştur. Apoptozdaki bozukluklar kanser hücrelerinin sayısının
artmasıyla sonuçlanabilir.
Nitrik oksitin (NO) kanser biyolojisinde özellikle kanser metastaz (yayılma),
hücre ölümü, neovaskülarizasyon (yeni damarlanma) ve immun cevabın başlamasını da
içeren birçok olayda etkili olabileceği görülmüştür. Artmış NO üretiminin hücrelerde
kanser gelişiminde rol oynadığı bilinmektedir. NO vericiler ile NO’e maruz kalmak,
bazı antikanser ilaçların aktivitelerinide düzenlemektedir. Doksorubisine karşı direnç
gelişmesi ile artan P-glikoprotein anlatımına bağlı olarak K562D (dirençli) ve K562S
(duyarlı) hücrelerde, doksorubisinin hücre dışına salınım ve hücre içinde tutulumu
kinetiklerini gösteren çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmada ise P-gp (P-glikoprotein)
substratı olarak Rho123 (Rodamin123) ve P-gp kanalının inhibitörü olarak verapamil
kullanıldı. NO’in ilaç direnci üzerine etkisinin belirlenmesi amacı ile NO vericisi olarak
SNAP varlığında akım sitometresi ile apoptoz analizleri yapıldı. Yapılan analizler
sonucunda K562S hücrelerin apoptoz değerleri, K562D hücrelerin apoptoz değerleri ile
karşılaştırıldı. K562D hücrelerinde SNAP varlığında ortalama apoptoz değerlerinin
gerilediği gösterilmiştir.
Anahtar Kelimeler: K-562, doksorubisin, P-gp, apoptoz, NO vericisi (SNAP)
Bu çalışma, Đstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından
desteklenmiştir. Proje No: 31613
xiii
ABSTRACT
Ülkü S. Effect of Nitric Oxide for emerging resistance against doxorubicin
in K562 cells. Đstanbul University, Đnstitute of Health Science, Depatment of
Biophysics. Master Thesis. Đstanbul. 2013
In hematologic cancers use of anticancer drugs is still most effective method of therapy.
However, disease may recur after treatment. Cross - resistance can develop against
drugs
which aren’t yet included in treatment. Some chemotherapeutic drugs give
positive results in some cancer cells while their action may be limited in other cancer
cells. Therefore, complete elucidation of distinct cytotoxic substances in different cells
is considerably significant. ABC transporter protein family, suppresion of apoptosis
(programmed cell death), increase of proliferation, changes in drug-target interactions,
drug inactivation have caused resistance to cytotoxic agents. Defects in apoptosis may
result in increase of cancer cells number. It’s known that nitric oxide (NO) play
important role in cancer biology, particularly many events including cancer metastasis,
cell death, neovascularization and also initiation of immune response. Increased NO
production in cells is known to play a role in cancer development. In K562D (resistant)
and K562S (sensitive) cells, studies that shown doxorubicin efflux kinetics in relation to
increasing p-gp expression with emergence of doxorubicin resistance were done. In this
study, as a p-gp substrate rho 123 (rhodamine dye) and as a p-gp channel inhibitor
verapamil were used. With the goal of determining NO effect on drug resistance
apoptosis analyses by flow cytometry were done in the presence of SNAP as a NO
donor. As a result of these analyses, apoptosis values of K562S cells were compared
with apoptosis values of K562D cells. Average apoptosis values have been shown to
decrease in K562D cells in the presence of SNAP.
Keywords: K-562, doxorubisin, P-gp, apoptosis, NO donor (SNAP)
The present work was supported by the Research Fund of Đstanbul University,
Project No: 31613
1.GĐRĐŞ VE AMAÇ
Kanser, ölüm nedeni olarak kalp ve damar hastalıklarının hemen ardından
gelmesiyle, önemi giderek artan bir sağlık ve yaşam sorunu olmuştur. Yüzyılın
başlarında ölüme neden olan hastalıklar sıralamasında yaklaşık yedinci sıralarda yer
alırken bugün birçok ülkede kardiyovasküler hastalıklardan sonra ikinci sırada
bulunmaktadır. Günümüzde ise her 5 ölümden biri kanserden olmaktadır. Ülkemizde
en sık görülen kanserler erkeklerde bronş ve akciğer, prostat, mesane, deri, mide ve
kalın barsak; kadınlarda meme, tiroid, deri, kalın barsak, akciğer, mide ve pankreas
kanserleri olarak sıralanabilir.
Antikanser tedavinin amacı primer tümörleri büzüştürerek küçültmek, tümör
gelişiminin ilerlemesini yavaşlatmak, primer tümör sahasından vücudun diğer
bölümlerine metastaz yapmış kanser hücrelerini yok etmek ve bazen de semptomları
rahatlatmaktır. Đdeal bir tedavinin amacı kötü huylu hücrelerin selektif bir biçimde
öldürülmesi olmasına rağmen, normal ve kötü huylu hücreler arasındaki ayrım pek net
olmadığı için bu tür bir selektif toksisite sağlamak zordur. Bu nedenle antikanser ilaçlar
tüm çoğalan hücreler için toksiktir. Dahası pek çok antikanser ilacın büyük ölçüde
immunosupresif (antikor oluşumunu baskılayan) etkinliği vardır ve daha sonrasında
tümöre immün yanıtı inhibe etmektedir. Bazı tümörler en başta ilaç tedavisine duyarlı
olabilirken tümörler genelde heterojen hücre toplulukları içerdiklerinden seleksiyon
dirençli bir alt grubun doğmasına yol açabilir. Kemoterapiye karşı gelişen dirençlilik
pek çok antikanser ilacın hastalar üzerinde beklenen etkisini gösterememesine ve
hastalığın ilerlemesine neden olmaktadır. Artırılan ilaç dozları ise hastalarda görülen
yan etkilerin artmasına sebep olmaktadır. Ayrıca, dirençlilik nedeniyle zaman ve ilaç
kaybı olmakta, hastaların tedavisi zorlaşmaktadır. Đlaç direnci, özellikle antikanser
ilacın uygulanması sonrası çoklu ilaç direncinden sorumlu proteinlerin aşırı anlatımı
sonucu gelişmektedir (1). Son zamanlarda tedavi sırasında çapraz direnç geliştiği
gösterilmiş olup tüm bunlar tedavideki başarı oranını düşürmektedir.
Hematolojik
malignitelerde de gözlenen bu çoklu ilaç direnci (MDR); hücre içi ilaç birikiminde
azalma (ilacın hücre içine girişinde azalma veya hücre dışına atma işlevinde artış), ilaçhedef ilişkisinde azalma, DNA hasarının onarımında artış, apoptoza giriş kapasitesinde
azalma veya detoksifikasyon işlevinde artış şeklinde gözlenebilmektedir (2).
2
Antikanser
tedavide
sıklıkla
kullanılan
ilaçların
pek
çoğu
DNA
(deoksiribonükleik asit) ve RNA (ribonükleik asit) sentezini bozarak etki etmektedir.
Antrasiklin türevi antibiyotik olan doksorubisin kanser kemoterapisinde kullanılan ve
grubunun ilk bulunan antikanser üyesidir. Doksorubisinin etki mekanizması karmaşık
ve hâlâ tamamen anlaşılmamış olmakla beraber doksorubisinin enterkalasyon yoluyla
etkileşip
DNA’nın
biyosentezini engellediği bilinmektedir
(3).
Doksorubisin,
topoizomerazın DNA'yı kesmesinin ardından meydana gelen topoizomeraz-DNA
kompleksini stabilize ederek, DNA ikili sarmalının tekrar birleşmesini engeller ve
böylece DNA çiftleşmesini durdurur. Doksorubisinin hem P-gp hem de çoklu ilaç
direnciyle ilişkili protein (MRP) substratı olması sebebiyle kanser tedavisi sırasında
etkisi azalmaktadır.
NO birçok farklı biyolojik olaylara aracılık yapan biyolojik haberci bir
moleküldür. Hücre büyümesi, konak savunması ve apoptoz da önemli rollere sahiptir.
NO aynı zamanda bir serbest radikaldir. NO DNA’yı hasarlayarak kanser başlangıcı ile
ilişkili olup damar geçirgenliği ve yeni damar oluşumunu arttırır. Son zamanlarda
yapılan çalışmalarda doksorubisin, kolon kanser hücrelerinde indüklenebilir NO sentaz
genlerini regüle ederek çok miktarda NO oluşumuna yol açtığı ve bu oluşan NO’in ise
kolon kanserinde kimyasal duyarlılaştırıcı ve ilaç toksisite mediatörü olarak davrandığı
gösterilmiştir (4) .
Kanser günümüze kadar birçok çalışmanın konusunu oluşturmuştur. Kanserin
daha iyi anlaşılmasına, tanı ve tedavinin geliştirilmesi çalışmalarına ihtiyaç
duyulmaktadır. Bu çalışmanın amacı, bir model hücre soyu olan K562 hücreleri
kullanılarak doksorubisine karşı direnç geliştirmek ve doksorubisin direnci üzerine NO
vericilerinin etkisini araştırmaktır.
3
2. GENEL BĐLGĐLER
2.1. Kanser
Kanser genetik bir hastalıktır. Kanser gelişimi ile ilgili farklı görüşler olmakla
birlikte hücreler karsinogenez (normal bir hücrenin tümör hücresine dönüşmesi)
oluşumunda genetik değişikliklerin ve çevresel faktörlerin etkisiyle çok basamaklı bir
süreç içinde bazı temel özellikler kazanır. Kanser bir organda oluştuktan sonra, uzak
doku ve organlara metastaz (yayılma) dediğimiz yerleşmeler yapar ve genel olarak
hastalar metastazlar nedeniyle kaybedilir. Kanser tedavisinde mortaliteyi azaltmak ve
yaşam süresini artırmak için farklı birçok tedavi yöntemleri kullanılır. Bunlar arasında
cerrahi, radyoterapi, kemoterapi tedavisi ve yeni tedavi yöntemlerinden immunoterapi,
sinyal ileti sistemi inhibitörleri, gen tedavisi ve anjiyogenez inhibitörleri olarak
sayılabilir. Kanser tedavisinde uygulanan kemoterapi, özellikle çoğalan hücrelere karşı
seçici öldürücü etkileri olan doğal veya sentetik kimyasal, biyolojik ilaçlar ve
hormonlarla yapılan tedavi şeklidir. Hücre kinetiği hakkında bilgiler arttıkça yeni ilaçlar
laboratuvarlarda antikanser aktiviteleri açısından araştırılmaya başlanmıştır.
Kanserde kemoterapi, tüm hücrelerdeki hücre siklusu gelişiminin çeşitli
fazlardaki biyolojisi üzerine kurulmuştur. Kanser hücrelerinin verilen ilaca duyarlılığı
genelde onların hücre döngüsü içindeki aşamalarına bağlıdır. Hücre döngüsünden
bağımsız olan ilaçlar ise DNA’ya doğrudan zarar verirler ve etkinlikleri açısından hücre
çoğalmasına bağlı değildirler. Sağlıklı vücut hücreleri de bölünebilme yeteneğine
sahiptirler. Ölen hücrelerin yenilenmesi ve yaralanan dokuların onarılması amacıyla bu
yeteneklerini kullanırlar. Fakat bu yetenekleri sınırlıdır. Sonsuz bölünemezler. Her
hücrenin hayatı boyunca belli bir bölünebilme sayısı vardır. Sağlıklı bir hücre ne zaman
ve nerede bölünebileceğini bilme yeteneğine sahiptir. Buna karşın kanser hücreleri, bu
bilinci kaybeder, kontrolsüz bölünmeye başlar ve çoğalırlar (5).
Kanser hücre toplulukları tümörleri oluştururlar. Eğer kanser hücreleri oluştukları ana
tümörden ayrılırsa kan veya lenf dolaşımı aracılığı ile vücudun diğer bölgelerine gider
ve oralarda da tümör odakları oluştururlar.
4
2.2. Kanser Hücre Bölünmesi
Kanser hücreleri, normal hücreler gibi bölünmelerini durdurmazlar ve sürekli
bölünme halindedir. Kanser hücrelerinin kontrolsüz çoğalımına neden olan ve bunları
normal hücrelerden genel olarak ayıran dört özellik vardır:
1. Sağlıklı hücreler, hücre siklusuna girebilmeleri için dış büyüme faktörlerine
gereksinim duyarlar. Bu faktörler hücrenin etrafında yer alan bazı maddelerdir ve hücre
bölünmesini tetiklerler. Kanser hücreleri ise, bu büyüme faktörlerinden bağımsızdırlar
ve dolayısıyla bölünme işlevleri süreklidir.
2.
Sağlıklı hücreler, diğer
hücrelerle temas kurma noktasına ulaştıklarında
bölünmelerini sınırlandırırlar. Kanser hücreleri ise diğer hücrelerle temas haline gelseler
bile bölünmeye devam ederek gittikçe büyüyen bir hücre topluluğu oluştururlar.
3. Olgun hücrenin her bölünüşünde DNA’nın sonunda bulunan telomer adlı bir yapı
kısalır. Telomer yapısı bittiğinde hücre artık bir daha bölünmez. Genç ve
olgunlaşmamış hücreler telomeraz adı verilen bir enzim taşırlar ki, bu enzim hücre
olgunluğa erişinceye kadar telomer yapısını değiştirir. Olgun hücreler telomeraz
üretimini durdurduktan sonra apoptoz adı verilen programlanmış hücre ölümü
gerçekleştirirler. Diğer taraftan, kanser hücreleri ise telomeraz enzimini üretmeye
devam ederler. Bu da onları apoptoza uğramalarına engel olur.
4. Tüm hücrelerin DNA’ları sürekli olarak yıkıcı etkilere maruz kalmaktadır. Bunlar
arasında güneşten gelen radyasyon, kimyasal maddeler ve diğer hücre atıkları da yer
almaktadır. Normal hücreler çoğu DNA hasarlarını onarabilecek güçte olup DNA’ları
hasar gördüğünde bölünme yeteneklerini kaybeder. Kanser hücreleri ise DNA hasarı ile
sınırlanamazken bölünmeye devam etmeleri yanında aynı zamanda genetik hasarı
sonraki kanser hücre nesillerine geçirirler.
2.3. Hücre Siklusu ve Kanser
Normalde hücreler proliferatif uyaranlara bağlı olarak gerektiğinde bölünebilir.
Kanser hücrelerinde ise mutasyonlar nedeniyle normal hücrelerdeki kontrollü
büyümenin yerini kontrolsüz sınırsız bir büyüme süreci almıştır. Kanserde sıklıkla hücre
siklusu düzenlenmesinde bir hata söz konusudur. Hücre döngüsü biri G2/M geçişi, bir
diğeri S fazı öncesi geç G1 fazınında dahil olduğu noktada ve M kontrol noktasında
olmak üzere farklı düzeylerde denetlenir. Bu denetim noktalarının her birinde, ilişkili
proteinler tarafından siklusun ilerleyip durmasına karar verilir. Bu kararların verilişinin
5
kontrolü, hedef proteinleri selektif fosforile eden bir enzim ailesinden olan protein
kinazlar ve hücre döngüsünün işleyişini kontrol eden siklin adlı proteinler tarafından
yapılır. Đlk kontrol noktası geç G1 fazı olup hücrenin G1 fazını terkedip S fazına
geçebilmesi için DNA’nın hasar görmemesidir. Aksi halde hasar onarılana kadar hücre
bu kontrol noktasında durur. Hasar onarılamayacak düzeyde ise birkaç saat süren G1
noktasındaki bu duruş p53 geninin girmesiyle uzatılır. Hücre döngü kontrolünü
herhangi bir basamakta bozan mutasyonlar kanser hücrelerindeki genetik bozukluğun en
önemli nedenlerinden biridir. Örneğin G1 kontrol noktasında görevli kinazları ya da
siklinleri kodlayan genlerdeki mutasyonların hücrelerin malign dönüşümünde önemli
rol alabileceği düşünülmektedir. G2 fazında tamir mekanizmalarından kaçan hasarlı
DNA veya replike olmamış DNA varsa bu fazda kontrol edilir (6). Ayrıca, tam bir
kromozom takımının yavru hücrelere geçmesini sağlamak üzere kromozomların mitoz
sırasındaki dizilimlerini kontrol eden M kontrol noktası bir diğer önemli kontrol
noktasıdır. Eğer hatalı dizilimle kromozomların tam bir takımının yavru hücrelere
geçişinde bir problem olursa, hata giderilinceye kadar mitoz fazının metafazında siklus
duraksar. Kanser kemoterapisinde kullanılan bazı ilaçlar, ölümcül aktivitelerini tümör
hücrelerinin
büyümelerindeki
belli
dönemlerinde
gösterir.
Mitoz
ve
hücre
bölünmesinden sonra oluşan yeni hücreler, bir dinlenme fazına girerler. Bu faza G0-fazı
adı verilmektedir. Bu fazda geçirilen zaman hem hücrenin tipine, hem de düzenleyici
faktörlere bağlıdır. Kemik iliği, gastrointestinal mukoza ve deri gibi bazı dokularda G0,
hücrenin olgunlaşma durumuna bağlı olarak uzatılabilinmesinin yanı sıra sinir, iskelet
kası gibi dokularda G0 süresi daha uzun olabilmektedir. Katı tümörlerde, hücre kütlesi
büyük olanların, hücre kütlesi küçük olanlara oranla G0 zamanı daha uzundur çünkü
vasküler destek, hücre büyüme hızına yeterince destek olamamaktadır. G0 fazından
sonra dinlenme sonrası faza yani G1-fazına girilmektedir. Bu fazda hücre bölünmesi
(yeni DNA’nın oluşumu), RNA ve diğer proteinlerin oluşumunda gerekli enzimler
üretilir. Daha sonra S-fazı gelmekte olup bu fazda mitoza hazırlık olarak DNA sentezi
aktive edilmektedir. S-fazı süresince DNA çiftleri hücre bölünmesi için hazır durumda
bulunmaktadır. DNA sentezi tamamlandıktan sonra pre-mitotik olarak tanımlanan G2fazına girilir. Bu fazda DNA sentezi dinlenme dönemindedir. Ancak RNA ve protein
sentezleri gerçekleştirilirken diğer metabolik aktivitelerde de yükselme görülmektedir.
Dolayısıyla da hücrenin hacmi artmaktadır. Bu faz, mitotik iplikçiklerin oluşumunda
önemlidir. En sonunda hücre mitoza girer (M-fazı) ve hücre bölünmesi gerçekleşir.
6
2.4. Apoptoz
Ökaryotik organizmadaki hücreler doğarlar, belirli bir süre yaşarlar ve sonra
ölürler. Yaşam süresi hücre tipine göre değişmektedir. Örneğin derinin epidermal
hücreleri 20-25 günlük bir süre sonunda ölürken miyokard kası hücreleri veya nöronlar
ömür boyu yaşarlar. Fakat buna rağmen miyositlerin veya nöronların kabaca % 10-15’i
yaşam sonunda kaybedilmektedir. Bahsedilen bu hücre ölümleri apoptozla gerçekleşir.
Apoptoz kelime anlamı olarak ağaçların yapraklarını dökmesi ile benzeştirilen yaprak
dökme anlamına gelen bir terimdir (7,8). Zamanı gelince ölen bu hücreler
programlanmış bir şekilde ölürler (programlanmış hücre ölümü). Tüm bu ölümler
fizyolojik şartlarda olduğundan fizyolojik hücre ölümü olarak da adlandırılır (9). Her
saniyede yaklaşık 1 milyon hücre apoptoz ile vücuttan uzaklaştırılır. Bunların yerine
yenileri yapılmaktadır. Yapım (mitoz) ile yıkım (apoptoz) arasında kontrollü bir denge
vardır. Đşte bu dengenin apoptoz lehine veya aleyhine bozulması birçok önemli
hastalığın
patogenezine
katkıda
bulunur.
Dengenin
korunması için
apoptoz,
organizmada doğru bir şekilde işlemelidir. Olmaması gerekirken gerçekleşen apoptoz
veya hızlanmış ya da tam tersine yavaşlamış apoptoz organizma için tehlikelidir. AIDS,
nörodejenereratif hastalıklar, insüline bağımlı diyabet, hepatit C infeksiyonu, miyokard
enfarktüsü, ateroskleroz gibi hastalıklar apoptozun gereksiz yere oluştuğu veya
hızlandığı hastalıklara örnek oluştururken; apoptozun yavaşladığı hastalıklara örnek
olarak ise otoimmün hastalıklar ve kanser verilebilir. Kanserli hücrelerde genellikle
apoptoz baskılanır ve böylece tümör dokusu sürekli çoğalma eğilimindedir.
Hücre zarının ya da hücredeki metabolik süreçlerin çok hızlı ve ağır biçimde
hasar gördüğü ve hızla bozulan zar geçirgenliğinin, hücrenin şişmesi ve zarın patlayarak
hücre içi maddelerin dışarı saçılmasıyla sonuçlanan nekrotik süreçten farklı olarak
apoptozda zar bütünlüğü bozulmaz (10). Apoptoz ayrıca, fetusun implantasyonundan
organogenezisine kadar tüm gelişim sürecinde yani embriyogenezde, insanın
embriyolojik gelişiminde; parmak aralarındaki zarın, sinir sisteminde istenmeyen
nöronların ortadan kaldırılmasında, erişkinde hormona bağlı involüsyonda; örneğin
menstrüel siklusta endometriyal hücre yıkımında, menapozal foliküler atrezide,
laktasyonun kesilmesi sonrası memede glanduler regresyonda ve bağışıklık sistemi
hücrelerinin seçimi gibi pek çok olayda rol alır. Ek olarak, yenidoğan timusunun
involusyonu sonucunda T lenfositlerin yaklaşık %98’inin seleksiyona uğradığı
7
bilinmektedir. Ayrıca B hücrelerinde de lenfositlerinin duyarlı olduğu uyaranla yeniden
karşılaşması durumunda hazır bulunmasını sağlamak amacıyla apoptozun baskılandığı
belirtilmektedir. Apoptoz genetik olarak düzenlenir, hatalı ya da hasarlı DNA apoptoz
ile kaldırılamazsa kromozom sayısındaki sabitlenme korunamaz ve anöploidi gibi
istenmeyen durumlar oluşabilir.
2.4.1. Apoptoz Mekanizması
Apoptozun hem temel adımlar hem de uygulayıcı proteinlerdeki özdeş yapılar
açısından birbirine benzeyen genetik bir yolla belirlendiği saptanmıştır. Apoptoz temel
olarak iki yolla başlatılır:
1. Hücre dışından tetiklenen, pozitif (TNF-α varlığı) ya da negatif dışsal yol (büyüme
faktörü yokluğu) 2. Hücre içinde DNA hasarı yada mitokondrial kaynaklı içsel yol.
Mitokondri aracılığıyla düzenlenen hücre içi yol aslında hücre dışı ve hücre içi
etkenlerin ortaklaştığı bir mekanizmadır (11). Apoptozu başlatan yolun mitokondri
olduğu anlaşılmıştır. Apoptoz ya hücre yüzeyindeki ölüm reseptörlerinin aktivasyonuyla
yada öncelikle mitokondride gelişen bir dizi hücresel olaylarla başlatılabilir. Apoptozun
tümörogenez ve kanser tedavisi için önemli olduğu gösterilmiştir. Apoptozdaki aksama
neoplastik hücrelerin sayısının artmasıyla sonuçlanabilir. Mitokondrinin aktivasyonuna
yol açan en önemli faktör Bcl-2 ailesidir. Bcl-2 ailesinin hem proapoptotik hem de
antiapoptotik üyeleri vardır. Bcl-2 ailesinin Bax, Bad, Bid, Bak, Bok, Bcl-Xs üyeleri
apoptozu tetiklerken, Bcl-2 ve Bcl-XL apoptozu inhibe eder. Pro-apoptotik olan üyeler
sitokrom-c’nin mitokondriden sitoplazmaya geçişini indüklerken, anti-apoptotikler
mitokondriden sitokrom-c çıkışını baskılar. Herhangi bir nedenle DNA hasarı
oluştuğunda bu hasara yanıt olarak p53 geni aktiflenir. Bunun sonucunda proapoptotik
Bcl-2 üyesi olan Bax’ın tetiklenmesine yol açarak apoptoz başlar. Bcl-2 ailesi
proteinleri mitokondrial membranın geçirgenliğini değiştirerek etkilerini gösterirler.
Yüksek seviyedeki Bcl-2 ekspresyonu pek çok insan tümörlerinde gözlenen bir
durumdur ve Bcl-2 ekspresyon seviyesi malign tümör gelişimi ile ilişkilidir. Bcl-2’nin
sitotoksik etkenleri TNF-α’nın indüklediği apoptozu bloke ettiği gösterilmiş, Bcl-2
fonksiyonlarının baskılanması apoptozu başlatır. Ayrıca glutatyon S-transferaz (GST)
enziminin baskılanmasının da apoptozu başlattığı ortaya konulmuştur.
8
2.5. Antikanser Đlaçların Sınıflandırılması
Antikanser ilaçların kullanımı, lösemi ve lenfoma gibi yaygın malignitelerin
tedavisinde sıklıkla direnci aşmak veya birbirlerinin etkilerini artırmak amacına yönelik
sık aralıklarla ve yüksek dozlarda verilmektedir. Antikanser ilaçların çoğu özellikle
sitotoksik ilaçlar, hücre biyolojisinde yalnızca hücre bölünmesini etkilemektedir. Çoğu
vakada, antiproliferatif etki, hücre siklusu S fazıyla ilişkili ve DNA düzeyinde başlatılan
apoptoz kaynaklıdır. Ana hedef hücre bölünmesi olduğundan tüm hızlı bölünen hücreler
yani kanser yanında normal dokuları da toksik etkiler. Ayrıca bazen bu ilaçlar kendileri
de karsinojenik olabilirler.
2.5.1. Alkilleyici Ajanlar
Kemoterapötik ve sitotoksik etkiler doğrudan DNA’nın alkillenmesiyle ilgilidir
ve interkromatin çapraz bağlara ve DNA sentezinin bozulmasına neden olur. Diğer
etkiler arasında anormal baz eşleşmesi, DNA transkripsiyonu blokasyonu, DNA zincir
kırıkları ve baz çifti kayıpları sayılabilir. Alkilleyici ajanlar hücre siklusundan bağımsız
ilaçlardır. Alkilleyici ajanlara karşı direnç gelişimi çok yaygın bir durumdur. Sitotoksik
aktiviteye karşı kazanılan bu tür bir direnç en az üç mekanizmayla meydana gelir(12)
1. Yüksek tiyol üretimi ilaçları etkisiz hale getirebilir. 2. Hücre geçirgenliğinin düşük
olması da bir rol oynayabilir. 3. DNA onarım kapasitesinin yüksek olması sitotoksik
aktiviteyi hafifletebilir. Alkilleyici ajanlara örnekler:
Nitrojen Mustard Analogları
Etileniminler
Alkil Sülfonatlar
Nitrosoüreler
2.5.2. Antimetabolitler
Hücre döngüsüne bağımlı ilaçlardır ve S-faza özgüdürler. Etkilerini DNA
sentezi üzerinde gösterirler. Antimetabolitlere örnekler:
Folik Asit Antagonistleri
Purin Antagonistleri
Pirimidin Antagonistleri
9
2.5.3. Bitkisel Alkaloidler
Bunların çoğu mikrotübül fonksiyonlarını ve bundan dolayı mitotik ağları
etkilerler. Bitkisel alkaloidlere örnekler:
Vinka Alkaloidler
Taksanlar
2.5.4. Hormonlar ve Hormon Antagonistleri
En önemlileri glukokortikoidler, östrojenler ve androjenlerdir. Bunların yanı sıra
hormon sekresyonlarını baskılayan veya antagonist hormon etkisi gösteren ilaçlar da
vardır. Hormonlara örnekler:
Glikokortikosteroidler
Östrojenler
Progestojenler
Gonadotropin Salgılatıcı Hormon Analogları
Hormon antagonistlerine örnekler:
Antiöstrojenler
Antiandrojenler
Enzim Đnhibitörleri
2.5.5. Sitotoksik Antibiyotikler
Aktinomisinler: Antitümör özelliği taşıyan ilk antibiyotik Streptomyces
türlerinden izole edilen antimosin A’dır. Bu grubun klinik kullanımında olan en önemli
temsilcisi antinomisin D, başka bir deyişle daktinomisindir.
Antrasiklinler: Antrasiklin antibiyotikler doksorubusin, daunorubisin, epirubisin
ve sentetik ajanlar idarubisin ve mitoksantronu içerir.
Doksorubisin: Doğal ürünler Streptomyces peucetius’dan türetilirler. DNA
interkalasyonuyla DNA replikasyon ve transkripsiyonunun her ikisini de bloke eder.
Esas sitotoksik etkisi çoğalan hücrelerde arttığı belirlenen topoizomeraz II üzerine olan
etkisidir. Topoizomerazların DNA eşleşmesi, kopyalanması ve tamirinde önemli rolleri
vardır. Doksorubisin reaktif oksijen bileşiklerinin oluşumuna yol açarak serbest radikal
hasarı üzerinden de antikanser etki gösterir. Hücre siklusundan bağımsız etkilidir.
10
Şekil 2-1. Doksorubisinin moleküler yapısı.
Antrasiklin türevi antibiyotik olan doksorubisin kanser kemoterapisinde
kullanılan ve grubunun ilk bulunan antikanser üyesidir (Şekil 2-1). Molekülün
düzlemsel kromofor kısmı DNA’ya enterkale olur. Doksorubisinin altı-üyeli
daunosamin şekeri DNA'nın küçük oyuğuna yerleşir ve baz çiftleri ile etkileşir. DNA
replikasyonu ve RNA transkripsiyonunun bozulmasına neden olur(13).
Topoizomerazların DNA eşleşmesi, kopyalanması ve tamirinde önemli rolleri
vardır. Antrasiklinler transkripsiyon sırasında Topoizomeraz II enziminin ilerlemesini
engeller. Ayrıca oksijen serbest radikalleri, hidroksil radikalleri içeren reaktif oksijen
partikülleri oluşturarak DNA, mRNA, protein ve lipid hasarı yaparlar. Oluşan lipid
peroksidasyonu bu ilacın aritmi ve kalp yetmezliği gibi kalp kası toksisitesine yol
açabilir. Bu etki serbest radikallerinin üretimi sonucu olabilir.
Bleomisin:
Streptomyces
verticullus’un
doğal
oluşumlu
fermentasyon
ürünlerinin (Cu+2 ile kompleksli temel glikoprotein) karışımıdır. DNA niteliğini bozarak
zincirin parçalanmasına ve serbest bazların salıverilmesine yol açan metal şelatlayıcı
glikopeptid antibiyotiklerdir. Antibiyotikler arasında hücre döngüsünün G2 fazında
hücrelerin akümülasyonuna neden olur. Ancak bölünmeyen hücreleri de (G0 fazındaki
hücreler) etkiler. Sıklıkla kalıtsal kanserlerin tedavisinde kullanılır.
Mitomisin: Streptomyces caespitosus’dan izole edilen bir antibiyotiktir.
2.5.6. Topoizomeraz Đnhibitörleri
DNA’nın topolojisini değiştiren enzimler sınıfıdır. Çift sarmal helikal yapının
açılması, çoğalması için gerekmektedirler. Zincirin açılmasını ve replikasyonu sağlarlar.
Topoisomeraz I Đnhibitörleri: Tek DNA zincirini kırarlar. ATP den
bağımsızdırlar.
11
Topoisomeraz II Đnhibitörleri: DNA’nın iki zincirini de kırarlar. ATP’ye
bağımlıdırlar.
2.5.7. Protein Kinaz Đnhibitörleri
Bu ilaçlar hızlı bölünen hücrelerde protein kinazı (tirozin kinaz) inhibe ederler.
Đmatinib: Hedefli kemoterapi tedavisinde sinyalleyici yol kinazlarının inhibitörü
olan küçük bir moleküldür. Đlaç oral yoldan verilir. Diğer kinaz inhibitörlere karşı hiç
mevcut olmayan çapraz dirençlere neden olur.
2.5.8. Diğer bileşikler
Adrenokortikal süpresantlar
Biyofosfonatlar
Sitoprotektör (Reaktif parçacık antagonistleri)
Metilhidrazin türevi
Somatostatin analoğu
Sübstitü melamin (heksametil melamin)
Hidroksiüre
2.6. Antikanser Đlaçların Etki Mekanizmaları
Vücutta mutasyona uğrayan hücrelerin ancak çok küçük bir kısmı kansere yol açar.
Bunun birçok nedeni vardır. Mutasyonlu hücrelerin yaşama kabiliyetleri normal
hücrelere göre daha az olup bu nedenle ölürler. Mutasyon gösteren hücrelerin pek
çoğunda bile hâlâ aşırı büyümeyi önleyen normal geridönüm kontrol düzeneği bulunur
(tümör supresör genler-antionkogenler). Bu yüzden yaşayabilen mutant hücrelerin çok
azı kanserli hücreye dönüşür. Bu prekanseröz hücreler genellikle büyüyüp kanser
oluşturmadan önce vücudun bağışıklık sistemi tarafından ortadan kaldırılır. Mutant
hücrelerin çoğu, değişikliğe uğramış genleri nedeniyle anormal protein sentezlemekte
olup bu anormal proteinler vücudun bağışıklık sistemini uyararak antikor yapımına veya
kanserli hücreye karşı duyarlılık kazanmış lenfositlerin oluşmasına neden olur.
Bağışıklık sisteminin etkinliğini bozan durumlar kanseri hazırlayıcı etmenler olarak
bilinir. Bağışıklık sistemi tarafından yok edilemeyen bu hücreler kontrolsüz çoğalarak
bulundukları dokuyu işgal ederler. Kanser ilaçlarındaki en önemli problemlerden birisi,
bu ilaçların yalnızca kanser hücrelerine öldürücü etkisi değil, aynı zamanda normal
hücrelere de öldürücü etkilerinin olmasıdır.
12
Antikanser ilaçları etki mekanizmasına göre iki grupta inceleyebiliriz:
1. Hücre siklusuna bağımlı ilaçlar: Etkinliği hücre çoğalması aşamasına bağlıdır.
S fazına dönük ilaçlar (Antimetabolitler): Hücre metabolizmasını ve DNA
sentezini bozarak etki ederler. Metotreksat, 5-Flourourasil, Sitarabin, Prokarbazin, 6
Tioguanin, 6 Mercaptopürin.
M fazına dönük ilaçlar (Bitki alkoloidleri ): Ana hücreden iki yavru hücre
oluşmasını engellerler. Vinkristin, Vinblastin.
G2 fazına dönük ilaçlar (Antitümör antibiyotikler): RNA, DNA ve protein
sentezini etkilerler. Bleomisin, Actinomisin-D, Daunorubisin.
2. Hücre siklusundan bağımsız ilaçlar: Etkinliği hücre çoğalmasına bağlı değildir.
Alkilleyici ajanlar: Hücre çekirdeğini, DNA ve RNA sentezini etkilerler. Hızlı
çoğalan hücrelerin ölümüne yol açarlar. Nitrojen mustard, Sisplatin, Siklofosfamid,
Prokarbazin.
Hormonlar: Tümör ortamını değiştirerek büyüme ve çoğalmayı engellerler,
protein sentezini bloke ederler. Östrojen, Kortikosteroidler.
Antibiyotikler: DNA replikasyonunu bozarlar. Adriamisin.
2.7. Kanser Hücresinin Geliştirdiği Direnç Mekanizmaları
Sitotoksik ajanlara direnç, insan kanserlerinin klinik tedavisinde en büyük
engellerden biridir. Tümörler; ilaç taşıyıcı proteinlerde artış, ilaç-hedef etkileşimlerinde
değişiklikler ve apoptozda azalmaya sebep olacak moleküler değişiklikler yoluyla
kemoterapi (KT)’ye direnç gösterirler. Bununla birlikte bu değişiklikler, tümörlerde
dirençli ve duyarlı hücrelerin ilaç uygulanımında nasıl hayatta kalarak böylece ilaç
direnci oluşturduğunu açıklamada yetersizdir. Bazı tümörlerde en başta ilaç tedavisine
duyarlı olabilirken primer dirençte olduğu gibi kazanılmış dirençte olabilir.
Hücrelerdeki, zararlı ve toksik maddeleri uzaklaştıran biyokimyasal sistemlerin olduğu
bilinmektedir. Apoptozu baskılayarak tümör hücrelerini canlı tutan proteinlerin
üretimindeki artış hücreleri ölümden koruyarak KT ve RT (radyoterapi)’ye karşı direnç
gelişimini sağlar. Apoptoz ya hücre yüzeyindeki ölüm reseptörlerinin aktivasyonuyla ya
da öncelikle mitokondride gelişen bir dizi hücresel olaylarla başlatılabilir ve hücrelerin
sayısının artmasıyla sonuçlanabilir. Apoptozun tümörogenez ve kanser tedavisi için
önemli olduğu gösterilmiştir.
13
Şekil 2-2. Đlaç direnç mekanizmalarının bazıları (13).
Sitotoksik etkenlere karşı tümör hücresinin geliştirdiği birçok ilaç direnç
mekanizması bulunur (Şekil 2-2).
1. Đlacı hücre dışına doğru aktif transportunda artma ve dolayısıyla hücre içi
konsantrasyonun azalması.
2. Đlaca hedef enzim üretiminin tümör hücresi tarafından artırılması ve dolayısıyla ilacın
etkisinin azalması.
3. Oluşan metabolitin tümör hücresi içinde, sitotoksik etki gösterebilmesi için gerekli
olan enzimin kaybı.
4. Đlacın tümör hücresi içine girmesini sağlayan transport sisteminin kaybolması.
5. Çoklu ilaç direnç proteinlerinin anlatımında artış.
6. Artmış hücesel ilaç detoksifikasyonu örneğin birçok antikanser ilaçların metabolik
biotransformasyonunda yer alan serbset radikallerden kaynaklı hasardan hücrelerin
korunması.
7. Kanser hücrelerinde glutatyon S-transferaz enzim düzeyinin artması dolayısıyla
apoptozun kesitiye uğraması.
8. Đmmun sistem hücrelerinden sitotoksik doğal öldürücü hücrelerine karşı tümör
membranının direnç kazanması.
14
Bazı durumlarda etkili bir kemoterapi ve hızlı iyileşme için farklı hücresel
hedefleri olan, farklı hücre içi mekanizmaya sahip birden çok ilaç kullanılır. Sıklıkla
direnç mekanizması bu çoğu farklı yapısal ve fonksiyonel özelliklere sahip, birbiriyle
bağlantısız ilaçlara karşı birlikte direnç gösterir (Şekil 2-3).
Şekil 2-3. Đlaç direncinin temel moleküler mekanizmaları (14).
Çoklu ilaç dirençliliğine neden olan mekanizmalar, ABC taşıyıcı gen ailesi
proteinlerinin ekspresyonlarındaki artış, hücreleri programlanmış ölüme (apoptoz)
götüren yolaklardan bazılarının bloke olması ve ilaç hedef moleküllerindeki
değişimlerdir. Çoklu ilaç direncine neden olan mekanizmalardan, en fazla ATP bağımlı
taşıyıcı proteinler (ABC taşıyıcı gen ailesi proteinleri) ile çalışılmıştır (14). Bu
proteinler arasında P-glikoprotein ve MDR-ilişkili proteinler (çoklu ilaç direnciyle
ilişkili-MRPs) bulunmaktadır. MDR fenotipi MDR1 geninin indüksiyonuyla ilişkilidir
ve bu indüksiyon P-gp’nin artışıyla sonuçlanır. Bu integral proteinlerin aşırı anlatımı
çeşitli kanser ilaçlarına karşı tümör hücrelerini dirençli hale getirmektedir. Bu durum
doğal olarak taşıyıcı proteinlerin, ilaçların etkinliği ve güvenliğinde değişiklik
yapabileceğini beraberinde getirmektedir.
ATP bağımlı taşıyıcı proteinleri P-gp, çoklu ilaç direnci ile ilişkili protein ailesi
(MRP 1-9) ve meme kanseri direnç (BCRP) proteinleridir (şekil 2-4) .
15
ATP bağımlı proteinler haricinde; akciğer direnç proteini (LRP), deoksisitidin
kinazbenzeri enzim değişiklikleri, apoptozu indükleyen kemoterapötik etkinin azalması,
sitostatik ilaçların hedef enzimlerinde değişimler, p53 gen mutasyonu hematolojik
kanserlerdeki diğer ilaç direnç mekanizmaları olarak bilinmektedir. Son zamanda
yapılan çalışmalar ise çoklu ilaç direncinin hastaların kısa yaşam süreleriyle ilişkili
olduğunu göstermektedir.
2.7.1. P-glikoprotein (P-gp, ABCB1)
P-gp,
ABC taşıyıcı protein veya CD243 olarak da bilinmektedir. P-gp,
insanlarda 7q21.1 kromozomunda yer alan MDR1/ABCB1 geni tarafından kodlanmakta
ve klonlanan ilk ABC taşıyıcı proteinidir. P-gp, 1280 amino asitin birleşmesinden
oluşur ve molekül ağırlığı 170 kilodaltondur. Molekül, altışar transmembranal segment
içeren iki transmembranal alan ve iki nükleotid bağlayıcı alandan oluşmaktadır (15-18).
Şekil 2-4. P-glikoprotein pompasının yapısı (14).
P-gp, ilk defa 1976 yılında Juliano ve Ling tarafından, kolşisine dirençli Çin
hamsteri yumurtalık hücrelerinde aşırı ekspresyonu olan bir yüzey glikoproteini olarak
tanımlanmıştır (19-22). Daha sonra, tümör hücrelerinde varlığı gösterilmiş ve bu
hücrelerde P-gp’nin antikanser ilaçları hücre dışına atarak çoklu ilaç direnci olarak
tanımlanan hücresel sürecin gelişmesinde rol oynadığı saptanmıştır. Monoklonal antikor
kullanılarak
gerçekleştirilen
immünohistokimyasal
analizler
P-gp’nin,
tümör
hücrelerindeki anlatımının yanı sıra, sağlıklı insan dokularında da büyük ölçüde
anlatımı olduğu ve bu hücreleri toksik maddelerden koruduğunu göstermiştir.
16
Đnsanlarda bu taşıyıcı protein, karaciğerde hepatositlerin kanaliküler yüzeyinde,
böbreklerde proksimal tübüllerin epitel hücrelerinin apikal yüzeyinde, ince bağırsakların
ve kolonun silindirik epitel hücrelerinin apikal yüzeyinde üretilmektedir. P-gp ayrıca,
beyin, periferik sinirler ve testislerde kapiller endotel hücrelerinin apikal yüzeyinde,
koroid pleksus epitel hücrelerinin apikal yüzeyinde, plasentanın epitel hücrelerinin
apikal yüzeylerinde, kan beyin ve kan omurilik sıvısı, kan testis ve kan plasenta gibi
çeşitli kan doku bariyerlerinin bir parçasını oluşturmaktadır (16,23,26,27). P-gp, ince ve
kalın bağırsak, karaciğer, pankreas, böbrek, ovaryum ve testis, hematopoietik sistem ve
çocukluk çağı kanserlerini de içeren pek çok insan kanser hücrelerinde artış
göstermektedir. MRP (MDR bağlantılı protein) de kemoterapötik ilaçları hücre dışına
taşır (20,21,24). P-gp’nin anatomik lokalizasyonu ve dışarı atım fonksiyonu göz önüne
alındığında ilaçların emilimi, dağılımı ve eliminasyonunda önemli rol oynadığı
görülmektedir. Beyin, plasenta, testis, lenfosit gibi dokularda lokalize olan P-gp, çeşitli
kan doku bariyerini oluşturarak ilaçların duyarlı doku ve hücrelere girişlerini
sınırlandırmakta ve bu dokularda toplanmalarını azaltmaktadır (25,26). P-gp, bu hassas
dokuları zararlı maddelere karşı doğal koruma fonksiyonunu gerçekleştirirken, bir
taraftan da ilaç dağılımını etkileyerek özellikle bazı ilaçların (antipsikotik ilaçlar, HIV
proteaz inhibitörleri, antikanser ilaçlar) terapötik etkilerini göstermelerine engel olabilir
(16,18,27-29). Bu etkileşimler klinik olarak anlam taşıyabilir. Yapılan in vitro ve in
vivo çalışmalarda P-gp inhibisyonu ve indüksiyonunun ilaç etkileşmelerine neden
olduğu gösterilmiştir. P-gp substratlarının ağız yolundan P-gp inhibitörleri ile birlikte
kullanılması substrat ilaçların biyoyararlanımlarını artırarak terapötik etkilerini
artırabileceği gibi toksisitelerinin artmasına ve ters etkilerinin şiddetlenmesinede yol
açabilmektedir (Şekil 2-5). Bununla birlikte P-gp substrat ilaçlarının P-gp indüktörleri
ile birlikte kullanılması substrat ilaçların biyoyararlanımlarının azalmasına ve terapötik
etkilerinin zayıflamasına neden olabilmektedir (17,18,30,31). Kanserin etkili kimyasal
tedavisinde bir engel olarak ortaya çıkan P-gp aracılı çoklu ilaç direncini yenmek ve
antikanser ilaçların tümör hücrelerinde birikmelerini sağlamak amacıyla P-gp işlevini
bloke eden moleküller elde etmeye yönelik birçok çalışma yapılmış ve çoklu ilaç
direncini tersine çeviren çok sayıda molekül sentez edilmiştir. P-gp’yi inhibe eden bu
moleküller, P-gp modülatörleri olarak da adlandırılmaktadır.
17
Şekil 2-5. P-gp pompası ve inhibitörlerinin aktivitesi (14).
Kanser hastalarına uygulanan kemoterapinin başarısız olmasının temel nedenlerinden
biri P-gp aracılığı ile gelişen çoklu ilaç direncidir (32-35). P-gp kanser hücrelerinde
hücre içi ilaç konsantrasyonlarının azalmasına neden olmaktadır. Bu durum KT’nin
başarısını olumsuz yönde etkilemektedir. Bu çoklu ilaç dirençliliğine sebep olan
biyokimyasal sistemler ve moleküler değişikliklerin tanımlanması sonucunda KT için
kullanılan ilaç stratejileri kişiye özel olarak şekillendirilebilir. P-gp’nin substrat
spesifitesinin yüksek olmasından dolayı tümör hücrelerinde P-gp substratı olan
doksorubisin, daunorubisin, irinotekan, vinkristin, vinblastin, metotreksat, etoposid,
paklitaksel, dosetaksel, tamoksifen, mitoksantron gibi yapısal olarak farklı birçok
sitotoksik ilaca karşı da çapraz direnç görülmüştür (33,34,36).
18
2.8. Nitrik Oksit (Endotel Kaynaklı Gevşetici Faktör)
Đlk olarak 1980’de Furchgott ve Zawadzki tarafından asetilkolin etkisi altında
tavşan aortası endotel hücrelerinden salındığı gösterilen çok labil bir vazodilatatör
otokoiddir. Daha sonra insan dahil çeşitli memeli türlerinde çeşitli kimyasal ve fiziksel
etkenlerin endotelden Endotel Kaynaklı Gevşetici Faktör (EDRF) salıverdikleri
bulunmuştur. EDRF’nin kimyasal yapısının NO veya ona çok benzeyen bir madde
olduğunu gösteren birçok deneysel kanıt ortaya konulmuştur. Bu nedenle EDRF’ye
EDRF-nitrik oksit veya endotel kaynaklı nitrik oksit adı da verilmiştir (37).
NO, endotel hücrelerinde L-argininin guanidino nitrojeninin kalsiyuma bağımlı
bir enzim olan endotelyal NO sentaz (eNOS) enzimi aracılığı ile oksitlenmesi sonucu
sentez edilir. Bir yarı esansiyel aminoasit olan L-argininin terminal guanidino azot
atomundan NO oluşur. NO oluşumundan sorumlu enzim NOS, sitozolik bir
flavoproteindir. NADPH ve O2’ye bağımlı oksijenasyonu katalize eder (Şekil 2-6).
Şekil 2-6. L-Arjinin-nitrik oksit yolu (38).
19
NOS’un çeşitli izoformları vardır; bunlar ilk bulundukları yere göre
adlandırmışlardır. Her biri ayrı genler tarafından eksprese edilir. Endotelde olan eNOS
ve beyinde bulunan nöronal NOS (nNOS), kalsiyum ve kalmodüline bağımlı yapısal
(indüklenmeyen, iNOS) olan izoformlardır. Makrofajlarda oluşan sitokinler ve
endotoksin tarafından sentezi arttırılan, hepatositlerde endotoksin ile indüklenen iNOS,
kalsiyum ve kalmodüline bağımlı değildir. Tüm NOS izoenzimleri aşağıda adı geçen Larginin anologları ile inhibe olur. Endoteldeki yapısal NOS ile oluşturulan NO, pikomol
(pmol) düzeyindedir ve çabuk salıverilir. Oysaki iNOS tarafından sentez edilen NO çok
daha yüksek miktarda nanomol düzeyinde (nmol) ve yavaş salıverilir (Tablo2-1).
iNOS, endotoksin (lipopolisakkarid), tümör nekroz faktör alfa (TNF-α),
interlökin-1 beta (IL-1β) ve interferon gamma tarafından aktive edilir; glukortikoidler,
TGF-β, interlökin-4 (IL-4) ve interlökin-10 (IL-10) tarafından inhibe olur.
Şekil 2-7. Nitrik oksit (NO) kaynakları ve oluşumu (39).
Nitrik oksit sentezleyen enzim (NOS), NADPH, oksijen, flavoproteinler (FAD, FMN),
kalmodulin (CaM) ve tetrahidrobiopterinin (BH4) varlığında L-arginini, sitrulin ve
NO’ya dönüştürür (Şekil 2-7).
20
Bütün NOS enzimleri arginin analoglarınca inhibe edilir. Nitrik oksit, guanil
siklazı aktive eder ve hücre içinde cGMP düzeyini artırır ve bu düz kaslarda gevşemeyle
sonuçlanır.
Tablo 2-1. NO sentezleyen enzim izoformları (39).
Nitrik Oksit Sentezleyen Enzimler
NOS
Đzoformları
Tip 1
DDiğer adı
Salınım
nNOS
Devamlı
Kaynak
Regülasyon
Kalsiyuma
Sinir Hücreleri
Bağımlı
Makrofaj, Damar düz kası,
Tip 2
iNOS
Indüklendiğinde
NO Miktarı Kromozom
dammar endoteli, miyokard,
endokard,hepatosit, Đmmun
hücreler, hava yolu epiteli
Düşük
(picomol)
12
Sitokinler,
endotokin ve
oksidanlar
tarafından
Yüksek
(nanomol)
17
indüklene
Vasküler endotel hücreleri,
Tip 3
eNOS
Devamlı
Plateletler, miyokard ve
Kalsiyuma
endokard, mast hücreleri,
Bağımlı
Düşük
(picomol)
7
nötrofiller
NOS:nitrik oksit sentezleyen enzim, nNOS:nöral NOS, iNOS:indüklenebilen NOS, eNOS:endotel kökenli NOS
Dokuda ve oksijenlenmiş fizyolojik sıvılarda NO hızlı katabolize olur. Dokuda
eliminasyon yarı ömrü yerine ve türe göre değişmek üzere 6 ile 50 saniye arasında
bulunmuştur (40). Süperoksit dismutaz enziminin ortama katılması ise NO’nun
inaktivasyonunu hızlandıran serbest oksijen radikallerini nötralize ederek NO yıkımını
yavaşlatır ve NO etkisini potansiyelize eder. NO, superoksit anyonu ile etkileşerek
ONOO- oluşumuna neden olur. Bu dönüşüm özellikle makrofajlar, polimorfonükleer
lökositler, mesenjial hücreler ve endotel hücrelerinde oluşur. ONOO- direkt ve indirekt
olarak lipit peroksit aktivasyonunu aktive eder; dolayısıyla hem vücut hücrelerinde ve
hem de enfeksiyon etkeni hücrelerde sitotoksik etki oluşturur. Đnsanlarda NO’nun bazal
durumda damar endotelinden sürekli olarak salıverildiği ve vazodilatör tonus oluşturup
damar direncinin fizyolojik düzenlenmesine katkıda bulunduğu bilinmektedir.
Aterosklerotik damarların çeperinde NO yapımının azaldığı ya da kaybolduğu
bulunmuştur.
NO,
endotelde
kalsiyuma
bağımlı
bir
şekilde
sentez
edilip
salıverildiğinden kalsiyum iyonoforu olan kalsimisin NO salıverir. Bu etkenlerden çoğu
endoteli sağlam damarlarda gevşeme yaptıkları halde, endoteli tahrip edilen damarlarda
damar düz kası üzerindeki direkt etkileri ile kasılma yaparlar. Damarın basınca ve
21
akımın yaptığı sürtünmeye maruz kalması (sürtünme stresi) endotelden hem prostasiklin
ve hem de NO salgılanmasını arttırır. Bu iki madde sinerjistik bir etkileşme ile trombus
oluşumunu engeller. Bunlara ek olarak, vazodilatatör ve antitrombojenik etkileri nedeni
ile sitoprotektif etkinlik gösterir (41). NO, sadece damar endotel hücrelerinde değil,
fakat aynı zamanda serebellum ve ön beyindeki nöronlarda, lökositlerde, böbrek tubulus
epitelyum hücrelerinde, adrenal medulla hücrelerinde, mast hücrelerinde ve bazı
otonom sinirlerin (nonadrenerjik nonkolinerjik sinirler) uçlarında da sentez edilip
salıverilir. Beyinde belirli nöronlarda NO sentezinin yapıldığı ve bu maddenin
nörotransmitter işlevi yapabileceği gösterilmiştir. Đlaç olarak kullanılan nitrogliserin,
sodyum salıvermek suretiyle kendilerine özgü vazodilatatör ve antiagregant etki
oluştururlar. Makrofajların ve karaciğer kuffer hücrelerinin sitotoksik miktarda NO
salıvererek, onun aracılığı ile enfeksiyon etkenlerini ve diğer hücreleri öldürdükleri
saptanmıştır. Daha önce belirtildiği gibi; NO’nun iltihap dokusunda toplanan
makrofajlar tarafından fazla miktarda sentez edilip salgılandığı ve onların enfeksiyon
etkeni mikroorganizma veya parazitler üzerindeki öldürücü etkilerine aracılık ettiği ve
nitratın idrarla atılımın arttırdığı ileri sürülmüştür (42,43).
2.8.1. Nitrik Oksitin Etki Mekanizması
NO salıverilmesine neden olan kimyasal etkenler arasında aktif endojen
maddeler ve ilaçlar bulunur; asetilkolin, histamin, seratonin, vazopresin, bradikinin,
prostasiklin, P maddesi, insülin, klonidin ve katekolaminler (son ikisi α2 adrenerjik
reseptörler aracılığı ile). Trombosit agregasyonu sırasında aktive olan trombositlerin
salıverdiği adenozintrifosfat (ATP) ve adenozindifosfat (ADP) maddeleri ile pıhtılaşma
sırasında oluşan trombin de NO salgılanmasına neden olur (44). NO, endotelde
kalsiyuma bağımlı bir şekilde sentez edilip salıverildiğinden kalsiyum iyonoforu olan
kalsimisin NO salıverir. Bu etkenlerden çoğu endoteli sağlam damarlarda gevşeme
yaptıkları halde, endoteli tahrip edilen damarlarda damar düz kası üzerindeki direkt
etkileri ile kasılma yaparlar. NO, damar düz kas hücreleri üzerindeki gevşetici etkisini
ve trombositler üzerinde etkilerini bu hücrelerde guanilat siklaz enzimini aktive edip
guanozintrifosfattan (GTP) ikinci ulak olarak siklik guanozin monofosfat (sGMP)
oluşmasını arttırmak suretiyle yapar. Bu enzimi inhibe eden metilen mavisi ve
hidrokinon,
NO’nun
etkilerini ortadan
kaldırabilir.
NO,
trombositlerin
agregasyonunu hem de damar çeperine adezyonu (yapışmasını) inhibe eder.
hem
22
2.8.2. Nitrik Oksit ve Kanser
Kültür mediumunda süspansiyon olarak büyüyen K562 hücrelerinin iki kat
artma süreleri ortalama 12 saattir. Bu nedenle hücre kültüründe kolayca çoğaltılabilen
K562 hücrelerinin sitotoksisite ve apoptoz çalışmaları için kullanımı yaygındır (45).
Kültürde spontan olarak apoptoza gitmeyen K562 hücrelerinde farklı maddelerle
apoptozu indüklemek başarılı sonuçlar elde edilmesini sağlamaktadır. Yakın zamanda
yapılan çalışmalar göstermiştir ki, NO en az iki mekanizma ile tümör gelişiminde ilgili
olabilir. Bunlardan ilki anjiogenezin (damar oluşumu) ve DNA üzerinden serbest
radikallerin direkt aktivasyonudur. Angiogenez; solid tümörlerin büyümesi ve metastaz
için gerekli olan yeni kan damarlarının oluşumudur. NO üretimi tümör gelişimindeki
angiogenezde anahtar rolü oynar (46). Đnsan meme kanseri ve metastazlarının iNOS ile
pozitif ilişkisi olduğu bildirilmiştir. Vasküler endotelial büyüme faktör (VEGF) ise
endotelial büyüme ve angiogenezi NO aktivitesini stimüle ederek arttıran çok
fonksiyonlu bir sitokindir. Yapılan bir çalışmada, serum VEGF ve nitrit-nitrat
seviyelerini meme kanserli hastalarda incelemişlerdir. Sonuç olarak serum VEGF
seviyesini metastatik hastalıklı kişilerde nonmetastazlılar ve kontrol grubuna göre daha
yüksek olarak saptamışlardır. Metastatik hasta grubunda nitrit-nitrat düzeyi ile VEGF
arasında pozitif bir ilişki saptamışlardır. Buradan yola çıkarak NO’nun VEGF
tarafından stimüle edilen angiogenezde rol alabileceğini belirtmişlerdir (42,44,47).
Đkincisi ise, tümör mikro çevresindeki oksijen seviyesi tümör evresi ve tedaviye
cevabını belirlemede önemli rol oynar. NO üretimi için de oksijen bir kofaktör olarak
gereklidir ve düşük oksijen seviyesine maruz kalma NO üretimini inhibe eder (48,49).
Tümör hücrelerindeki hipoksi malign progresyon, metastatik yayılım, KT (kemoterapi)
ve RT (radyoterapi)’ ye dirence neden olur (50). Ayrı bir çalışmada; insan meme
kanseri hücreleri (MDA-MB-231) ile fare melanom hücreleri (Bl6F10) üzerinde
hipoksinin neden olduğu KT direnci ile NO seviyesinin azalması arasında bağlantı tespit
etmişlerdir. Ayrıca NO benzeri birer öncü ilaç olan gliseril trinitrat veya
diethylamintriamini hipoksi maruziyetinin başında vererek hipoksiye bağlı direnci
azaltmışlardır.
Tümörlerde
oksijen
eksikliği cerrahi dışı tedavilerin
örneğin
konvansiyonel RT ve KT’nin etkinliğini azaltır (51,52). NOS inhibitörleri ile tümör
oksinejasyon etkilerinin azaldığı saptanmış. Tümör oksijenizasyonu ile tümör
büyümesini 1,65 oranında inhibe etmişlerdir.
23
NO’nun DNA’yı hasarlayarak kanser başlangıcı ile ilişkili olduğu ve ayrıca
immün hücrelerin tümörisidal aktivitesi için NO’nun gerekli olduğu bilinmektedir
(53,54-57). NO’nun inflamasyon ve konak savunmasında rolü vardır (58,59). Daha
yüksek konsantrasyonlarda NO, direkt mikroorganizmalara, tümör hücrelerine ve
konakçı hücrelere etki ile sitotoksik etki gösterir (60,61). NO; birçok farklı biyolojik
olaylara (vazodilatasyon, nörotransmisyon, immun savunma) ara buluculuk yapan güçlü
bir biyolojik moleküldür (62,63). Đleri sürülen çok sayıda kanıta göre; artmış NO
üretimi hücrelerde kanser gelişiminde kritik bir rol oynar. Özellikle NO’nun bir
izoformu olan indüklenebilen nitrik oksit sentaz (iNOS) enzimi karsinogenez, tümör
angiogenezi, kanser progresyonu ve metastaz olaylarına karışır(64,65).
24
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. GEREÇLER
3.1.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler
DMEM F-12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12) (Gibco)
FBS (Fetal sığır serumu) (Gibco)
Penisilin-streptomisin solüsyonu (Gibco)
Rodamin 123
Verapamil
Hemoglobin
SNAP (S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine)
Doksorubisin
P-Gp-PE (Becton Dickinson)
CD38-APC (Becton Dickinson)
CD34-PeCy7 (Becton Dickinson)
MRP-1-FITC (Becton Dickinson)
3.1.2. Çalışmada Kullanılan Kitler
Annexin V-Fitc Assay Kit (Becton Dickinson)
3.1.3. Çalışmada Kullanılan Cihazlar
Buz Makinası (Hoshizali)
Distile Su Cihazı (GFL)
Etüv (Sanyo)
FACS Flow Cihazı (Becton Dickinson)
Laminar Hava Akım Cihazı (Heraus)
Otoklav (Hirayama)
Santrifüj (Hettich)
Sıvı Azot Tankı (34 XT Taylor-Wharton)
Ters Mikroskop (Olympus IM)
Vorteks (Biosan)
Floresan Mikroskobu (Olympus BX51)
25
Spektroflorimetre LS-45
3.1.4. Çalışmada Kullanılan Çözeltiler
PBS (Tuz Đçeren Yıkama Eriği):
1,44 g/ltNa2HPO4.2H2 O
0,2 g/l KH2HPO4
8,0 g/l NaCl
0,2 g/l KCl
800 ml dH2 O ile çözülerek pH HCl ile 7,4 olacak şekilde ayarlanarak son hacm 1 lt’ye
tamamlanır.
26
3.2. YÖNTEMLER
3.2.1. Hücre Kültür Çalışmaları
Çalışmada kullanılan, K562 (insan eritrolösemi hücresi) hücreleri standart kültür
koşullarında, %10 FBS ve %1 antibiyotik (100 µg/ml streptomisin ve 100 U/ml
penisilin) içeren DMEM F-12 içerisinde kültür şişelerine ekilerek 37 ºC’de %5 CO2’li
inkübatörde çoğaltıldı. Ters mikroskopta 2-3 günde bir kontrol edilen hücreler
semikonfluent duruma geldiğinde hücre kazıyıcı ile yüzeyden kaldırılarak 15 ml’lik
steril tüplere aktarıldı. 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlendikten sonra üst sıvı
atıldı ve pelet 1-2 ml taze cDMEM’ de çözüldü. Hücreler her yeni pasajda 1-2x105
hücre/ml olacak şekilde taze cDMEM içeren kültür şişelerine eklendi ve çoğalmaya
bırakıldı. Bu şekilde 2-3 günde bir kontrol edilen hücrelerin, belirli aralıklarla yeni
pasajları yapıldı.
3.2.2. Hücrelerin Dondurulması ve Çözülmesi
Hücre dondurulması işleminde, hücre kazıyıcısı ile kültür şişesi yüzeyinden
kazınan hücreler, 15 ml’lik santrifüj tüplerinde 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüj
edildi ve üst sıvıları atıldı. Tüp içerisindeki hücre sayısı 5x105 olacak şekilde ayarlandı.
1/9 oranında DMSO/FBS içindeki soğuğa dayanıklı kryotüplere alınan hücreler 30
dakika buzda bekletildi. Ardından -20 ºC’de 24 saat bekletilerek -80 ºC’ye aktarıldı.
Uzun süre saklanması gerekiyorsa sıvı azot tankına konuldu.
Hücrelerin çözülmesi işleminde ise -80 ve sıvı nitrojende bulunan hücreler, hızlı
bir şekilde 37 ºC’ ye konuldu. Hücrelerin %50’si çözüldüğü zaman 15 ml’lik steril
tüplere geçirilip üzerlerine taze cDMEM eklendi. Hücreler, 3000 devir/dakika olarak
santrifüj edildi ve supernatan atıldı. Ardından bir kez daha cDMEM ile yıkanarak kültür
şişelerine ekildi.
3.2.3. Sitotoksisite deneyi
96 kuyulu kültür plate’lerine 2x104/100 µl hücre olacak şekilde K562 hücreleri
ekildi. 24 saat sonra 25, 100, 200, 250, 500, 750 ve 1000 nM konsantrasyonlarında
doksorubisin
eklendi.
24
saatlik
inkübasyonun
sonunda
kuyu
içindeki son
konsantrasyonu 0,45 mg/ml olacak şekilde 10 µl MTT solüsyonu ilave edildi. 37 ºC’de
mor formazan kristalleri oluşana kadar ortalama 3 saat inkübe edildi. Đnkübasyon
27
sonrası canlı hücrelere giren MTT koyu mavi renkli formazon ürününe dönüştüğü için
renk değişimi gözlendi. Son olarak her bir kuyucuğa 100 µl izoprapanol/ HCl çözeltisi
koyulup formazon kristallerinin çözülmesi sağlandıktan sonra ELISA okuyucusunda
570 nm’de absorbans değerleri hesaplandı. Sitotoksite düzeyleri aşağıdaki formül ile
hesaplandı :
1-Test kuyucuğunun adsorbansı / Kontrol kuyucuğunun adsorbansı x 100
Kontrole göre %50 oranında sitotoksik etki gösteren konsantrasyon, sitotoksik doz
olarak kabul edildi.
3.2.4. Hücrelerin Doksorubisin ile Muamele Edilmesi
Çalışmada kullanılan doksorubisin, klinikte tedavi amacıyla hastalara verilen bir
ilaçtır ve eczaneden temin edilmişitir. Hücrelere verilmeden önce her seferinde taze
olarak hazırlandı. Verapamil, saf su ile 5 mg/ml olarak hazırlandı ve +4 ºC’de tutuldu.
Doksorubisin başlangıç doz 250 nM olacak şekilde, artan dozlarda K562 hücrelerine
eklendi. Her bir doz için hücreler ortalama 2 hafta inkübe edildiler. Bu sürenin sonunda
çoğalan hücrelerde doksorubisine karşı direnç gelişti.
Tablo 3-2 Doksorubisine karşı direncin geliştiği doz değerleri
[Dox (nM)]
Hafta sayısı
250
3
330
2
410
2
500
2
580
2
660
2
3.2.5. K562S ve K562D Hücrelerin Antikorlar ile Boyanması
Akım sitometri tüpleri içine P-gp-PE, CD38-APC, CD34-PE Cy7 ve MRP-1FITC antikorları hem K562S ve hem de K562D hücreleri için 5 µl olarak konuldu.
Ardından tüpler içine 50 µl’de 5x105 hücre eklendi. +4 ºC’de 30 dakika inkübe edildi.
Üzerlerine 1 ml PBS eklenerek yıkandı. Analizle FACS Calibur (Becton Dickinson) ile
yapıldı.
28
3.2.6. K562S ve K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Floresan
Mikroskop ile Görüntülenmesi
6’lık platelerdeki her bir kuyuya, 3 ml cDMEM içindeki 5x105 K562S ve
K562D hücresi ekilerek gece boyu 37 ºC’de inkübe edildi. Ertesi gün hücrelerin
Verapamil ile 1 saat muamele edilmesinin ardından, verapamil varlığında veya
yokluğunda Rho123 ile 1 saat daha inkübe edildi. Hücreler PBS ile yıkanarak floresan
mikroskopta görüntülendi.
3.2.7.
K562S
ve
K562D
Hücrelerinde
Rho123
Alımı
ve
Tutumunun
Spektroflorimetre ile Belirlenmesi
6’lık plate’lerdeki her bir kuyuya, 3 ml cDMEM içindeki 5x105 K562S ve
K562D hücresi ekilerek gece boyu 37 ºC’de inkübe edildi. Ertesi gün hücrelerin
verapamil ile 1 saat muamele edilmesinin ardından, verapamil varlığında veya
yokluğunda Rho123 ile 1 saat daha inkübe edildi. Hücreler PBS ile yıkanarak
spektroflorimetrede 1 saat boyunca 10’ar dakika aralıklarla ölçüm yapıldı.
3.2.8. K562S ve K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Akım
Sitometre ile Belirlenmesi
6’lık plate’lerdeki her bir kuyuya, 3 ml cDMEM içindeki 5x105 K562S ve
K562D hücresi ekilerek gece boyu 37 ºC’de inkübe edildi. Ertesi gün hücrelerin
verapamil ile 1 saat muamele edilmesinin ardından, verapamil varlığında veya
yokluğunda Rho123 ile 1 saat daha inkübe edildi. Hücreler PBS ile yıkanarak akım
sitometrede belirlenmek üzere tüplere alındı.
3.2.9. K562S ve K562D Hücrelerinde Doksorubusin Varlığında Apoptoz
Doksorubisine karşı direnç gelişmiş K562 hücreleri (660 nM) ve duyarlı K562
hücreleri, 33 µM doksorubisin ile 24 saat muamele edildi. Ardından hücreler iki kez
soğuk PBS ile yıkanarak Apoptoz Kit ile (Annexin V-Fitc Assay Kit (Becton
Dickinson) erken ve geç apoptoz ve hücre canlılıklarına bakıldı. Kısaca, 2x105 hücre 10
µl bağlanma tamponu içine alındı. 5 µl PI ve Annexin V-FITC eklenerek 20 dakika oda
ısısında inkübe edildi. Đnkübasyon sonunda tüplerin üzerine 400 µl bağlanma tamponu
eklenerek 1 saat içinde akım sitometresinde hücrelerin analizi yapıldı.
29
3.2.10. K562S ve K562D Hücrelerinde NO Vericisi (SNAP) Varlığında Apoptoz
Doksorubisine karşı direnç gelişmiş K562 hücreleri (660 nM) ve duyarlı K562
hücreleri, 24 saat NO vericisi SNAP (500 µM) ile muamele edildikten sonra, başta 1
saat verapamil ve ardından doksorubisin (33 µM) ile 24 saat inkübe edildi. Hücreler iki
kez soğuk PBS ile yıkanarak Apoptoz Kit ile (Annexin V-Fitc Assay Kit (Becton
Dickinson) erken ve geç apoptoz ve hücre canlılıklarına bakıldı. Kısaca, 2x105 hücre 10
µl bağlanma tamponu içine alındı. 5 µl PI ve Annexin V-FITC eklenerek 20 dakika oda
sıcaklığında inkübe edildi. Đnkübasyon sonunda tüplerin üzerine 400 µl bağlanma
tamponu eklenerek 1 saat içinde akım sitometresinde hücrelerin analizi yapldı.
30
4. BULGULAR
4.1. Doksorubisinin Doz Bağımlı Sitotoksik Etkisi
Doksorubisinin K562 hücrelerinde doz-bağımlı sitotoksik etkisi Şekil 4.1’de
görülmektedir. Her bir doz için üç kuyu çalışıldı ve deney üç kez tekrar edildi. Elde
edilen absorbans değerleri, negatif kontrol olarak belirlenen ve %100 canlılğın olduğu
hücre absorbans değerelerinden çıkarılarak elde edildi. IC50 değeri 250 nm olarak
bulundu.
Şekil 4-1. MTT Testi.
K562 hücreleri farklı konsantrayonlardaki doksorubisin ile 24 saat inkübe
edildikten sonraki hücre canlılık oranları. Doksorubisinin sitotoksik değeri MTT testi ile
belirlendi.
31
4.2. K562D Hücrelerinin Verapamil Varlığında ve Yokluğunda Rho123 ile
Boyanması
40x objektif altında rodamin boyamanın ışık mikroskobu ile ardından floresan
mikroskop ile aynı alanın görüntüleri Şekil 4.2 A ve B’de verilmektedir. Şekil 4.2 C’de
ise 10 mM verapamil eklenmiş ve rodaminsiz ortama çekildikten 2 saat sonraki
görüntüsü verilmektedir. Verapamil varlığında rodaminin hücre dışına çıkmadığı
verapamilin P-gp kanallarını inhibe ettiği floresan sönümlenmenin bulunmamasından
dolayı görülebilmektedir. 100X objektif altında yine aynı alandaki hücrelerin ilk 15
dakika içinde boyanın hücre dışına çıkarak floresan sönümlenme görüntüleri Şekil 4.2
D, E ve F’de gösterilmektedir.
32
Şekil 4-2. K562D hücrelerinin Rho123 varlığında ışık ve floresan mikroskobu görüntüleri.
A) K562D hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüsü (40x).
B) Aynı K562D hücrelerin floresan mikroskobu görüntüsü (40x).
C) K562D hücrelerin verapamil varlığında boyayı tutmasının görüntüsü (40x).
D) K562D hücrelerinin Rho123 boyası varlığında sönümlenmesi görüntüsü (100x).
E) K562D hücrelerinin Rho123 boyası varlığında sönümlenmesi görüntüsü (100x).
F) K562D hücrelerinin Rho123 boyası varlığında sönülmenmiş görüntüsü (100x).
33
4.3. K562S ve K562D Hücrelerin P-GP, CD38, CD34 ve MRP-1 Yüzey Belirteçleri
ile Boyanması
K562 hücrelerinin direnç kazanması sürecinde, kök hücre belirteçlerinden
olduğu ifade edilen CD34 ve CD38 anlatımlarında artma olup olamadığı araştırıldı.
Aynı zamanda diğer bir çoklu ilaç direnci ile ilişkili protein ailesinden olan MRP-1
yüzey belirtecinin anlatım seviyesine de bakıldı. K562D hücrelerinde öncelikle P-gp
anlatım seviyesinin %65 olduğu belirlendi. Ardından CD34 anlatım seviyesinin %7,
CD38’in %50 ve MPR-1’in ise %5 olduğu belirlendi.
34
Şekil 4-3. K562D hücrelerinde P-gp, CD34, CD38 ve MRP-1 yüzey belirteçleri ile
boyanmış hücrelerin akım sitometresi görüntüleri.
Sol kolonlarda, her bir belirtecin negatif kontrolü verilemektedir. A) CD34 belirtecinin anlatımının negatif kontrolu.
B) CD34 belirtecinin anlatımı. C) P-gp belirtecinin anlatımının negatif kontrolu. D) P-gp belirtecinin anlatımı. E)
CD38 belirtecinin anlatımının negatif kontrolu. F) CD38 belirtecinin anlatımı. G) MRP-1 belirtecinin anlatımının
negatif kontrolu. H) MRP-1 belirtecinin anlatımı.
35
4.4. K562S ve K562D Hücrelerin P-gp, CD38, CD34 ve MRP-1 Yüzey Belirteçleri
ile Karşılaştırılmalı Boyanması
Şekil 4-4. K562D hücrelerinde P-gp, CD34, CD38 ve MRP-1 yüzey belirteçlerinin
karşılaştırmalı akım sitometresi görüntüleri.
P-glikoprotein anlatımı olan hücrelerin yaklaşık %18,04’inde CD34 anlatımı da,
%16,49’unda CD38 anlatımı da, %15,53’nde MRP-1 anlatımı da bulunmaktadır.
36
4.5. K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Spektroflorimetre ile
Belirlenmesi
K562D hücrelerinde rodamin boyasının hücre dışına sızma deneyleri verapamil
varlığında ve yokluğunda spektroflorimetrik ölçümler ile de belirlendi. Yöntemler
bölümünde de ifade edildiği gibi hücreler bir saat rodamin ile inkübe edildikten sonra,
rodaminsiz cDMEM içine alındılar. Eksitasyon dalga boyu 460 nm, emisyon dalga boyu
ise 520 nm olacak şekilde spektroflorimetrik ölçümler alındı. Verapamil varlığında
rodamin boyasının hücre dışına daha az sızdığı, verapamilin P-gp kanallarını inhibe
ettiği gösterildi.
Şekil 4-5. K562D hücrelerinde verapamil varlığında (■) ve yokluğunda (♦) rodaminin
hücre dışına sızmasının spektroflorimetrik ölçümleri.
K562D hücrelerinde varapamilin olmadığı durumlarda hızlı bir şekilde floresan
yoğunluğunda düşme gözlendi.
37
4.6. K562D Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Akım Sitometresi ile
Belirlenmesi
K562D hücrelerdeki P-gp substratı olarak bilinen rodamin boyası ve P-gp’nin
inhibitörü olan verapamil varlığında rodaminin hücre tarafından tutulumunu veya hücre
dışına salınımı Şekil 4.6’da görülmektedir. Hücreler rodaminsiz ortama alındıktan sonra
iki saat PBS içinde inkübe edilmişler, ardından analizler gerçekleştirilmiştir. Verapamil
varlığında rodaminin hücre içinde tutulduğu için grafik tepelerindeki kayma ve bununla
birlikte floresan şiddette artma görülmektedir. Bu analizlerin sonunda, verapamilin
bulunmadığı K562D hücrelerindeki rodaminin, iki saatin sonunda hücre dışına
sızıntıdan dolayı ortalama floresans yoğunluğu 1112,
P-gp inhibitörü verapamil
varlığındaki hücrelerin ortalama floresans yoğunluğu ise 3233 olarak bulunmuştur. Bu
çalışma K562S hücreleri ile tekrarlandığında, verapamil varlığında ve yokluğunda
rodaminin hücre dışına sızıntısı görülmemiştir (Şekil 4-7).
Şekil 4-6. K562D hücrelerinin rodamin ve verapamil varlığında inkübasyonları
sonrasındaki akım sitometri analizleri.
Mor renkli histogram negatif kontrolü, yeşil renkli histogram rodamin varlğında
ve mavi renkli histogram ise rodamin ve verapamil varlığındaki grafikleri
göstermektedir. Elde edilen değerler 2 saat inkübasyonun sonunda alınan değerlerdir.
38
K562D hücrelerinin rodamin varlığında ölçülen floresan değerleri.
Marker
All
M1
Left, Right
1, 9910
43, 8738
Events
5851
5715
%Gated
100,00
97,68
%Total
44,85
43,81
Mean
1311,95
1112,77
K562D hücrelerin rodamin ve verapamil varlığında ölçülen ortalama floresan değerleri.
Marker
All
M1
Left, Right
1, 9910
43, 8738
Events
5285
5160
%Gated
100,00
97,63
%Total
41,87
40,88
Mean
3380,41
3233,43
4.7. K562S Hücrelerinde Rho123 Alımı ve Tutumunun Akım Sitometresi ile
Belirlenmesi
Şekil 4-7. K562S hücrelerinin rodamin ve verapamil varlığında inkübasyonları.
Mor renkli histogram negatif kontrolü, yeşil renkli histogram rodamin varlığında
ve mavi renkli histogram ise rodamin ve verapamil varlığındaki grafikleri
göstermektedir. Elde edilen değerler 2 saat inkübasyonun sonunda alınan değerlerdir.
39
K562S hücrelerinin rodamin varlığında ölçülen floresan değerleri.
Marker
All
M1
Left, Right
1, 9910
12, 9910
Events
8922
8922
%Gated
100,00
100,00
%Total
64,76
64,76
Mean
1909,13
1909,13
K562S hücrelerin rodamin ve verapamil varlığında ölçülen ortalama floresan değerleri.
Marker
All
M1
Left, Right
1, 9910
12, 9910
Events
8521
8521
%Gated
100,00
100,00
%Total
60,39
60,39
Mean
1761,14
1761,14
4.8. K562S ve K562D Hücrelerinin NO Varlığında Apoptoz Analizleri
Şekil 4-8. K562 S veK562D hücrelerinin NO varlığında apoptoz görüntüleri.
A)K562S hücreleri ve SNAP .B) K562D hücreler ve SNAP.
SNAP’in 500 µΜ olarak kullanılan konsantrasyon değeri, literatür bilgileri ile elde
edilmiştir. Bu dozun apoptotik doz olup olmadığını belirlemek için K562S ve K562D hücreleri
24 saat NO vericisi SNAP ile inkübe edildiler ve Annexin V ile apoptoz analizleri yapıldı. Bu
analizler sonucunda 500 µΜ SNAP varlığında K562S ve K562D hücrelerinde apoptoza
girişlerinde farklılıklar gözlendi. K562S hücrelerinin aynı konsantrasyondaki apoptoz değeri
%90 iken, K562D hücrelerinin %61 oldu.
40
4.9. K562D Hücrelerinin NO, Doksorubisin ve Verapamil Varlığında Akım
Sitometre ile Apoptoz Analizleri
Şekil 4-9. K562D hücrelerinin NO, doksorubisin ve verapamil varlığında apoptoz
görüntüleri.
A) K562D hücreler ve 33 µΜ doksorubisin. D)K562D hücreler ve 33 µΜ doksorubisin ve 500 µΜ SNAP. B) K562D
hücreler 33 µΜ doksorubisin 10 mM verapamil. C) K562D hücreler 33 µΜ doksorubisin, 500 µΜ SNAP ve 10 mM
verapamil.
41
4.10. K562S Hücrelerinin NO, doksorubisin ve Verapamil Varlığında Akım
Sitometre ile Apoptoz Analizleri
Şekil 4-10. K562S hücrelerinin NO, doksorubisin ve verapamil varlığında apoptoz
görüntüleri.
E) K562S hücreler ve 33 µΜ doksorubisin. G) K562S hücreler ve 33 Μm doksorubisin ve 500 µΜ SNAP. F) K562S
hücreler 33 µΜ doksorubisin ve 10 mM verapamil. H) K562D hücreler 33 µΜ doksorubisin, 500 µΜ SNAP ve 10
mM verapamil.
Hem K562S hem de K562D hücreleri ilk 24 saat NO vericisi SNAP ile ardından
33 µΜ doksorubisin ile 24 saat muamele edildikten sonra apoptoz analizleri yapıldı. Bu
analizler sonucunda, K562S hücrelerinde SNAP apoptozu indüklerken, K562D
hücrelerinde SNAP varlığında ise apoptoz değerlerinin gerilediği gösterilmiştir.
42
5. TARTIŞMA
Kemoterapi, kanser tedavisinde uygulanan en yaygın ve etkili yöntemdir. Ancak,
kemoterapi süresince, hastaların tedaviye cevap vermemesi veya tedavi sonrası kanserin
tekrarlaması sıklıkla görülen bir durumdur. Kanser tedavisinde başarıya ulaşmak için
genellikle birden fazla antikanser ilacı uygulanmaktadır. Ancak, sonradan kazanılan ya
da tedavi öncesi kişide var olan ilaç dirençliliği, kanser kemoterapisinde başarıya
ulaşmayı büyük ölçüde engellemektedir. Bu çoklu ilaç direnci ilacın hücre içine
girişinde azalma veya hücre dışına atma işlevinde artış, ilaç-hedef ilişkisinde azalma,
veya ilaç dağılımında değişiklik şeklinde gözlenebilmektedir. Artırılan ilaç dozları ise
hastalarda görülen yan etkilerin artmasına neden olmaktadır. Ayrıca dirençlilik
nedeniyle zaman ve ilaç kaybı olmakta, hastaların tedavisi zorlaşmaktadır.
Bu çalışmada, insan eritrolösemi kanser hücre soyu, bir antrasiklin türevi
antibiyotik olan ve kemoterapide kullanılan doksorubisine karşı dirençli hale getirildi.
Başta uygun doz değeri için MTT testi yapıldı. Bu testin sonunda IC50 değeri 250 nM
olarak bulundu. Bu değerdeki konsantrasyon ile K562 hücrelerinin dirençli hale
getirilmesi deneylerine başlandı. Her bir konsantrasyon artışı için haftada iki kez
yapılan pasaj ile yaklaşık 2-3 hafta belirlenen dozlarda inkübe edildi. Ardından Pglikoprotein anlatımı akım sitometresi ile analiz edildi. Bu çalışmada elde edilen tüm
bulgular %70 P-glikoprotein anlatımı varlığında olan bulgulardır. Hücreler bundan
sonra aynı dozda yani 660 nM’deki doksorubisin ile inkübe edilmeye devam edildi.
K562D’li hücreler ile öncelikle floresan mikroskobunda, P-gp’nin substratı olan
rodamin boyası ve onun inhibitörü varapamil varlığında, hücre içinde ilaç tutulumu
incelendi. Boyama sırasında kullanılan rodamin ve verapamil konsantrasyonları,
literatür sayesinde elde edilen değerlerdir. Elde edilen sonuçlara göre, ortamda
verapamilin olmadığı durumlarda, rodaminin ilk onbeş dakika içinde büyük oranda
hücre dışına çıktığını yani hücrenin sönümlendiği görüldü (Şekil 4-2 d,e,f). Verapamil
varlığında ise aradan 2 saat geçmesine rağmen P-glikoprotein kanalları inhibe olduğu
için rodamin hücre içinde kalabildi, sönümlenme gözlenmedi (Şekil 4-2 c). Floresan
mikroskop bulgularını desteklemek üzere, spektroflorimetrede yine verapamil
varlığında ve yokluğunda rodaminin hücre içindeki tululumu ve hücre dışına çıkışını
gösterecek ölçümler yapıldı. Bu ölçümlerde hücrelerin dışarı saldığı rodamin değerleri,
belli zaman aralıklarında hücrelerin santrifüj ile çöktürüldükten sonra supernatantın
43
ölçülmesi sayesinde elde edildi. K562D hücrelerinde varapamilin olmadığı durumlarda
hızlı bir şekilde floresan yoğunluğunda düşme gözlendi (Şekil 4-5). Floresan
mikroskobunda yapılan gözlemler ve spektroflorimetrede yapılan ölçümler K562S
hücreleri ile de tekrarlanmış, verapamil varlığında ve yokluğunda anlamlı bir fark
gözlenememiştir. Bu deneylerin son ayağında akım sitometresinde yapılan analizler
vardır. K562D hücrelerde verapamil varlığında floresan yoğunluğun oldukça yüksek
olduğu belirlenmiş, verapamilin P-glikoprotein inhibitörü olmasından dolayı ilacın
hücre dışına salınımını engellediği bu çalışmada da gösterilmiştir (Şekil 4-6). Aynı
çalışma doksorubisine duyarlı hücreler ile yapıldığında, verapamil varlığında ve
yokluğunda floresan yoğunlukta bir fark gözlenememiştir (Şekil 4-7). Tüm bu bulgular
varlığında, doksorubisine dirençli hücrelerin P-gp anlatımından dolayı substratı olan
rodamininin hücre içinde tutulamadığı bu kanallardan dışarı salındığı ancak P-gp
inhibitörü olan verapamil varlığında hücre içinde kaldığı gösterilmiştir. Çalışmadaki
bulgular bu konu üzerinde verilen literatür bilgisi ile uygunluk göstermektedir. Çoklu
ilaç direnci ile ilişkilendirilen diğer bir protein ailesi olan MRP-1’in akım sitometresi ile
yapılan analizleri sonucunda anlatımının duyarlı hücrelere göre %5 arttığı belirlenmiş
bu seviyenin düşük olduğu düşünülerek substratı olan Fluo-3 ve inhibitörü olan MK571 kullanılarak hücre içinde ilacın hücre içinde tutulum deneyleri yapılmamıştır.
Bu çalışmada P-gp anlatımının yanında, kök hücre ve kanser kök hücre yüzey
belirteçlerinden olan CD34 ve CD38 anlatımlarının, doksorubisine direnç geliştiği
süreçte değişiklik olup olmadığı sorusuna yanıt arandı. Son yıllarda kanser kök hücre
denilen (KKH), kanseri başlatan küçük bir grup hücrenin var olduğu ve bu hücre
grubunun kendi-kendilerini yenileme ve farklılaşma özelliğine sahip olduğu
gösterilmiştir. Kanser kök hücreleri veya kanseri başlatan hücreler olarak bilinen kanser
öncü hücrelerinin, kanserin başlaması, ilerlemesi ve klasik tedavi şekillerine direnç
göstermesinden sorumludur. Klasik tedaviler, tedavinin başlangıç aşamasında etkilidir,
fakat kanserin invaziv veya metastatik olarak ilerlemesi durumunda genellikle tedaviye
dirençlidir ve relaps gözlenmektedir ki ölümle sonuçlanır. Kanserin tekrarlaması kanser
hücrelerindeki genetik ve/veya epigenetik değişikliklerin birikimi ile ilişkilidir. Bu
genetik ve/veya epigenetik değişiklikler kontrolsüz hücre çoğalmasına, hücrenin
yaşaması ve invazyonuna olduğu kadar klinik tedaviye dirençlilikten de sorumludurlar.
Akım sitometresi kullanarak KKH’lerini, kök hücreler ile olan benzerliklerinden de yola
çıkılarak izole etmek mümkündür. Lösemik hücrelerin en karakteristik özelliği
44
CD34+CD38- fenotipine sahip hücreleri içermesidir. Yapılan çalışmalar sonucunda, bu
hücre tiplerinin NOD/SCID farelere verildiklerinde onlarda da kanser başlattığı için
KKH olma ihtimali yüksek olduğu gösterilmiştir. K562S hücrelerde CD34 ve CD38
anlatımlarının olmadığı hem literatür sonuçlarında hem de bu yapılan analizler
sonucunda gösterilmiştir. Ancak, P-gp anlatımının ilaç direncine paralel olarak
artmasıyla birlikte CD34 ve CD38 anlatımı da artmıştır. CD34 anlatımı, P-gp anlatımı
olan hücrelerin yaklaşık %7’sinde, CD38 anlatımı ise P-gp anlatımı olan hücrelerin ise
yaklaşık %50’sinde vardır. Sonuçta doksorubisine karşı direnç kazanan hücrelerin ilacı
dışarı salarak verdiği cevabın yanında aynı zamanda KKH özelliklerini de kazanıp
kazanmadığı önem kazanmaktadır. Daha fazla çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
Doksorubisin genel olarak kullanımı çok yaygın olan bir kemoterapik ilaçtır.
Bununla birlikte hem P-gp’nin hem de MRP’lerin substratı olduğu için etkisi kullanım
boyunca azalmaktadır. En önemli özelliklerinden bir tanesi de NO sentezini
arttırmasıdır. NO, birçok fizyolojik ve patolojik şartları içeren çok fonksiyonlu hücre içi
bir habercidir. Apotozda NO’in rolünün araştırılması ile ilgili yapılan çalışmalarda
molekülün pro- veya anti-apoptotik etkiye sahip olabileceğini gösteren bulgular elde
edilmiştir (66,67,68,69). Lösemi ve lenfoma hastalarından alınan kanlar ile yapılan
deneyler sonunda NO’in bu hücreler üzerine stotoksik etkisi olduğu gösterilmiştir (70).
Bu da çeşitli hematolojik malignitelerde NO vericilerini kullanma ihtimalini ortaya
çıkarmaktadır. Aynı zamanda NO sentezinin azalması çoklu ilaç direnci mekanizması
fenotiplerinin oluşumunun değişmesine ve NO üretiminin başlamasıyla bu fenotiplerin
geri döndürülebileceğini gösteren bir çalışma da bulunmaktadır (71). Son aşamada, NO
molekülünün ilaç direnci gelişmiş hücrelerdeki apoptoz üzerine etkisine bakıldı.
Öncelikle hem K562S hem de K562D hücreleri ilk 24 saat NO vericisi SNAP ile inkübe
edildi ve doksorubisine dirençli hücrelerin NO vericisi SNAP’e de dirençli olduğu
apoptoz analizlerine bakarak değerlendirildi. Hem K562S hem de K562D hücreleri ilk
24 saat NO vericisi SNAP ile ardından 33 µΜ doksorubisin ile 24 saat muamele
edildikten sonra apoptoz analizleri yapıldı. Bu analizler sonucunda, K562S hücrelerinde
SNAP apoptozu indüklerken, K562D hücrelerinde SNAP varlığında ise apoptoz
değerlerinin ortalama gerilediği belirlenmiştir. Dirençli ve duyarlı K562 hücrelerinin
NO varlığında apoptoza gidişlerinde farklılıklarının olması hücre içi NO seviyeleriyle
ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.
45
Son yıllarda yapılan çalışmalarda, antiapoptotik etkinin cGMP’deki artma ile,
apoptotik proteinlerin ve NF-κB transkripsiyon faktörlerin aktivasyonu ile olabileceği
düşünülmektedir. Bu etkilerin hücreden hücreye değişibileceği de ifade edilmektedir.
Örneğin PC12 ve U937 karaciğer hücrelerinde, NO’in antiapoptotik etkisi sitokrom c
salınımı, seramid oluşumu ve kaspas aktivasyonu ile birliktedir. Aynı zamanda, NO’in
antikanser ilaçların çalışma mekanizmasına müdahele ettiği ve ilacın hücre dışına
çıkışını inhibe ettiği için doksorubisine karşı oluşan direnci geri döndürdüğü
gösterilmiştir. Ancak doksorubisine karşı direnç gelişmiş hücrelerde bu sürecin nasıl
işlediği konusu hakkında henüz çalışılmamıştır. Bu tez çalışmasında elde edilen veriler
ile ilaç direnci üzerine NO’in etkisinin anlaşılmasında faydalı olacağı düşünülmektedir.
46
KAYNAKLAR
1) Hirose M, Hosoi E, Hamano S, Jalili A. Multi drug resistance in hematological
malignancy. J Med Invest.2003; 50(3-4):126-135.
2) Gottesman MM, Fojo T, Bates SE. Multidrug resistance in cancer: role of ATPdependent transporters. Nat Rev Cancer.2002; 2: 48–58.
3) Fornari FA, Randolph JK, Yalowich JC, Ritke MK, Gewirtz DA. Interference by
doxorubicin with DNA unwinding in MCF-7 breast tumor cells. Molecular
Pharmacology.1994; 45: 649–656.
4) Boo S, Kopecka J, Brusa D, Gazzano E, Matera L, Ghigo D, Bosia A, Riganti C.
iNOS activity is necessary for the cytotoxic and immunogenic effects of doxorubicin in
human colon cancer cells. Mol Cancer. 2009; 5:8:108.
5) Mealey, K.L. Therapeutic Implications of the MDR-1 Gene. J. Vet. Pharmacol.
Therap. 2004; 27: 257-264
6) Büyükbingöl E. Farmasötik Kimya-2 Ders Notları.2009;1-9 Erişim: 12.6.2013,
http://medisinalkimya.net/jlms/docs/0007 pdf.
7) Kolb JP. Mechanisms involved in the pro- and anti-apoptotic role of NO in human
leukemia. Leukemia.2000; 14: 1685-94.
8) Bouchier Hayes L. Lartigue L. Newmeyer D. Mitochondria pharmacological
manipulation of cell death. Cancer 2005;115 (10):2640.
9) Lüleyap Ü. Moleküler genetiğin esasları Adana: Nobel;2008; 1: 1-437.
10) Kerr J.F.R. Wyllie A.H., Currie A.R. Cell death: the significance of apoptosis.
Int Rev Cytol.1980; 68: 251-306.
11) Fulda S. Debatin KM. Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer
chemotherapy. Oncogene.2006; 25: 4798-4811.
12) Onat H.(2013).Kanser Kemoterapi El Kitabı.(8.baskı). Çukuova. Nobel.1-875.
13) Coley HM. Mechanisms and strategies to overcome chemotherapy resistance in
metastatic breast cancer. Cancer Treat Rev. 2008; 34(4):378-90.
14) K.J. Patel. Distribution of anti-cancer drugs within solid tumors and normal tissues
its potential for modification to improve therapeutic index. (Thesis) 2011;13-22.
15) Schinkel AH, Jonker JW. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding
cassette (ABC) family: an overview. Adv Drug Deliv Rev. 2003; 55: 3-29.
47
16) Lin JH, Yamazaki M. Role of P-glycoprotein in pharmacokinetics: clinical
implications. Clin Pharmacokinet. 2003; 42: 59-98.
17) Ravna AW, Sager G. Molecular modeling studies of ABC transporters involved in
multidrug resistance. Mini Rev Med Chem. 2009; 9: 186-193.
18) Padowski JM, Pollack GM. Pharmacokinetic and pharmacodynamic implications of
P-glycoprotein modulation. Methods Mol Biol. 2010; 596: 359-384.
19) Zhang Y, Benet LZ. The gut as a barrier to drug absorption: combined role of
cytochrome P450 3A and P-glycoprotein. Clin Pharmacokinet. 2001; 40: 159-168.
20) Klaassen CD, Aleksunes LM. Xenobiotic, bile acid, and cholesterol transporters:
function and regulation. Pharmacol Rev. 2010; 62: 1-96.
21) Del Amo EM, Heikkinen AT, Mönkkönen J. In vitro-in vivo correlation in Pglycoprotein mediated transport in intestinal absorption. Eur J Pharm Sci. 2009; 36:
200-211.
22) Juliano RL, Ling Toxicol Lett. 2005V. A surface glycoprotein modulating drug
permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta. 1976; 455:
152-162.
23) Fromm MF. The influence of MDR1 polymorphisms on P-glycoprotein expression
and function in humans. Adv Drug Deliv Rev. 2002; 54: 1295-1310.
24) Balayssac D. Authier N. Cayre A. Coudore F. Does inhibition of P-glycoprotein
lead to drug-drug interactions? Toxicol Lett. 2005; 156: 319-329.
25) Huls M, Russel FG, Masereeuw R. The role of ATP binding cassette transporters in
tissue defense and organ regeneration. J Pharmacol Exp Ther. 2009; 328: 3-9.
26) Fromm MF. Importance of P-glycoprotein at blood-tissue barriers. Trends
Pharmacol Sci. 2004; 25: 423-429.
27) Marchetti S, Mazzanti R, Beijnen JH, Schellens JH. Concise review: Clinical
relevance of drug-drug and herb-drug interactions mediated by the ABC transporter
ABCB1 (MDR1, P-glycoprotein). Oncologist. 2007; 12: 927-941.
28) Kunta JR, Sinko PJ. Intestinal drug transporters: in vivo function and clinical
importance. Curr Drug Metab. 2004; 5: 109-124.
29) Aszalos A. Drug-drug interactions affected by the transporter protein, Pglycoprotein (ABCB1, MDR1) II. Clinical aspects. Drug Discov Today 2007; 12: 838843.
48
30) Stavrovskaya AA, Stromskaya TP. Transport proteins of the ABC family and
multidrug resistance of tumor cells. Biochemistry (Mosc) 2008; 73: 592-604.
31) Takano M, Yumoto R, Murakami T. Expression and function of efflux drug
transporters in the intestine. Pharmacol Ther. 2006; 109: 137-161.
32) Zhou SF. Structure, function and regulation of P-glycoprotein and its clinical
relevance in drug disposition. Xenobiotica 2008; 38: 802-832.
33) Lee CH. Reversing agents for ATP-binding cassette drug transporters. Methods Mol
Biol. 2010; 596: 325-340.
34) Vaalburg W, Hendrikse NH, Elsinga PH, Bart J, van Waarde A. P-glycoprotein
activity and biological response. Toxicol Appl Pharmacol. 2005; 207:257-260.
35) Yuan H, Li X, Wu J, Li J, Qu X, Xu W, Tang W. Strategies to overcome or
circumvent P-glycoprotein mediated multidrug resistance. Curr Med Chem. 2008; 15:
470-476.
36) Morjani H, Madoulet C. Immunosuppressors as multidrug resistance reversal
agents. Methods Mol Biol. 2010; 596:433-446.
37) Đmamoğu G.D. (2006) Pelvik bölgeye radyoterapi uygulanan serviks kanserli
hastalarda oluşan yan etkilerle serum nitrik oksit seviyesi arasındaki ilişki. (Tez). Dr.
Lütfi Kırdar Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Đstanbul.
38) Güray A, Samancı N, Ovalı F, Dağoğlu T. Nitrik Oksit Fizyolojisi ve Klinik Önemi.
Türkiye Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi 1997; 17(2):115-9
39) Özkan M, Yüksekol Đ. Türk Toraks Dergisi 2003;4(1):088-094.
40) Martin J H J, Alalami O, Van den Berg H W. Reduced expression of endothelial
and inducible nitric oxide synthase in a human breast cancer cell line which has
acquired estrogen independence. Cancer Lett. 1999; 144: 65–74.
41) MacRitchie A N. Jun S S. Chen Z, German Z. Yuhanna IS. Sherman TS. Estrogen
up regulates endothelial nitric oxide synthase gene expression in fetal pulmonary artery
endothelium. Circ Res. 1997; 81: 355–362.
42) Plate K H. Breier G. Millauer B. Ullrich A. Risau W. Up-regulated of vascular
endothelial growth factorand its cognate receptors in a rat glioma model of tumor
angiogenesis. Cancer Res. 1993; 53: 5822–5827.
43) Ku D D, Zaleski J K, Liu S. Brock TA. Vascular endothelial growth factors induced
EDRF dependent relaxation in coronary arteries. Am J Physiol. 1993; 265:586–592.
49
44) Coşkun U. Gunel N. Sancak B. Gunel U. Onuk E. Bayram O. ve ark. Significance
of serum vaskuler endothelial growth factor, insulin- like growth factor-1 levels and
nitric oxide activitiy in breast cancer patients. Breast. 2003; 12(2): 104-10.
45) Saydam G. Aydın HH. Đnvolvement of protein phosphatase 2A in interferon alfa2b
inducedapoptosis in K562 human CML cells. Leukemia research. 2003; 27: 709-717.
46) Ohshima H, Baithch H. Chronic infections and inflammatory process as cancer risk
factors: possible role of nitric oxide in carcinogenesis. Mutat Res. 1994; 305:253–264.
47) Brown JM, Giaccia AJ. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and
problems) for cancer therapy. Cancer Res. 1998; 58: 1408–16.
48) Whorton AR. Simonds DB. Piantadosi CA. Regulation of nitric oxide synthesis by
oxygen in vascular endothelial cells. Am J Physiol. 1997; 272:1161–6.
49) McCormick CC, Li WP, Calero M. Oxygen tension limits nitric oxide synthesis by
activated macrophages. Biochem J. 2000; 350(3): 709–16.
50) Matthews NE, Adams MA, Maxell LR. Nitric oxide-mediated regulation of
chemosensitivity in cancer cells. J Natl Cancer Inst. 2001; 93(24): 1879-85.
51) Vaupel P, Kallinowski F, Okunieff P. Blood flow, oxygen and nutrient supply, and
metabolic microenvironment of human tumors: A review. Cancer Res.1989; 49: 6449–
6465.
52) Kimura H, Braun RD, Ong ET. Fluctuations in red cell flux in tumor microvessels
can lead to transient hypoxia and reoxygenation in tumor parenchyma. Cancer Res.
1996; 56: 5522–5528.
53) Wink DA, Vodovotz Y, Laval J. The multifaceted roles of nitric oxide in cancer.
Carcinogenesis 1998; 19: 711-721.
54) Das UN. Fırat Üniversitesi Sağlık Bil. Dergisi. A radical approach to cancer. Med
Sci Monit 2002; 8: 79-92.
55) Tozer GM, Everett SA. Nitric oxide in tumor biology and cancer therapy. Clin
Oncol. 1997; 9: 357–364.
56) Seçkin D. Onur R.Đlhan N. Prostat Kanser ve Benign Prostat Hiperplazi Hastalarda
Plazma Vasküler Endotel Büyüme Faktörü, Oksidatif Stres Ve Nitrik Oksit Đlişkisi.
Fırat Üniversitesi Sağlık Bil. Dergisi 2005; 19(4): 277-281.
57) Wamvakas S, Schmidt HHHW. Just say NO to cancer? J Natl Cancer Inst. 1997;
89: 406-407.
50
58) Adams MA. Maxwell LR. Goftoni TE. Graham CH. Nitric Oxide-Mediated
Regulation of Chemosensitivity in Cancer Cells. Journal of the National Cancer
Institute 2001; 93(24):1879-85.
59) Vanhoutte PM. Endothelium and control of vascular function: state of the art
lecture. Hypertension. 1989; 13: 658–667.
60) Law M. Radiation-induced vascular injury and its relation to late effects in normal
tissue. Adv Radiat Biol. 1981; 9: 37–73.
61) Sugihara T. Hattori Y. Yamamoto Y. Qi F. Ichikawa R. Sato A. ve ark. Preferential
Impairment of Nitric Oxide–Mediated Endothelium-Dependent Relaxation in Human
Cervical Arteries After Irradiation. Circulation 1999; 100: 635-641.
62) Assreuy J, Cunha FQ, Epperlein M, Noronha-Dutra A, O'Donnell CA, Liew FY,
Moncada S. Production of nitric oxide and superoxide by activated macrophages and
killing of Leishmania major. Eur J Immunol. 1994; 24: 672-6.
63) Moncada S, Higgs EA. Molecular mechanisms and therapeutic strategies related to
nitric oxide. FASEB J 1995; 9: 1319–1330.
64) Lala PK. Significance of nitric oxide in carcinogenesis, tumor progression and
cancer therapy. Cancer Metastasis Rev. 1998; 17: 1–6.
65) Ambs S. Merriam WG. Ogunfusika MO. Bennett WP. Ishibe N. Hussain SP. P53
and vascular endothelial growth factor regulate tumor growth of NOS 2-expressing
human carcinoma cells. Nat Med. 1998; 4: 1371–1376.
66) Wink DA. Mitchell JB. Chemical biology of nitric oxide: insights into regulatory,
cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radical Biol Med.1998;
25: 34-56.
67) Moulder JE. Rockwell S. Tumor hypoxia: its impact on cancer therapy. Cancer
Metastasis. Rev. 1987; 5(4): 313–41.
68) Blaise G. Gauvin D. Gangal M. and Authier S. Nitric oxide, cell signaling and cell
death. Toxicology 2005; 208: 177-92.
69) Filep JG Baron C. Lachance S. Perreault C and Chan JS. Involvement of nitric
oxide in oxide in target-cell lysis and DNA fragmentation induced by murine natural
killer cells. Blood.1996; 87: 5136-43.
70) Tsumori M. Tanaka J.Koshimura K. Kawaguchi M. Murakami Y. and Kato Y.
Cytotoxic effect of nitric oxide on human hematological malignant cells. Acta Biochim
Pol.2002; 139-44.
51
71) Riganti C. Miraglia E. Viarisio D. Costamagna C. Pescarmona G. and Ghigo D.
Nitric oxide reverts the resistance to doxorubicin in human colon cancer cells by
inhibiting the drug effux. Cancer Res. 2005; 65: 516-25.
52
ÖZGEÇMĐŞ
Kişisel Bilgiler
Adı
Sibel
Soyadı
Ülkü
Doğ.Yeri
Đstanbul
Doğ.Tar.
08.11.1977
Uyruğu
T.C
TC Kim No
16366293826
Email
[email protected]
Tel
05053123977
Eğitim Düzeyi
Mezun Olduğu Kurumun Adı
Mez. Yılı
Doktora
Yük.Lis.
Lisans
Trakya Üniversitesi-TIP Fakültesi
2002
Lise
Sırrı Yırcalı Anadolu Lisesi-Balıkesir
1995
Đş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın)
Görevi
1. Pratisyen Hekim
Kurum
Süre (Yıl - Yıl)
Sağlık Bakanlığı
2003- 2013
2.
-
3.
-
Yabancı
Okuduğunu
Dilleri
Anlama*
Đngilizce
iyi
Konuşma*
Yazma*
iyi
*Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin
iyi
KPDS/ÜDS
(Diğer)
Puanı
Puanı
51
53
Sayısal
LES Puanı
Eşit Ağırlık
Sözel
60
(Diğer) Puanı
Bilgisayar Bilgisi
Program
Kullanma becerisi
Microsoft Office 07
Đyi
Yayınları/Tebligleri Sertifikaları/Ödülleri
Özel Đlgi Alanları (Hobileri): Yüzmek, Müzik dinlemek
Download