mikrobiyolojide biyoteknoloji

advertisement
MİKROBİYOLOJİDE
BİYOTEKNOLOJİ
Doç. Dr. Funda BAĞCIGİL
Biyoteknoloji;
Genetik materyallerde moleküler düzeyde yapılan
manipulasyonlarla
yeni ve istenilen fenotipte organizmalar ve faydalı ürünler
elde etmektir
1920’li yıllar.....
1960 sonlarına doğru Arber ve Smith.... Restriksiyon endonukleazlar
Mikrobik biyoteknoloji,
yiyecek üretimi için daha kullanışlı enzim ve organizma eldesi, üretim
sistemlerinin kolaylaştırılması, ……
Tarımsal biyoteknoloji,
gıda üretiminde kullanılan ekinleri daha verimli kılacak ya da ürüne
istenilen özellikleri kazandıracak genetik değişiklikleri sağlayan
teknoloji
Hayvan biyoteknolojisi,
hayvanların genetik yapısının değiştirilerek daha yararlı özelliklere
sahip hayvan ve hayvan ürünlerinin elde edilmesi (özellikle antikor üretimi)
başka bir canlının genini taşıyan hayvanlar (transgenik hayvanlar)
Örneğin insanda kan pıhtılaşması için gerekli olan protein geni ineklere verilerek,
ineklerin bu proteini sütünde üretmesi sağlanabilmektedir.
Klonlama……
3
Adli Biyoteknoloji:
Parmak izi yöntemi,
1985’den itibaren …. DNA parmak izi yöntemi
Tıbbi biyoteknoloji
hastalıkların teşhisinde ve tedavisinde,
hastalıklı genlerin sağlam genlerle değiştirildiği gen terapisi
gelişince sinir, kas, kan hücreleri gibi insan vücudunun
çeşitli hücreleri olmak üzere özelleşen olgunlaşmamış
hücrelerin kullanıldığı stem hücresi teknolojisi,
4
Restriksiyon endonukleazlar:
dışarıdan hücrelere giren yabancı DNA dizilimlerinin*,
bakterideki özel gen ya da markerlar taşıyan genetik materyalleri
ayrıştırarak, mutasyonlar meydana getirmesini engelleyen,
böylece türlerin genetik karakterlerinin stabilitesini korumakla
görevli enzimlerdir
Kısa DNA dizilerini özgül olarak tanır;
bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler
içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı keser
Bakterilerin büyük bir bölümü, bir ya da birkaç türde
restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler
E. coli RY 13 suşu
EcoRI
6

RE’lerin
aktivitelerini
gösterebilmeleri
için
bazı
optimal koşulların sağlanması gereklidir. Ör: ısı, pH, buffer vs..

Modifikasyon enzimleri?
9
Polymerase Chain Reaction-PCR
Prensip:
Hedef genetik materyallerin (DNA/RNA*)
spesifik kısa zincirli oligonukleotid primerler yardımı ile
enzimatik olarak sayısal çoğaltılması
10
PCR reaksiyon karışımı
Hedef DNA sekansları
İki tür spesifik oligonukleotid primerleri
(15-30 bazlık, tek iplikcikli)
Termostabil DNA polimeraz (Taq polimeraz)
Dört tür dNTP
Tampon çözelti, MgCl2
11
Hedef DNA sekansları
varlığı aranan, çoğaltılmak edilmek istenen hedef DNA
kan, serum, plazma, gaita, doku parçaları, idrar, sperm, saç teli
gibi inceleme örneklerinden ayrıştırılır ve saflaştırılarak
karışıma eklenir
12
Primerler
Replikasyonun başlama noktası
Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen,
bir çift kısa sentetik oligonukleotid
13
http://www.bio.davidson.edu
Nükleotidler (dNTP= deoksinükleotid trifosfat )
20-200 µM (her dört nükleotit de eşit oranda)
Karışım içindeki dNTP, Taq DNA polimerazın çalışması için gerekli MgCl2’u bağlar
konsantrasyonları birbirine paralel artmalı ya da azaltılmalı…
Enzim (Taq Polymerase)
Thermus aquaticus adlı termofilik bakteriden izole edilen ısıya dayanıklı
polimeraz enzimi
Tampon çözelti, Magnezyum
Primerlerin bağlanması ve reaksiyonların gerçekleşmesi için uygun ortam ve pH
sağlayan çözelti içerisinde Tris-HCl, KCl, MgCl2 bulunmaktadır.
Ayrıca, jelatin, sığır albumini ve tween
20 gibi deterjanlarda Taq polimeraz
enzimini stabilitesi için katılabilir.
14
PCR’ın aşamaları
1- Hedef DNA’nın denatürasyonu
2- Primerlerin bağlanması
3- Sentez/Uzama
Yeni
DNA
Hedef
sekans
Yeni
DNA
15
PCR’ın aşamaları
1- Hedef DNA’nın denatürasyonu
Nükleotid baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının yüksek ısı
yardımı ile birbirinden ayrılması sonucu çift iplikli DNA’dan tek
iplikli DNA moleküllerinin oluşması aşamasını kapsar
Yüksek ısı: 94-96 °C
Ön denatürasyon; özellikle denatürasyonu zor
olan kalıp DNA’lar için 3-5 dak. 94-96 °C
16
PCR’ın aşamaları
2- Primerlerin bağlanması
(Annealing/hibridizasyon)
Primer adı verilen tek iplikçi kısa oligonükotidlerin
uygun ısı (30-60 C) ve uygun sürede
kalıp DNA üzerindeki hedef bölgelere bağlandığı aşamadır.
Çoğaltılacak hedef bölgeye komplementer
30sn-1dk
öz. başlangıç ve bitiş noktalarını sınırlar
genellikle primerlerin erime ısısının 5º C altında, (54-65º C)
17
I. basamak
II. basamak
http://users.ugent.be/%7Eavierstr/principles/pcr.html
Primer sekansları 5’ ve 3’ olmak üzere iki uca sahip olup
amplifikasyon sürekli 5’ den 3’ yönüne doğru gerçekleşir
18
PCR’ın aşamaları
3-Sentez
(Polimerizasyon/Uzama/Extension)
Polimeraz enzimi yardımı ile tek iplikçikli
DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’—3’
yönde uzatılması
Sentez işlemi 72º C de 1-2 dakika sürede
gerçekleştirilir
19
3 basamaktan oluşan bu bir siklus yaklaşık 30 kez üst üste
tekrarlandığında hedef DNA’nın milyarlarca kopyası elde edilebilir.
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/56/Pcr.png
20
Sonuçların değerlendirilmesi
Elektroforez
PCR amplifikasyon ürünleri (amplikon)
agarose ya da poliakrilamid jele
bilinen işaret DNA lar (DNA marker)
ve
kontrol PCR ürünleri ile birlikte
yüklenerek elektrik akımına tabi tutulurlar.
ethidium bromür ile boyanır, U.V. ışığı kullanılarak incelenir.
21
22
Marker Pozitif kontrol
Negatif kontrol
Örnekler

23
POZİTİF
NEGATİF
MARKER
310- bp
ÖRNEKLER
24
Çabuk, güvenilir, duyarlı ve spesifik
Etkenin vücutta çok az sayıda olması durumlarından daha az
etkilenir
incelenen materyalin eski* ya da kontamine olmasından etkilenmez
izolasyon ve identifikasyonu zor olan bakteriyel ve viral ajanların
belirlenmesinde yararlı
Personel hatalarını, insan gücünü minimuma indirger
25
Pahalı
???
deneyimli personel
gelişmiş ekipmanlar
kontaminasyonlar
sonuçların yorumlanmasında güçlükler
26
PCR’ ın kullanım alanları
Hastalıkların tanısı
Özellikle zor üreyen bakterilerin tanısında, antibiyotik kullanmış hastalarda tanı…
Toksijenik, virulan suşların saptanmasında
Antimikrobiyal direncinin saptanmasında
Moleküler tiplendirme çalışmalarında
Epidemiyolojik çalışmalarda
Defektlerin saptanmasında
Adli tıp…………………………………
27
Farklı PCR çeşitleri:
Multiplex (Çoklu) PCR:
Bir PCR ile birden fazla DNA segmentinin (hedefin),
birden fazla primer çifti kullanarak
aynı amplifikasyon reaksiyonunda çoğaltılmasını sağlar.
28
M
pozitif kontroller
örnekler
Marker
29
Farklı PCR çeşitleri:
Nested PCR:
ardarda iki PCR yapılır.
İlk PCR ürünleri ikinci PCR için hedef olarak kullanılır.
İkinci PCR da ilk çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren
primerler kullanılarak asıl istenilen hedef bölge çoğaltılır ve daha özgün
ürünler elde edilir.
30
Farklı PCR çeşitleri:
Reverse-Transcriptase PCR (Geri Transkripsiyon PCR/ RT-PCR):
İki aşamalı olup RNA dan cDNA sentezi (geri transkripsiyon) +
komplementer DNA nın standart PCR ile çoğaltılması aşamalarını kapsar.
31
32
Moleküler tiplendirme yöntemleri
Benzer klinik bulgulara neden olan infeksiyöz
etkenlerin, antijeniteleri ve patojeniteleri farklı alt
tipleri görülebilmektedir.
Korunma ve sağaltımda
Epidemiyolojik verilerin oluşturulmasında
Serotiplendirme, biyotiplendirme, faj ile tiplendirme,
morfolojik, fizyolojik özelliklerine göre tiplendirme........
Moleküler tiplendirme
Lipopolisakkarid ve yağ asitlerin saptanması
Protein saptanması
Nukleik asitlerin saptanması
PCR a dayalı metodlar
Epidemiyolojik açıdan tiplendirme yöntemlerinin
başlıca kullanım amaçları
•Salgınların kaynağı ve yayılma yolları hakkındaki hipotezlerin test edilmesi
•Hastalıkların epidemiyolojik olarak birbirleri ile ilişkisinin belirlenmesi
•Re-aktivasyon ile yeni infeksiyonların birbirinden ayırt edilmesi
•Hastane infeksiyonları ile toplumsal kaynaklı infeksiyonların belirlenmesi
•Laboratuvar kontaminasyonlarının saptanması
•Populasyondaki epidemi klonlarının belirlenmesi, buna göre kontrol
yöntemlerinin değerlendirilmesi
35
Tiplendirme yöntemlerinin yaygın kullanılabilmesi için
sahip olması gereken kriterleri
• Tiplendirebilirlik
•Ayrım gücü
•Tekrarlanabilirlik ve Stabilite
•Kullanım kolaylığı, maliyeti, testin süresi, kullanım spektrumu
•Sonuçların kolayca yorumlanabilir olması
•Sonuçların laboratuvarlar arasında paylaşılabilir olması
36
Moleküler tiplendirmede kullanılan bazı önemli terimler
Klon:
Ortak bir atadan gelen, genetik olarak aynı bir ya da daha fazla
organizmadır
Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar:
Belli bir bölgeden ya da belli bir zaman diliminde hastalardan toplanan
örneklerden izole edilen ve ortak bir kaynaktan geldikleri düşünülen
izolatlardır
Genetik olarak ilişkili izolatlar (klonlar):
Genetik tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da
ortak bir atadan köken aldıklarını düşündürecek kadar yakın olan
izolatlar
37
Salgın suşu:
Aynı türün hem epidemiyolojik (zamna, yer, ortak kaynak) hem de
genetik olarak ilişkili aynı genetik profile sahip izolatlar
Endemik suş:
Belli bir populasyonda infekte hastalardan sıklıkla izole edilen,
tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da yakın
ilişkili bulunan ancak direkt epidemiyolojik bir bağlantı gösterilemeyen
izolatlar
38
Yakın ilişkili izolatlar:
Salgın suşundan yalnızca bir genetik olay bakımından farklı olan
izolatlar
Olası ilişkili izolatlar:
Salgın suşundan iki genetik olay bakımından farklı olan izolatlardır. Bu
izolatlar salgın suşu ile aynı genetik soydan olabilir ancak genetik olarak
yakın ilişkili değildir
İlişkisiz izolatlar:
Salgın suşundan üç genetik olay bakımından farklı olan izolatlar
39
Pulsed-Field Gel
Electrophoresis
(PFGE)
40
Moleküler tiplendirme yöntemleri içerisinde
altın standart
Düz elektroforez yöntemlerinde 30-50 kb’dan daha büyük
DNA molekülleri büyüklükleri farketmeksizin aynı hızla aynı
miktarda hareket ederler, jel içerisinde göç ederler. Bu da
jel üzerinde tek bir bant olarak gözlemlenir.
Eğer DNA elektoforez işlemi sırasında yön değiştirmeye
zorlanırsa, birbirlerinden ayrımı yapılabilecek şekilde farklı
bantlar oluşur. Bu da tiplendirmeyi olanaklı hale getirir.
41
Lizis aşamasında DNA nın parçalanmaması gerekir,
Büyük DNA molekülleri ise kolay kırılabilir özelliktedir +
pipetleme gibi işlemleri yapmak çok zordur
Sıvı ya da katı besiyerinde üretilen bakteriler düşük erime ısılı
agarozda karıştırılıp kalıplara dökülürler. Lizis işlemleri bu agar
blokları içerisinde yapılır.
Lizis aşaması sonucunda agar bloklarının içerisinde bulunanan
çıplak DNA molekülleri uygun restriksiyon enzimleri aracılığı ile
kesilir,
özel elektroforez işlemi başlatılır.
42
43
PFGE..Pulsed-Field Gel Electrophoresis
45
Yöntemin ayrım gücü çok yüksek
Zaman alıcı ve kompleks bir yöntem
Laboratuvarlar arasında standardizasyon problemi
46
47
Blotlama,
Elektriksel ortamda jel üzerinde göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan
proteinlerin veya nükleik asitlerin
bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmesi
Southern Blotlama
E.M. Southern adlı bilim adamı 1975
Herhangi bir kaynaktan elde edilen DNA’ nın analizi için kullanılan
membran blotlama ve görüntüleme tekniği
48
1- DNA izolasyonu:
Genomik ya da plazmid DNA’sı değişik yöntemlerle ekstrakte edilir.
2- Restriksiyon endonükleazlar (RE) ile kesim:
Bir önceki aşamada saf olarak elde edilen DNA süspansiyon ve RE’lar
birlikte inkube edilir. Bu süre içerisinde RE’lar DNA üzerinde
spesifik bölgeleri keser ve böylece farklı büyüklüklerde DNA
segmentleri oluşur.
3- Elektroforez:
Fragmentlere ayrılmış DNA’lar, büyüklüklerine göre elektriksel bir
ortamda jelde büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar
oluştururlar.
49
4- Membrana transfer
Jel üzerindeki DNA’ların, nitrosellüloz ya da naylon membranlara
aktarılma aşaması
Kapiller transfer, elektroforetik transfer, vakumla transfer
Prensibi;sıvı bir akımda jeldeki DNA’nın destek tabakaya geçmesidir.
Transfer oranı DNA parçalarının büyüklüklerine,
jeldeki kalıntılara,
sıvının pH sı gibi özelliklerine bağlıdır
50
51
52
53
54
55
5- Denatürasyon ve Fikzasyon:
Membran üzerine transfer edilen DNA bantları
muamele edilerek denatüre edilir
0.5 N NaOH ile
= çift iplikçikli DNA, bazlar arası bağlar koparak, tek iplikçikli hale
gelir.
Naylon membran 80º C ye ısıtılarak iplikçiklerin membran üzerine fikze
edilmesi (yapışması) sağlanır.
56
6- Hibridizasyon:
3 temel adımda gerçekleşir;
a) prehibiridizasyon: özgül olmayan bağlanmaları en aza indirmek için
blotlanması tamamlanan membranın bloklanması
b) hibridizasyon: hedef DNA ile probun birleştiği aşama
c) hibridize olmayan probların yıkanması ve görüntülenme aşaması
57
58
6- sonuçların gözle görülmesi
Kullanılan probun özelliğine göre otoradiografi, ya da özel boyama
yöntemleri ile oluşan hibrib bantlar gözle görülür hale getirilir.
59
Northern Blotlama
J.Alwine ve G. Stark, 1979
Herhangi bir kaynaktan elde edilen RNA’ nın analizi
RNA nın izolasyonu
Elektroforez
Membrana aktarma
Blotting
RNA nın saptanması
Bu teknikten, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya
organlardaki mRNA seviyesini belirlemede ve viral RNA ları saptamada yararlanılır
60
Dot/Slot Blotlama
DNA /RNA’nın elektroforez yapılamadan membrana damlatılması ve bu
membranda sabitlendikten sonra özgül dizilimlerinin belirlenmesi
Klinik materyalden DNA izolasyonu,
İki ya da beş katlı seri dilüsyon,
Her dilüsyondan naylon membran üzerine damlatma,
Denatürasyon ve fikzasyon,
Hibridizasyon,
Otoradiografi ile görüntüleme.
Çalışılan örnekteki DNA miktarı önemli, genellikle fazla miktarda DNA ile
çalışılması gerekmektedir
61
In situ Hibridizasyon
Doku, organ ve hücrelerdeki özgül nükleik asitlerin belirlenmesi
Hücre ve doku içindeki hedef nükleik asidin lokalizasyonunu belirleme
imkanı sağlar
5 temel adımda gerçekleşir;
•Dokuların işlenmesi(fikze edilme ve kesilme)
•Spesifik olmayan bağlanmaların engellenmesi
•Hibridizasyon
•Yıkama
•Görüntüleme
62
Download
Random flashcards
qweeqwqwe

5 Cards oauth2_google_78146396-8b44-4532-a806-7e25cc078908

KIRIHAN GÜMÜŞ DEDEKTÖR

6 Cards oauth2_google_49cd8e53-7096-4be6-ba73-4ff7e4195b4b

KALPTE İLETİM NOKTALARI

3 Cards oauth2_google_cfd2531f-f18a-45fd-9d97-afe31596ce7b

Terimler

2 Cards oauth2_google_ef32970e-e5f9-4595-9abe-394e9f6bc8d9

Create flashcards