MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİ
advertisement
MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİ Biyoteknoloji; Genetik materyallerde moleküler düzeyde yapılan manipulasyonlarla yeni ve istenilen fenotipte organizmalar ve faydalı ürünler elde etmektir 1920’li yıllar..... 1960 sonlarına doğru Arber ve Smith.... Restriksiyon endonukleazlar Mikrobik biyoteknoloji, yiyecek üretimi için daha kullanışlı enzim ve organizma eldesi, üretim sistemlerinin kolaylaştırılması, …… Tarımsal biyoteknoloji, gıda üretiminde kullanılan ekinleri daha verimli kılacak ya da ürüne istenilen özellikleri kazandıracak genetik değişiklikleri sağlayan teknoloji Hayvan biyoteknolojisi, hayvanların genetik yapısının değiştirilerek daha yararlı özelliklere sahip hayvan ve hayvan ürünlerinin elde edilmesi (özellikle antikor üretimi) başka bir canlının genini taşıyan hayvanlar (transgenik hayvanlar) Örneğin insanda kan pıhtılaşması için gerekli olan protein geni ineklere verilerek, ineklerin bu proteini sütünde üretmesi sağlanabilmektedir. Klonlama…… 3 Adli Biyoteknoloji: Parmak izi yöntemi, 1985’den itibaren …. DNA parmak izi yöntemi Tıbbi biyoteknoloji hastalıkların teşhisinde ve tedavisinde, hastalıklı genlerin sağlam genlerle değiştirildiği gen terapisi gelişince sinir, kas, kan hücreleri gibi insan vücudunun çeşitli hücreleri olmak üzere özelleşen olgunlaşmamış hücrelerin kullanıldığı stem hücresi teknolojisi, 4 Restriksiyon endonukleazlar: Bakterilerde dışarıdan hücrelere giren, bazı özel gen ya da markerlar taşıyan genetik materyalleri ayrıştırarak, mutasyonlar meydana getirmesine mani olmak ve böylece türlerin genetik karakterlerinin stabilitesini korumakla görevli enzimlerdir Bakterilerin büyük bir bölümü, bir ya da birkaç türde restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI RE’lerin aktivitelerini gösterebilmeleri için bazı optimal koşulların sağlanması gereklidir. Ör: ısı, pH, buffer vs.. Modifikasyon enzimleri? Gen Klonlaması (moleküler klonlama) Önemli bir ürünün (ya da proteinin) sentezini kodlayan genin ait olduğu hücre genomundan özel yöntemlerle kesilerek çıkartılması, bunun bir taşıyıcı (vektör) DNA’sı ile birleştirilerek alıcı bir hücreye transfer edilmesi, bu alıcı hücrede genin ekspresyonunun sağlanması Nukleik asitlerin (DNA/RNA) invitro amplifikasyon yöntemleri Çeşitli organ, doku ve sıvılardan izole edilen genetik materyaller enzimatik olarak çoğaltılır bu genetik ürünler ya homolog problar kullanılarak hibridizasyon ya da elektroforezis ve boyama sonrası direkt görüntülenir 8 9 Polymerase Chain Reaction-PCR Prensip: Hedef genetik materyallerin (DNA/RNA*) spesifik kısa zincirli oligonukleotid primerler yardımı ile enzimatik olarak sayısal çoğaltılması 10 PCR reaksiyon karışımı Hedef DNA sekansları İki tür spesifik oligonukleotid primerleri (15-30 bazlık, tek iplikcikli) Termostabil DNA polimeraz (Taq polimeraz) Dört tür dNTP Tampon çözelti, MgCl2 11 Hedef DNA sekansları varlığı aranan, amplifiye edilmek istenen hedef DNA kan, serumu, plazma, gaita, doku parçaları, idrar, sperm, saç teli gibi inceleme örneklerinden ekstrakte edilerek ve saflaştırılarak karışıma eklenir 12 Primerler: Replikasyonun başlama noktası Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen, bir çift kısa sentetik oligonukleotid 13 http://www.bio.davidson.edu Nükleotidler (dNTP= deoksinükleotid trifosfat ) 20-200 µM (her dört nükleotit de eşit oranda) Karışım içindeki dNTP, Taq DNA polimerazın çalışması için gerekli MgCl2’u bağlar konsantrasyonları birbirine paralel artmalı ya da azaltılmalı… Enzim (Taq Polymerase) Thermus aquaticus adlı termofilik bakteriden izole edilen ısıya dayanıklı polimeraz enzimi Tampon çözelti, Magnezyum Primerlerin bağlanması ve reaksiyonların gerçekleşmesi için uygun ortam ve pH sağlayan çözelti içerisinde Tris-HCl, KCl, MgCl2 bulunmaktadır. Ayrıca, jelatin, sığır albumini ve tween 20 gibi deterjanlarda Taq polimeraz enzimini stabilitesi için katılabilir. 14 PCR’ın aşamaları 1- Hedef DNA’nın denatürasyonu 2- Primerlerin bağlanması 3- Sentez/Uzama Yeni DNA Hedef sekans Yeni DNA 15 PCR’ın aşamaları 1- Hedef DNA’nın denatürasyonu Nükleotid baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının yüksek ısı yardımı ile birbirinden ayrılması sonucu çift iplikli DNA’dan tek iplikli DNA moleküllerinin oluşması aşamasını kapsar Yüksek ısı: 94-96 °C Ön denatürasyon; özellikle denatürasyonu zor olan kalıp DNA’lar için 3-5 dak. 94-96 °C 16 PCR’ın aşamaları 2- Primerlerin bağlanması (Annealing/hibridizasyon) Primer adı verilen tek iplikçi kısa oligonükotidlerin uygun ısı (30-60 C) ve uygun sürede kalıp DNA üzerindeki hedef bölgelere bağlandığı aşamadır. Çoğaltılacak hedef bölgeye komplementer 30sn-1dk öz. başlangıç ve bitiş noktalarını sınırlar genellikle primerlerin erime ısısının 5º C altında, (54-65º C) 17 I. basamak II. basamak http://users.ugent.be/%7Eavierstr/principles/pcr.html Primer sekansları 5’ ve 3’ olmak üzere iki uca sahip olup amplifikasyon sürekli 5’ den 3’ yönüne doğru gerçekleşir 18 PCR’ın aşamaları 3-Sentez (Polimerizasyon/Uzama/Extension) Polimeraz enzimi yardımı ile tek iplikçikli DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’—3’ yönde uzatılması Sentez işlemi 72º C de 1-2 dakika sürede gerçekleştirilir 19 3 basamaktan oluşan bu bir siklus yaklaşık 30 kez üst üste tekrarlandığında hedef DNA’nın milyarlarca kopyası elde edilebilir. 20 Sonuçların değerlendirilmesi Elektroforez PCR amplifikasyon ürünleri (amplikon) agarose ya da poliakrilamid jele bilinen işaret DNA lar (DNA marker) ve kontrol PCR ürünleri ile birlikte yüklenerek elektrik akımına tabi tutulurlar. ethidium bromür ile boyanır, U.V. ışığı kullanılarak incelenir. 21 Marker Pozitif kontrol Negatif kontrol Örnekler 22 M P N 1 2 3 4 5 6 M 649 bp M: Marker; P=Pozitif Kontrol; N= Negatif Kontrol; 1-7= İncelenen örnekler (2 numaralı örnek pozitif) 23 Çabuk, güvenilir, duyarlı ve spesifik Etkenin vücutta çok az sayıda olması durumlarından daha az etkilenir incelenen materyalin eski* ya da kontamine olmasından etkilenmez izolasyon ve identifikasyonu zor olan bakteriyel ve viral ajanların belirlenmesinde yararlı Personel hatalarını, insan gücünü minimuma indirger 24 Pahalı ? ? ? deneyimli personel gelişmiş ekipmanlar kontaminasyonlar sonuçların yorumlanmasında güçlükler 25 PCR’ ın kullanım alanları Hastalıkların tanısı Özellikle zor üreyen bakterilerin tanısında, antibiyotik kullanmış hastalarda tanı… Toksijenik, virulens suşların saptanmasında Antibiyotik direncinin saptanmasında Moleküler tiplendirme çalışmalarında Epidemiyolojik çalışmalar Defektlerin saptanmasında Adli tıp………………………………… 26 Farklı PCR çeşitleri: Multiplex (Çoklu) PCR: Bir PCR ile birden fazla DNA segmentinin (hedefin), birden fazla primer çifti kullanarak aynı amplifikasyon reaksiyonunda çoğaltılmasını sağlar. 27 M pozitif kontroller örnekler Marker 28 Farklı PCR çeşitleri: Nested PCR: ardarda iki PCR yapılır. İlk PCR ürünleri ikinci PCR için hedef olarak kullanılır. İkinci PCR da ilk çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren primerler kullanılarak asıl istenilen hedef bölge çoğaltılır ve daha özgün ürünler elde edilir. 29 Farklı PCR çeşitleri: Reverse-Transcriptase PCR (Geri Transkripsiyon PCR/ RT-PCR): İki aşamalı olup RNA dan cDNA sentezi (geri transkripsiyon) + komplementer DNA nın standart PCR ile çoğaltılması aşamalarını kapsar. 30 31 Moleküler tiplendirme yöntemleri Benzer klinik bulgulara neden olan infeksiyöz etkenlerin, antijeniteleri ve patojeniteleri farklı alt tipleri görülebilmektedir. Korunma ve sağaltımda Epidemiyolojik verilerin oluşturulmasında Serotiplendirme, biyotiplendirme, faj ile tiplendirme, morfolojik, fizyolojik özelliklerine göre tiplendirme........ Moleküler tiplendirme Lipopolisakkarid ve yağ asitlerin saptanması Protein saptanması Nukleik asitlerin saptanması PCR a dayalı metodlar Epidemiyolojik açıdan tiplendirme yöntemlerinin başlıca kullanım amaçları •Salgınların kaynağı ve yayılma yolları hakkındaki hipotezlerin test edilmesi •Hastalıkların epidemiyolojik olarak birbirleri ile ilişkisinin belirlenmesi •Re-aktivasyon ile yeni infeksiyonların birbirinden ayırt edilmesi •Hastane infeksiyonları ile toplumsal kaynaklı infeksiyonların belirlenmesi •Laboratuvar kontaminasyonlarının saptanması •Populasyondaki epidemi klonlarının belirlenmesi, buna göre kontrol yöntemlerinin değerlendirilmesi 34 Tiplendirme yöntemlerinin yaygın kullanılabilmesi için sahip olması gereken kriterleri • Tiplendirebilirlik •Ayrım gücü •Tekrarlanabilirlik ve Stabilite •Kullanım kolaylığı, maliyeti, testin süresi, kullanım spektrumu •Sonuçların kolayca yorumlanabilir olması •Sonuçların laboratuvarlar arasında paylaşılabilir olması 35 Moleküler tiplendirmede kullanılan bazı önemli terimler Klon: Ortak bir atadan gelen, genetik olarak aynı bir ya da daha fazla organizmadır Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar: Belli bir bölgeden ya da belli bir zaman diliminde hastalardan toplanan örneklerden izole edilen ve ortak bir kaynaktan geldikleri düşünülen izolatlardır Genetik olarak ilişkili izolatlar (klonlar): Genetik tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da ortak bir atadan köken aldıklarını düşündürecek kadar yakın olan izolatlar 36 Salgın suşu: Aynı türün hem epidemiyolojik (zamna, yer, ortak kaynak) hem de genetik olarak ilişkili aynı genetik profile sahip izolatlar Endemik suş: Belli bir populasyonda infekte hastalardan sıklıkla izole edilen, tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da yakın ilişkili bulunan ancak direkt epidemiyolojik bir bağlantı gösterilemeyen izolatlar 37 Yakın ilişkili izolatlar: Salgın suşundan yalnızca bir genetik olay bakımından farklı olan izolatlar Olası ilişkili izolatlar: Salgın suşundan iki genetik olay bakımından farklı olan izolatlardır. Bu izolatlar salgın suşu ile aynı genetik soydan olabilir ancak genetik olarak yakın ilişkili değildir İlişkisiz izolatlar: Salgın suşundan üç genetik olay bakımından farklı olan izolatlar 38 Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) 39 Moleküler tiplendirme yöntemleri içerisinde altın standart Düz elektroforez yöntemlerinde 30-50 kb’dan daha büyük DNA molekülleri büyüklükleri farketmeksizin aynı hızla aynı miktarda hareket ederler, jel içerisinde göç ederler. Bu da jel üzerinde tek bir bant olarak gözlemlenir. Eğer DNA elektoforez işlemi sırasında yön değiştirmeye zorlanırsa, birbirlerinden ayrımı yapılabilecek şekilde farklı bantlar oluşur. Bu da tiplendirmeyi olanaklı hale getirir. 40 Lizis aşamasında DNA nın parçalanmaması gerekir, Büyük DNA molekülleri ise kolay kırılabilir özelliktedir + pipetleme gibi işlemleri yapmak çok zordur Sıvı ya da katı besiyerinde üretilen bakteriler düşük erime ısılı agarozda karıştırılıp kalıplara dökülürler. Lizis işlemleri bu agar blokları içerisinde yapılır. Lizis aşaması sonucunda agar bloklarının içerisinde bulunanan çıplak DNA molekülleri uygun restriksiyon enzimleri aracılığı ile kesilir, özel elektroforez işlemi başlatılır. 41 Yöntemin ayrım gücü çok yüksek Zaman alıcı ve kompleks bir yöntem Laboratuvarlar arasında standardizasyon problemi 42 43 Blotlama, Elektriksel ortamda jel üzerinde göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan proteinlerin veya nükleik asitlerin bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmesi Southern Blotlama E.M. Southern adlı bilim adamı 1975 Herhangi bir kaynaktan elde edilen DNA’ nın analizi için kullanılan membran blotlama ve görüntüleme tekniği 44 1- DNA izolasyonu: Genomik ya da plazmid DNA’sı değişik yöntemlerle ekstrakte edilir. 2- Restriksiyon endonükleazlar (RE) ile kesim: Bir önceki aşamada saf olarak elde edilen DNA süspansiyon ve RE’lar birlikte inkube edilir. Bu süre içerisinde RE’lar DNA üzerinde spesifik bölgeleri keser ve böylece farklı büyüklüklerde DNA segmentleri oluşur. 3- Elektroforez: Fragmentlere ayrılmış DNA’lar, büyüklüklerine göre elektriksel bir ortamda jelde büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar oluştururlar. 45 4- Membrana transfer Jel üzerindeki DNA’ların, nitrosellüloz ya da naylon membranlara aktarılma aşaması Kapiller transfer, elektroforetik transfer, vakumla transfer Prensibi;sıvı bir akımda jeldeki DNA’nın destek tabakaya geçmesidir. Transfer oranı DNA parçalarının büyüklüklerine, jeldeki kalıntılara, sıvının pH sı gibi özelliklerine bağlıdır 46 47 48 49 50 51 5- Denatürasyon ve Fikzasyon: Membran üzerine transfer edilen DNA bantları muamele edilerek denatüre edilir 0.5 N NaOH ile = çift iplikçikli DNA, bazlar arası bağlar koparak, tek iplikçikli hale gelir. Naylon membran 80º C ye ısıtılarak iplikçiklerin membran üzerine fikze edilmesi (yapışması) sağlanır. 52 6- Hibridizasyon: 3 temel adımda gerçekleşir; a) prehibiridizasyon: özgül olmayan bağlanmaları en aza indirmek için blotlanması tamamlanan membranın bloklanması b) hibridizasyon: hedef DNA ile probun birleştiği aşama c) hibridize olmayan probların yıkanması ve görüntülenme aşaması 53 54 6- sonuçların gözle görülmesi Kullanılan probun özelliğine göre otoradiografi, ya da özel boyama yöntemleri ile oluşan hibrib bantlar gözle görülür hale getirilir. 55 Northern Blotlama J.Alwine ve G. Stark, 1979 Herhangi bir kaynaktan elde edilen RNA’ nın analizi RNA nın izolasyonu Elektroforez Membrana aktarma Blotting RNA nın saptanması Bu teknikten, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya organlardaki mRNA seviyesini belirlemede ve viral RNA ları saptamada yararlanılır 56 Dot/Slot Blotlama DNA /RNA’nın elektroforez yapılamadan membrana damlatılması ve bu membranda sabitlendikten sonra özgül dizilimlerinin belirlenmesi Klinik materyalden DNA izolasyonu, İki ya da beş katlı seri dilüsyon, Her dilüsyondan naylon membran üzerine damlatma, Denatürasyon ve fikzasyon, Hibridizasyon, Otoradiografi ile görüntüleme. Çalışılan örnekteki DNA miktarı önemli, genellikle fazla miktarda DNA ile çalışılması gerekmektedir 57 In situ Hibridizasyon Doku, organ ve hücrelerdeki özgül nükleik asitlerin belirlenmesi Hücre ve doku içindeki hedef nükleik asidin lokalizasyonunu belirleme imkanı sağlar 5 temel adımda gerçekleşir; •Dokuların işlenmesi(fikze edilme ve kesilme) •Spesifik olmayan bağlanmaların engellenmesi •Hibridizasyon •Yıkama •Görüntüleme 58
