Doç.Dr.Engin DEVECİ

Doç.Dr.Engin DEVECİ
HÜCRE KÜLTÜRÜ
 Hücre Kültürü Araştırma Laboratuvarı, çeşitli hücrelerin
invitro kültürlerini yaparak araştırmacılara kanser, kök
hücre, hücre mekaniği çalışmaları gibi konularda hücre içi
ve hücreler arası biyokimyasal olayların moleküler düzeyde
incelenebilmesi için devamlı olarak hücrelerin temin
edilmesi ve bu hücrelere istenilen deneysel uygulanmaların
yapılması için kurulmuştur.
•Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü
mikroskopik görüntüsü.
 Hücre kültürü besiyerleri laboratuar ortamında hücrelerin normal
metabolik aktivitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan
mikroçevreyi sağlayan besleyici solusyonlardır.
 Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat,
vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini desteklerler.Laboratuar
ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun pH sıcaklık ve
nemin sağlanması çok önemlidir.
 Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekli
ozmolarite ve pH’ı da sağlarlar
HÜCRE KÜLTÜRÜ
 Hücre kültür ortamının hazırlanması ve içeriği
 Beslenme
 Pasajlama
 Sayım
 Dondurma
Katı (agarlı) besiyerinde sayım, canlı hücrelerin koloni
oluşturması ve bu kolonilerin sayılarak «her canlı hücre
1 koloni oluşturur» prensibi ile materyaldeki canlı hücre
sayısının hesaplanması esasına dayanır. Bu amaçla
sayım yapılacak materyalden belirli bir miktar alınır ve
besiyerine aktarılır. Koloni oluşması için gerekli
inkübasyon süresinin sonunda Petri kutusundaki
koloniler sayılarak materyaldeki canlı hücre sayısı
hesaplanır. Ölü hücreler üreyip koloni meydana
getiremeyeceği için bu yöntemde sadece canlı hücreler
sayılır.
Hücre Kültür ortamında kullanılan cihazlar
 Steril çalışma kabini
 CO2 inkübatörü yada CO2 tankı
 İnverted mikroskobu
 Santrifüj
 Vakum hattı yada pompası
 Otoklav
 Sıvı azot tankı
Hücre Kültürü
 Primer Kültürler;Doğrudan dokudan elde edilen hücre
kültürleridir.Elde edildikleri dokunun özelliklerini
taşırlar
 Hücre Hatları;Primer hücrelerin spontan
mutasyonu,kimyasal madde uygulanması ile mutasyon
oluşturularak elde edilen ölümsüz hücre tipleridir.
Kültür Ortamlarının Temel Bileşenleri
 İnorganik tuzlar
 Karbonhidratlar
 Aminoasitler
 Vitaminler
 Yağ asitleri ve Lipidler
 Proteinler ve Peptidler
 Serum
Hücre Kültür Ortamları
 DMEM(Dulbecco's Modification of Eagles
Medium);çoğu memeli hücresinin üremesini destekler
 RPM 1640 (L-glutaminli);Özellikleri hemapoetik
sistem hücrelerinin üretilmesinde kullanılır
 Ham’s F10 ve F12 (Besleyici karışım)
 F10-insan diploid hücreler,sıçan,tavşan
 F12-Sıçan hepatosit,prostat
 Fischer’s medium-lenfoblast
 Iscove-Eritroblast,makrofaj
Besleme İşlemi
 Ekimi yapılan hücrelerin
yapışması beklendikten
sonra besleme amacı ile ortam
değiştirir.
Hücreler zemini kapladığında
ise hücreler ya pasajlanır yada
dondurulur.
Hücre Kültürlerinin
Hazırlanması
A-Pasajlama (subkültür)
Hücrelerin pasajlanabilmesi için hücre kültür
flakslarının yüzeyini kaplamış olmalıdır.Böyle
flakslara konfulent flakslar denir.Pasajlama işlemi
hücreler sıkışık konumda olduğu için yapılır.Ve
daha geniş alana yayılır.Pasajlama işlemi besi
ortamı içerisindeki hücrelerin nutrientleri
tüketmesinden dolayı üreme hızlarının düşmesini
ölümlerini önlemek amacı ile yapılır
 Pasajlama işlemi tutunarak çoğalan hücrelerde ve
süspanse kültürlerde farklı yapılır:
 Süspanse kültürlerde pasajlama yapılırken;
 kültür eşit şekilde santrifüj tüplerine dağıtılır
 ve santrifüj edilerek kullanılmış besi ortamı
 atılır.Daha sonra uygun besi ortamıyla dilue
 edilerek platelere ya da flasklara ekim yapılır.
 Bazı hücre türlerinin pasajlaması yapılırken
 kullanılmış besi ortamından bir miktar tekrar besi
ortamına eklenir.
B-Hücrelerin Dondurulması
 Hücre kültürünün uzun süre devam etmesi
kontaminasyon ve üreme hızının düşüşü gibi
olumsuzluklara yol açar.Bunun önüne geçebilmek için
hücreler dondurulur.
 Dondurma işleminin başarısı,çözdürme işleminin
sonunda hücre canlılık oranının yüksek olması ile
orantılıdır
Dondurma Prosedürü
 Su banyosu 37C ye ısıtılır.
 Hücre besi ortamı ve serum su banyosunda 37 C ye ısıtılır
 Hücre Pasajlanması protokolünde belirtildiği
şekilde hücre pelleti elde edilir.
 Hücre pelleti, 1 ml dondurma ortamı
 içinde süspande edilir ve cryovial adı verilen tüplere
konulur.Hücrelerin bulunduğu tüpler dondurma kabına konulur
ve -80C ‘de bir gece bekletilir.
 Ertesi gün sıvı azot tankına transfer edilir.
C- Hücrelerin çözülmesi
 Başka laboratuardan gönderilmiş yada üzerinde
yapılan çalışmaya daha sonra devam edilmek üzere
dondurulmuş olan hücre kültürleri,yeni kültürler
üretilmesi amacı ile tekrar çözülürler
• Kan lenfosit hücreleri için kültür süresi genellikle 72
saattir. Fibroblast kültür süresi hücrelerin canlılık oranına,
sayısına ve aktivasyonuna bağlı olarak değişmekte
ortalama 10-12 gün veya daha uzun sürebilmektedir. Kan
lenfosit kültürü için 37°C’lik etüv, fibroblast kültürleri için
37°C, %5 CO2’li etüv ortamına gerek vardır. Kültürün son
2 saatinde hücreleri mitoz aşamasında durdurmak için
kültürlere kolsemid ilavesi yapılırFibroblast kültürlerinde
hücrelerin flask tabanında tutunarak çoğalmaları beklenir.
• Hücre kolonileri belirli bir yoğunluğa ulaşana kadar
kontrol edilir ve medium değişimleri yapılır.Yeterli hücre
elde edileceğine karar verildiğinde harvest işlemi başlatılır
 1. Örnek materyalin (tümör dokusu, biyopsi materyali,
kemik iliği, periferik kan, veya “ascite”) laboratuara teslimi.
2. Materyalden enzimatik ve mekanik yollarla tümör hücre
süspansiyonunun elde edilmesi.
 3. Hücrelerin sayılması, 96 kuyucuklu plaklara (20.000
hücre/kuyucuk) ekimi ve takibinde hücrelerin hekimin
karar verdiği veya Karar Lab.ın her tümör tipi için
belirlenmiş ilaç panel listesindeki kemoterapötik ilaçların
farmakokinetik verilere göre belirlenmiş 6 farklı dozu ile
hücre kültür ortamında muamele edilmesi