HLA TAYİNİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER,SORUNLAR ve

HLA TAYİNİNDE KULLANILAN
YÖNTEMLER,SORUNLAR
ve
ÇÖZÜM ÖNERİLERİ
Dr. Türkan Patıroğlu
Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi
Pediatrik Hematoloji ve İmmünoloji Bilim Dalları
Kayseri
HLA-Klinik önemi
•
•
•
•
Antropolojik çalışmalar
Babalık tayini
Hastalıklarla ilişki
Transplantasyon:
Renal: Graft ömrünü etkiler,
Renal ve pankreas:HLA-DR daha önemli
KİT: Tam uyum (GvHH)
Güvenirlik
• HLA-klas I ve klas-II için %97
HLA Tiplendirme Testleri
Serolojik test
Moleküler testler
Mikrolenfositotoksisite
(PCR’a dayalı testler)
SP,SSO,SSPC,SBT
Hücresel testler
(Miks lenfosit
Reaksiyonu)
Serolojik Testler
Makroaglütinasyon
Mikrolenfositotoksisite
Seroloji Plakları
Klas-I ve II
Kuyucuk sayısı:
60,72,120,144
Kullanılan Hücrelerin Özellikleri
•
•
•
•
Viabilite
Saflık
Temizlik
Hücrelerin izolasyonu
-48 st içinde kullanılmalı
-Buffy coat eldesi
-Magnetik boncuklar ile T-B hücre
saflaştırılması
Mikrolenfositotoksisite Yöntem
• Plak oda ısısında eritilir
• Kompleman hazırlanır(1viyal 2 ml distile su)
• 1 µl hücre süsp. kuyucuklara konur
• Oda ısısında(18-22 C) 30 dk beklenir
• 5 µl tavşan komplemanı eklenir
• 1 µl boya solüsyonu eklenir
• +4 C’de 15 dk. karanlıkta saklanır
• Okuma (floresan ataçmanlı mikroskopta)
Mikrolenfositotoksisite Skorlama
Ölü hücre %
Skor
Değerlendirme
0-10
1
11-20
2
Olası
(-)
21-50
4
Zayıf
(+)
51-80
6
(+)
81-100
8
Kuvvetli (+)
(-)
Mikrolenfositotoksisite Sorunlar
Yalancı pozitiflik:
•
•
•
•
•
•
Lenfosit kalitesinin kötü olması
Kontaminasyon
Komplemanın kuvvetli olması
İnkübasyon sürelerinin uzaması
Isının yüksek olması
Diğer hatalı teknik detaylar
Mikrolenfositotoksisite Sorunlar
Yalancı negatiflik
•
•
•
•
•
•
Trombosit ve granülosit kontaminasyonu
Komplemanın unutulması
İnkübasyon sürelerinin kısa olması
Isının düşük olması
Hastanın aldığı ilaçlar
Diğer hatalı teknik detaylar
– Antiserumun bozuk olması,
– Uygunsuz taşınma
– Kuyucuklardaki hücre sayısının fazlalığı
Mikrolenfositotoksisite
Avantajları
• Basit
• Hızlı
Dezavantajları
• Hata payı yüksek
(ölü hücrelerin değerlendirilmesi subjektif)
• Yetersiz B lenfosit izolasyonu
(klas-II için)
• CREG
• Tekrarı zor
(Ag-Ab-C birleşmesine bağlı)
• Saptanamayan aleller veya tek alel
saptanması
• Yanlış saptanan aleller
Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?
Zayıf (+)ise:
• Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı
• Eleme yöntemi
A32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)
olmalı
• CREG tablolarının kullanılması
• Linkeage disequilibriumReaksiyonlar
Etnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir
Bw4, Bw 6 Birliktelikleri
Bw4
Bw6
B5
B53
B7
B41
B65(14)
B5102
B57(17)
B703
B42
B67
B5103
B58(17)
B8
B45(12)
B70
B13
B59
B14
B46
B71(70)
B17
B63(15)
B18
B48
B72(70)
B27
B77(15)
B22
B50(21)
B73
B2708
B54(22)
B75(15)
B37
B38(16)
A9
B35
B55(22)
B76(15)
B44(12)
A23(9)
B39(16)
B56(22)
B78
B47
A24(9)
B 3901
B60(22)
B81
B49(21)
A2403
B3902
B61(40)
B51(5)
A25(10)
B40
B62(40)
B52(5)
A32(19)
B4005
B64(14)
Marsh SGE, Parham P, Barber LD, 2000
Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?
Zayıf (+)ise:
• Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı
• Eleme yöntemi
A32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)
olmalı
• CREG tablolarının kullanılması
• Linkeage disequilibriumReaksiyonlar
Etnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir
Cross Reaktif Antijen Grupları (CREG),
Bw4 Bw6 Bulunduran Antijenler
CREG
Yer Alan Antijenler
A01C
A1, A3, A11, A29, A30, A31, A36, A80
A10C
A10, A11, A19, A25, A26, A32, A33, A34, A43, A66, A74
A02C
A2, A9, A23, A24, A28, A68, A69, A203, A210, A2403, B17,
B57, B58
B05C
B5, B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102, B5103
B07C
B7, B8, B13, B22, B27, B40, B41, B42, B47, B48, B54, B55,
B56, B59, B60, B61, B67, B81, B82, B703
B08C
B8, B14, B16, B18, B38, B39, B59, B64, B65, B67, B3901,
B3902
B12C
B12, B13, B21, B37, B40, B41, B44, B45, B47, B49, B50, B60,
B61, B4005
B21C
B5, B15, B17, B21, B35, B46, B49, B50, B51, B52, B53, B57,
B58, B62, B63, B70, B71, B72, B73, B75, B76, B77, B78,
B4005, B5102, B5103
Çapraz Reaksiyonlar
Aynı kuyuda 2 farklı Ag
ile reaksiyona giren 2
farklı Ab olabilir
Isı, süre,komplemanın
şiddeti çapraz reak
oluşturabilir
Antiserum 2 farklı Ag
üzerinde de bulunan
ortak bir antijenik epitop
ile reaksiyon verebilir
(CREG)
Homozigotluk durumunda
beklenmeyen çapraz
reaksiyon olabilir. A2 için
homozigot ise, A28 ile
çapraz reaksiyon
CREG
Çin’de yapılan bir çalışmada: A 19, B62,B40,B75
Tan et al.Transplantation Proceedings 2000:32
Kadaverik renal transplantasyonda CREG ile graft ömrü
ilişkili bulunmuş
Laux G, Opelz G. Transplantation 2004
Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?
Zayıf (+)ise:
• Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı
• Eleme yöntemi
A32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)
olmalı
• CREG tablolarının kullanılması
• Linkeage disequilibriumReaksiyonlar
Etnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir
• Aile çalışmaları
Haplotip belirleme
Antijenik birliktelikler
Eksik Ag tanımlama
Homozigotluğun tanımlanması
Etnik özelliklerin gösterilmesi
• Moleküler çalışma
Moleküler Teknik Avantajları
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Güvenilir (seroloji=düşük çözünür )
Hızlı (SSP 4 st, kadavra için bile zaman uygun)
Canlı hücre gerektirmez
DNA, herhangi bir çekirdekli hücreden elde edilebilir
Örnek volümü daha az
Lenfosit kalitesi kötü olsa bile sonuç verir
Homozigot ise tam gösterim
Otomasyona daha uygun
Serolojide tanımlanamayan aleller bulunabilir
Kalitesi kötü lenfosit
• Yetersiz sayıda lenfosit
(Lösemi veya aplastik anemi,kemoterapi)
• Uzun süreli hemodiyaliz
• İzole edilen lenfositlerde ölü hücre oranının yüksek olması
Moleküler Teknik Avantajları
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Güvenilir (seroloji=düşük çözünür )
Hızlı (SSP 4 st, kadavra için bile zaman uygun)
Canlı hücre gerektirmez
DNA, herhangi bir çekirdekli hücreden elde edilebilir
Örnek volümü daha az
Lenfosit kalitesi kötü olsa bile sonuç verir
Homozigot ise tam gösterim
Otomasyona daha uygun
Serolojide tanımlanamayan aleller bulunabilir
Mikrolenfositotoksisite Moleküler yöntem
Karşılaştırmaları
•
•
•
•
İki yöntem arasında hata %23; HLA-A:%8.8,HLA-B:%14.2
En sık hata: B15:%13.9, A32:%7.2, A31:%5.7
Klas-I’de hata %8.5
Klas-II’de hata %20
Mytilineos J et al.Human Immunol 1998;59
KİT hastalarında %30.6 sonuç yok
En sık hata:HLA- A10, A19 ve B15
Seyhun Y ve ark.Gaziantep Tıp Dergisi2008,41
Kord kanı HLA çalışması %13.8
Li D et al.ZhonghuaXue YeXueZaZhi 2000;21
Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem
Karşılaştırmaları
Saptanamayan
aleller
B15;%24,
A32;%7.9
A33;%4.5
Homozigot ?
B15 %15
B53 %8.1
A32 %6.9
Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları
•
•
•
•
Tan(n:525)
Mytilineous(n:421)
Kulcsarova(n:50)
Seyhun(n:1567)
A(%)
B(%)
9
4.8
9
24.1
12.2
10.5
11
15.8
Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem
Karşılaştırmaları
HLA-C ekspresyonu A ve B’ye göre daha zayıf
1 alel noksanlığı %78.2
Yanlış sonuç %13.7, Cw7 aleli Cw5 olarak değerlendirilmiş
Torio a et al.Transplantation Proceedings2004;34
Serolojik HLA-Cw
HLA-Cw noksanlığı
Tek Cw noksanlığı
2 Cw alel noksanlığı
n:1203
n:26
n:13
n:13
Mytilineous et al.Tissue Antigen1997;50
Moleküler Yöntemler
• SSP: Sequence Specific Priming (bir alel veya alel
grubuna yönelik primerler)
• SSO: Sequence Specific Oligonucleotid (tüm bölgeyi
içeren primerler)
• SSCP:Sequence Specific Conformational Polymorphism
• SBT: Sequence Based Typing
SSP
Primer hangi alel için hazırlanmış ise DNA’nın o kısmına bağlanır.
Primer’e özgü segment varsa Amplifikasyon olur
Yöntem:
DNA izolasyonu
DNA amplifikasyonu
Elektroforez
Görüntüleme
Verilerin sisteme girilmesi
Analiz
SSP: Tekrar Gereken Durumlar
•
Kuyularda (+) bandın yokluğu ile birlikte internal kontrol bandın olmayışı
• Reaksiyon olmayan kuyu ile tezat bir sonuç varsa;Örnek:DRB1 için
23+(DR53),8+(DR4),9(DR7) çalışmamış ise
• İkiden fazla sonuç veriyorsa; (DR15 ve DR11, DR15 ve DR13
vb.DR11?DR13?)
•
Seroloji ile uyumsuz bir sonuç varsa;
•
Nonspesifik bandlar fazla ise;
•
Bandlar çok soluk ise,
•
Aile içinde klas-I tam uyumlu ama klas-II’de uyumsuzluk varsa
SSP: Sorunlar-I
Reaksiyon yok
• Az veya kalitesiz DNA
Reaksiyonun zayıf olması
• Az veya kalitesiz DNA
Bir lokusta beklenenden çok alele özgü band var
• Yeni bir alel olabilir
• Kontaminasyon varsa, bantların koyu olması gerekir
Tüm lokuslarda çok sayıda alel spesifik bandlar olması
• PCR kaynaklı olabilir;
• Program kesintileri etkiler (nonspesifik bağlanmalar nedeni ile)
• Örnek veya master mix kontaminedir
SSP: Sorunlar-II
Bir lokusta alele uygun band yok?
• Bilinmeyen bir alel için homozigotluk
• Kitler doğru koşullarda saklanmamışsa
• Hatalı master mix
Alele özgün band var ama kontrol bandı yok?
Kontrole ait band var ama alele özgün band yok?
• Hatalı master mix
• Cihazın kullanımı ile ilgili sorunlar olabilir
Çalışmanın bir kısmı sorunlu ?
• Genellikle cihazın kullanımı ile ilgilidir
Hasta
A*02
A*26
B*38
B*51
DRB1*10
DRB1*13
Kardeş
(Kord kanı)
A*02
A*26
B*38
B*51
DRB1*13
DRB1*13??
Anne
DRB1*04
DRB1*13
Baba
DRB1*10
DRB1*15
SSP: Sorunlar ve Öneriler
DNA kalitesini artırmak için;
• Daha az DNA, 2 kat taq polimeraz konmalı
• DNA zaman içinde bozulmuşsa,örnek yenilenmeli
Bandlar soluk ise;
• Daha fazla DNA
• Master mix yeniden hazırlanmalı
• Taq miktarı artırılmalı
Beklenenden çok alel varsa;
• Yeni bir alel mi? Sekans yapılmalı
•
•
•
Cihaz hatalarında çalışma tekrarlanmalı, cihaz kalibre edilmeli,
Hata belli bir lot ile oluyorsa, değiştirilmeli
Özellikle verici akraba dışı ise yüksek çözünürlükte çalışma yapılmalı
SSO
•
Bir HLA bölgesine özgün primerler kullanılarak çoğalma sağlanır
•
Specific oligonucleotidlerin boncuk gibi katı bir ortamda bağlanması
•
Reaktif eklenmesi
•
Hibridizasyon
•
Yıkama işlemi
•
Enzim işaretli avidin eklenmesi ile DNA’nın enzimle işaretlenmesi
•
Enzimin substratının ortama ilavesi ile hangi oligonükleotid probun bağlandığı
saptanır
SSO Dezavantaj
• Bölgeye özgün olanlardan başka gruba özgün çalışmaların
yapılması
Moleküler Yöntem Dezavantajları
• Çok sayıda tüp,primer ve işlem gerektirir
• Doğru sonuç için tüm eksonlar değerlendirilmeli
• HLA alelleri arasında ortak dizilimlerden dolayı
karışıklıklar olabilir. Bu nedenle duyarlılığı artırıcı
yöntemler (“nested PCR”, ”multiplex PCR”)
kullanılabilir
Neden Multiplex?
• Farklı allellere özgü olan farklı probları taşıyan farklı
renklerdeki (~100 renk) boncukları kullanarak aynı
anda pekçok allelin varlığının test edilebilmesi
• HLA allellerinin düşük/orta/ yüksek çözünürlükte
belirlenebilmesi
Luminex
Mikro boncukların kullanımına dayalı, çoklu analiz
imkanı olan, floresan ölçümü yapabilen hibridizasyon
ve floresan tayin yöntemlerini birlikte kullanan
multiplex bir sistem
Luminex:Yöntem
• DNA izolasyonu
• DNA amplifikasyonu
• Hibridizasyon
• Quicktype for LifeMatch
kullanarak hasta girişleri
• Çalışmanın okutulması
• Analiz
Luminex:Sorunlar ve çözüm
• DNA’nın bozulması veya az olması reaksiyonda yetmezliklere neden
olur.DNA kalitesine duyarlı olan lokuslar sırasıyla: C > A > B > DQ > DR dir.
• DNA kontaminasyonu karmaşık sonuçlar alınmasına yol açar.
• Sık DNA sorunu varsa hibridizasyon öncesi jel elektroforezi uygulanarak
amplifikasyonun kontrol edilmesi gerekir
• Materyalin taşınması , ısı ve ışıktan ( probeMixve SA-PE) koruması,
süreye uyum önemlidir
• Çalışma için sadece rekombinant Taq polimeraz kullanılmalıdır.
• İyi karışmayan boncuklar, düşük prob sayımlarına ve verilerin analiz
edilemesine sebep olur.
Luminex:Sorunlar ve çözüm
• Plastik malzemelerin kalitesiz olması, boncukların bu malzemenin
çeperine yapışmasına neden olur ve analiz sorunlarına yol açar
• Hibridizasyon sırasında olabilecek buharlaşmalar, bazan yetersiz sonuç
alınmasına sebep olabilir.
• Hazırlanan SA-PE solusyonunun iyi karışmaması çalışmada farklı tip
sonuçlara neden olur
• Amplifiye olmus ürünler en kısa sürede işleme konmalıdır,yükleme
cihaza hemen yapılamayacaksa ürün 3 gün boyunca 2-8˚C’de saklanabilir.
En çok 1 hf.-20˚C’de saklanabilir.
• Her koşulda bir negatif ve bir pozitif kontrol kullanılması gerekir.
SBT
Aleller, nükleotid dizilerinin incelenmesi ile
bulunur
• Klas-I için:Ekson 2-3
• Klas-II için:Ekson 2
İlk adım:
Lokusa veya alel sekansına özgü primerler
Ampflikonların oluşması
İkinci adım:Reaksiyonun durdurulması
SBT:Avantajları
• Seroloji ile saptanamayan aleller
• Benzer alellerin ayırımı
• Mutasyonların saptanması
Miks Lenfosit Reaksiyonu(MLR)
• Kültür ortamındaki lenfositlerin aynı ortamdaki ikinci
bir seri hücrenin yüzey Ag’lerine karşı çoğalmasıdır
• Bir hücre serisi ışınlama veya mitomisin-C ile immün
cevapsız hale gelir
• Uyarılan hücrelerin çoğalması radyoaktif yöntemlerle
ölçülür
• HLA-Klas II antijenlerinin uyum veya uyumsuzluğu
gösterilir
Öneriler
• İyi bir değerlendirme için: Irk,haplotip bilgisi, popülasyondaki alel
sıklığı dikkate alınmalı
• Alıcı-verici için: HLA-A,B,DR çalışılmalı
• Hasta KİT’e hazırlanıyorsa moleküler yöntem tercih edilmeli
• Uygun donör taraması için seroloji yapılmalı
• Donör arama:Hastanın 1 derece akrabaları taranmalı
• Hematolojik malignite varsa moleküler yöntem tercih edilmeli
SBT
Ne zaman yapalım ?
• Diğer yöntemlerle saptanamayan HLA tiplerinde
• KİT için akraba dışı donör aranmasında
Sorunlar ?
Eğitimin sürekliliği
Uluslar arası kalite kontrolu
EFI veya ASHI akreditasyonu