Ankara Üniversitesi Açık Erişim Sistemi

advertisement
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
ASMA (Vitis vinifera L.)’DA ÖNEMLİ VEGETATİF VE GENERATİF
KARAKTERLER İLE HASTALIKLARA DAYANIM ÖZELLİKLERİNE
YÖNELİK GENOM HARİTALAMASI
Zeliha YAŞA
BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI
ANKARA
2005
Her hakkı saklıdır
ÖZET
Doktora Tezi
ASMA (Vitis vinifera L.)’DA ÖNEMLİ VEGETATİF VE GENERATİF
KARAKTERLER İLE HASTALIKLARA DAYANIM ÖZELLİKLERİNE YÖNELİK
GENOM HARİTALAMASI
Zeliha YAŞA
Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı
Danışman: Prof.Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU
Bu araştırmada, V. vinifera L. varyetesi olan Italia ve Mercan üzüm çeşitlerinin
melezlenmesi ile elde edilen F1 populasyonu kullanılarak (60 F1 + 2 ebeveyn) genom
haritasının çıkarılması ve incelenen morfolojik ve hastalıklara dayanım özelliklerine
yönelik bağlantı analizinin yapılması amaçlanmıştır. Bu populasyon Tekirdağ bağcılık
Araştırma Enstitüsü’nde geliştirilmiştir. Populasyonun genom haritalaması amacıyla
seçilmesinin nedeni F1 populasyonunun hastalıklara dayanım ve diğer morfolojik
özellikler açısından açılım göstermesidir.
Araştırmada gerçekleştirilen RAPD reaksiyonlarında toplam 300 adet primer test
edilmiştir. Amplifikasyon ürünleri negatif filmden "var" ya da "yok" diye
değerlendirildikten sonra yapılan χ2 testleri sonucunda 1:1 ve 3:1 dağılım gösteren
polimorfik lokuslar belirlenmiştir. Italia çeşidinde 59, Mercan çeşidinde ise sadece 55
adet lokus bağlantı analizlerinde kullanılabilmiştir. Haritanın çıkartılması amacıyla
Mapmaker/Exp 3.0 paket programında farklı LOD değerleri kullanılmıştır. Genom
haritalaması için çift yönlü-yalancı melezleme tekniği kullanılmıştır.
Ana ve baba ebeveyne ait 2 ayrı genetik bağlantı haritası elde edilmiş olup 8 (ana) ve 6
(baba) bağlantı grubu içermiştir. Bağlantı gruplarına yerleşen lokusların incelenen
morfolojik ve hastalılara dayanım karakterlere olan bağlantılarını tespit etmek amacıyla
regresyon ve varyans analizleri yapılmıştır. Analiz sonuçlarına göre p≤0.01 önem
derecesinde iki adet karakterin (çiçeklenme zamanı ve küllemeye dayanım) sırasıyla 1
ve 2 markör lokusu ile bağlantılı oldukları tespit edilmiştir. Regresyon analizi diğer
markör- kantitatif karakter ilişkilerini de göstermektedir.
2005, 123 sayfa
Anahtar Kelimeler: Asma, genetik harita, bağlantı analizi, QTL, RAPD
i
ABSTRACT
Ph.D. Thesis
GENOME MAPPING IN GRAPE (Vitis vinifera L.) FOR SOME IMPORTANT
VEGETATIVE, GENERATIVE AND DISEASE RESISTANCE TRAITS
Zeliha YAŞA
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Horticulture
Supervisor: Prof.Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU
This research was conducted to construct genetic linkage maps of Vitis (2n =38) from
grape populations (60 F1 + 2 parents) of crossing of Italia and Mercan (Vitis vinifera L.)
cultivars. This cross was developed at Tekirdağ Viticultural Research Institute in 1992
and was chosen because the progeny segregated for disease resistant and other
important vegetative and generative traits.
RAPD reactions was performed by using a total of 300 RAPD primers. The
amplification products were scored from negatives as presence or absence. The parental
data was used to calculate goodness-of-fit for the segregating markers using χ2 analysis.
Only 59 loci for Italia and 55 loci for Mercan could be used for linkage analysis.
Mapmaker/ Exp.3.0 was used for genetic linkage analysis and multipoint ordering
among markers at different LOD scores. Genetic linkage maps were developed by using
the double-pseudotestcross mapping approach.
Italia and Mercan resulted in having 8 (maternal) and 6 (paternal) linkage groups,
respectively. Loci placed on the linkage groups were further analyzed by regression and
variance analyses in order to determine possible linkages between the loci and
morphological and disease resistance characteristics. According to the results, only two
characters, flowering time and resistance to powdery mildew, were found to be
significantly linked (p≤0.01) to 1 and 2 marker loci, respectively. Other marker-QTL
relationships are also provided from regression analysis.
2005, 123 pages
Keywords: grape, genetic map, linkage analysis, QTL, RAPD
ii
TEŞEKKÜR
Asma (Vitis vinifera l.)’da önemli vegetatif ve generatif karakterler ile hastalıklara
dayanım özelliklerine yönelik genom haritalaması konusunda bana çalışma olanağı
veren, yardımlarını esirgemeyen ve çalışmalarımın her aşamasında beni yönlendirip
fikir
ve
tecrübelerini
aktaran
Danışman
Hocam
Sayın
Prof.Dr.
Gökhan
SÖYLEMEZOĞLU’na, Tez İzleme Komitesi’nde bulunan, her konuda yardım ve
desteklerini esirgemeyen Sayın Prof.Dr. Hasan ÇELİK’e ve Sayın Prof.Dr. Sebahattin
ÖZCAN’a teşekkürlerimi sunarım.
Tez kapsamında incelenen morfolojik ve hastalıklara dayanım karakterlerinin gözlem ve
değerlendirmesini gerçekleştiren T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tekirdağ Bağcılık
Araştırma Enstitüsü’nden Sayın Dr. Cengiz ÖZER’e, sonuçların değerlendirilmesi
konusunda eşsiz yardımlarından dolayı Sayın Prof.Dr. Zeki KAYA’ya (Ortadoğu
Teknik Üniversitesi) ve tezi en ince detayına kadar okuyup fikirleri ile bana yol
gösteren
Sayın Prof.Dr. Y.Sabit AĞAOĞLU’na
ve çalışmam süresince verdiği
destekten dolayı Sayın Prof.Dr. Birhan MARASALI KUNTER’e teşekkür ederim.
Çalışmam
sırasında
yardım ve
desteklerini
esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Ali
ERGÜL’e, Dr. Hüseyin KARATAŞ’a, ve Mehmet TÜRKOĞLU’na, biyolog Sevgi
BOZTAŞ ve Sevil MADEN’e teşekkür ederim. Tez sonuçlarımın istatistiki
değerlendirmesi konusunda yardımcı olan Sayın Doç.Dr. Mehmet Ali YILDIZ’a,
Araş.Gör. Özgür KOŞKAN’a ve Araş.Gör Abdullah ÖZSOY’a teşekkürü bir borç
bilirim.
Bu çalışma boyunca sevgi, destek ve anlayışları ile her zaman yanımda olan tüm YAŞA
ailesi ile özellikle ağabeyim Mehmet YAŞA’ya şükranlarımı sunarım.
Zeliha YAŞA
Ankara, Temmuz 2005
iii
İÇİNDEKİLER
ÖZET ................................................................................................................... i
ABSTRACT......................................................................................................... ii
TEŞEKKÜR......................................................................................................... iii
SİMGELER DİZİNİ ............................................................................................ v
ŞEKİLLER DİZİNİ.............................................................................................. vii
ÇİZELGELER DİZİNİ ........................................................................................ viii
1. GİRİŞ ....................................................................................................... 1
2. KURAMSAL TEMELLER.................................................................... 3
2.1. Asma Islahı ve Genetiği ........................................................................... 6
2.2. Moleküler Markörler................................................................................ 8
2.3. Markör Sistemi Seçimi............................................................................. 15
2.4. Harita Oluşturma...................................................................................... 16
2.5. Klasik Haritalama..................................................................................... 20
2.6. QTL Haritalama ....................................................................................... 23
3. MATERYAL VE YÖNTEM.................................................................... 41
3.1. Materyal ................................................................................................... 41
3.2. Yöntem..................................................................................................... 55
3.2.1. DNA ekstraksiyonu............................................................................... 56
3.2.2. PCR uygulaması.................................................................................... 57
3.2.3. Agaroz jel elektroforezi ........................................................................ 59
3.2.4. Genetik bağlantı analizi ve kantitatif karakter lokus (QTL)
Haritalama ............................................................................................. 60
3.2.5. Kantitatif karakter analizi...................................................................... 60
4. ARAŞTIRMA BULGULARI................................................................... 61
4.1. Fenotipik Analiz....................................................................................... 61
4.2. Moleküler Analiz ..................................................................................... 63
4.3. Genetik Bağlantı Analizi.......................................................................... 65
4.4. Kantitatif Karakter Analizi....................................................................... 72
5. TARTIŞMA ve SONUÇ .......................................................................... 75
KAYNAKLAR .................................................................................................... 81
EKLER................................................................................................................. 91
EK 1. .............................................................................................................. 92
EK 2 ............................................................................................................... 101
EK 3 ............................................................................................................... 105
EK 4 ............................................................................................................... 108
EK 5 ............................................................................................................... 110
EK 6 ............................................................................................................... 116
EK 7 ............................................................................................................... 118
EK 8 ............................................................................................................... 119
EK 9 ............................................................................................................... 120
EK 10 ............................................................................................................. 122
ÖZGEÇMİŞ ......................................................................................................... 123
iv
SİMGELER DİZİNİ
DNA
Deoksiribo Nükleik Asit
Mbp
Mega base pair
Pg
Pikogram
C
Replike Olmamış Haploid Kromozoma Ait DNA kapsamı
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA
cM
centiMorgan
QTL
Quantitative Trait Locus / Loci
STS
Sequence Tagged Sites
CAPS
Cleaved Amplified Polymorphic Sites
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
BSA
Bulked Segregant Analysis
SCAR
Sequence Characterized Amplified Regions
ISSR
Inter-Simple Sequence Repeats
RGA
Resistance Gene Analogs
SSR
Simple Sequence Repeats
cDNA
cloned DNA
PCR
Polymerase Chain Reaction
DAF
DNA Amplification Fingerprinting
AP-PCR
Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
ng
Nanogram
YAC
Yeast Artificial Chromosome
MAS
Marker Assisted Selection
DDGE
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
SSCP
Single Strand Conformation Polymorphism
ASAP
Allele Specific Associated Primers
SPAR
Single Primer Amplification Reaction
STR
Short Tandem Repeats
v
BC
Backcross
RIL
Recombinant Inbred Lines
DH
Doubled Haploids
NIL
Nearly Isogenic Lines
OIV
Organisation Internationale de la Vigne et du Vin
UPOV
International Union for the Protection of New Varieties
PVPP
Polyvinylpolypyrolidone
ml
Mililitre
rpm
Dakikada Dönüş Sayısı
TE
Tris-EDTA Çözeltisi
RNase
Ribonükleaz
RNA
Ribonükleik asit
EDTA
Etilen
mM
Milimol
M
Mol
CTAB
Hekzadesil Trimetil-Amonyum Bromür
mg
Miligram
µl
Mikrolitre
MgCl2
Magnezyum Klorür
dNTP
Deoksi-Nüklozid trifosfat
TBE
Tris-Borik Asit- EDTA Çözeltisi
UV
Ultraviyole
LOD
Maximum Likelihood Odds Value
Ort.
Ortalama
S.S.
Standart Sapma
ANOVA
Varyans Analizi
aimine Tetra Asetik Asit
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 3.1. Italia üzüm çeşidi ..................................................................................42
Şekil 3.2 Mercan üzüm çeşidi ..............................................................................42
Şekil 4.1. Italia x Mercan populasyonunda elde edilen DNA’ların agaroz jel
(%1.5) üzerindeki görüntüleri ............................................................... 63
Şekil 4.2. Italia üzüm çeşidine ait bağlantı grupları..............................................67
Şekil 4.3. Mercan üzüm çeşidine ait bağlantı grupları..........................................68
vii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Belli başlı bitki türlerinde akış sitometrisi ile belirlenen genomik
DNA kapsamı....................................................................................4
Çizelge 2.2. . Vitis türleri, çeşitleri ve diğer Vitis cinslerine ait DNA kapsamı….5
Çizelge 3.1. Ön deneme çalışmalarında kullanılan çoğaltma ve
döngü koşulları..................................................................................58
Çizelge 4.1. Italia x Mercan populasyonunda incelenen fenotipik özeliklerine
ait istatistiksel değerlendirme............................................................62
Çizelge 4.2. Açılım gösteren RAPD lokusları hakkında bilgi ..............................64
Çizelge 4.3. Italia x Mercan’a ait genetik haritaların karşılaştırılması .................69
Çizelge 4.4. Italia çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler ve
uzaklıkları..........................................................................................70
Çizelge 4.5. Mercan çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler................71
Çizelge 4.6. Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçları....................72
Çizelge 4.7. Binary lojistic regresyon analizi sonuçları........................................73
Çizelge 4.8. Hastalığa dayanım karakterleri üzerinde ANOVA testi
sonuçları ............................................................................................74
viii
1. GİRİŞ
Asma (Vitis vinifera L.) dünyada en fazla yetiştirilen ve en fazla ekonomik öneme sahip
meyve türlerinin başında gelir. Bunun en önemli nedeni; asmanın ürünü olan üzümün
sofralık, kurutmalık, meyve suyu ve şaraplık gibi çok yönlü değerlendirme şekillerine
sahip olmasıdır. Aynı zamanda rakı, konyak ve hafif içkiler gibi yüksek ticari öneme
sahip ürünler olarak da değerlendirilmektedir. Bağcılık ve şarap yapımı binlerce yıldan
beri insan kültürünün ve bazı dinlerin bir parçası olmuştur. Bugün, ekonomik öneme
sahip bir ürün olmasının dışında, Batı dünyasında değişik sektörlerde çok geniş iş sahası
yaratması ve bazı durumlarda ulusal kültür veya yaşam stili ile bağlantılı olmasından
dolayı ayrıca bir öneme sahiptir.
Asma ıslah çalışmaları, başlangıçta filokseraya yüksek düzeyde dayanımlı, geniş
adaptasyon yeteneğine sahip ve Vitis vinifera L. ile iyi uyuşan, yüksek oranda köklenen
Amerikan türlerini belirlemek ve bu türler arasında amaca en uygun olanlarını seçmek
veya bu türler arasında ve bu türlerle Vitis vinifera L. arasında melezlemeler yapmak
suretiyle istenilen karakterlerin kombine edildiği yeni asma anaçları elde etmek, yine
külleme, mildiyö ve kurşuni küfe dayanıklı ve vinifera’nın verim ve kalite özelliklerini
taşıyan çeşitlerin elde edilmesi konularına öncelik verilerek başlatılmış; zaman
içerisinde bu konulara ek olarak verimin arttırılması, kalitenin yükseltilmesi,
çekirdeksiz çeşitlerin elde edilmesi, erkenci ve geçci çeşitlerin elde edilmesi, kuraklık
ve soğuk gibi stres koşullarına dayanıklılık konularında yeni çeşitler elde etmeyi
amaçlayan çalışmalar şeklinde devam etmektedir.
Asmalarda yukarıda belirtilen amaçlara yönelik olarak çeşitlerin geliştirilmesi, uygun
ebeveynlerin melezlenerek elde edilecek F1 populasyonlarından yapılacak seleksiyona
dayanmaktadır. Kaçınılmaz olan klasik asma ıslah çalışmaları oldukça uzun ve yoğun
bir emek gerektirmektedir. Asmanın diğer çok yıllık meyve türlerine göre daha kısa (3-5
yıl) gençlik kısırlığı (yenice safhası)’na sahip olmasına rağmen, seleksiyon işlemi F1
bitkilerinin
fenotipleri
ve
genotipleri
arasındaki
ilişkilendirilmenin
belirsizlik
göstermesi nedeniyle ilk yıllarda yapılamamaktadır (Reisch et al. 1994). Amaca uygun
F1’lerin seleksiyonunun uzun yıllar alması, melezleme ıslahının en önemli dezavantajını
1
oluştururken, kendileme depresyonu, somatik mutasyonlar ve himeyreler bu süreçte
karşılaşılan diğer problemler arasında gösterilmektedir. Bu koşullar gözönüne
alındığında ıslahın seleksiyon kriterlerini oluşturan verim, kalite, çekirdeksizlik,
olgunlaşma zamanı, tane rengi, salkım şekli, anacın gelişme kuvveti, abiotik ve biotik
stres koşullarına dayanıklılığın belirlenmesi gibi özelliklerin tespiti uzun yıllar
almaktadır.
Bu araştırmada, asmanın (Vitis vinifera L.) ve bağcılık kültürünün anavatanı olan
ülkemizde, ilk defa “Melezleme Tekniği İle Külleme ve Mildiyöye Dayanıklı Standart
Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde Edilmesi” konulu ülkesel proje
kapsamında Italia x Mercan çeşitlerinin melezlenmesinden elde edilen F1 populasyonu
kullanılarak, 35 adet vegetatif ve generatif karakter ile, Külleme (Uncinula necator),
Mildiyö (Plasmopara viticola) ve Kurşuni Küf (Botrytis cinerea Pers.) gibi hastalıklara
dayanım özelliklerini içeren asmanın genom haritasının çıkartılması amaçlanmıştır.
Çalışma sonucunda ortaya çıkartılacak genom haritası aracılığıyla; 1) asma genomunu
daha iyi tanımayı sağlayacak moleküler markörlerin geliştirilmesi, 2) moleküler
markörlerin 38 adet vejetatif ve generatif karakterle, külleme, mildiyö ve kurşuni küf
gibi hastalıklara dayanım özelliklerini kontrol eden gen/genlere bağlanması, 3)
araştırmada incelenecek olan kalitatif ve kantitatif özellikleri kontrol eden gen /
bölgelerin kromozom üzerindeki muhtemel yerlerinin belirlenmesi ve 4) tüm bunlardan
sonra bir başka deyişle genom haritasının çıkarılmasından sonra kalıtımda dominant
olan RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markörlerin kodominant olan
SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sites), AS-PCR
(Allele Specific-Polymerase Chain Reaction) gibi markörlere dönüştürülerek asma ıslah
çalışmalarında çok erken dönemlerde arzu edilen özelliğe göre seleksiyon imkanı
sağlaması ve bu markörlerin
dünyanın herhangi bir yerinde oluşturulan F1
populasyonlarında da denenmesi suretiyle, genom haritalarının birbirine bağlanması
amaçlanmıştır.
2
2. KURAMSAL TEMELLER
Asma (Vitis vinifera L.) dünyada yetiştirilen bahçe bitkileri türleri içinde çok önemli bir
yere sahip türdür. Yaklaşık 7.7 milyon hektarlık alanda 65.5 milyon tona varan üretim
hacmi ile ilk sıralarda yer almaktadır (Anonymous 2004). Dünya üzerinde ekonomik
olarak çok büyük önemi olan üzüm yetiştiriciliği ve üzümden elde edilen ürünlerin
çeşitliliği ve zenginliği, asmanın bir çok yönleri ile ele alınmasına ve üzerinde derin
araştırmalar yapılmasına sebep olmuştur (Ağaoğlu 1999). Galet (1988) Vitaceae
familyasına ait asmada 14 cins ve 1000’in üzerinde tür bulunduğunu ifade etmiştir.
Vitis
cinsi içerisinde yer alan Vitis vinifera L. türü ticari öneme sahip çeşitleri
bünyesinde barındırmaktadır.
Asmanın (Vitis vinifera L.) genomu hakkındaki bilgiler incelendiğinde, diğer çok yıllık
bitkilere oranla nispeten küçük bir genoma sahip olduğu görülmektedir. Bazı türlerde
akış sitometrisi (flow cytometry) yöntemi ile belirlenen nüklear DNA kapsamı Çizelge
2.1’de verilmiştir (Arumuganathan and Earle 1991). Elde edilen sonuçlara göre asma
genomunun 483 Mbp/1C DNA kapsamına sahip olduğu belirtilmiştir.
Lodhi (1994), Vitis türleri, çeşitleri ve diğer Vitis cinsleri arasında DNA kapsamını
belirlemek amacıyla yaptığı çalışmada Vitis türleri arasında istatistik öneme sahip
olmayan farklılık bulmuştur (Çizelge 2.2).
Araştırıcı, Arumuganathan and Earle
(1991)’den farklı olarak asma genomunun 475 Mbp/1C olarak tespit etmiştir.
Toplam genomik DNA kapsamını bilmek, asmanın genom organizasyonunu anlamak ve
gen klonlamak açısından önemlidir. Ayrıca evrimsel ilişkiler kurmak, genom
haritalamak ve ekolojik veya çevresel adaptasyon çalışmaları yapmak için önem
arzeder. Flavell (1993)’e göre diploid bir bitki, genomunda 1000-1500 centiMorgan
(cM) DNA bulundurmaktadır (Lodhi 1994).
3
Çizelge 2.1. Belli başlı bitki türlerinde akış sitometrisi ile belirlenen genomik DNA
kapsamı
Tür ismi
Yaygın ismi
pga/2C
Mbp/1Cb
Allium cepa
Soğan
31.69-32.74
15290-15797
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis
0.30
145
Brassica oleracea ssp. botrytis
Karnabahar
1.30-1.37
628-662
Brassica oleracea ssp. capitata
Baş lahana
1.25
603
Citrullus vulgaris
Karpuz
0.88-0.90
425-434
Citrus sinensis
Portakal
0.76-0.82
367-396
Helianthus annuus
Ayçiçeği
5.95-6.61
2871-3189
Hordeum vulgare
Arpa
10.10
4873
Lactuva sativa
Marul
5.47
2639
Lycopersicon esculentum
Domates
1.88-2.07
907-1000
Malus x domestica (2n:2x)
Elma
11.54-1.65
743-796
Nicotiana tabacum (2n=4x)
Tütün
8.75-9.63
4221-4646
Oryza sativa ssp. Indica
Çeltik
0.87-0.96
419-463
Solanum melongena
Patlıcan
2.28-2.48
1100-1197
Triticum aestivum (2n=6x)
Buğday
33.09
15966
Vitis vinifera L.
Asma
1.00
483
Zea mays
Mısır
0.80
386
a
pg (pikogram): 965 milyon baz çifti (Mbp)
b
C: replike olmamış haploid kromozoma ait DNA kapsamı
Kaynak: Arumuganathan and Earle (1991)
4
Çizelge 2.2. Vitis türleri, çeşitleri ve diğer Vitis cinslerine ait DNA kapsamı
Genotip
DNA (pg/2C)
Mbp/1C
V. amurensis
1.01
487
V. betulifolia
0.98
473
V. coignetiae
1.00
483
V. flexuosa
0.91
439
V. thunbergii
1.09
526
V. yenshanensis
1.08
522
V. acerifolia Seleksiyon I
0,97
469
V. aestivalis
0,95
459
V. berlandieri
1,01
488
V. champinii
0,92
444
V. cinerea
0,98
473
V. labrusca
1,05
507
V. riparia
0,97
469
V.rupestris
1,12
541
V. vulpina
0,88
425
Cabernet Sauvignon
1,00
483
Chardonnay
0,86
415
Pinot noir
0,86
415
Thompson Seedless
0,92
444
Cayuga White
1,00
483
Aurore
0,98
473
C.White x Aurore No. 89
1,06
511
C.White x Aurore No.99
0,99
478
C.White x Aurore No.135
0,95
459
Ampelopsis brevidenculata
1,38
666
Parthenocissus tricuspidata
1,07
516
Vitis türleri
a. Asya
b. Kuzey Amerika
V. vinifera çeşitleri
Ebeveyn ve Döller
Vitaceae familyasına ait diğer türler
Bennett et al. (1982) ve Lukaszewski et al. (1982)’e göre genomik DNA kapsamı, bir
türün kromozomlarının toplam büyüklüğü ile ilişkilidir ve Shetty (1959), Vitis türlerinin
5
ortalama kromozom büyüklüğünün 0.85 -.1.07 m arasında olduğunu ifade etmiştir
(Lodhi 1994).
Bennett and Smith (1976), çiçekli bitkilerin somatik hücrelerindeki genomik DNA
miktarının 5x107- 8x1019 baz çifti arasında olduğunu bildirirken; Flavell (1980)
bitkilerin bütün özelliklerini belirleyen DNA’nın yaklaşık 107-108 baz çifti olduğunu
ifade etmiştir. Aynı araştırıcı, ortalama bir mRNA molekülünün yaklaşık 1200 baz
uzunluğunda olduğunu ve haploid genomda yaklaşık 15.000 gen bulunduğunu
hesaplayarak tek bir gene ait ortalama 1.8x107 baz çifti uzunluğundaki bir mRNa
molekülünün transkripsiyonda görev aldığını ifade etmiştir (Lodhi 1994).
Asma
genomu yaklaşık olarak 4.75x108 bp/2C’ dir. Yukarıda yapılan açıklamaya göre; gen
kodlayan bölge (3.6x107 bp) genomun sadece %7.6’sını oluşturmaktadır. Geri kalan
genom ise büyük ihtimalle tekrar bölgeleri ile kodlama yapmayan bölgeleri
kapsamaktadır.
2.1. Asma Islahı ve Genetiği
Yabancı tozlanan çok yıllık bir bitki olması nedeniyle asma, ürün görmek için beklenen
sürenin uzunluğu (2-5 yıl), kendilenme depresyonu ve somatik mutasyonlar ile
himeyrelerin görülmesi gibi problemlerle karşı karşıyadır. Ayrıca, uygun genetik
stokların olmaması asmaya yönelik genetik bilgi elde edilmesini sınırlamaktadır.
Asmalar yüksek oranda heterozigottur ve klonal çoğaltma yoluyla korunmaları birörnek
ve homozigot ebeveyn hatları oluşturma ihtiyacını ortadan kaldırmaktadır.
Asmada çeşit geliştirme uygun ebeveynleri melezleyerek F1 eldesini gerektirir.
Ebeveynlerin yüksek oranda heterozigot olması nedeniyle döller de heterozigottur. Döl
bazı lokuslarda bir F2 gibi davranırken (3:1) bazı lokuslarda ise bir geri melezleme
populasyonu (1:1) gibi davranır. Üstün özellikli genotiplerin seçimi bu tür
populasyonlarda yapılır. Diğer çok yıllık bitkilere göre daha kısa gençlik kısırlığı
dönemine sahip olmalarına rağmen asmalarda seleksiyon, fide döneminin erken
6
aşamalarında fenotip ve genotip arasında bir korelasyon
belirsizliği nedeniyle
yapılmamaktadır. Bu problemi aşmanın bir yolu; moleküler markörler kullanarak
çevresel varyansı azaltmak suretiyle kalıtım derecesini araştırmaktır.
Kantitatif karakterler, etkileri istatistiksel terminoloji ile açıklanan bir çok gen
tarafından kontrol edilmektedir. Kalıtım, karakterde genetik etkilere atfedilen
gözlenebilen varyansın miktarı olarak ifade edilmektedir. Kalıtımın ölçülmesi, genetik
etkilerin çevresel etkilere göre önemini tahmin etmektedir. Bitki ıslahçısının amacı,
ıslah populasyonunda istenen allelerin frekansını arttırmaktır. Bir populasyonda
istenilen allellerin frekansının arttırılması, fenotip ile allelin varlığı arasında korelasyon
olmasını gerektiren seleksiyonla yapılabilir. Bu şekilde elde edilen seleksiyon güdümlü
artışlar, generasyon başına azdır ve ıslah amacına ulaşması için çok sayıda generasyon
gerektirir. Bazı meyve türlerinde populasyon geliştirme stratejileri birkaç değişiklikle
tarla bitkilerinde uygulanan stratejilerle aynıdır. Oysaki, klonal olarak çoğaltılan
türlerde istenilen özelliğe sahip ebeveynler seçilir, melezlenir ve döllerde değerlendirme
yapılır. Açılım gösteren döller incelenir ve üstün özellikteki bireyler seçilerek vegetatif
olarak çoğaltılmak suretiyle korunur.
Riemenschneider et al. (1988) kantitatif karaktelerde istenilen allellerin frekansının,
fenotipik değerlerine bakılarak bireylerin seçimi ile bir generasyonda hızlı şekilde
arttırılabildiğini, ancak, kalıtımın düşük olduğu kantitatif karakterlerde seleksiyonun
daha az etkili olduğunu ifade etmişlerdir (Lodhi 1994). Genetik markörler, fenotip ve
genotip arasında bir korelasyon kurulmasını mümkün kılmıştır. Bu markörler, bütün
bitki türlerinde önem kazanmıştır. İzozim,
RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) ve RAPD gibi teknikler genetik haritaların yapılmasında ve önemli
genlerin etiketlenmesinde başarı sağlamıştır. Takip eden seleksiyon, parça değişiminin
olmadığı durumlarda, morfolojik karakterlere bağlı bu markörlerin varlığına ve
yokluğuna dayandırılarak yapılabilir.
7
2.2. Moleküler Markörler
Protein ya da DNA'da bulunan polimorfizme dayanan "moleküler markörler"in
geliştirilmesi; taksonomi, filojeni, ekoloji, genetik ve bitki ıslahında araştırmaları büyük
oranda kolaylaştırmıştır.
Aşağıda belirtilen özelliklerin genellikle bir moleküler markörde olması istenir:
1. Yüksek derecede polimorfik davranış,
2. Kodominant kalıtım,
3. Genomda sıkça bulunma,
4. Genomda düzgün dağılım,
5. Seçici nötr davranış (pleitropik etkisi yok),
6. Kolay ulaşım (satın alma veya hızlı işlemler sonucunda),
7. Kolay ve hızlı değerlendirme (otomasyona uygun işlemle),
8. Yüksek tekrarlanabilirlik,
9. Laboratuvarlar arası kolay veri alışverişi.
Bu özelliklerin hepsi bir moleküler markörde bulunmamaktadır. Ancak çalışmanın
amacına en uygun olanı seçerken yukarıdaki özelliklerden en azından bir kaçının bir
arada bulunması istenir (Tanskley 1993, Weising et al. 1995).
En fazla istenen markör, dayanıklılık geni ile bağlantısı bulunan, çok değişik
genotiplerde ifade edilen ve fonksiyonel olandır (Kelly 1995).
Markör tipleri
A. Morfolojik: Tek lokus ile idare edilen morfolojik özellikler, değişik çevre
koşullarında ifade edilebildiği sürece genetik markör olarak kullanılabilir. Kodominant
morfolojik markörler seleksiyonla genetik tepkinin tahmin edicisi olarak fayda
8
sağlasalar da çevresel ve genetik (epistasis) gibi faktörlerden etkilenirler (Staub et al.
1996).
B. İzozimler: Elektroforetik işlemler (genellikle nişasta jeli) aracılığıyla birbirinden
ayırtedilebilen farklı yüklere sahip protein molekülleridir. Spesifik biyokimyasal
reaksiyonları katalize etmelerinden dolayı belli bir enzimin jel üzerindeki yerini, uygun
kofaktör ve maddeleri sağlayarak ve renk üreten bir reaksiyonda enzimatik reaksiyon
ürününü bulundurarak görsel hale getirmek mümkündür. Renkli ürün jelde birikir ve
elektroforetik olarak jele yerleşen enzim belirgin bir bant oluşturur. Elde edilen bantlar
protein ürünlerini gösterir, genetik temele dayanır ve kodominant markör olarak genetik
bilgi sağlayabilir. Ancak, izozim lokuslarının azlığı ve translasyon sonrası değişimlere
açık olmaları kullanım olanaklarını sınırlamaktadır (Staub et al. 1982, Bernatzky and
Tanksley 1989).
C. DNA markörleri
Hibridizasyona dayalı markörler
RFLP, genomik DNA'yı belli nükleotid dizilerinden (restriksiyon bölgesi) kesen ve
böyle değişik uzunlukta DNA parçaları oluşturan restriksiyon enzimlerinin kullanımı ile
saptanmaktadır. Bu parçaların tanımlanması elektroforez ile ayrılan DNA parçalarının
nitroselüloz veya naylon filtre üzerine geçirildiği Southern blot işlemi (Southern 1975)
ile yapılmaktadır. Filtreye sabitlenen DNA, radyoaktif etiketlenmiş prob DNA ile
hibridize edilir. Problar genellikle küçük (500-3000 baz çifti) klonlanmış DNA
(genomik veya cDNA) parçalarıdır. Filtre, fotoğraf filmine yapıştırılarak radyoaktif
yayılımların görünür bant haline geçmeleri sağlanır. Bu bantlar RFLP'nin görsel hale
geçmesidir ve kodominant markörlerdir (Staub et al. 1996).
9
RFLP markörleri genetik haritaların oluşturulmasında ve mono- ve poligen lokusların
tanımlanmasında
kullanılmıştır.
Ancak
birkaç
dezavantajı
da
bünyesinde
bulundurmaktadır. İlk olarak, bir markörün tanımlanıp haritalanması; klonların elde
edilmesi, bir kütüphaneden parçaların izole edilmesi, saflaştırılması ve radyoaktifle
etiketlenmesi, değişik restriksiyon endonükleazlar ile parçalanan ebeveynsel ve F2
DNA'ların Southern blot hibridizasyonu ve X-ışını filmin elde edilmesi gibi aşamaları
nedeniyle oldukça pahalı olmakta ve
yüksek işgücü ile zaman gerektirmektedir
(Malyshev and Kartel 1997).
PCR (Polymerase Chain Reaction)’a dayalı markörler
Yöntem DNA'nın enzimatik in vitro çoğaltımına dayanmaktadır. Çok düşük
(çoğunlukla nanogram-ng) miktardaki kalıp DNA ile başlanarak bir veya daha fazla
belli DNA parçalarının milyonlarca kopyası elde edilir ve elektroforez işleminden sonra
boyama veya otoradyografi aracılığıyla görünür hale getirilir. PCR çok hızlı, basit ve
duyarlıdır. Çok değişik organizmalara çok değişik amaçlarla uygulanması moleküler
biyolojide yeni olanaklara imkan sağlamıştır (Weising et al. 1995).
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Tek primer bazlı PCR teknolojileri (DAF- DNA Amplified Fingerprinting ve AP-PCR;
Arbitrarily Primed- PCR) arasında, RAPD (Wiliams et al. 1990); haritalama ve bağlantı
analizlerinde en fazla kullanılmaktadır. Polimorfik DNA'nın PCR tabanlı rastgele
çoğaltımı
(RAPD-PCR), bir şablon genomik DNA üzerinde rastgele primerler
kullanılarak yapılmaktadır. Karşılıklı iki zincir üzerine nispeten yakın şekilde yerleşen
primerlere homolog kısa DNA dizileri bulunduran genomik parçalar çoğaltılmaktadır.
RAPD-PCR desenlerinin polimorfizmi; tek ya da iki taraflı primer bağlanma bölgeleri
arasındaki farklılıklar veya çoğaltılan parçada bulunan ekleme ve çıkarma sayesinde
tespit edilmektedir (Malyshev and Kartel 1997).
10
Çoğaltma ürünleri agaroz veya poliakrilamid jeller üzerinde ayrılır ve etidium bromid
veya gümüş ile görünür hale getirilir. RAPD, genellikle bireyler arasında polimorfizmin
bandın varlığı/yokluğu şekilde ifade edildiği bir dominant markördür (Staub et al.
1996).
Devos and Gale (1992) ve Giese et al. (1994) RAPD analizini değişik türlerde
polimorfizmi çalışmak amacıyla kullanmıştır (Malyshev and Kartel 1997). Birkaç
RAPD markörü ise bazı hastalığa dayanım genleri ile bağlı bulunmuştur (Yoshimura et
al.
1995, Naqvi et al. 1995). RAPD analizi RFLP'ye göre daha az aşama kapsar ve
daha kısa sürelidir. Ayrıca, daha az miktardaki DNA (25 ng) küçük çaplı ekstraksiyon
işlemleri ile sağlanabilir. RAPD markörleri özellikle koniferlerin genomlarının
haritalanmasında fayda sağlamıştır (Tulsieram et al. 1992).
RAPD markörleri; genom haritalama ve gen etiketleme, genetik parmakizi belirleme ve
çeşit tanımlama, populasyon farklılığı, klon tanımlama, taksonomik ve filogenetik
çalışmalar, genetik introgresyon, pedigri ve ebeveyn analizi, bitki büyüme ve gelişmesi,
taksonomik kimliğin belirlenmesi, akrabalık derecelerin belirlenmesi ve karışık genom
örneklerinin analizi, bitkinin farklı yaşam evrelerinin araştırılması, yabancı tozlanma
oranlarının tahmini, ve QTL (Quantitative Trait Locus) analizi gibi çok değişik amaçlı
çalışmalarda kullanılmaktadır (Lodhi 1994).
RAPD markörleri kullanarak genetik haritalama ve gen etiketleme diğer metotlara göre
bazı avantajlara sahiptir: 1) üniversal bir primer seti kullanılabilir ve kısa sürede
taranabilir, 2) klonlanan DNA problarının izolasyonu veya hibridizasyon filtrelerinin
hazırlanması gerekli değildir ve 3) sadece az bir DNA gereklidir (Kelly 1995).
RAPD bazı özellikleri açısından sorun yaratmaktadır. Bu metot, Mg
+2
konsantrasyonu
ve primer/şablon DNA oranı gibi koşullar açısından çok duyarlıdır. Bu da laboratuvar
içi tekrarları azaltmaktadır. Düşük duyarlılıkları nedeniyle karşılaştırmalı haritalama ve
klonlama için çok ender kullanılırlar. Akraba türlerin genomlarını karşılaştırma her
birinde
homolog bölgeleri tanıyan probları gerektirmektedir. Oysaki, genomlar
11
arasında benzerliğin olmaması, RAPD markörlerin poliploid türlerin genom
haritalamasında kullanılmasına olanak verirken, tek-kopya RFLP problar, bir çok dizi
ile hibridize olur ve alternatif allellerin tanımlanmasını güçleştiren oldukça kompleks
desenler oluştururlar (Malyshev and Kartel 1997).
RAPD markörleri tanımlamak için kullanılan kısa primerler bağlı olmayan bölgelerden
bazı dizileri çoğaltabilir. Bu nedenle, bu tür markörler belli bir gen ile yakın bağlantıları
ortaya çıkarsa bile Maya Yapay Kromozom (Yeast Artificial Chromosome-YAC) veya
kozmid kütüphanesinden klonların taranması için kullanılamaz (Paran and Michelmore
1993).
Dominant kalıtımı ve küçük allel sayısı da RAPD'in diğer bir dezavantajıdır. Bir
markör, ıslah programında ancak değişik melezlemelerde açılım gösterirse faydalı
olmaktadır. Bir RAPD lokusu genellikle bir bantın varlığı/yokluğu şeklinde ifade edilen
iki allele sahiptir (Malyshev and Kartel 1997) ve haritalama denemelerinde bu durum
göz önüne alınmalıdır. Haritalama ve tanımlama uygulamalarında, bağlantı fazı durumu
(coupling veya repulsion) mutlaka seçilmelidir. Böylece elde edilen bilgiden ıslahçının
en üst düzeyde yararlanması gerçekleşebilir (Rafalski and Tingey 1993).
RAPD teknolojisi, araştırıcıya çok geniş sayıdaki lokuslarda DNA dizi tabanlı
polimorfizmleri etkin ve hızlı tarama olanağı sağlamıştır. RAPD çoğaltımına uygun
kısa
primer
(genellikle
10-mer)
setleri
ticari
olarak
bulunabilmekte
ve
sentezletilebilmektedir. Bir PCR cihazı ve agaroz jel düzeneği dışında herhangi bir özel
ekipman gerektirmez. Tekrarlanabilirlikle ilgili zorluklar DNA konsantrasyonundaki
varyasyonu ortadan kaldırmak ve çoğaltma sırasında sabit reaksiyon koşulları ve
sıcaklık profili kullanmak suretiyle aşılabilir (Rafalski and Tingey 1993).
12
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmin üretimi, restriksiyon enzimi ile parçalara
ayrılmış DNA parçalarının seçici çoğaltılmasına dayanır (Vos et al. 1995). DNA'nın
poliakrilamid jelde analizi genellikle örnek başına 50-100 band verir. Bantların
yoğunluğuna bakarak homozigot ve heterozigot bireyler ayırtedilmektedir. Minimum
primer testi ile çok sayıda markör üretmesi ve yüksek çözünürlüğü, bu teknolojiyi
genetik markör olarak çekici kılmaktadır. Pahalı olmasından dolayı, bu teknolojinin
MAS
(Markör
Aracılığıyla
Seleksiyon)'ta
kullanılabilmesi
için
otomasyonu
gerekmektedir (Malyshev and Kartel 1997).
SSR (Mikrosatelitler)
Litt and Luty (1989) ve Weber and May (1989), ökaryötik genomda bir çok tekrar
dizilerinin (satelit, mini- ve mikrosatelit, serpiştirilmiş tekrarlar, transpozonlar, yalancı
genler [pseudogenes] vb.) bulunduğunu ifade etmiştir (Malyshev and Kartel 1997).
Mikrosatelitler veya basit tekrar dizileri (SSR) 2-5 ardışık tekrarlı nükleotidleri ifade
etmektedir.
SSR
sayısı
bitkilere
göre
değişiklik
göstermekte
ve
sıklıkları
monokotiledonlarda dikotiledonlara göre daha düşük olmaktadır. Sayıları (n) 10 ila 80
arasında değişen (A)n, (AT)n ve (GA)n dizileri bitkilerde en yaygın olanıdır.
Mikrosatelitler, diğer DNA dizilerinden daha hızlı evrimleşirler. Tekrar sayısında
farklılık gösteren polimorfik alleller oluşturan dinamik mutasyonlar geçirirler. Geniş
dağılım ve yüksek polimorfizm özellikleri nedeniyle mikrosatelitler değişik metotlarda
moleküler markörler olarak kullanılmaktadır (Malyshev and Kartel 1997).
13
SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)
İstenilen bir RAPD markörünün kullanımı, uç kısımlarının dizilerinin belirlenmesi ve
daha uzun primerler (24 nükleotid gibi) oluşturmakla arttırılabilir (Paran and
Michelmore 1993). Bu tür dizileri belirlemiş çoğaltılmış bölgelerde (SCAR) DNA dizi
farklılıkları tek eşsiz bir bandın varlığı/yokluğu ile belirlenir. SCAR, RAPD'e göre daha
fazla tekrarlanabilir ve elektroforeze ihtiyacın olmadığı var/yok dağılımlarına
dönüştürülebilirler. SCAR'lar genelde dominant markörler olmalarına rağmen 4 baz çifti
restriksiyon enzimleri ile parçalanmaları ve DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis) veya SSCP (Single Strand Comformation Polymorphism) teknikleri ile
tanımlanmaları suretiyle kodominant markörlere dönüştürülebilirler (Rafalski and
Tingey 1993).
ASAP (Allele Spesific Associated Primers)
Gu et al. (1995)’ e göre bu teknoloji, belli bir bağlanma sıcaklığında tek bir DNA
parçası oluşturan allel-spesifik bağlantılı primerlerin kullanılması suretiyle alkali DNA
ekstraksiyonunu takiben mikrotiter tabakalar içinde DNA çoğaltımına dayanmaktadır
(Malyshev and
Kartel 1997). DNA parçası sadece uygun allele sahip bireylerde
oluşmakta ve bu sayede çoğaltılan DNA parçalarının elektroforezde ayrımına ihtiyaç
göstermemektedir. Bu
metotta kullanılan etidium bromid
DNA çift sarmala
bağlanmakta ancak PCR karışımındaki serbest nükleotidlere bağlanmamaktadır. Bu
yöntem DNA ekstraksiyon süresini kısaltmak ve geniş çaplı taramalarda PCR
reaksiyonunun güvenilirliğini arttırmak için geliştirilmiştir
SPAR (Single Primer Amplification Reaction)
SPAR,
deney başına çoklu makör üreten bir DNA markör sistemidir. Kullanılan
primerler SSR tabanlıdır ve SSR'ler arası DNA dizileri çoğaltılır (Gupta et al. 1994).
Polimorfizmin düzeyi tür içindeki genomik çeşitliliğe bağlıdır. Çoğu DNA markörü
14
dağınık genom bölgelerini haritalar. Çoğu SSR-SPAR dominant karakterde olmasına
rağmen kodominant olanları da saptanabilir (Malyshev and Kartel 1997).
2.3. Markör Sistemi Seçimi
Bitki ıslahında DNA markör sistemimin seçimi; araştırmanın amacına, populasyonun
yapısına, çalışılan türün genomik çeşitliliğine, markör sisteminin bulunma durumuna,
analiz için gerekli zamana ve birim bilgi başına maliyete bağlı olarak değişir. Her bir
markör sistemi avantaj ve dezavantajlara sahiptir ve bu nedenle kullanım potansiyeli
değerlendirmek çok önemlidir. Örneğin, türler arası haritalar, yaygın RFLP probları ile
oluşturulabilir; ancak her tür başlangıçta bir harita oluşumunu gerektirir. Türdeki
polimorfizmin dağılımı da markör seçiminde rol oynar, yani kendine tozlanan türlerde
RAPD, RFLP'ye göre daha fazla polimorfizm saptar. Ayrıca bir türde kullanılan markör
sistemi bir diğerinde aynı etkinliği göstermeyebilir (Staub et al. 1996).
Markör sistemleri aynı zamanda değişik populasyon, tür ve sınıflarda hem kullanım
hem de polimorfizmi
yakalamak açısından
farklılık gösterir.
Örneğin, bir
populasyonda haritalanan RFLP'ler aynı tür içinde diğer populasyonların karakterize
edilmesinde kullanılabilir. Oysaki SSR, RFLP kadar bilgi sağlayıcı olmasına rağmen
bir türde belirlenen diziler diğer türlerde fayda sağlamayabilir. Aynı şekilde, RAPD,
SPAR ve AFLP kullanan haritalar, kısa sürede yapılmasına rağmen her bir markörün
kendi uzunluğu ile tanımlanmasından dolayı değişik populasyonlarda kullanılamazlar
(yani dizi bilgisi sınırlı olabilir). Ayrıca, populasyon/tür arasında belirlenen aynı
büyüklükteki bir bant, hibridizasyon ile kanıtlanmadığı sürece, aynı diziye sahip demek
değildir (Thormann et al. 1994). RFLP'den farklı olarak, bu markörler PCR tabanlı
sistemlerin tüm avantajlarına (küçük örnek ihtiyacı, yüksek veri eldesi ve erken
seleksiyon vb.) sahiptir. Bu avantajlar tür içinde polimorfizm düşük olduğunda
azalabilir. Bu durumda STR (Short Tandem Repeats) ve SSR seçilmelidir ancak bu
markör sistemlerinin geliştirilmesi oldukça fazla zaman ve maliyet gerektirmektedir
(Staub et al. 1996).
15
Birim bilgi başına maliyet; DNA ekstraksiyonun süresi, analiz için gerekli DNA
miktarı, klonlama ve dizi belirlemesinin gerekliliği, elde edilen genetik bilginin
potansiyel kullanım düzeyi, genetik bilgi tipi, allel varyasyonunun açıklanma durumu
(dominant - kodominant), elektroforez sisteminin otomasyonu, genetik haritaların
kullanım potansiyeli ve tekniğin uygunluğu konularına bağlıdır. RFLP gibi kodominant
markörler MAS ve evrim çalışmaları için yararlıdır ancak çok zaman gerektirir, nispeten
pahalı olabilir ve yüksek oranda teknik uzmanlık gerektirir. Yeni bir tür için RFLP
markör sistemi geliştirmenin çok pahalı olması veya yüksek miktarda DNA'ya ihtiyaç
göstermesi ve yavaş taraması nedeniyle MAS'da etkinliğinin olmaması çoğunlukla
PCR-tabanlı sistemlerden birinin kullanma zorunluluğunu ortaya çıkarır. Fakat, 20-40
baz arasında varyasyonu yakalayan PCR tabanlı teknolojilerden farklı olarak RFLP,
büyük DNA parçaları (prob uzunluğu) arasında benzerliğe dayalı olarak veri elde etmesi
nedeniyle sistematik ve evrim çalışmalarında avantaja sahiptir. Polimorfizmin yüksek
olduğu durumda RFLP'nin bu tür çalışmalarda kullanımı artmaktadır (Staub et al.
1996).
2.4. Harita Oluşturma
Bitki genetik haritalarının geliştirilmesi, genlerin kromozomlar üzerinde nasıl
düzenlendiği hakkında bilgi vermektedir. Haritalar, görünür fenotipik karakterleri
kontrol eden genler olabilen markörlerden (klasik markörler) veya "fenotipi" modern
moleküler biyoloji teknikleri ile ortaya çıkarılan moleküler markörlerden oluşmaktadır.
Haritalardaki markörler, tıpkı yol işaretleri gibi, genetikçiye diğer markörlere veya
önemli genlere göre nerede olduklarını gösterir. Bir dizi markör için açılım gösteren
herhangi bir bitki populasyonu haritalama amaçlı kullanılabilse de geleneksel metot,
uygun ebeveynleri melezleyerek haritalama için gerekli olan çabayı en aza indirmektir
(Grant and Shoemaker 2001).
Moleküler markör teknolojisinin gelişmesi ve birçok markör lokusunun belirlenmesi
genetik haritalamaya olan ilgiyi arttırmıştır. Gen haritalaması araştırıcının; 1) en uygun
populasyonu seçmesini, 2) bu populasyonları kullanarak ikili rekombinasyon
16
frekanslarını hesaplamasını, 3) bağlantı gruplarını belirlemesini ve harita uzaklıklarını
saptamasını, ve 4) harita sırasını belirlemesini gerektirir. Büyük haritalama
populasyonlarının farklı markör sistemleri ile karakterize edilmesinden dolayı harita
oluşturma, bilgisayar programlarına bırakılmıştır. Linkage 1 (Suiter et al. 1983),
Gmendel (Echt et al. 1992), Mapmaker (Lander et al. 1987), MapManager (Manly and
Elliot 1991) ve JoinMap (Stam 1993) gibi bilgisayar paket programları haritalamada
genetik bilginin analizinde kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Bu programlar, açılım
gösteren populasyonlardan elde edilen bilgileri kullanarak rekombinasyon frekanslarını
tahmin etmek suretiyle rekombinasyon olaylarını en aza indirmekte ve genetik
markörlerin doğrusal sıralarını belirlemektedir.
Genetik haritalar ve onları tanımlayan markörler çok çeşitli uygulamalara sahiptir.
Örneğin, verim, tohum kalitesi veya hastalıklara dayanım gibi önemli bitki
karakterlerini kontrol eden genlere yakın haritalayan ve kolayca değerlendirilebilen
genetik markörler, ıslah programlarında dolaylı yoldan bu karakterlerin seçimi için
kullanılabilirler. Bu "markörler aracılığıyla" seleksiyon, yeni ve geliştirilmiş bitki
çeşitlerinin eldesini büyük oranda hızlandırmaktadır (Grant and Shoemaker 2001).
Farklı türlere ait gen haritalarının ortak markörler kullanılarak karşılaştırılması bu
türlerin tarihçesi hakkında bilgi verir. Bu tür bilgiler bitki taksonomisinde evrimin
anlaşılmasında önemli araçlardır. Bu karşılaştırmalar, aynı zamanda araştırıcının bir
türde elde edilen bilgiyi bir diğerinde problem çözmek için kullanmasına imkan sağlar
(Grant and Shoemaker 2001).
Haritalama Populasyonları
Başarılı bir haritalama için populasyon seçimi çok önemlidir. Haritanın ekonomik
önemi markör-karakter ilgisine bağlı olduğundan ebeveyn olarak seçilen genetik
stoklarda mümkün olduğunca kalitatif kalıtıma sahip morfolojik karakterler
bulunmalıdır. Ebeveynlerin kaynağı (kültür ve egzotik) da önemli bir unsurdur. Geniş
çaplı melezlemelerde (kültür x egzotik) kromozom eşlemesi ve rekombinasyon oranları
17
önemli ölçüde zarar görür (baskılanır) ve genellikle daha kısa bağlantı uzaklıklarına
neden olur. Geniş melezlemeler, dar melezlemelere (kültür x kültür) oranla nispeten
geniş polimorfizme sahip açılım populasyonları oluştururlar. Bitki ıslah programlarında
önemli bir değere sahip olması için, geniş melezleme ile yapılan bir haritanın, kültür
ebeveynler kullanılarak elde edilen haritalarla kolinear yani lokus sıralaması benzer
olmalıdır (Staub et al. 1996).
Uygun haritalama populasyonunun seçimi, kullanılan markör sistemine bağlıdır. En
fazla genetik bilgi tamamen sınıflandırılmış F2 populasyonu ve kodominant markörlerle
elde edilebilir. Dominant bir markör sistemi ile elde edilen bilgi ancak heterozigot F2
bireylerinin döl testi (F3 ve F2BC-backcross) ile belirlendiği durumlarda tamamen
sınıflandırılmış F2 populasyonundan elde edilen bilgiye eşdeğer olabilir. Döl testlerinin
uzun ve pahalı olması nedeniyle bu işlem sınırlayıcıdır (Staub et al. 1996).
Dominant markörler, rekombinant sürekli kendilenmiş hatlarda (Recombinant Inbred
Lines-RIL, genellikle >F8), katlanmış haploidlerde (DH) veya cis fazı halindeki geri
melezleme populasyonlarında kodominat markörler kadar bilgi sağlar (Burr et al.
1988). Dominant markörlerden elde edilen bilgi, bütün lokusların neredeyse ve
tamamiyle homozigot olmaları nedeniyle RIL veya DH'in kullanılması suretiyle
maksimum hale getirilebilir. Reiter et al. (1992)’e göre, sıkı bağlantı (~%10
rekombinasyon) durumunda, dominant ve kodominant markörler BC populasyona göre
RIL populasyonunda birey başına daha fazla bilgi sağlamaktadır (Staub et al. 1996).
Ancak, aradaki uzaklık arttıkça (yani lokus daha bağımsız oldukça) RIL
populasyonunda birey başına elde edilen bilgi, kodominant markörlere oranla oldukça
azalmaktadır.
Geri melezleme (BC) populasyonları, geriye melezlenen (alıcı) ebeveynde bütün
lokuslar homozigot ve alıcı ile verici (donör) ebeveyn birbirine zıt polimorfik markör
allellere sahip ise dominant markörlerin haritalanması için uygundur (Reiter et al.
1992). Kodominant veya dominant markörlerin kullanıldığı BC'de elde edilen bilgi, F2
populasyonundan elde edilenden daha azdır; çünkü bitki başına 2 yerine 1 rekombinant
18
gamet örneklenmektedir. Ancak, rekombinant safhat populasyonunda bağlı lokuslar
arasında uzaklık artmasından (~%15 rekombinasyon) dolayı BC populasyonu (düşük
markör yoğunluğunda) RIL'e göre daha fazla bilgi sağlar. Artan rekombinasyon sıkı
bağların çözünmesinde fayda sağlayabilir fakat düşük markör yoğunluğunda harita
oluşturmada istenmeyebilir (Staub et al. 1996).
Yakın zamanda, bağlantıların hızlı tespiti için Bulked Segregant Analysis (BSA)
yöntemi geliştirilmiştir. BSA'da iki grup DNA örneği, tek bir melezden gelen açılım
populasyonundan elde edilir. Bu gruplarda bir özellik için birbirinin aynısı (örneğin bir
hastalığa dayanıklı veya duyarlı) olan fakat diğer bağlı olmayan bölgelerde tesadüfi
(heterozigot) olan bireyler veya genomik bölgeler bulunur. Bu gruplar, DNA
polimorfizmi için taranır ve farklılıklar, bağlantısız lokusların tesadüfi genetik durumu
ile karşılaştırılır. Böylece, bu iki grup arasındaki farklılıklar belli bir özelliğe bağlı
markörleri (bantları) gösterir. BSA, geliştirilmeleri için birçok geri melezlemenin
yapılması gereken neredeyse izogenik hatların (NIL-Nearly Isogenic Lines)
kullanımından kaynaklanan bazı problemleri aşmaktadır. NIL'de polimorfik lokusların
sadece bir kısmı seçilen bölgenin haritalanmasında kullanılırken, hedef bölgeye bağlı
olmayan bölgeler BSA'da gruplar arasında farklı olmayacaktır. Ayrıca BSA'da saptanan
bütün lokuslar açılacak ve haritalanacak, bu şekilde bağlantı sürüklenme problemleri
(verici ebeveynden gelen DNA parçaları ile çevrilen genlerin geri melezleme ile hatlara
yerleştirilmesi) saf dışı bırakılacaktır (Staub et al. 1996).
Yüksek düzeydeki heterozigotluk, asmada her çeşidin aslında bir F1 olması nedeniyle
genetik çalışmaları büyük oranda kolaylaştırmıştır. Döl, heterozigot bütün lokuslar
açısından açılım gösterecektir. Genetik olarak iki çeşit veya bitki arasındaki kontrollü
melezleme “çift yönlü yalancı melezleme” tekniği olarak ifade edilir (Grattapaglia et
al. 1992, Hemmat et al. 1994, Weeden et al. 1994). Yalancı melezleme populasyonu,
heterozigot bir birey (+/-) ile homozigot resesif bir bireyin (-/-) melezlenmesi ile elde
edilmektedir. Döl, polimorfik RAPD veya AFLP markörleri için 1:1 oranında açılım
gösterir. Bu tür melezlemelerde, dominant markörler en az kodominant markörler kadar
değerlidir çünkü 1:1 dağılımda fenotip genotipe eşittir (Luo et al. 2002). Bu durumda
yapılan bağlantı analizi, iki genetik harita ile sonuçlanır: bir tanesi dişi ebeveyn, diğeri
19
baba ebeveyn içindir. Bu iki harita daha sonra kodominant markörler (izozimler,
RFLP, mikrosatelitler) veya daha az etkin olan RAPD veya AFLP (3:1 açılım gösteren)
markörler kullanılarak tek bir harita haline getirilebilir (Lodhi et al. 1995).
Bağlantı fazı
Genler aynı kromozom üzerinde olduğunda bağlıdırlar. Bir çift kromozom üzerinde iki
gen iki farklı şekilde düzenlenebilir; cis (coupling) ve trans (repulsion). Cis durumunda
iki resesif allel bir kromozom üzerinde, dominant alleller ise diğer kromozom üzerinde
yer alır (AB//ab). Trans durumu ise alternatif düzeni (bir dominant ve bir resesif allel
aynı kromozom üzerinde) anlatır (Ab//aB). Bu ilişki, harita oluştururken dominant
markörler kullanıldığında özellikle önemlidir. Dominant allel olarak belirlenen iki bağlı
markör (AA veya bant var (+)) sadece cis fazında iken saptanabilir; çünkü heterozigot
sınıf homozigot sınıftan ayırt edilemez. Aksine kodominant markörler her iki allelin
ifadesine olanak sağlar (fenotipik olarak AA, Aa, aa) (Haley et al. 1994).
2.5. Klasik Haritalama
Bir populasyonda genetik çeşitliliği sağlayan en önemli faktörler mutasyon ve genetik
rekombinasyondur. Mutasyon genetik koddaki değişikliktir. Bu değişim, tek bir
nükleotidi etkileyen basit bir tek nokta mutasyonu şeklinde olabileceği gibi daha büyük
eksilme veya yeniden düzenlenme gibi bir yapısal değişim şeklinde de olabilir. Bu
mutasyonlar, bireyler arasında genetik varyasyona neden olmaktadır. Bireyler ya da
populasyonlar arasında farklı olan bütün karakterler, genetik koddaki değişikliğin
sonucu olarak ortaya çıkar. Bu görünür karakterler (veya fenotipler) "klasik karakterler"
olarak tanımlanırlar ve aksi ispat edilmedikçe tek bir gen tarafından kontrol edilen
karakterlerdir. Her gen, bir genetik lokusu ifade eder ve genin her bir farklı durumu
"allel" olarak bilinir.
Birçok türde, iki bitkinin melezlenmesiyle elde edilen döl, ebeveyninden 1 kromozom
alır ve genler kromozom üzerinde doğrusal şekilde yer aldıklarından ebeveynlere ait
20
lokuslar, döle ebeveynde yer aldığı sıralamanın aynısı olarak aktarılırlar, yani homolog
kromozomların her bir çifti ebeveynlerde var olan tüm genetik varyasyonu kapsar.
Kromozom üzerindeki herhangi bir lokus için döl homozigot (her iki ebeveyn aynı
allelleri verir) veya heterozigot (ebeveynsel alleller farklıdır) olabilir.
Döl daha ileri düzeyde eşeyli üreme gerçekleştirirse, mayozun bir aşamasında
kromozomlar sıralanır ve homolog kromozomlar arasında genetik materyal alışverişi
gerçekleşebilir. Bu alışverişe "rekombinasyon" ya da "parça değişimi" adı verilir ve her
gamette kromozomlar üzerinde yeni allel kombinasyonları ile sonuçlanır. Bu
rekombinant gametler daha sonra yeni ebeveyne ait olmayan allel kombinasyonları
taşıyan bitkiler oluştururlar.
Rekombinasyon, genetik harita oluşturmanın temelidir. Rekombinasyon tesadüfi bir
olaydır;
bir
kromozomun herhangi bir yerinde bir rekombinasyon olayının olma
olasılığı herhangi bir başka yerde oluşma olasılığı ile aynıdır. Bu nedenle, iki gen
kromozom üzerinde birbirine ne kadar yakın ise rekombinasyon ile birbirinden ayrılma
olasılığı o kadar düşüktür (Grant and Shoemaker 2001).
Rekombinasyon frekansı genetik haritanın çıkarılmasında kullanılmaktadır. Örnek
verecek olursak;
A
B
C
--
--
--
A
B
C
x
a
b
c
--
--
--
a
b
c
Ebeveynlere ait
Ne sıklıkta
Ebeveynlere ait olmayan
Ne sıklıkta
allel kombinasyonu
gözlendiği
allel kombinasyonu
gözlendiği
A-B veya a-b
%70
A-b veya a-B
%30
A-C veya a-c
%95
A-c veya a-C
%5
B-C veya b-c
%75
B-c veya b-C
%25
A, B ve C'yi oluşturan genlerin kromozomlar üzerindeki sıralaması: A--C-----------B
21
Gen veya markörlerin ne sıklıkta rekombine oldukları; harita üzerindeki yerleri
arasındaki genetik uzaklığı ifade eder. Harita uzaklığı ile rekombinasyon değeri
arasındaki ilişki, genetik haritalama fonksiyonu (mf) ile belirtilir. mf, bir bağlantı
haritasında parça değişimi frekansını kullanarak uzaklıklar arasındaki kantitatif ilişkiyi
açıklayan bir formüldür. Haritalama populasyonunu en iyi temsil eden tahmini parça
değişimi derecesine bağlı olarak birden fazla haritalama fonksiyonu bulunmaktadır. En
yaygın olanları Haldane (1919) ve Kosambi (1944)’dir. Haldane bir bölgedeki parça
değişiminin yanındaki bölgede parça değişimi olmasını engellemediğini (interference)
hesaplarken, Kosambi ise daha az parça değişimine neden olduğunu (positive
interference) hesaplamaktadır (Malyshev and Kartel 1997).
Moleküler biyolojinin başlangıcından önce genetikçiler klasik karakterleri kullanarak
bir çok bitki türüne ait genetik haritaları geliştirmiştir. Değişik genotiplerde doğal
olarak meydana gelen mutasyonlar boy, çiçek rengi, tohum morfolojisi gibi bitki
karakterlerinde varyasyonlara yol açmıştır. Melezlemeler yaparak ve uygun alleller
oluşturarak genetikçiler sadece fenotipik karakterlerin açılımını kullanmak suretiyle
genetik harita çıkarabilmişlerdir.
Klasik haritalar çok faydalı ve bilgi vericidir, çünkü haritada her bir markör bir bitki
karakterini oluşturan genin yerini temsil etmektedir. Ancak tanımı itibariyle, bir klasik
haritadaki markör sayısı, gözlenebilir karakterlere ait genlerin sayısı ile sınırlıdır. Klasik
haritaları çıkarmak da zordur; çünkü çoğunlukla sınırlı sayıda gözlenebilir genetik
varyasyonlar, üreme veya yaşam problemi çıkarmadan bir döl populasyonunda açılım
göstermektedir. Bu nedenle, klasik genetik haritalar her zaman bir organizmada olduğu
ifade edilen gen sayısından çok daha az markör bulundurur (Grant and Shoemaker
2001).
22
2.6. QTL Haritalama
Bitki ıslahı, uygulamalı bilimin dinamik bir alanı olup genetik varyasyona dayanır ve
seleksiyonu kullanarak üretici ve tüketici için ilgi çekici olan karakterler açısından
bitkiyi geliştirir. Kültür bitkilerinde kantitatif varyasyon; verim, kalite veya hastalıklara
dayanım gibi bir çok önemli karakterin bir özelliğidir. Bu nedenle kantitatif
varyasyonun araştırılması ve özellikle potansiyel genetik temelinin ortaya çıkarılması
ıslah çalışmalarında birincil öneme sahiptir. W. Johannsen 20. yüzyılın başında bu tür
kantitatif varyasyonun çok sayıda açılım gösteren genler ile çevresel faktörlerin birlikte
hareket etmesinden kaynaklandığını göstermiştir (Asins 2002).
Markör genlerin açılımı ve birey veya hatların fenotipik değerlerinin analiziyle,
kantitatif karakterleri etkileyen lokusların (QTL) yerini saptamak ve tanımlamak
mümkündür. QTL'lerin saptanması, kesin fenotipik açılımların olmayışı ve kompleks
bir karakter ile ilgili her bir genin fenotipik etkisinin nispeten küçük oluşu nedeniyle
zordur. QTL analizi, bir ya da daha fazla kalitatif karakter açısından farklı ebeveynlerin
seçilmesi ve melezlenmesi ile açılım gösteren döllerin analiz edilip bilinen DNA
molekülleri ile kantitatif karakter lokusu arasında bir bağlantının kurulmasıyla
gerçekleştirilir. Islahçı bu bilgiyi, örneğin dolaylı seleksiyonu kullanarak, kendi
avantajına kullanabilir. Seleksiyon, moleküler markörlerin uygulanması aracılığıyla elde
edilen genetik bilgiye dayanıyorsa, markörler aracılığıyla seleksiyon (MAS) adını alır
ve bitki ıslahı çalışmalarının etkinliğini arttırmak için kullanılabilir. Aynı zamanda
baskılanmış ilginç yabani allelleri açığa çıkarır ve akraba olan ve olmayan yabani
türlerden genetik materyalin daha kolay aktarılmasını sağlar (Asins 2002).
QTL terimi ilk kez Geldermann (1975) tarafından ileri sürülmüştür. QTL saptama
konusu ise yaklaşık 80 yıl önce Sax’ın çalışmalarından sonra geliştirilmiştir. Son
yıllarda DNA markörlerinin geliştirilip ıslahta kullanılması ile birlikte güçlü biyometrik
metodların varlığı, bitkilerde QTL haritalamada önemli gelişmelere yol açmıştır (Asins
2002).
23
QTL analizinin en belirgin uygulamaları ıslah ve ıslah öncesi çalışmalar ile QTL
klonlamada markörler aracılığıyla seleksiyondur. Başarı, bilginin sağlandığı QTL
analizinin güvenilirliği ve doğruluğuna dayanır. QTL analizinin temel amacı, QTL’i dar
kromozomal
bölgelere
yerleştirmektir.
Bu
amaçla
deneme
şeklinin,
açılım
populasyonunun tipinin, büyüklüğünün, sayısının, DNA markörlerinin bilgi sağlama
düzeyi ile polimorfikliği, bağlantı haritasının kurulması ve QTL analizinin yapılması
için istatistiksel metodolojilerin hepsinin birlikte değerlendirilmesi gerekir (Asins
2002).
Hyne and Kearsey (1995) herhangi bir anda, herhangi bir populasyonda 12’den fazla
QTL saptanmasının zor olduğunu ifade etmiştir. QTL sayısı karaktere, ebeveynlerin
yapısına ve fenotipik varyansa bağlıdır. QTL’lerin küçük etkileri, moleküler markörler
ile aşağıda belirtilen özelliklere bağlı olarak saptanabilir: (i) QTL ile ona en yakın
markör arasındaki harita uzaklığı; QTL marköre ne kadar yakın ise QTL’in küçük olan
etkileri o kadar sağlıklı saptanabilir, (ii) açılım populasyonunun büyüklüğü; populasyon
ne kadar büyük ise çok daha az etkiye sahip QTL’lerin istatistiki öneme sahip olma
olasılığı artar, ve (iii) kalıtsallık; kalıtsallık ne kadar az ise bir QTL’in saptanma
olasılığı o kadar az olur (Brar 2002).
QTL’in Saptanması
Markör lokuslarının kullanılmasıyla QTL'lerin saptanması düşüncesinin altında yatan
prensip; markör lokusu ile bağlı QTL'in allelleri arasında bağlantı dengesizliği (linkage
disequilibrium) olmasıdır. Bağlantı dengesizliği, bir populasyonda farklı lokuslardaki
allellerin tesadüfi olmayan ilişkisi olarak tanımlanabilir ve seleksiyon ve genetik
yönlenme gibi faktörler tarafindan ortaya çıkarılır. Ancak, F2, F3 veya geri melezleme
populasyonu gibi generasyonlarda bağlantı dengesizliğinin en önemli nedeni, lokuslar
arasındaki fiziksel bağlantıdır ve bu durum geçtiğimiz yüzyılda klasik bağlantı
haritalarının temelini oluşturmuştur. Lokuslardaki fiziksel bağlantıdan kaynaklanan
bağlantı dengesizliği, kontrollü dölleme ile elde edilen populasyonlarda çok önemlidir
24
ve dolayısıyla markör lokuslarını kullanarak QTL'leri saptama ve tanımlama yeteneği
en yüksek derecededir (Tanksley 1993).
Tek gen karakterlerin klasik bağlantı saptaması yönteminin aksine tek QTL'in
tanımlanması (saptanması ve yerinin belirlenmesi) için farklı stratejiler ileri sürülmüştür
(Jiang and Zeng 1995, Lander and Botstein 1989). Bu stratejiler, karakterin
varyasyonuna katkıda bulunan toplam genetik varyansın ana düzeylerini tanımlamaya
çalışır. Bağlantı tahmini sırasında değerlendirdikleri markör sayısına bağlı olarak
yaklaşımları farklılık gösterir. QTL/ karakter bağlantısı testleri; her seferinde bir markör
(tek nokta analizi), aynı anda iki markör lokusu (aralık haritalama) veya bütün olası
markör lokuslarının aynı anda değerlendirilmesini (çoklu aralık analizi) içerir. Tekmarkör karşılaştırma stratejisinde, geri melezleme populasyonunda tek yönlü varyans
testi (F testi) ve geri melezleme ve F2 populasyonlarında markör genotip ortalama
karşılaştırmaları (t testi) tipiktir (Soller et al. 1976, Stuber et al. 1992). Bu yaklaşım,
markör ve QTL arasında potansiyel rekombinasyonu dikkate almaz ve böylece QTL ve
markör denk gelmiyorsa, QTL etkisinin daha az tahmin edilmesine yol açar. Tek markör
yaklaşımı, aynı zamanda populasyon dağılımının uçlarında yer alan bireylerin markör
frekansları için örneklendiği karakter merkezli analizi de devreye sokar. Bu durumda,
dağılımın uçları arasında yer alan ve frekansları farklı olan markörlerin karakteri
etkileyen QTL ile bağlantılı olduğu düşünülür (Staub et al. 1996).
Aynı anda 2 markör lokusunu araştıran yaklaşımlar, bir çift markörün çevrelediği tek
QTL'in analizinde azami olasılığın kullanıldığı aralıklı (interval) haritalama stratejilerini
ifade eder (Lander and Botstein 1989, Paterson et al. 1991). Aralık haritalama yaklaşımı
nispeten yüksek derecede genom doygunluğuna (her 5-20 cM'da bir markör) sahip
bağlantı haritalarının sağladığı ek bilgilerden faydalanmak için geliştirilmiştir (Paterson
et al. 1991). Aralık yaklaşımı, bir markör aralığında herhangi bir yerde aday QTL
etkilerinin tahminine, markör sınıflarındaki ortalama ve varyanslar ile belli bir aralığı
çevreleyen markörler arasındaki rekombinasyon frekanslarına dayanarak izin verir
(Lander and Botstein 1989). Bu yaklaşım, kısmen bağlı olmayan markörleri test
edememe ve belli bir bağlantı grubunun uç markörlerinin ötesinde QTL'i
yerleştirememesinden dolayı sınırlıdır (Staub et al. 1996).
25
Cowen (1989), Rodolphe and Lefort (1993) ve Stam (1993) QTL analizi sırasında
bütün olası markör lokuslarının aynı anda düşünülmesinin karmaşık olduğunu ve çoklu
markör lokus değerleri üzerinde karakter ifadesinin regresyonunu gerektirdiğini
bildirmiştir (Staub et al. 1996).
Pahalı olmayan ve kolay uygulanabilir moleküler markörlerin varlığı, Vitis genetiğine
yönelik araştırmaları kolaylaştırmıştır. Günümüzde asma genomunu haritalamak ve her
genotipin DNA profilini çıkarmak mümkün olmaktadır. İlk bitki bağlantı haritaları
görsel değerlendirebilen morfolojik markörlere dayanmaktadır. Daha sonra izoenzim ve
DNA-tabanlı markörler yoğun şekilde doygun haritaların çıkartılmasında kullanılmıştır.
Weeden et al. (1988) “Cayuga White” x “Aurore” melezlerinden birinde yaptıkları
çalışmada değişik izoenzim sistemlerini kullanarak bağlantı analizi yapmıştır.
Araştırıcılar asmada yeterince izoenzim polimorfizminin bulunduğu sonucuna
ulaşmıştır.
Mauro et al. (1992), Cayuga White x Aurore F1 populasyonunda RFLP markörlerini
kullanarak genetik analiz yaptıkları çalışmada, Vitis’in RFLP yönünden zengin
olduğunu ve Vitis gibi genomunda nispeten yüksek düzeyde polimorfizme sahip çok
yıllık odunsu türlerin ilk generasyonlarında RFLP çalışmalarının yapılabileceği
sonucuna varmıştır.
Asmada moleküler markörler kullanılarak yapılan ilk gerçek haritalama çalışması Lodhi
et al. (1995) tarafından Cayuga White x Aurore interspesifik hibrid çeşitlerinin çift
yönlü yalancı melezleme tekniği kullanılarak oluşturulan F1 populasyonunda
gerçekleştirilmiştir. Çalışmada 422 RAPD ile 16 RFLP ve izoenzim markörü
kullanılmıştır. “Cayuga White” haritası 19 kromozom üzerinde 214 markör yaklaşık
1196 cM’lık alanı kapsamakta ve her biri üzerinde 4-21 markör bulunduran 20 adet
bağlantı grubundan oluşmaktadır. “Aurore” haritası ise 225 markörün 1477 cM’lık
alana yayıldığı ve her biri üzerinde 3-21 adet markör bulunduran 22 bağlantı grubundan
oluşmaktadır. Kullanılan toplam 443 markör ile “Cayuga White” x “Aurore” bağlantı
26
haritaları orta derecede doygundur. Araştırıcılar bu haritanın hibrit bitkilerin
gelişmenin erken dönemlerinde markör aracılığıyla seleksiyon programlarında
kullanılabileceğini ileri sürmüştür.
Ye et al. (1995) asmalarda özellikle küllemeye (Uncinula necator) karşı dayanım
haritasının oluşturulması amacıyla; iki interspesifik hibritten (Horizon ve Illinois 547-1)
elde edilen F1 populasyonunda, küllemeye dayanıma yönelik veriler 4 yıl boyunca
hastalığın kontrol altında tutulmaya çalışıldığı alanlarda ebeveyn ve döllerin
yetiştirilmesiyle elde etmiştir. İncelenen 327 RAPD primerinden sadece 90 adedi ile
504 adet skorlanabilen ve açılım gösteren DNA parçası çoğaltılmış ve haritalamada
kullanılmıştır. Bunlardan 42 adedi Horizon çeşidinde 19 bağlantı grubunda 1099 cM’lık
ve 48 adedi de Illinois 547-1 çeşidinde 20 bağlantı grubunda 1059 cM’lık alana
yayılmıştır. Çalışmanın sonuçlarına göre araştırıcılar 3 yıllık arazi gözlemlerinin de
yardımıyla 547-1 çeşidinde (dayanıklı) 10 numaralı bağlantı grubunda bir bölgenin,
büyük bir ihtimalle, küllemeye dayanımı etkileyen bir QTL taşıdığı sonucuna
ulaşmışlardır.
Bouquet and Danglot (1996) çekirdeksizliğin birbirinden bağımsız kalıtım gösteren 3
adet tamamlayıcı resesif gen ile 1 adet dominant gen (sdI, seed development inhibitor)
tarafından kontrol edildiğine dair bir model ileri sürmüştür.
Early Muscat ve Flame Seedless çeşitleri arasında yapılan melezleme çalışmasından
elde edilen populasyonda çekirdeksizlik ile bağlantılı markörler araştırılmıştır (Striem et
al. 1996). 82 bireyden oluşan bu populasyonda çekirdeksizlik karakteri ile ilgili 7
özellik analiz edilmiştir. Bu özellikler; bir çekirdeğin ortalama taze ağırlığı, tanedeki
çekirdeklerin toplam taze ağırlığı, çekirdeğin kapsam algısı, görsel değerlendirilen
çekirdek büyüklüğü kategorileri, tohum kabuğunun sertlik derecesi, endospermin
gelişme derecesi ve embriyonun gelişme derecesidir. İncelenen 160 RAPD primerinden
110 adedi belirgin bant desenleri vermiştir. 12 markör özellikle kantitatif karakter olan
bir çekirdeğin ortalama taze ağırlığı ve tanedeki çekirdeklerin toplam taze ağırlığı ile
önemli korelasyon göstermiştir. 4 markör, 9 adet çekirdekli bireyi tanımlamıştır. Ek
27
olarak, 3 markör, 21 adet çekirdekli ve 4 görülebilen çekirdek izine sahip bireylerin
tanımlanmasını sağlamıştır. Bu işlem ile populasyon büyüklüğü %44 oranında
azaltılabilmiştir. Bu sonuçların ön seleksiyon amaçlı kullanılabileceği araştırıcılar
tarafından ifade edilirken, öncelikle seçilen markörlerin, ebeveynler arasında polimorfik
olduğunun belirlenmesi gerektiği ifade edilmiştir.
Reisch and Pratt (1996), külleme (Uncinula necator)’nin asmanın zarara yol açan en
önemli hastalıklarından biri olduğunu ifade etmiştir (Dalbó et al. 2001). Islah
programları, bu nedenle, dayanıklı çeşitler geliştirmek üzerine yoğunlaşmıştır.
Küllemeye dayanımda birden fazla genin görev aldığı düşünülmüştür (Boubals 1961).
Markör aracılığıyla seleksiyon yaklaşımına tek engel, yeterli düzeyde dayanım için
birden fazla genin gerekli olabilmesidir. Ancak küllemeye dayanım üzerinde nispeten
güçlü etkiye sahip bir genomik bölgenin tespit edilmesi (Dalbó 1998), bir major genin
veya gen salkımının rol oynadığını düşündürmektedir.
Ye et al. (1995)’ın oluşturduğu Horizon x Illinois 547-1 populasyonunda, Dalbó (1998)
külleme ve siyah çürüklük hastalıklarına dayanımın kalıtımını çalışmıştır. RAPD
markörlerin kullanıldığı haritalama çalışmasında her iki ebeveyne ait genetik haritalar
çıkarılmış ve 20 adet bağlantı grubu belirlenmiştir. Çalışmaya 30 mikrosatelit ve 4 STS
(Sequence Tagged Sites) markörünün de eklenmesiyle 10 adet homolog bağlantı grubu
tespit edilmiştir. Birbirlerinden ortalama uzaklığı 7.5 cM olan 451 markör haritalar
üzerine yerleştirilmiştir. Araştırıcılar dayanıklı çeşit olan 547-1 üzerinde 10 numaralı
bağlantı grubu üzerinde küllemeye dayanım için güçlü bir QTL tespit etmişlerdir.
CS25997 markörü bu QTL ile sıkı ilişkili bulunmuştur. İki küllemeye dayanım QTL’i
ise Horizon (duyarlı) çeşidinde 16 ve 18 no’lu bağlantı grubunda bulunmuştur. İlginç
bir şekilde, küllemeye dayanım QTL’inin bulunduğu bağlantı gruplarında aynı zamanda
süyah çürüklük için de QTL bulunmuştur. Çalışmanın sonucunda elde edilen bulguların
ıslah programında kullanılma olasılığı da araştırılmıştır. Buna göre, küllemeye
dayanımda görev alan en güçlü QTL (547-1 çeşidinde 10. bağlantı grubu) seçilmiştir.
Bu QTL’e yakından bağlı bir RAPD markörü (CS25b) ve bir AFLP markörü (AfAA6),
CAPS markörlerine dönüştürülerek aynı dayanım kaynağının kullanıldığı farklı
28
melezlerde QTL açılımı takip edilmiştir. Bütün melezlerde, küllemeye duyarlı
bireylerin yüzdesinin, bu markörler esas alınarak yapıldığında önemli ölçüde
azaltılabileceği sonucuna varılmıştır
Fungal hastalıklara dayanıklı “Regent” ve duyarlı “Lemberger” çeşidi arasındaki
melezleme ile elde edilen 150 bireylik populasyon,
asmanın moleküler haritasını
çıkarmak amacıyla kullanılmıştır. 47 birey üzerinde test edilen RAPD markörlerin tüm
populasyona uygulanması ile 11 bağlantı grubu ortaya çıkarılmıştır (Buck and Zyprian
2000).
Antcliff (1980) çiçek cinsiyetinin tek lokus tarafından yönetildiğini, Carbonneau (1983)
ise bu karakterin bir başka lokus tarafından epistatik olarak etkilendiğini ifade etmiştir
(Dalbó et al. 2000). Horizon ve Illinois 547-1’in melezlenmesi ile oluşturulan 58 F1
bitkisinde gerçekleştirilen genetik haritalama çalışmasında 277 RAPD, 25 mikrosatelit,
4 CAPS ve 12 AFLP markörü kullanılmış ve asmalarda cinsiyeti kontrol eden tek bir
lokusun bir mikrosatelit (VVS3) ve bir RAPD (GY104i) markörü ile yakından bağlantılı
olduğu bulunmuştur. Bazı rekombinantların varlığına rağmen VVS3, Vitis
ıslah
programlarında erkek tiplerin çıkartılması amacına yönelik olarak en fazla kullanılma
olanağına sahip olmuştur (Dalbó et al. 2000).
Grando et al. (2000) Moscato bianco ve Vitis riparia arasındaki melezleme ile elde
ettikleri populasyonda (90 bitki) polimorfizm ve moleküler karakterlerin açılımını test
etmek amacıyla mikrosatelit ve RAPD markörleri kullanmışlardır. Ebeveynlere ait
bütün allel büyüklükleri analiz edilen bütün lokuslarda farklı olmuştur. Allel açılım
oranları Mendel değerlerine yakın olmuş ve VVMD6 ve VVMD7 lokusları dışındaki
tüm lokuslar bağımsız şekilde kalıtım göstermiştir. Bant desenlerinin tekrar elde
edilmesi
aşamasında
karşılaşılan
zorluklar
nedeniyle
markörlerinin açılımı haritalama için daha az yararlı olmuştur.
29
populasyondaki
RAPD
Vitis amurensis hibritleri, Vitis vinifera çeşitleri ve Franko-Amerikan hibritlerinin
kullanıldığı bir çalışmada Kozma (2000), fungal hastalıklara dayanımı araştırmıştır.
Doğal ve yapay enfeksiyonun yapıldığı çalışmada, dayanım düzeyleri tespit edilmiştir.
Külleme ve mildiyöye dayanımın dominant karakterde olduğu tespit edilmiştir.
Dayanım derecesi ebeveynin genetik kaynağına göre değişmiştir. Franko-Amerikan
hibritleri ile Doğu Asya V. amurensis hibritlerinin dayanım ıslahı çalışmaları için iyi bir
kaynak olabileceği araştırıcı tarafından belirtilmiştir.
Milutinovic et al. (2000) tarafından gerçekleştirilen çalışmada, renkli meyve suyuna
sahip çekirdeksiz bir çeşit elde etmek amacıyla yapılan melezlemede (Evita x
Beogradska Besemena) kalıtım şekli de incelenmiş ve tane rengi ile meyve suyu rengi
için tek gen kalıtımının olduğu gözlenmiştir. Çekirdeksizliğin monogenik kalıtımın
dışında bir kalıtıma sahip olduğu belirlenmiştir. Verim ve salkım ağırlığı için, düşük
verim ve salkım ağırlığına sahip ebeveynin (Evita) dominantlığı saptanmış ve tane
ağırlığı için düşük tane ağırlıklı ebeveynin (Evita) kısmi dominantlığı belirlenmiştir.
Ren et al. (2000) iki muskadin üzüm çeşidi “Summit (beyaz) x Noble (kırmızı)”
kullanarak tane rengine yönelik markör tespit etmeye çalışmıştır. F1 populasyonunda
tane rengine yönelik açılım kırmızı rengin tek bir dominant gen tarafından kontrol
edildiğini göstermiştir. RAPD-PCR tekniği ve BSA yöntemi tane rengi karakterini
etiketlemek için kullanılmıştır. Toplam 350 adet primer, 7’şer bireyden oluşan kırmızı
ve beyaz DNA havuzunda polimorfizm açısından incelenmiştir. Hedef gene bağlı 2
RAPD markörü tespit edilmiştir. Bir tanesi (650 baz çiftlik) kırmızı taneli 56 bireyle
birlikte açılım gösterirken, beyaz bireyler bu markörü taşımamıştır. Sonuçlar RAPD
markörünün tane rengine yönelik erken seleksiyonda güvenilir olduğunu göstermiştir.
M. rotundifolia,
Xiphinema index’e (kamalı nematod) karşı çok güçlü dayanıma
sahiptir. V. rupestris x M. rotundifolia melezi olan 200 F1 birey X. index dayanımı
yönünden taranmış (Walker and Yin 2000) ve 70 adedi dayanıklı bulunmuştur. İki F1
(8909 ve 8913) DNA markör taraması ve kalıtım testi için kullanılmıştır. Analiz edilen
30
70 RAPD primerinden bir tanesi (OPA-12) dayanım ile bağlantılı bulunmuştur. OPA12 ürünü klonlanmış ve bir SCAR markörüne dönüştürülmüştür. Dayanıklı bitki
seleksiyonundan 30 tanesi arazi performansı ve virüs dejenerasyonuna dayanımı
değerlendirmek amacıyla 7 denemeye alınmıştır. X. index’e dayanımı açısından normal
olmayan açılım oranları gözlenmesine rağmen F1 bitkilerin sitogenetik incelemesi, 38
kromozom taşıdıklarını göstermiştir. Hibritler umulmadık şekilde verimli çıkmıştır ve
araştırıcılar tarafından “dayanıklı x dayanıklı”, “dayanıklı x duyarlı”, her iki ebeveyne
geri melezleme ve dayanıklı bitkilerin kendilenmesi ile F2 generasyonu elde edilmiştir.
2000’den fazla haritalama hibriti, X. index’e dayanım için test edilmiş ve normal
Mendel oranları gözlenmiştir. Kendilenmiş grup dışında bütün sonuçlar, dayanımın tek
bir dominant gen tarafından kontrol edildiğini düşündürmüştür. 350 bireyden oluşan
“dayanıklı x duyarlı” melezleme populasyonu genetik haritalama analizinde
kullanılmıştır. Tesadüfi seçilen 116 hibritte AFLP markörleri kullanılarak dayanıma
bağlı markör bulma çalışması yapılmıştır. Açılım gösteren 500’ün üzerinde AFLP
markörü her iki ebeveynde 19 bağlantı grubu oluşturmuştur. Araştırıcılar bu haritanın
Muscadinia’dan Vitis’e bir çok önemli dayanım karakterlerinin aktarılması için temel
oluşturacağını ifade etmişlerdir.
Lahogue et al. (1998) tarafından bulunan sdI genine bağlı RAPD markörleri, Sultana
kökenli kısmen çekirdeksiz iki genotipin melezlenmesi ile elde edilen populasyonda
BSA yöntemi ile araştırılmıştır (Adam-Blondon et al. 2001). İki RAPD markörü (OPC08 ve OPP-18) sadece çekirdeksiz genotiplerde bulunmuş ve bu karakter ile bağlantılı
bir majör lokusun varlığı gösterilmiştir. OPC-08 RAPD markörü SCAR markörüne
(SCC8) dönüştürülmüştür.
Georgiady et al. (2001) asmada ekonomik anlamda öneme sahip bir çok özelliğin
birden fazla gen grubu tarafından kontrol edildiğini ifade etmiştir. Bu poligenik
karakterlerin doğasını daha iyi anlamak için Vitis’e ait bir genomik harita çıkartılması
ve önemli özelliklerin düzenlenmesinde rol alan genetik faktörlerin haritalanması
amacıyla bir adet F1’in kendilenmesi ile oluşturulan 1000 bireylik F2 populasyonu
oluşturmuştur. Yaklaşık 700 AFLP ve bazı SSR markörleri haritalama için halen
31
kullanılmaktadır. Populasyondan seçilen ve vegetatif olarak çoğaltılan 300 birey
hastalığa dayanım, genel bitki gelişmesi ve şekli ile meyve verimi ve kalitesi gibi
kantitatif karakterlerin haritalanmasında kullanılmaktadır. Bu QTL haritalama
populasyonu, çevrenin karakterler üzerine etkilerini araştırmak amacıyla coğrafik ve
iklimsel yönden farklı alanlarda yetiştirilmektedir.
Pauquet et al. (2001)’ın yaptıkları çalışmada, Muscadinia rotundifolia türünden Vitis
vinifera’ya yalancı geri melezleme (V. vinifera çeşidi her bir geri melezlemede
değişmiştir) ile aktarılan Run1 (Uncinula necator dayanım geni) geni etrafında AFLP
markörleri ile bölgesel bir harita oluşturmak ve markör aracılığıyla seleksiyonda
kullanım olanaklarını araştırmak amaçlanmıştır. Cabernet Sauvignon çeşidinin duyarlı
kontrol çeşidi olarak kullanıldığı araştırmada, melezleme ile elde edilen bütün bireylere
ait fidanlar, serada yapay olarak patojen ile inoküle edilmiş ve patojenite durumları
tespit edilmiştir. 157 bireyden oluşan BC5 populasyonu üzerinde 13 AFLP markörü 22
adet Run1 taşıyan genotip ile 16 duyarlı genotip üzerinde daha da ileri düzeyde
araştırılmıştır. 3 markör sadece dayanıklı genotiplerde bulunmuştur. Daha önceden gen
ile birlikte açılım gösteren markörler arasında rekombinasyonun görülmesi bu bölgede
rekombinasyonun mümkün olabileceğini ve bu nedenle daha büyük populasyonlarda
araştırılması gerekliliğini ortaya koymuştur.
Ageoerges et al. (2002) tarafından yapılan kapsamlı bir araştırmanın parçası olarak
Syrah, Grenache ve küllemeye kısmen dayanıklı bir interspesifik hibrit arasında yapılan
melezleme populasyonlarında küllemeye dayanım ile ilgili QTL araştırılmıştır. Syrah ve
Grenache arasında yapılan melezleme ile elde edilen populasyonda da tane gelişimi ve
olgunlaşmasında görev alan genlerin saptanmasına yönelik olarak çalışmalara devam
edilmektedir. Araştırıcılar ilk sonuçların 3 yıl içerisinde alınabileceğini ifade etmiştir.
M. rotundifolia çok sayıda asma zararlılarına karşı çok güçlü dayanıma sahiptir.
Genellikle Vitis türleri ile uyuşmaz olmasına rağmen V. rupestris ile verimli döller
oluşturmaktadır. Bu hibritler dayanım genlerinin kültür asmasına geçişi için eşsiz bir
genetik köprü olmaktadır. V. rupestris “A. de Serres” (2n=38) x M. rotundifolia
32
“Cowart” (2n=40) hibridine ait genetik bağlantı haritası yalancı melezleme stratejisi
kullanılarak çıkartılmıştır (Callahan et al. 2002). 418 AFLP, 32 ISSR (Inter-Simple
Sequence Repeats), 23 RAPD markörü ile 18 mikrosatelit kullanılmıştır. Ebeveynler
için oluşturulan haritalarda 19 bağlantı grubu tespit edilmiştir. Xiphinema index’e
dayanım ile bağlantılı bir lokus harita üzerinde belirlenmiştir.
İki kısmen çekirdeksiz genotipin melezlenmesinden elde edilen 139 bireylik F1
populasyonu üzerinde genetik haritalama yapılmıştır (Doligez et al. 2002). 301
markörün (250 AFLP, 44 SSR, 3 izoenzim, 2 RAPD, 1 SCAR ve 1 fenotipik markörtane rengi) kullanılmasıyla 20 bağlantı grubu haritalanmış ve 1002 cM’lık alan
kapsanmıştır. Tane rengi için majör gen, hem babaya ait haritada hem de birleştirilmiş
haritada tespit edilmiştir. Çekirdeksizliğin kantitatif alt karakterlerine ait QTL
araştırması 3 yıl süreyle ebeveynlere ait haritalarda analiz edilmştir: tane ağırlığı,
çekirdek sayısı, çekirdek toplam kuru ve taze ağırlığı, çekirdek kuru madde yüzdesi ve
çekirdek ortalama taze ve kuru ağırlıkları. Bütün karakterlerde aynı bölgede yıllar için
tek bir bağlantı grubunda yüksek etkili QTL’ler saptanmıştır. Bazı sonuçlar ikinci bir
majör QTL’in bazı karakterler için varlığını göstermiştir. Bu majör QTL’ler için
ebeveynlerin kısmi etkilerinde farklılıklar gözlenmiştir. Diğer 3 bağlantı grubu üzerinde
tane ağırlığı ve çekirdek sayısı için bir adet, çekirdek kuru madde miktarı için iki farklı
yılda küçük etkilere sahip 3 ayrı QTL saptanmıştır.
Donald et al. (2002) tarafından yapılan çalışmada daha önceden klonlanmış patojen
dayanım genleri içerisinde korunmuş bölgelere yönelik dizayn edilen dejenere primerler
(belli bir protein dizisini kodlayan DNA ile hibridize olan tek iplikçikli sentetik
oligonükleotid) asmada dayanım gen analogları (Resistance Gene Analogs, RGA)’nı
çoğaltmak için kullanılmıştır. 28 adet asma RGA dizileri tanımlanmış ve %70 veya
daha fazla nükleik asit, dizi özelliğine dayanarak 22 alt gruba bölünmüştür. Her grubun
temsilcilerine ait RFLP ve AFLP markörleri run-1 lokusuna bağlantı açısından
taranmıştır. 3 RGA ve 13 AFLP markörü bu lokusa sıkı şekilde bağlantılı bulunmuştur.
Bu markörlerden 2 RGA (GLP1-12 ve MDH145) ve 10 AFLP markörü dayanıklı
genotipte aynı anda açılım göstermiştir. 22 run-1 taşıyan dayanıklı genotip ile 16
33
duyarlı genotip 13 AFLP markörü kullanılarak analiz edilmiştir. 3 markörün sadece
dayanıklı genotiplerde bulunmuş olması, küllemeye dayanıklı asma çeşitlerinin markör
aracılığıyla seleksiyonu için bir olanak sağlayabilir. Araştırıcılar, gen ile birlikte açılım
gösterdiği tespit edilen markörler arasında rekombinasyonun görülmesini bu bölgede
rekombinasyonun mümkün olabileceği ve daha büyük populasyonlarda araştırılmasının
gerekeceği şeklinde ifade etmişlerdir.
Bir Çin yabani asma türü olan Vitis quinquangularis (83-4-96) ile Vitis vinifera L.
(Muscat Rose) arasındaki melezleme ile oluşturulan F1 hibrit populasyonunda 280
RAPD primeri ile yapılan ön çalışmalar sonucunda 39 primerin polimorfik bant deseni
verdiği tespit edilmiştir (Luo et al. 2002). 80 bireylik F1 populasyonunda bu primerler
ile DNA çoğaltımı gerçekleştirilmiştir. 1:1 veya 3:1 oranında açılım gösteren 90 adet
RAPD
markörünün
ebeveynelere
ait
bağlantı
haritalarının
çıkartılmasında
kullanılabileceği bildirilmiştir. Halen devam eden çalışmalarında araştırıcılar, tane ve
meyve suyu rengi, tane şekli ve büyüklüğü, cinsiyet, iyonik antosiyanin kapsamı,
fenolojik aşamalar, külleme ve antraknoza dayanım gibi bir çok önemli morfolojik
karakterleri kontrol eden majör veya tek gene bağlı markörleri gruplandırılmış açılım
analizi tekniği kullanarak tespit etmeye çalışmaktadır.
Zavala et al. (2002) tarafından Şili’de sofralık üzüm ıslah programlarına yardımcı
olmak amacıyla dominant ve kodominant markörlere dayalı bir bağlantı haritası
hazırlanmıştır. Bu amaçla Ruby Seedless x Thompson Seedless melezi 127 bireylik bir
populasyonda 50 SSR, 150 AFLP ve 30 RAPD polimorfik markör tanımlanmıştır. Az
sayıda markör nedeniyle ebeveynlere ait sadece sırasıyla 13 ve 11 bağlantı grubu
oluşturulmuştur. Bu çalışmanın ikinci kısmında çekirdeksizliğe bağlı markörler
tanımlanmıştır. 4 adet çekirdekli veya çekirdeksiz fenotip grubu (5’er genotip)
gruplandırılmış açılım analizi yaklaşımıyla kullanılmıştır. 350 RAPD primer testinden
sonra 10 adet aday markör tespit edilmiş, ancak sadece 5 bant iki grubun bütün
genotiplerinde bulunmuş veya bulunmamıştır. Bu bantların klonlanması ve dizilerinin
belirlenmesi ile araştırıcılar, döllerde çekirdeksizlik karakterini izlemede faydalı yeni
SCAR markörlerini geliştirmeyi ummaktadır.
34
Lemberger ve Regent çeşitlerinin melezlenmesiyle elde edilen populasyonda AFLP ve
CAPS markörlerinin de eklenmesiyle zenginleştirilen haritalama çalışmaları ile fungal
hastalıklara (Uncinula necator ve Plasmopara viticola) ve bazı karakterlere yönelik
QTL analizi yapılmıştır (Zyprian et al. 2002). Araştırıcılar harita tabanlı klonlama
yaklaşımını kullanarak ilgili genlerin izole edilmesi için çalışmaktadır.
Doligez et al. (2003) iki kısmen çekirdeksiz genotip (Dattier de Beyrouth x 75
Pirovano) x (Alphonse Lavallée x Thompson Seedless) arasındaki melezleme
sonucunda elde edilmiş tam akraba döllerde bazı kalite ile ilişkili özelliklere yönelik
QTL’leri araştırmıştır. 300’den fazla AFLP lokusu ile 182 SSR lokusun genotipi
çıkarılmıştır.
Moscato bianco (Vitis vinifera L.) ve bir Vitis riparia bitkisi arasında yapılan melezleme
sonucu elde edilen 81 F1 bitkisi ile yapılan çalışma sonucunda 2 bağlantı haritası elde
edilmiştir (Grando et al. 2003). Üç moleküler markör tipinin kullanıldığı çalışmada çift
yönlü yalancı melezleme stratejisi izlenmiştir. Diğer Vitis haritalarında bağlantı
gruplarına
yerleşen
SSR’ların
etkinliği
ve
doygun
haritalardaki
AFLP’lerin
yarayışlılıkları değerlendirilmiştir. Ana ebeveyne ait haritada 20 bağlantı grubuna 338
markör yerleşirken (1.639 cM), baba ebeveynde ise 19 bağlantı grubuna 429 lokus
yerleşmiştir (1.518 cM). 14 adet homolog bağlantı grubu bulunmuştur. SSR lokuslarının
yerlerinin diğer haritalarla paralel olduğu belirtilmiştir.
Kozma Jr. and Dula (2003), iki hibrit ailesinde (Muscadinia x V. vinifera BC4 x
Franco-American hibrit x V. vinifera x V. amurensis ve Muscadinia x V. vinifera BC4
x (V. amurensis x V. vinifera) BC2)
külleme dayanımının değişkenliğini çalışmıştır.
Bitkiler serada yetiştirilmiş ve yapay olarak inoküle edilmiştir. Çalışma sonuçları,
Muscadinia’dan gelen külleme dayanımından sorumlu Run1 geninin mildiyö dayanımı
ile bağlantılı olduğunu göstermiştir. Araştırıcılar ebeveynlerinden daha fazla mildiyöye
dayanıklı hibritler elde etmiştir.
35
Madini et al. (2003) tarafından hastalığa dayanım ve kalite amaçlı ıslah çalışmalarında
kullanılmak üzere QTL bilgilerinin üretimine yönelik olarak V. vinifera L. ve V. riparia
Michx.’a ait iki bağlantı haritası oluşturulmuştur. 350 AFLP ve mikrosatelit markörüne
dayalı olarak her iki harita yaklaşık 1150 cM’ı kapsamıştır. Bitki savunmasında görev
alan aday genler mildiyöye karşı kantitatif dayanım ile ilişkisi açısından analiz
edilmiştir. Dayanım özelliği açılım gösteren populasyonda mildiyö ile doğal enfeksiyon
ve yapay inokülasyondan sonra değerlendirme yapılmıştır. Çelikler serada, kontrollü
koşullarda yapay inokülasyondan sonra sporulasyon, kloroz ve nekroz için de
değerlendirilmiştir. Tanede aroma oluşumu analiz edilmiştir. Yapay inokülasyondan
sonra mildiyö simptomları ve tanede serbest aroma formlarının kapsamına ilişkin
QTL’ler tanımlanmıştır.
Marino et al. (2003) Vitis vinifera Muscato bianco x V. riparia populasyonunda
belirlenen 2 moleküler bağlantı haritasında kodominant markörler kullanarak
yapraklarda mildiyöye dayanım ve tanede aroma bileşikleri için QTL analizi yapmıştır.
Ana ebeveyn haritası 403 SSR ve AFLP markörleri ile 21 bağlantı grubundan (1128
cM) ve baba ebeveyn haritası 502 SSR ve AFLP markörleri ile 20 bağlantı grubundan
(1143 cM) oluşmuştur. Mildiyöye dayanımın belirlenmesi için doğal enfeksiyon ve
yapay inokülasyon sonrası değerlendirme yapılmıştır. Yapay inokülasyon sonrası
mildiyö semptomları ve serbest aroma bileşikleri ile ilgili QTL rapor edilmiştir.
Çekirdeksizlik ile ilişkili bir SCAR markör geliştirmek amacıyla, çekirdekli ve
çekirdeksiz fenotipleri temsil eden iki grup arasında (BSA) RAPD markörleri
kullanılmıştır (Mejia and Hinrichsen 2003). 127 bireylik Ruby Seedless x Sultanina F1
populasyonunda 336 adet RAPD primeri test edilmiştir. Sadece çekirdeksiz
genotiplerde bulunan, WF27-2000 adı verilen bir RAPD markörü klonlanmış, dizisi
belirlenmiş ve bir SCAR markörüne dönüştürülmüştür. SCF27 adı verilen bu markörün
127 bireyde yapılan analizi, 3:1 açılım gösterdiğini ortaya çıkararak ebeveylerin
heterozigot olduklarını göstermiştir.
Markörün çekirdekli hibritlerde incelenmesi
sonucunda %82’lik bir korelasyon gözlenmiştir.
36
Araştırıcılar bu marköre dayalı
seleksiyonun populasyonda incelenecek birey sayısını azaltmada faydalı olabileceğini
ifade etmiştir.
Muskadinya üzümlerine mildiyö dayanımı kazandıran gene bağlı moleküler markörleri
tanımlamak amacıyla BSA metodunu kullanan Merdinoğlu et al. (2003) açılım gösteren
BC2 populasyonunda dayanım düzeyini, bitkideki tüm yaprakların patojen ile
inokülasyonundan sonra görsel olarak değerlendirmiştir. 151 RAPD primeri, 13 ISSR
primeri ve 208 SSR lokusu ile ortaya çıkarılan polimorfizm 6’şar bireyden oluşan 2
DNA havuzunda (dayanıklı x duyarlı) incelenmiştir. Varyans analizi sonucunda 1
RAPD, 4 ISSR ve 8 SSR’ın dayanım üzerine önemli etkide bulunduğu gösterilmiştir.
Bunlardan 12 adedi aynı bağlantı grubunda 45 cM’lık bir bölge içine yerleşmiştir.
Dayanım QTL’in varlığı aralık (interval) haritalama ile doğrulanmıştır. Bu QTL
gözlenen varyansın %73’ünü ve genetik varyansın %83’ünü açıklamaktadır. Bu
sonuçlar; Rpv1 (Plasmopara viticola dayanım geni) olarak isimlendirilen bu QTL’in
muskadinia üzümlerinde dayanım sağlayan tek bir eşsiz gen olduğunu düşündürmüştür.
Rpv1, ayrıca külleme dayanım geni Run1’e yakından bağlantılı bulunmuştur.
Külleme ve mildiyöye tolerans açısından açılım gösteren, 70 bireylik bir Welschriesling
x Sirius (KI.K1977) populasyonu 160 SSR ve 190 RAPD markörü kullanılarak
araştırılmıştır (Regner et al. 2003). RAPM markörlerinin %65’ten fazlasının polimorfik
olduğu bu populasyonda araştırıcılar, 7 RAPD markörünün küllemeye dayanımla
önemli derecede bağlantılı olduğunu bulmuştur. Tek bir markörün etkisinin yüksek
olmaması, dayanımın birden fazla allele dayalı olduğunu doğrulamıştır. Bu
populasyonda elde edilen markörler başka bir populasyonda (Gr. Veltliner x
Seyyal=KI.K1979) incelenmiş, ancak RAPD markörleri arasında herhangi bir ortaklık
sağlanamamıştır. Araştırıcılar elde edilen ilk haritadan yola çıkarak,populasyondaki
birey sayısı ile markör sayısının arttırılmasının gerekli olduğu sonucuna ulaşmıştır.
Zyprian et al. (2003) fungusa dayanıklı iki hattın (Gf.Ga-47-42 ve Villard blanc)
melezlenmesi ile elde ettikleri populasyonu külleme ve mildiyö hastalıklarına karşı
moleküler markörleri kullanarak analiz etmişlerdir. Daha önce kullandıkları Regent x
37
Lemberger populasyonuna ait harita kadar doygun olmamakla birlikte Gf.Ga-47-42 x
Villard blanc genetik haritasının, fenotipik karakterlere ait QTL’lerin genetik
bölgelerinin korelasyonu çalışmasında kullanılabileceği görüşünde olan araştırıcılar her
iki haritayı kullanarak fungal patojenlere dayanımla ilgili genetik faktörlerin
karşılaştırmasını yapmışlardır.
346 adet SSR markörünün Syrah ve Grenache melezi olan populasyonda test edilmesi
sonucunda 177 adet markör Syrah’ta 19 bağlantı grubu oluşturmuş ve toplam 1.172
cM’lık alan kapsanmıştır (Adam-Blondon et al. 2004). Grenache haritasında ise 178
markör 18 bağlantı grubuna yerleşmiş ve 1.306 cM’lık alan kapsanmıştır. Bağlantı
grubu başına ortalama 6.5 yeni markör bulunmuştur. Araştırıcılar bu haritanın; dağılımı
iyi olan markörlerin diğer haritalara transferi ile QTL saptanması, belli bölgelerdeki
markörlerin kullanımıyla gen veya QTL’lerin detaylı haritalanması veya markörler
aracılığıyla seleksiyon için markör seçilmesinde büyük bir potansiyele sahip olduğunu
belirtmiştir.
Zyprian ve ekibi tarafından çok değişik markör tipleri kullanılarak Regent x Lemberger
populasyonunda 153 adet F1 bitkisi ile oluşturulan genetik haritada 16 nolu bağlantı
grubunda yerleşen küllemeye dayanım ile bağlantılı 7 adet RAPD markörü SCAR
markörlerine
dönüştürülmüştür
tekrarlanabilirliği test edilmiş ve
(Akkurt
2004).
Bu
SCAR
markörlerinin
4 tanesi daha önceden oluşturulan haritaya geri
bağlanmıştır. ScORA7 adı verilen SCAR markörü yapılan bütün testlerde sadece
dayanıklı tür ve çeşitlerde
bant verdiğinden MAS’ta kullanılabilir olduğu tespit
edilmiştir.
Doucleff et al. (2004) Vitis rupestris x V. arizonica melezlenmesinden elde edilen 116
bireylik populasyonda yalancı melezleme stratejisi kullanarak bir genetik harita
çıkarmıştır. 475 adet DNA markörü (410 AFLP, 24 ISSR, 32 RAPD, 9 SSR) kullanarak
ebeveynlere ait haritayı oluşturmuştur. Ana ebeveyne ait haritada 17 bağlantı grubu
(756 cM), baba ebeveynde ise 19 bağlantı grubu (1.082 cM) bulunmuştur. 138 adet 3:1
açılan heterozigot markör ise haritaları birleştirmede kullanılmıştır. Orta derecede
38
doygun olan bu haritanın kamalı nematoda (Xiphinema index) ve asma vebasının
(Pierce’s disease) taşıyıcısı olan Xylella fastidiosa’ya dayanım genlerinin veya
QTL’lerin tespitinde başlangıç oluşturabileceği ifade edilmiştir.
Fischer et al. (2004) 153 bireylik
‘Regent x Lemberger’ populasyonunda fungal
hastalıklara dayanıma yönelik yaptıkları araştırmada, 185 AFLP, 137 RAPD, 85 SSR ve
22 SCAR veya CAPS markörünü haritalamıştır. Ana ebeveynde küllemeye dayanım
için 1 adet QTL ve mildiyöye dayanım için birden fazla QTL saptanmıştır. Olgunlaşma
zamanı, tane büyüklüğü ve koltuk sürgünü büyümesine yönelik başka QTL’ler
bulunmuştur.
Riesling x Cabernet Sauvignon populasyonunda 153 bitki üzerinde mikrosatelit
markörleri kullanılarak bir çerçeve haritası çıkaran Riaz et al. (2004) 20 bağlantı grubu
bulmuştur. Markörler arası ortalama 11.0 cM uzaklıkla toplam 1.728 cM’lık bir kısım
kapsanmıştır. Bu harita Uluslarası Asma Genomu Programı tarafından referans harita
olarak kabul edilmiştir.
Tane aromasını belirleyen ana bileşiklerin (terpenler) genetik kontrolu araştırma
amacıyla , yoğun bir aromaya sahip V. Vinifera cv. Moscato bianco ile önemli fungal
hastalıklara dayanıklı V.riparia
arasında yapılan melezleme ile elde edilen bir
populasyona ait 81 bireyde, serbest ve glikozid bağlı terpenlerin miktarları saptanmış
ve markör (SSR, AFLP ve SSCP) - karakter analizi MapQTL 4.0 yazılım programı ile
belirlenmiştir (Sevini et al. 2004).
Terpenoid biyosentezinde görevli aday genler
polimorfizm ve açılım açısında incelenmiştir. Monoterpenlerin tanedeki miktarlarına
yönelik ilk QTL’ler tanımlanmıştır. Araştırıcılar bu populasyonda konuya yönelik
çalışmalarına devam etmektedir.
Zyprian et al. (2005) Gf.Ga.47-42 ve Villard blanc arasında yaptıkları melezleme ile
elde ettikleri populasyonda fungal hastalıklara dayanım ve tat bileşiklerine yönelik
çalışmalar yapmıştır. Elde edilen sonuçları, Regent çeşidine ait genetik bilginin QTL
ilişkisi ile karşılaştırmıştır. Regent’te bulunan külleme hastalığına dayanım markörleri
39
yeni bir melezlemede test edilmiştir. Dayanımın yanında tat bileşiklerinin Gf.Ga 47-42
ıslah hattından elde edildiğini ve Villard blanc’ın daha natürel beyaz şarap verdiğini
ifade etmiştir.
Yapılan araştırmaların asmada genetik ilerlemeye büyük fayda sağladığı ve hız
kazandırdığı göz önüne alındığında, ülkemizde de bu alanda öncü ve ileri çalışmaların
gerekliliği ortaya çıkmaktadır.
40
3. MATERYAL VE YÖNTEM
Bu çalışma T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü,
Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serası ile Tarım
Biyoteknolojisi Bahçe Bitkileri Birimi Laboratuvarında gerçekleştirilmiştir.
3.1. Materyal
Bu araştırma ile asma ıslahında karşılaşılan sorunların çözümüne yönelik olarak,
Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü’nde yürütülen “ Melezleme Yoluyla Külleme ve
Mildiyö’ye Dayanıklı ve Standart Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde
Edilmesi” konulu projede (Proje Kod No: Tagem/IY/96/06/04/013) 1992-1993 yılında
Italia ve Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesi yoluyla geliştirilen F1 populasyonu
kullanılarak asmanın genom haritasının çıkarılması amaçlanmıştır.
Italia üzüm çeşidi 1911 yılında İtalya’da Bicane x Muscat Hamburg melezi olarak elde
edilmiş (Çelik 2002) iri ve konik piramit şeklinde salkımlara sahip beyaz, orta geççi ve
sofralık bir çeşittir. Taneleri oval ve iridir. Misket kokusuna sahip olup Marmara, Ege,
İç ve Güneydoğu Anadolu’da yetiştirilmektedir (Şekil 3.1.).
Mercan üzüm çeşidi ise konik salkımlı, yuvarlak ve beyaz taneli, tatlı, sulu, Eylül
ortasına olgunlaşan şıralık bir çeşit olup Amasya’da yöresel olarak yetiştirilmektedir
(Odabaş vd. 2002) (Şekil 3.2.).
41
Şekil 3.1. Italia üzüm çeşidi (Ana)
Şekil 3.2. Mercan üzüm çeşidi (Baba)
42
Araştırmada kullanılan Italia x Mercan kombinasyonuna ait 60 adet F1 bitkisinde
vegetatif, generatif (çiçek, salkım ve meyve) ve hastalıklara dayanım özelliklerini içeren
toplam 38 adet karakter incelenerek, bu özellikler ile asmanın genomik haritasını
çıkarmak suretiyle ilişkilendirilmesi amaçlanmıştır.
Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü’nde bu çalışma kapsamında incelenen vegetatif,
generatif ve hastalıklara dayanımla ilgili 38 adet karakter aşağıda sunulmuştur.
A. Vegetatif Özellikler
1. Sürgün ucunda antosiyan yoğunluğu (OIV 003, UPOV 5) (Anonymous 1983)
0
Yok
1
Çok zayıf
3
Zayıf
5
Orta
7
Yoğun
9
Çok yoğun
Bu özellik çiçeklenmeden önce 10 adet sürgün ucunda gözlemlenmiştir.
2. Dinlenme halindeki kışlık gözlerin soğuğa dayanımları (Anonymous 1983,
Anonymous 1995)
1
% 0-25 ölü (Sürmeyen göz) - Dayanıklı
2
% 26-50 “
“
“
- Yarı Dayanıklı
3
% 51-75 “
“
“
- Yarı Hassas
4
% 76 “
“
“
- Çok Hassas
Bu özellik vejetasyon döneminde incelenmiştir.
43
3. Gözlerin patladığı dönem (OIV 301, UPOV 1) (Anonymous 1983)
1. Çok erken
3. Erken
5. Orta
7. Geç
9. Çok geç
Bu özellik gözlerin %50’sinde koruyucu tüylerin göründüğü dönemde incelenmiştir.
4. Genç yaprak üst yüzey rengi (OIV-051-1, UPOV-24) (Anonymous 1983)
1. Yeşil-Sarı
2. Kahverengi-Yeşil
3. Bakır kırmızısı
Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta
gözlemlenmiştir.
5. Genç yaprak üst yüzey tüylülüğü (Galet 1979)
1. Tüysüz
2. Tüylü
3. Örümcek ağı gibi tüylü
4. Kalın ve diken gibi tüylü
5. İnce hav (yün) gibi tüylü
Bu özellik çiçeklenmeden önce 10 sürgünde incelenmiştir.
44
6. Genç yaprak alt yüzey rengi (OIV-051-1) (Anonymous 1983)
1. Yeşil-Sarı
2. Kahverengi-Yeşil
3. Bakır kırmızısı
Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta
gözlemlenmiştir.
7. Yaprak alt yüzey tüylülüğü (Galet 1979)
1. Tüysüz
2. Tüylü
3. Örümcek ağı gibi tüylü
4. Kalın ve diken gibi tüylü
5. İnce hav (yün) gibi tüylü
Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta
gözlemlenmiştir.
8. Yaprak üst yüzey görünümü (Anonymous 1995)
1. Yağımsı
2. Parlak
3. Mat
Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde 4-6. boğumlardaki olgun yapraklarda
incelenmiştir.
45
9. Yaprak formu (Galet 1979)
1.
Düz
2.
İç bükey
3.
Dış bükey
Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde 4-6. Boğumlardaki olgun yapraklarda
incelenmiştir.
10. Yaprak şekli (Galet 1979)
1.
Yürek şekilli
2. Beşgen şekilli
3.
Üçgen şekilli
4.
Yuvarlak şekilli
5.
Böbrek şekilli
6. Yuıvarlağımsı böbrek şekilli
7.
Yuvarlağımsı konik şekilli
Bu özellik olgun yaprakta 10 sürgünde sürgünün 1/3’nün uç kısmından alınan
yapraklar dikkate alınarak çiçeklenme öncesi incelenmiştir.
11. Yaprak üst yüzeyinin yapısı (Galet 1979)
1.
Kabarık
2.
Düz
3.
Kıvrımlı (dalgalı)
Bu özellik olgun yaprakta 10 sürgünde sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklar
dikkate alınarak çiçeklenme öncesi incelenmiştir.
46
12. Yaprak sap cebinin şekli (OIV 080, UPOV-42) (Anonymous 1983, Anonymous
1995)
1.
U- Şekilli
2.
V- Şekilli
3. Birbiri üstüne binmiş
Bu özellikte tane tutumundan ben düşmeye kadar ki dönemde 10 sürgünde, sürgünün
1/3 kısmından alınan yapraklarda incelenmiştir.
13. Olgun yaprakta cep genişliği (Galet 1979)
1. Geniş
2.
Orta geniş
3.
Kapalı
Bu özellikte tane tutumundan ben düşmeye kadarki dönemde 10 sürgünde sürgünün 1/3
uç kısmından alınan yapraklarda incelenmiştir.
14. Olgun yaprakta dişlilik durumu (OIV 079, UPOV 40) (Anonymous 1989)
1. Sivri
2. Dış bükey
3. İç bükey
4. Orak şeklinde
Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan
yapraklardan incelenmiştir.
47
15. Yaprak sapı rengi (Anonymous 1995)
1. Yeşil
2.
Kahverengi-Yeşil
3.
Kırmızı
Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan
yapraklardan incelenmiştir.
16. Yaprak sapı tüylülük durumu (Galet 1979)
1. Tüysüz
2. Tüylü
3. Örümcek ağı gibi tüylü
Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan
yapraklardan incelenmiştir.
17. Sürgün (1 yıllık dal) rengi (OIV 103, UPOV-18) (Anonymous 1983)
1. Sarı
2. Sarı-Kahverengi
3. Koyu kahverengi
4. Kırmızımsı kahverengi
5. Mor
Bu özellik dinlenme döneminde yapraklar döküldükten sonra ortalama 10 boğum
arasında sürgünlerin ortasında gözlem yapılmıştır.
48
B. Generatif (Çiçek, Salkım ve Meyve) Özellikler
1. Çiçek tipi (OIV 151, UPOV 56)
1. Hermafrodit
2. Morfolojik erdişi fizyolojik erkek
3. Morfolojik erdişi fizyolojik dişi
4. Erkek
5. Dişi
Çiçeklenme döneminde incelenmiştir.
2. Çiçeklenme zamanı (Anonymous 1995)
1. Erkenci
2.
Orta erkenci
3.
Orta mevsim
4.
Orta geç
5.
Geççi
Çiçeklerin %50’nin açtığı dönem, çiçeklenme dönemi olarak kabul edilmiştir.
3. Sürgün başına düşen salkım sayısı (OIV 201) (Anonymous 1983)
Bu özellik meyve olgunlaşma zamanında incelenmiştir.
4. Meyvenin olgunlaşma zamanı (Anonymous 1995).
% 18 Kuru maddeye ilk ulaşanlar
Erkenci
% 14-18 Kuru madde
Orta mevsim
% 12 Kuru madde
Geçci
49
Bu özellik 10 sürgün üzerindeki tüm salkımlarda ortalama her salkımdan 5 tane
alınarak refraktometre yardımıyla belirlenmiştir.
5. Salkımdaki tane sayısı (OIV 205) (Anonymous 1983)
Bu özellik 10 sürgünde, olgunluk zamanında tüm salkımlarda gözlemlenmiştir.
6. Tane şekli (UPOV 64, OIV 223) (Anonymous 1983)
1. Basık
6. Küt- kalın yumurta
2. Hafif basık
7. Ters yumurta
3. Yuvarlak
8. Silindirik
4. Kısa eliptik
9. Orak şekilli
5. Yumurta şeklinde
Bu özellik olgunluk zamanında 10 adet salkımda salkım ortasından alınan 10 tanede
gözlemlenmiştir.
7. Tek tane ağırlığı (OIV 503) (Anonymous 1983)
Bu özellik 5 salkımdaki tüm tanelerin ortalama ağırlığı şeklinde hesaplanmıştır.
8. Tane etinin yapısı (OIV 234, 235 ve UPOV 72) (Anonymous 1983)
1. Çok yumuşak
2. Yumuşak
3. Orta
4. Sert
5. Çok sert
Bu özellik 10 salkımda ve her salkımın orta kısmından alınan 10 tanede incelenmiştir.
50
9. Tane kabuğunun yapısı (Anonymous 1995)
1. Yumuşak
2. Yarı yumuşak
3. Gevrek
4. Yarı sert
5. Sert
Bu özellik olgun tanelerde 10 adet salkımda ve her salkımın ortasından alınan 10
tanede gözlemlenmiştir.
10. Salkım uzunluğu (OIV 203) (Anonymous 1983).
1. Çok kısa <11.0 cm
2. Kısa
11.0-17.4 cm
3. Orta
17.5-22.4 cm
4. Uzun
22.5-30.0 cm
5. Çok uzun
> 30 cm.
Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir.
11. Salkım ağırlığı (g) (Anonymous 1995)
1. Çok küçük
<50 g
2. Küçük
50-125 g
3. Orta küçük
126-250 g
4. Orta iri
251-500 g
5.
501-1000 g
İri
6. Çok iri
>1000 g
Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir.
51
12. Salkım sıklığı (OIV 204, UPOV 59) (Anonymous 1983)
1. Çok gevşek
2. Gevşek
3. Orta
4. Sık
5. Çok sık
Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir.
13. Salkım sapı rengi (OIV 207, UPOV 51) (Anonymous 1983).
(Salkım sapında kahverengileşme)
1. Zayıf
2. Orta
3. Kuvvetli
Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgündeki tüm salkımlarda gözlemlenmiştir.
14. Tane etinin sululuğu (OIV 232, UPOV-73). (Anonymous 1983).
1.
Sulu değil
2.
Sulu
Bu özellik olgunlukta 10 salkımdan alınan 10 adet tanede belirlenmiştir.
52
15. Salkım şekli (Galet 1979)
1. Silindirik
2. Silindirik-Kanatlı
3. Konik
4. Konik-kanatlı
5. Kanatlı
6. Omuzlu
Bu özellik olgunlukta 10 sürgün üzerindeki tüm salkımlarda gözlemlenmiştir.
16. Tane etinin kabuktan ayrılma durumu (OIV 237) (Anonymous 1983)
1. Ayrılıyor
2. Ayrılmıyor
17. Tanedeki aroma (koku) (OIV 237) (Anonymous 1983)
1.
Yok (Nötr)
2. Az
3.
Orta
4. Çok
Bu özellik olgunlukta 10 salkımın ortasından alınan 10 tanede gözlemlenmiştir.
18.Tane şeklinin bir örnekliği (OIV 222, UPOV 63) (Anonymous 1983)
1.
Bir örnek
2.
Bir örnek değil
Bu özellikte olgunlukta 10 salkımın ortasından alınan 10 tanede incelenmiştir.
53
C. HASTALIK VE ZARARLILARA DAYANIM ÖZELLİKLERİ
1. Külleme (Uncinula necator )’ye dayanım (Eibach 1994)
1.
Enfeksiyon yok
3.
Küçük noktalar şeklinde nekrozlar; hastalıklı alanlar sınırlı
5.
Nekrozların çapı 2-5 cm’e ulaşmış, hastalıklı alanlar tamamen
sınırlı
7.
Geniş ve yoğun şekildeki hastalıklı alanlar;bu alanların bir kısmının
sınırları halen belirli
9.
Sınırsız ve çok yoğun hastalıklı alanlar; yaprağın tamamı hastalıklı
Bu özellik 20 yapraktan elde edilen değerlerin ortalaması şeklinde belirlenmiştir.
2. Kurşuni küf (Botrytis cinerea Pers.)’e dayanım (Anonymous 1995).
1.
Salkımda %10 zararlanmış taneler
-dayanıklı
2.
Salkımda %11-20 zararlanmış taneler
-kısmen dayanıklı
3.
Salkımda %21-30 zararlanmış taneler
-kısmen duyarlı
4.
Salkımda %31-40 zararlanmış taneler
-duyarlı
5.
Salkımda >%40 zararlanmış taneler
-çok duyarlı
Bu özellik hasat döneminde tüm salkımlarda gözlemlenmiştir.
54
3. Mildiyö’ye (Plasmopara viticola) dayanım (OIV 452) (Anonymous 1983)
1.
Çok düşük
- Belirti yok yada çok küçük nokta şeklinde nekrotik lekeler
2.
Düşük
- 1 cm’den küçük çaplı lekeler
3.
Orta
- 1-2 cm çaplı küçük lekeler, etmenin sporları ve düzensiz misel
oluşumu
4.
Yüksek
- Geniş lekeler ve yoğun bir spor oluşumu ve misel oluşumunun
gözlemlenmesi, yaprak dökümü
5.
Çok yüksek
- Çok geniş lekelerin oluşumu, tüm yaprak alanının etmenle
kaplanmış olması, yoğun bir spor oluşumu ve misel gelişimi,
çok erken yaprak dökümü.
Bu özellik 20 yapraktan elde edilen değerlerin ortalaması şeklinde belirlenmiştir.
3.2. Yöntem
Araştırmada Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü’nde 1986 yılından itibaren
yürütülen “Melezleme Yoluyla Külleme ve Mildiyö’ye Dayanıklı ve Standart
Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde Edilmesi” konulu uygulama projesi
kapsamında 1992-1993 yılında Italia x Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesinden
elde edilen F1 populasyonu kullanılmıştır.
Italia x Mercan kombinasyonundan elde edilen ve 1997 yılından itibaren her türlü
kalitatif ve kantitatif özellikler yönünden değerlendirilebilecek düzeyde olan toplam 331
adet F1 bitkisinin oluşturduğu populasyondan vegetatif, generatif ve hastalıklara
dayanım yönünden yapılan gözlem ve analizler sonucunda bu projede incelenmesi
öngörülen özelliklere göre açılım gösteren 60 adet F1 ile ana ve baba ebeveynler
asmanın genom haritasının çıkarılması için kullanılmıştır.
55
Asmanın yukarıda açıklanan kalitatif ve kantitatif özelliklerini içeren genom
haritasının çıkarılmasında yararlanılabilecek RAPD markörlerin eldesi amacıyla
kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemi, PCR uygulamaları, agaroz jel elekroforezi
tekniği, moleküler bağlantı analizi ile kantitatif karakter lokusu analizi ile ilgili
yöntemler aşağıda verilmiştir.
3.2.1. DNA ekstraksiyonu
DNA ekstraksiyonu için Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü’ndeki denemeye alınan
2 ebeveyn ve 60 adet F1’e ait omcalardan alınan çelikler, Ankara Üniversitesi Ziraat
Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serasında toprak:perlit:turba (1:1:1) karışımı
içerisinde yetiştirilmiş ve süren sürgün ucundaki yarı açılmış genç yapraklar
kullanılarak Lodhi et al. (1994)’nin geliştirdiği yönteme göre DNA ekstraksiyon işlemi
gerçekleştirilmiştir.
Bu yönteme göre;
•
0.5 g genç yaprak alınarak havan içerisine konulup üzerine sıvı azot ilavesinden
sonra havan eli ile ezilir,
•
6 ml ekstraksiyon tampon çözeltisi ilave edilir,
•
Homojen hale getirilen çözeltiye 50 mg PVPP (Polyvinylpyroprrolidone)
(Sigma P6755) ilave edilir,
•
Çözelti 15 ml’lik konik tüpe aktarılır,
•
Tüpler 600C’deki su banyosunda 25 dakika bekletilir ve daha sonra su
banyosundan çıkarılarak oda sıcaklığına kadar soğuması sağlanır,
•
6 ml kloroform: oktanol (24:1) çözeltisi ilave edilerek hafifçe 20-25 defa
sallanır,
•
6000 rpm’de 15 dakika oda sıcaklığında santrifüj edilir,
•
Üstteki sıvı kısım yeni bir 15 ml’lik tüpe alındıktan sonra, üzerine hacminin
yarısı kadar 5 M NaCl çözeltisi eklenerek iyice çalkalanır,
•
Toplam hacmin 2 katı kadar %95’lik soğuk etanol (-200C) ilave edilir ve tüpler
buz dolabına yerleştirilerek 30-60 dakika bekletilir,
56
•
DNA sarmalları görüldüğünde, steril bir plastik çubuk (lup) yardımı ile
alınarak, içinde %76’lık soğuk etanol bulunan 1.5 ml’lik eppendorf tüplere
aktarılır,
•
DNA’nın çöktürülmesi amacıyla sırası ile 3000 ve 5000 rpm’de 3 dakika
santrifüj yapılır,
•
Tüpler ters çevrilerek 20-30 dakika tüplerin ağzı açık bırakılarak kurutulur ve
etanolün tamamen DNA’dan uzaklaşması sağlanır,
•
DNA, 200-300 µl TE tampon çözeltisi içerisinde çözülür,
•
Her 100 μl için 1 μl RNAase-A ilave edildikten sonra 370C’de 15 dakika
süreyle etüvde bekletilir ve RNA uzaklaştırılır.
Çözeltiler:
Ekstraksiyon çözeltisi: 20 mM sodyum EDTA (Etilen Diamine Tetra Asetik Asit) ve
100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.4 M NaCl ve %2’lik (ağırlık/hacim) CTAB (Hekzadesil
Trimetil-Amonyum Bromür) şeklinde hazırlanan çözeltiye %0.2 β-mercaptoethanol
kullanım öncesi ilave edilir.
Kloroform: Oktanol: 24:1 (hacim:hacim)
NaCl: 5 M
TE çözeltisi : 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA karışımı (pH 8.0)
RNase A (Sigma R6513): 10 mg/ml
3.2.2. PCR uygulaması
Yukarıda açıklanan protokole göre izole edilen DNA’ya uygun çoğaltma ve PCR döngü
koşullarını belirlemek için ön denemeler yapılmıştır. Bu amaçla; Ye et al. (1995), This
et al. (1997) ve Ergül vd. (2002)’e ait çoğaltma ve döngü koşulları denenmiştir. Çizelge
3.1’de denenen çoğaltma ve döngü koşulları verilmiştir. Bütün denemelerde toplam
hacim 25 μl olarak belirlenmiştir.
57
Çizelge 3.1. Ön deneme çalışmalarında kullanılan çoğaltma ve döngü koşulları
Çoğaltma Öğeleri
DNA
Primer
(ng)
dNTP
MgCl2
PCR Döngü Koşulları
Enzim
(toplam)
Ön
Denatürasyon Primer
denatürasyon
bağlanma
Yeni iplikçik Son
Toplam
yazılımı
döngü
yazılım
Referans
sayısı
100-
0,4 μM
480 μM 2 mM
200
25
0,5-1,0-
-
94ºC -30 sn
1,5 ünite
30 ng
800 μM 1,5 mM
0,4 ünite
35ºC-1 dk 72ºC
72ºC-8 dk 35
(1995)
1 dk 45 sn
94ºC -4 dk
94ºC -1 dk
38ºC-1 dk 72ºC
72ºC-6 dk 36
200
200 ng
2.5 mM 2,5-3,5 mM 0,5-1,0-
-
94ºC -30 sn
1,5 ünite
35ºC-1 dk 72ºC
1 dk 45 sn
58
This et al.
(1997)
1 dk
100-
Ye et al.
72ºC-8 dk 35
Ergül vd.
(2002).
Yapılan ön denemeler sonucunda en iyi sonucu, yapılan modifikasyonlarla Ergül vd.
(2002)’nin çoğaltma ve PCR döngü protokolü vermiştir. Buna göre; RAPD
uygulamaları 25μl’lik miktarda ve her bir reaksiyon karışımında 200 ng genomik DNA,
2.5 μl 10x reaksiyon tampon çözeltisi, 3.5 μl 25 mM MgCl2, 2 μl 2.5 mM dNTP
(Promega, Wis., ABD), 200 ng primer ve 1.5 ünite Taq-Polimeraz (Promega, Wis.,
ABD) bulunacak şekilde yapılmıştır. Ayrıca her örneğe 1 damla mineral yağ (Amresco
J217, Ohio, ABD) damlatılmıştır.
DNA çoğaltımı için örnekler 35’er devir olacak şekilde 30 sn 94ºC’de, 1 dakika
35ºC’de ve 1 dk 45 sn 72ºC’de ve bunu takiben 8 dakika 72ºC’de tutulmuştur.
DNA çoğaltımı PTC-100 MJ Research Type Thermocycler’da gerçekleştirilmiştir.
RAPD Markörlerinin Geliştirilmesinde Kullanılan Primerler
Primerlerin seçiminde asmada değişik araştırıcılar tarafından denenmiş olanlar ve
tamamen tesadüfi olarak belirlenenler kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan 300 primer
OPERON (Alameda, CA, ABD), Research Genetics (Huntsville, AL, ABD) ve IDT
(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, ABD) firmalarından temin
edilmiştir (EK 1).
3.2.3. Agaroz jel elektroforezi
RAPD-PCR tekniği ile elde edilen çoğaltma ürünleri % 2’lik agaroz jelde (%1 agaroz +
%1 Nusieve GTG agarose FMC) elektroforezinde 1x TBE (Tris, Borik asit, EDTA)
(Sambrook et al. 1989) tampon çözeltisi içerisinde 100V’da yaklaşık 4 saat
koşturulduktan sonra, etidium bromid (0.01 mg/ml)
ile boyanarak ve UV altında
(λ=302 nm) Polaroid 65 tip negatifli film kullanılarak fotoğrafları çekilmiş ve 62 adet
bireyde, 300 adet primerin kullanılmasıyla elde edilen çoğaltma ürünleri (bantlar)
genom haritasının çıkarılması amacıyla negatif film üzerinde görsel olarak polimorfizm
59
var (1), ya da yok (0) şeklinde değerlendirilmiş ve veriler Microsoft Excel Programına
girilmiştir.
3.2.4. Moleküler bağlantı analizi ve kantitatif karakter lokus (QTL) haritalama
Microsoft Excel Programın girilen veriler, bağlantı analizlerinin yapılması amacıyla
MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al.
1987) paket programında kullanılmıştır.
Bağlantı gruplarının ve markörler arası uzaklıkların belirlenmesinde LOD 2, 3, 4 ve 5
değerleri ile 25 cM maksimum uzaklık değerleri kullanılmıştır.
Genetik bağlantı analizi ile bağlantı çıkarıldıktan sonra bu harita üzerindeki markörlerle
kantitatif karakterler arasındaki ilişkileri belirlemek amacı ile QTL haritalama
çalışmaları yapılmıştır.
3.2.5. Kantitatif karakter analizi
Bağlantı analizi sonucunda ana ve baba ebeveynde bağlantı gruplarına yerleşen markör
lokusları üzerinde regresyon ve tek yönlü Anova istatistiki analizleri yapılarak markör –
karakter bağlantısı ortaya çıkarılmıştır.
60
4. ARAŞTIRMA BULGULARI
4.1. Fenotipik Analiz
Italia x Mercan melezlemesi ile oluşturulan F1 populasyonunda Tekirdağ Bağcılık
Araştırma Enstitüsü tarafından yapılan morfolojik analizlerin sonuçları EK 2’de
verilmiştir. Elde edilen veriler daha sonra QTL analizinin yapılmasında kullanılmıştır.
Morfolojik analizlerin sonucuna göre; populasyonun dinlenme halindeki kışlık gözlerin
soğuğa dayanımı (A2), genç yaprak üst yüzey tüylülüğü (A5), genç yaprak alt yüzey
rengi (A6), yaprak üst yüzey tüylülüğü (A7), yaprak üst yüzey görünümü (A8), yaprak
üst yüzey yapısı (A11), yaprak sapı cebinin şekli (A12), olgun yaprakta dişlilik durumu
(A14), çiçek tipi (B1), salkım sapı rengi (B13) ve tane etinin kabuktan ayrılma durumu
(B16) özellikleri açısından açılım göstermediği anlaşılmaktadır. Sürgün başına düşen
salkım sayısı (B3) ve salkımdaki tane sayısı (B5) hakkında bilgi alınamamıştır. Gözlerin
patladığı dönem (A3) karakteri, tarih olması nedeniyle değerlendirmeye alınmamıştır.
Geri kalan 24 morfolojik ve hastalığa dayanım karakterlerinde açılım gösteren
populasyon üzerinde QTL analizi yapılmıştır.
Populasyonda incelenen 24 adet morfolojik ve hastalıklara dayanım özelliklerine
yönelik istatistiksel değerlendirmeler Çizelge 4.1’de verilmiştir. Bu değerlendirme,
populasyonun incelenen karakterler açısından nasıl davrandığını görmek açısından
önemlidir.
Çizelgeden
izlenebileceği
gibi
generatif
özelliklere
ait
değerler,
populasyonun ancak üçte birlik bir kısmından temin edilmiştir. Bu genişlikteki veri
kaybı, markör-karakter bağlantısının kurulmasında büyük engel teşkil etmektedir.
61
Çizelge 4.1. Italia x Mercan populasyonunda incelenen fenotipik özelliklere ait
istatistiksel değerlendirmeler
Kodu
A1
A4
A9
A10
A13
A15
A16
A17
B2
B4
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
B14
B15
B17
B18
C1
C2
C3
Karakter
Sürgün ucunda
antosiyanin yoğunluğu
Genç yaprak üst yüzey
rengi
Yaprak formu
Yaprak şekli
Olgun yaprakta cep
genişliği
Yaprak sapı rengi
Yaprak sapı tüylülük
durumu
1 yıllık dal rengi
Çiçeklenme zamanı
Meyvenin olgunlaşma
zamanı
Tane şekli
Tek tane ağırlığı
Tane etinin yapısı
Tane kabuğunun yapısı
Salkım uzunluğu
Salkım ağırlığı
Salkım sıklığı
Tane etinin sululuğu
Salkım şekli
Tanede aroma
Tane şeklinin
birörnekliği
Küllemeye dayanım
Kurşuni küfe dayanım
Mildiyöye dayanım
Gözlem
sayısı
59
Ort.± S.S.
Minimum Maksimum
Değer
Değer
1
5
4.46 ± 0.971
59
1.61 ± 0.526
1
3
59
59
59
1.75 ± 0.843
2.85 ± 0.761
2.25 ± 0.477
1
2
1
3
4
3
58
59
2.19 ± 0.438
2.25 ± 0.604
1
1
3
3
59
52
21
2.36 ± 0.517
2.42 ± 0.871
21.44 ± 1.596
1
1
16.6
3
4
23.5
18
20
18
18
16
16
17
17
12
17
15
3.06 ± 0.236
3.24 ± 0.637
3.39 ± 0.916
3.94 ± 0.539
2.13 ± 0.500
2.38 ± 0.500
3.41 ± 0.870
1.71 ± 0.470
2.58 ± 1.240
1.77 ± 0.903
1.53 ± 0.516
3
1.9
2
2
1
2
2
1
1
1
1
4
4.4
4
5
3
3
5
2
4
3
2
58
50
59
6.54 ± 2.871
1.46 ± 1.073
0.63 ± 0.471
1
1
0
9
5
3
İncelen karakterlerde değerlendirme skalalarına bakıldığında populasyonun genellikle
dar sınırlar içerisinde dağılım gösterdiği görülmektedir. Örneğin sürgün ucunda
antosiyanin yoğunluğu, yaprak şekli, sürgün rengi, tane şekli gibi karakterler oldukça
dar alanlarda farklılık göstermektedir.
62
Kantitatif karakterlerin tipik bir özelliği karakterlere ait değerlerin normal bir dağılım
göstermesi beklenir. Populasyonda incelenen 24 karakterin normal dağılıma
uygunlukları ise Kolmogorov-Smirnov testi (Minitab 13.1, p ≤ 0.05) ile analiz edilmiştir
(EK 3). Buna göre sadece hastalıklara dayanım karakterleri normal dağılıma uygunluk
göstermiştir.
4.2. Moleküler Analiz
DNA izolasyonu
Lodhi et al. (1994)’te belirtilen yönteme göre elde edilen Italia, Mercan ve Italia x
Mercan F1’lerine ait DNA’ların saflık ve miktar değerleri NanoDrop ND1000 ile
belirlenmiştir (EK 4). Moleküler düzeyde yapılan çalışmalarda DNA’nın saflığının 1.82.0 arasında olması istenen bir durumdur. EK 4’ten de anlaşılacağı üzere elde edilen
DNA’ların saflıkları 0.99 – 2.77 arasında değişmiştir.
Ekstrakte edilmiş olan DNA’ların ayrıca görsel olarak da agaroz jel (%1.5) üzerinde
görüntüleri saptanmıştır (Şekil 4.1).
Şekil 4.1. Italia x Mercan populasyonunda elde edilen DNA’ların agaroz jel (%1.5)
üzerindeki görüntüleri
63
PCR Uygulamaları
Araştırmada kullanılan toplam 300 adet RAPD primerinden sadece 113 adedi
polimorfizm göstermiştir. Test edilen primerlerden bazılarına ait DNA bant desenleri
EK 5’te verilmiştir.
Polimorfik olduğu tespit edilen primerlerden elde edilen bantlardan ise toplam 219
adedinin populasyonda polimorfizm gösterdiği belirlenmiştir. Bu lokusların polimorfik
primer başına oranı 1.94 seviyesinde kalmıştır. Lokusların her bir bireyde var (1), yok
(0) ya da çoğaltımın bireyde olmaması nedeniyle tespit edilemediği (-)
şeklinde
değerlendirmesi yapılarak sonuçlar Microsoft Excel çalışma sayfasına girilmiştir.
Lokusların varlığı/yokluğu durumlarının Mendel dağılımlarına uyumlarını test etmek
amacıyla χ2 testi (p ≤ 0.05) yapılarak elde edilen lokuslardaki 1 ve 0 sayılarının 1:1 veya
3:1 dağılımlarına uygunluğu belirlenmiştir. Buna göre; 219 adet lokustan 59 adedi ana
ebeveynde (Italia) 1:1 açılım gösterirken baba ebeveynde (Mercan) bu sayı 55 olmuştur.
3:1 dağılım gösteren heterozigotik lokus sayısı ise 16 adet olarak tespit edilmiştir. 89
adet lokus ise Mendel dağılımına uygun açılım göstermemiş ve bu nedenle bağlantı
analizi dışında tutulmuştur. Analiz sonucunda elde edilen bilgilerin toplu sunumu
Çizelge 4.2’te verilmiştir.
Çizelge 4.2. Açılım gösteren RAPD lokusları hakkında bilgi
62 Bireyde Test Edilen Toplam Primer Sayısı
En Az Bir Potansiyel Polimorfik Lokus Gösteren Primer Sayısı
Polimorfik Primerlerin Test Edilen Toplam Primerlere Oranı
(%)
Toplam Polimorfik Lokus Sayısı
Polimorfik Primer Başına Düşen Polimorfik Lokus Sayısı
1:1 Açılım Gösteren Lokus Sayısı
1:1 Açılım Gösteren Lokusların Polimorfik Primer Başına
Oranı
Açılım Gösteren Lokusların Toplam Primer Başına Oranı
64
300
113
37.7
219
1.94
114
1.03
0.73
4.3. Genetik Bağlantı Analizi
RAPD analizi sonucunda elde edilen veriler 3 ebeveynsel veri dosyası haline
çevrilmiştir: 1) 1:1 açılan bantlar, “Italia”da var “Mercan”da yok, 2) 1:1 açılan bantlar,
“Mercan”da var “Italia”da yok, ve 3) her iki ebeveynde olan bantlar (dölde 3:1 açılım
gösteren bantlar). Bir bantın çoğaltımı o lokusun bir bireyde heterozigot diğerinde
homozigot resesif olduğu anlamına gelmektedir. Bantın her iki ebeveynde olması ve
dölde açılım göstermesi ise ebeveynlerde heterozigotluğu göstermektedir. Her iki
ebeveynde heterozigot olan bantlar ilk bağlantı analizinde kullanılmamıştır.
Markörlerin isimlendirilmesinde primer ismi ve bunu izleyen harf sistemi kullanılmıştır.
Harfler alfabetik sıraya göre ve en büyük bant büyüklüğünden en küçük bant
büyüklüğüne doğru isimlendirilmiştir.
Bağlantı
gruplarının
tespiti
ve
markörlerin
yerlerinin
belirlenmesi
amacıyla
MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al. 1987) paket programında markörler arası
maksimum uzaklık 25 cM ve LOD ≥ 2.0, 3.0, 4.0 ve 5.0 ve Haldane (1919) haritalama
fonksiyonu kullanılarak yapılmıştır. Kosambi (1944) haritalama fonksiyonu kullanılarak
yapılan haritalama sonuçları parantez içerisinde verilmiştir. LOD 3.0 değerine göre elde
edilen harita temel harita olarak kabul edilmiş ve takip eden QTL analizi bu harita
üzerinde yapılmıştır. LOD 2.0, 4.0 ve 5.0 değerleri ile elde edilen harita ve QTL analiz
sonuçları EK 6-10’da bilgi için ayrıca verilmiştir.
Yalancı melezleme (pseudotestcross) populasyonlarında bağlantı fazı (coupling veya
repulsion) bilinmediğinden her bir açılım gösteren lokus bir “sessiz lokus (dummy
locus)” ile eşleştirilmiştir. Örneğin
Lokus 1
AAHAAAHHHHAHHAAAHH
Lokus 1d
HHAHHHAAAAHAAHHHAA
65
“A” homozigot resesif (- / -) ve “H” heterozigot (+ / -) genotipleri göstermektedir. Her
harf her bir F1’in genotipini temsil etmektedir. “Lokus 1d” lokus 1’in tam zıttıdır. Bu
düzenleme her bir ebeveyne ait “coupling” ve “repulsion” fazı ile karışık halde 2
bağlantı haritası vermiştir. Sadece bir tanesi daha ileri analizler için rastgele seçilmiştir.
Bağlantı gruplarının tespitine yönelik analiz sonucunda Italia çeşidi 8 (maternal harita)
ve Mercan çeşidi (paternal harita) ise 6 bağlantı grubu vermiştir. Italia’da açılım
gösteren 59 adet lokustan sadece 19 tanesi bağlantı grupları üzerine yerleşmiştir (Şekil
4.2). Mercan çeşidinde ise 1:1 açılım gösteren 55 adet lokustan 13 adedi 6 bağlantı
grubuna yerleşmiştir (Şekil 4.3).
66
P166d
B389c
OPO12c
17.3
25.5
26.8
OPI4c
5.0
OPI4d
OPA11b
OPF1b
Bağlantı grubu 1
Bağlantı grubu 2
OPC20
14.3
Bağlantı grubu 3
OPB12a
OPI15d
21.4
27.5
OPC13c
OPM10d
25.3
OPC16a
17.8
B391b
Bağlantı grubu 4
OPM9
Bağlantı grubu 5
Bağlantı grubu 6
OPI15e
OPD3a
9.2
OPD4a
28.0
OPN13a
Bağlantı grubu 7
Bağlantı grubu 8
Şekil 4.2. Italia üzüm çeşidine (ana ebeveyn) ait bağlantı grupları
67
gt04a
OPB7c
OPI15a
26.2
25.8
26.3
OPK19c
OPU16a
Bağlantı grubu 1
OPN15
Bağlantı grubu 2
Bağlantı grubu 3
OPK10c
Sc1082b
6.8
OPN6
13.3
OPM2a
25.3
OPK10a
21.3
OPN12
OPI9a
Bağlantı grubu 4
Bağlantı grubu 5
Bağlantı grubu 6
Şekil 4.3. Mercan üzüm çeşidine (baba ebeveyn) ait bağlantı grupları
Bağlantı gruplarının incelenmesi sonucunda Italia’da elde edilen 8 bağlantı grubu
üzerinde 19 adet markör lokusu yerleşirken, 6 bağlantı grubundan oluşan Mercan
bağlantı haritası ise sadece 13 adet markör lokusu içermiştir. Analiz sonucunda Italia x
Mercan populasyonunda elde edilen genetik haritaların bir karşılaştırması Çizelge 4.3’te
verilmiştir.
68
Çizelge 4.3. Italia x Mercan’a ait genetik haritaların karşılaştırılması
Toplam
Italia (ana)
Mercan (baba)
-
218.1
144.9
32
19
13
11.3
11.5
11.1
14
8
6
39.6
28.0
3
3
Kapsanan toplam uzaklık (cM)
Haritalanan markör sayısı
Markörler arası ortalama uzaklık (cM)
Bağlantı grubu sayısı
En geniş bağlantı grubu (cM)
En geniş bağlantı grubundaki markör
sayısı
Ana ebeveyne ait genetik haritada bulunan 19 lokus arasında ortalama 11.5 cM’lık bir
uzaklık bulunmuştur. Bu değer Mercan genetik haritası için 11.1 cM olarak
saptanmıştır. En geniş bağlantı grubu Italia’da üzerine 3 lokusun yerleştiği 39.6 cM’lık
5. grup olurken Mercan’da ise 28 cM’lık en geniş bağlantı grubu olan 4. grupta 3
markör lokusu yerleşmiştir.
Ebeveyn olarak kullanılan Italia ve Mercan çeşitlerinde bireysel bağlantı gruplarının
analiz sonuçları Çizelge 4.4 ve 4.5’te verilmiştir.
69
Çizelge 4.4. Italia çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler ve uzaklıkları
Markör
OPF1b
Uzaklık cM
Bağlantı Grubu No
26.8
1
B389c
OPO12c
17.3
2
OPI4c
5.0
OPI4d
P166d
3
25.5
OPA11b
OPC20
14.3
4
OPC13c
25.3
B391b
OPB12a
21.4
5
OPM10d
17.8
OPM9
OPI15d
27.5
6
28.0
7
9.2
8
OPC16a
OPI15e
OPN13a
OPD3a
OPD4a
70
Çizelge 4.5. Mercan çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler
Markör
OPB7c
Uzaklık cM
Bağlantı Grubu No
26.2
1
OPU16a
OPI15a
2
25.8
OPN15
gt04a
3
26.3
OPK19c
sc1082b
4
6.8
OPM2a
21.3
OPI9a
OPK10c
5
13.3
OPM10a
OPN12d
6
25.3
OPN6
Italia bağlantı haritasında en geniş aralık OPI-15e ile OPN-13a arasında (28 cM), en dar
aralık ise OPI-4c ile OPI-4d arasında (5.0 cM) olarak belirlenmiştir. Mercan’da ise bu
değerler, sırasıyla, 26.3 cM (gt04a – OPK19c arasında) ve 13.3 cM (sc1082b ve
OPM2a arasında) şeklinde olmuştur.
71
Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçların toplu gösterimi ise Çizelge 4.6’
da verilmiştir.
Çizelge 4.6. Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçları
Italia
Bağlantı grubu
Toplam uzaklık
Mercan
Markör sayısı
Toplam uzaklık
(cM)
Markör sayısı
(cM)
I
26.8
2
26.2
2
II
22.3
3
25.8
2
III
25.5
2
26.3
2
IV
39.6
3
28.0
3
V
39.2
3
13.3
2
VI
27.5
2
25.3
2
VII
28.0
2
VIII
9.2
2
TOPLAM
218.1
19
144.9
13
Çizelge 4.6 incelendiğinde, ana ebeveyne (Italia) ait genetik haritanın baba ebeveyne
(Mercan) göre daha büyük olduğu görülmektedir.
4.4. Kantitatif Karakter Analizi
Açılım gösteren 24 adet morfolojik ve hastalığa dayanım karakterine ait veriler
kantitatif karakter lokusu (QTL) analizi için kullanılmıştır. Bağlantı gruplarına yerleşen
markörlerin karakterlere olan bağlılık durumlarını tespit etmek amacıyla istatistiki
analizler gerçekleştirilmiştir. Tek nokta analizi, normal dağılım göstermeyen
karakterlerde Binary Lojistik Regresyon (p ≤ 0.05) ve normal dağılıma uygun olan
karakterlerde ise ANOVA testi (p ≤ 0.05) yöntemlerinin kullanılması ile uygulanmıştır.
Her iki analiz Minitab 13.1 paket programında gerçekleştirilmiştir. Bu analiz
yöntemlerinin seçilme nedeni, çalışma sonucunda yeteri kadar doygun bir moleküler
72
genetik haritanın henüz elde edilememiş olması ve dolayısıyla buna bağlı olarak QTL
haritalama çalışmalarında bilim adamlarının hizmetine sunulmuş olan paket
programlarından yararlanılamamasıdır.
Binary lojistik regresyon yöntemine göre 9 adet markör lokusu 6 adet morfolojik
karakter ile bağlantılı bulunmuştur (Çizelge 4.7).
Çizelge 4.7. Binary lojistik regresyon analizi sonuçları
Markör
Karakter
P (≤0.05)
*IOPA11b
0.037
IOPB12a
Yaprak sapı
rengi
Çiçeklenme
zamanı
Sürgün ucunda
antosiyanin
yoğunluğu
Yaprak formu
IOPB12a
Tanede aroma
0.040
IOPI15e
Çiçeklenme
zamanı
Yaprak formu
0.016
IOPC13c
IOPM10d
IOPD3a
**MOPK19c Tane şekli
birörnekliği
MOPN6
Çiçeklenme
zamanı
MOPN12
Çiçeklenme
zamanı
Grup
Ort ± S.S.1
1
0
1
0
1
0
2.108±0.393
2.400±0.507
2.469±0.915
1.800±0.632
4.750±0.676
4.161±1.128
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
2.042±0.806
1.417±0.776
1.143±0.916
2.375±0.378
2.083±0.776
2.704±0.869
2.067±0.868
1.417±0.669
1.750±0.436
1.167±0.408
2.645±0.839
2.050±0.826
2.667±0.777
1.944±0.873
0.050
0.038
0.013
0.035
0.047
0.023
0.009
Bağlantı
Grubu
3
4
5
7
8
3
6
*Italia moleküler bağlantı haritasında yer almaktadır.
** Mercan moleküler bağlantı haritasında yer almaktadır
1
Ortalama ± Standart Sapma
Çizelge 4.7’den anlaşıldığı üzere sürgün ucunda antosiyanin yoğunluğu (A1) 1 lokus,
yaprak formu (A9) 2 lokus, yaprak sapı rengi (A15) 1 lokus, çiçeklenme zamanı (B2) 4
lokus, tanede aroma (B17) 1 lokus ve tane şeklinin birörnekliği (B18) ise 1 lokus
tarafından kontrol edildiği ortaya çıkmaktadır. Yaprak formunu kontrol eden OPB12a
73
lokusunun aynı zamanda tanede aroma karakterini kontrol ettiği de tespit edilmiştir.
OPN12 markörü çiçeklenme zamanı ile yakından ilişkili bulunmuştur (p=0.009).
bulunan bu ilişkilerin istatistik önem dereceleri çok yüksek olmamıştır.
ANOVA testinin yapıldığı hastalığa dayanım karakterlerinin analiz sonuçları Çizelge
4.8’de verilmiştir.
Çizelge 4.8. Hastalığa dayanım karakterleri üzerinde ANOVA testi sonuçları
Markör
IOPI4c
IOPI4d
Karakter
Küllemeye
dayanım
Küllemeye
dayanım
P
(≤0.05)
0.013
0.013
Grup
Ort ± S.S.
1
0
1
0
5.669±2.743
7.354±2.743
7.283±2.720
5.682±2.854
%Açıkladığı
fenotipik
varyans
Bağlantı
grubu ve
uzeklık
cM
66
66
2
5 cM
Üzerinde tek yönlü ANOVA testinin yapıldığı hastalığa dayanım karakterleri
(küllemeye dayanım (C1), kurşuni küfe dayanım (C2) ve mildiyöye dayanım (C3))
incelendiğinde kurşuni küf ve mildiyöye dayanıma bağlı hiçbir markör tespit
edilememiştir. Buna karşılık küllemeye dayanımın kontrolü ile ilgili markörlerin Italia
çeşidinde 2 nolu bağlantı grubunda bulunan 2 lokus olduğu tespit edilmiştir. Lokuslar
fenotipik varyansın %66’sını açıklamaktadır.
74
5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Moleküler markörler genetik ve bitki islahında yepyeni bir çığır açmıştır. Bu markörler
doygun moleküler genetik haritaların geliştirilmesi, bitki genomlarının genetik yapısının
araştırılması, kantitatif karakter lokuslarını (QTL) da kapsayan tarımsal açıdan önemli
genlerin haritalanması, bitki gen havuzunda ve patojen populasyonunda genetik
çeşitliliğin saptanması, yabancı genlerin en doğru şekilde takibi ve evrimsel ilişkilerin
analizinde önemli ve güçlü araçlar olmaktadır.
Denenen farklı DNA izolasyon yöntemlerinde en başarılı sonucun elde edildiği Ergül
vd. (2002)’e ait modifiye edilmiş protokol, hem uygulama kolaylığı hem DNA
saflığının istenilen sınırlar içerisinde olması ve hem de DNA’nın uzun süre bozulmadan
saklanabilmesi nedeniyle oldukça kullanışlı olmuştur.
RAPD primerlerinin populasyonda yer alan genotiplerin üzerinde test edilmesi
sonucunda Mendel dağılımına (1:1 ve 3:1) uygun olan markörler Mapmaker/Exp 3.0
(Lander et al. 1987) paket programı kullanılarak değişik LOD (2.0, 3.0, 4.0 ve 5.0)
değerlerinde bağlantı gruplarının oluşturulması gerçekleştirilmiştir. Italia ve Mercan
çeşidine ait elde edilen haritalarda (LOD 3.0) sırasıyla 8 ve 6 adet bağlantı grubu
üzerinde sayıları 2-3 arasında değişen markör bulunmuştur. Uygun istatistik
programlarının kullanılması suretiyle bu markörlerin incelenen morfolojik ve hastalığa
dayanım karakterleri ile olan muhtemel bağlantıları ortaya çıkarılmıştır.
Italia x Mercan populasyonunda incelenen toplam 38 adet karakterin polimorfizm
durumlarına bakıldığında; ana ve baba bireyin 11 adet karakter açısından aynı oldukları
ve döl populasyonunun da 11 karakter bakımından açılım göstermediği anlaşılmaktadır.
Genel bir genetik haritalama çıkarılması amaçlandığında haritalama populasyonunu
oluşturacak ana ve baba bireyin mümkün olduğunca çok sayıda morfolojik karakterler
açısından farklılık göstermesi istenmektedir. Bu şekilde, döl populasyonlarında yüksek
düzeyde açılım gözlemek mümkün olmaktadır. İncelenen karakterlerle ilgili lokusları
75
dar kromozomal bölgelere yerleştirmek analizin güvenilirliğini ve doğruluğunu
arttıracaktır. Bu nedenle deneme şekli, açılım populasyonunun tipi, büyüklüğü, birey
sayısı ve DNA markörü tipi çok önemli olmaktadır. Asmada kendileme depresyonu ve
uzun generasyon süresi vb. nedenlerle F2 ve ileri populasyonların eldesi çok zor
olmaktadır. Ayrıca asmanın süregelen klonal veya vegetatif olarak çoğaltımı da genetik
yapısında bir durağanlığa neden olmaktadır. Ancak bir avantaj olarak, her bir asma
bitkisinin/çeşidinin yüksek düzeyde heterozigot olması tek bir melezleme yapılmasını
yeterli kılmaktadır. Açılım oranının en yüksek düzeyde gerçekleşebilmesi için ana ve
baba bireylerin incelenen karakter/karakterler açısından birbirinden farklı olması yani
polimorfizm göstermesi önem arzetmektedir. Araştırmada Italia x Mercan F1
populasyonunda incelenen karakterlerin 1/3’lük kısmında polimorfizm göstermemesi
yukarıda sıralanan olumsuzlukların bir göstergesidir.
Bu dezavantajın ortadan kaldırılmabilmesi için ana ve baba bireyin seçiminde daha
fazla özen gösterilmesi gerekir. Kompleks genetik yapıya sahip bireylerle veya arasında
yapılabilecek melezlemeler sonucunda daha fazla polimorfizm elde edileceği açıktır. İlk
haritalama çalışmaları 50-80 bireylik populasyonlarda (Lodhi et al. 1995, Dalbó et al.
2000, Grando et al. 2000) ‘Cayuga White’ ve ‘Aurore’ gibi Amerikan genotiplerle,
Çin’in yabani türleri (Luo et al. 2001) veya çekirdeksizlik üzerine yoğunlaşan çeşitler
ile (Doligez et al. 2002) başlamıştır. Bazı araştırmalar Vitis türlerinde dayanımla ilişkili
faktörler yönelik olmuştur (Luo et al. 2001, Di Gaspero and Cipriani 2002, Marino et
al. 2000). Bu araştırmalarda kullanılan bireylerin genetik yapısındaki komplekslik veya
incelenen karakter açısından iki zıt uçta yer almaları (dayanıklı x duyarlı, çekirdekli x
çekirdeksiz vb.) polimorfizmi arttırmıştır.
Sonuçlar incelendiğinde; kullanılan populasyonun ve polimorfik markör sayısı ile
markörlerin polimorfikliğinin düşük olması elde edilen haritanın doygunluğunun düşük
olmasına neden olmuştur. Hem ana hem de baba ebeveynde arzu edilen haploid
kromozom sayısı (n=19) kadar bağlantı grubu yerine sadece sırasıyla 8 ve 6 bağlantı
grubunun elde edilmesi ve bu bağlantı grupları üzerine yerleşen yalnızca 2-3 markörün
bulunması çalışmanın amacı kısmında belirtilen hedeflere ulaşılmasını bu aşamada
güçleştirmiştir. Bunda incelenen populasyonda incelenen birey sayısının çok düşük
76
olmasının da payı vardır. Bu dezavantaj yüksek sayıda RAPD primeri kullanılarak
giderilmeye çalışıldıysa da düşük markör polimorfizmi bu amaca ulaşmayı
engellemiştir.
Bununla beraber eldeki haritanın doygunluğu ve QTL’lerin haritalanması yönünde bu
materyalle veya yeni oluşturulacak populasyonlarla ileride yapılacak çalışmalara ışık
tutacak çok önemli sonuçlar elde edilmiştir. Örneğin, moleküler markörün (RAPD)
polimorfizmindeki düşüklük ve fenotipik karakterlerin sayısının fazlalığı ve
polimorfikliğinin durumları, bunların kalıtımı ve haritadaki konumları üzerine önemli
bilgiler sağlanmıştır.
Italia x Mercan populasyonunda test edilen RAPD primerleri çok düşük oranda
polimorfiklik (%37) göstermiştir. χ2 testi (p ≤ 0.05) sonucunda 1:1 ve 3:1 dağılım
gösteren markör sayısı sırasıyla 114 ve 16 olmuştur. Düşük açılım oranı bağlantı
gruplarının ve bu bağlantı gruplarına yerleşen markör sayısının arzu edilenden düşük
olmasına neden olmuştur.
Literatürde genel olarak kabul edilen prensibe göre;
aralarında 10 cM’dan fazla bir mesafenin bulunduğu iki markörün birbirleriyle
bağlantılı olmadıkları düşünülmektedir. Bu prensipten hareketle Italia ve Mercan’da
elde edilen bağlantı grupları incelendiğinde; Italia çeşidinde sadece OPI4c ve OPI4d
arasında (5.0 cM) ve OPD3a ve OPD4a arasında (9.2 cM) gerçek bir bağlantı
olduğundan söz edilebilir. Mercan çeşidinde ise sc1082b ile OPM2a arasında (6.8)
arasında bir bağlantı söz konusudur. Daha fazla sayıda ve daha fazla bilgi verici
primerlerle yapılacak ileri analizlerle diğer bağlantı gruplarının daha detaylı tespit
edilmesi gerekmektedir.
Aynı çerçevede, QTL analizlerinde elde edilen QTL-markör ilişkilerinin gerçek
oldukları tartışılabilir. Gerek regresyon ve gerekse anova testlerinde önem eşik
değerinin (p) 0.05 olarak ele alınmasıyla daha fazla sayıda markör-QTL bağlantısının
araştırılması amaçlanmıştır. Ancak bu eşik değerinin gerçek ve güvenilir anlamda ve her
zaman markör-QTL bağlantısını ortaya çıkaramayacağı da bilinmelidir. Özellikle,
hastalığa dayanımla ilgili lokusların açıkladığı fenotipik varyans yüzdelerinin çok
77
yüksek olması bu kuşkuyu güçlendirmektedir. Fischer et al. (2004) 3-4 yıllık gözlem
sonucunda külleme ve mildiyö hastalıklarına dayanım açısından bitkilerin yaprak ve
salkım/tane dayanım durumları konusunda yıllar arası korelasyonu hesapladıklarında bu
değerlerin mildiyöde yaprak ve salkım/tanede sırasıyla 0.52 ve 0.37 olduğunu
belirtirken külleme için hem yaprak hem de salkım/tane dayanımı için 0.49 olduğunu
rapor etmiştir. Aynı araştırıcılar Regent x Lemberger populasyonunda yaprakta
küllemeye dayanım QTL’inin 0.49-0.65 oranında, tanede ise 0.23-0.42 oranında
fenotipik varyansı açıkladığını bulmuştur. Mildiyöye dayanım QTL’inin ise yaprakta
0.46-0.56, tanede 0.23-0.42 arasında fenotipik varyansı açıkladığı tespit edilmiştir.
Merdinoğlu et al. (2003) BSA yöntemiyle BC2’de yaprıkları çalışmada mildiyöye
dayanım ile ilgli QTL’in gözlenen varyansın 0.73’ünü, genetik varyansın ise 0.83’ünü
açıkladıklarını ifade etmiştir. Bu çalışmaların yüksek sayıda birey içeren etkin bir
populasyonda ve etkin bir markör ile yapıldığını göz önüne almak gerekir.
Italia çeşidinde 8 markör lokusu 6 karakterden sorumlu bulunmuştur. Mercan çeşidinde
ise 3 lokus 2 karakteri idare etmektedir. Toplamda ise 11 markör lokusu 7 karakter ile
bağlantılı bulunmuştur. Yaprak formu ve çiçeklenme zamanı birden fazla lokus
tarafından idare edilmeleri sebebiyle poligenik karakterdirler. Mercan çeşidine ait
bağlantı gruplarına yerleşen OPN12 markörü çiçeklenme zamanı ile önemli derecede
(p=0.009) bağlantılı bulunmuştur. Yaprak formu ile ilişkili olduğu tespit edilen
lokuslardan OPB12a daha önemli (p=0.013) olmuştur. Mercan’da, küllemeye daha
dayanıklı olmasına rağmen bir QTL bulunamaması sürpriz gibi görünse de bunun
nedeni açılım populasyonundaki genel polimorfizmin ve birey sayısının düşük
olmasıdır.
Markör varlığı (1) veya yokluğu (0) değerlerinin fenotip üzerine regresyonunda
ortalama ve
standart sapma değerleri incelendiğinde; sürgün ucunda antosiyanin
yoğunluğu, yaprak formu ve
tane şekli birörnekliği karakterleri üzerine ilgili tüm
markör lokuslarının varlığının olumlu, tanede aroma üzerine ise OPB12a lokusunun
olumsuz etkide bulunduğu söylenebilir. Ancak tane şekli birörnekliği ve tanede aroma
karakterlerinde gözlem sayısının düşük olmasının (sırasıyla 17 ve 15) buna yol açması
mümkündür.
78
Küllemeye dayanım üzerine etkili olduğu tespit edilen lokuslardan sadece OPI4c’nin
hastalığa duyarlı bireylerin ortalamasını yükseltirken OPI4d hastalığa daha dayanıklı
bireylerin ortalamasını yükseltmektedir. OPI4c ve OPI4d lokuslarının önem derecesinin
daha yüksek olması (p=0.013) ve birbirinden sadece 5 cM uzaklıkta yerleşen bu iki
markörün külleme ile bağlantısı olduğunun tespiti önemli bir sonuçtur. Ek 6, 7, 8, 9 ve
10 incelendiğinde OPI4c lokusunun külleme ile olan ilişkisinin değişik LOD
değerlerinde sürekli olarak tespit edildiği ortaya çıkmaktadır. Külleme hastalığına
duyarlı olduğu tespit edilen Italia’da bu lokusun varlığı hastalıkla ilişkilendirilebilr.
Daha doygun bir harita elde edilmesi ile birlikte bu lokusların külleme ile ilgili
bağlantısının daha detaylı tespiti mümkün olacaktır.
Bu çalışmada incelenen karakterlerin bazılarında, örneğin sürgün ucunda antosiyanin
yoğunluğu, yaprak şekli ve formu, yaprak sapı tüylülük durumu, çiçeklenme zamanı,
tane etinin ve kabuğunun yapısı ve salkım uzunluğu gibi, transgresif (ebevenynlerin
döllere göre daha düşük değerler vermesi) davranış gözlenmiştir. Bu durum ebeveyn
fenotiplerinin farklı allelerin kombinasyonunun bir sonucu olduğunun göstergesi
olabilir ve özellikle bu durumun tür içi melezlemelerde fazlaca karşılaşılabilen bir
durum olduğu ifade edilmiştir (Mansur et al. 1993, Tanskley 1993).
Markör-QTL bağlantısı tespitinde kullanılan regresyon ve tek yönlü anova testlerinin
dezavantajı veri kaybını dikkate almamasıdır. Bu konuda aralık haritalamanın (interval
mapping) etkisi çok daha güçlüdür ancak sadece 60 bireyden oluşan Italia x Mercan
populasyonu bu analizin yapılması için uygun değildir. Van Ooijen (1992) 200’den
daha az bireyden oluşan populasyonlarda küçük eklemeli etkilere sahip QTL’lerin
saptanmasının zor olacağını ve sadece büyük etkiye sahip genlerin tespit edilebileceğini
ifade etmiştir.
Bu çalışmanın ülkemizde asmada ilk kez yapılıyor olması önem arzetmesine rağmen
haritalama populasyonu olarak kullanılan Italia x Mercan populasyonun bir haritalama
populasyonundan incelenen karakterler açısından beklenen polimorfizmi göstermemesi
79
amaçlanan hedeflere ulaşılmasında ve bir başka ifade ile markör-QTL ilişkisini
açıklamak için yeterli olmamıştır.
Bunu takip edecek ileri çalışmalarda aynı populasyon üzerinde birey sayısının
arttırılması ve/veya değişik markörlerin (daha fazla RAPD, AFLP, SSR ve RFLP gibi)
kullanılması ve hali hazırda bu çalışma ile elde edilmiş markörler ile yeniden
değerlendirilmesi suretiyle yukarıda belirtilen amaçlara ulaşmak mümkün olabilecektir.
Bu şekilde, çalışma sonucunda elde edilen haritaların doygunluğu arttırılabilecek ve
QTL bilgilerinin detaylandırılması ve daha güvenilir hale getirilmesi sağlanabilecektir.
80
KAYNAKLAR
Adam-Blondon, A. -F, Lahogue-Esnault, F., Bouquet, A., Boursiquot, J.M. and This, P.
2001. Usefulness of two SCAR markers for marker-assisted selection of seedless
grapevine cultivars. Vitis, 40(3); 147-155.
Adam-Blondon, A.-F., Roux, C., Claux, D., Butterlin, G., Merdinoğlu, D. and This, P.
2004. Mapping 245 SSR markers on the Vitis vinifera genome: a tool for grape
genetics. Theor.Appl. Genet., 109(5); 1017-1027.
Ageoerges, A., Albagnac, G., Doligez, A., Dosba, F., Nottenghem, J., Peros, J.P.,
Terries, N., Tesniere, C., This, J. P. and Torregrosa, L. 2002. Towards a better
understanding of berry quality and powdery mildew resistance in grapevine.
Genetic determinism and pathways. Plant Animal & Microbe Genome X
Conference Abst. 12-16 Ocak 2002, San Diego, CA, ABD.
Ağaoğlu, Y.S. 1999. Bilimsel ve uygulamalı bağcılık (Asma biyolojisi). Kavaklıdere
Eğitim Yayınları, No:1. 205 s, Ankara.
Akkurt, M. 2004. Entwichlung molekularer marker für Oidium (Uncinula necator)resistenz bei der Weinrebe. PhD Diss. Karlsruhe T.H. Deutschland. 117 s.
Anonymous.1983. Descriptors for grape. International Board for Plant Genetic Sources.
Secretariat, 93 p, Rome.
Anonymous. 1989. Minimal Descriptor List for Grapevine Varieties. 49 p.
Anonymous. 1995. Genetic analysis in Vitis using molecular markers. BARD project
No: US 1888-90, 150 p.
Anonymous. 2004. FAO üzüm istatistikleri. Web sitesi http://www.fao.org. Erişim
Tarihi:09.03.2005
Arumuganathan, K. and Earle, E.D. 1991. Nuclear DNA content of some important
plant species. Plant Molecular Biology Reporter, 9(3); 208-218.
Asins, M.J. 2002. Present and future of quantitative trait locus analysis in plant
breeding. Plant Breeding, 121; 281-291.
Bernatzky, R. and Tanksley, S.D. 1989. Restriction fragments as molecular markers for
germplasm analysis and utilization. in: Brown A.D.H., Marshall, D.R., Frankel,
O.H. Williams J. T (eds). The Use of Plant Genetic Resources, Cambridge
University Press, pp. 353-362, Cambridge.
81
Boubals, D. 1961. Etude des causesde la resistance des vitacees a l’oidium de la vigne
(Uncinula necator Burr.) et de leur mode de transmission hereditaire. Ann
Amélior Plantes, 11: 401-500.
Bouquet, A. and Danglot, Y. 1996. Inheritance of seedlessness in grapevine (Vitis
vinifera L.). Vitis, 35; 35-42.
Brar, D.S. 2002. Molecular marker assisted breeding. In: Jain, S.M., Brar, D.S. and
Ahloowalia, B.S. (eds.) Molecular techniques in crop improvement. Kluwer
Academic Publishers. 616 p.
Buck, S, and Zyprian, E. 2000. First approaches of molecular mapping in a model
population derived from the crossing of the grapevine varieties ‘Regent’ x
‘Lemberger’. Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and
Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2, Acta Horticulturae,
No:528; 203-207.
Burr, B., Burr, F.A., Thompson, K.H., Albertsen, M.C. and Stuber, C.W. 1988. Gene
mapping with recombinant inbreds in maize. Genetics, 118; 519-526.
Callahan, M., Jin, Y., Gao, F. and Walker, M.A. 2002. A genetic map of Vitis rupestris
x Muscadinia rotundifolia locating resistance to Xiphinema index, the dagger
nematod. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst. 12-16 Ocak
2002, San Diego, CA, ABD.
Çelik, H. 2002. Üzüm Çeşit Kataloğu. Sun Fidan A.Ş. Mesleki Kitaplar Serisi:2. 137 s.
Dalbó, M.A. 1998. Genetic mapping, QTL analysis and marker-assisted selection for
disease resistance loci in grapes. Ph.D. Thesis, Cornell Univ., Ithaca, NY.
Dalbó, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Steinkellner, H., Sefc, K.M. and Reisch, B.I.
2000. A gene controlling sex in grapevines placed on a molcular marker-based
genetic map. Genome, 43; 333-340.
Dalbó, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Wilcox, W.F. and Reisch, B.I. 2001. Markerassisted selection for powdery mildew resistance in grapes. J. Amer. Soc. Hort.
Sci., 126(1); 83-89.
Doligez, A., Bouquet, A., Danglot, Y., Lahogue, F., Riaz, S., Meredith, C.P., Edwards,
K.J. and This, P. 2002. Genetic mapping of grapevine (Vitis vinifera L.) applied
to the detection of QTLs for seedlessness and berry weight. Theor. Appl. Genet.
105; 780-795.
82
Doligez, A., Bouquet, A., Ballester, J., Farnos, M., Danglot, Y., Adam-Blondon, A., -F
Roux, C., Domergue, P. and This, P. 2003. QTLs for quality-related traits in
table grapes. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst. 12-16
Ocak 2002, San Diego, CA, ABD.
Donald, T., Pauquet, J., Pellerone, F., Adam-Blondon, A. -F, Bouquet, A., Thomas, M.
and Dry, L 2002. Identification and local mapping of resistance gene analogs
linked to a powdery mildew resistance locus in grapevine. Plant Animal &
Microbe Genome X Conference Abst. 12-16 Ocak 2002, San Diego, CA, ABD.
Doucleff, M., Jin, Y., Gao, F., Riaz, S., Krivanek, A.F. and Walker, M.A. 2004. A
genetic linkage map of grape, utilizing Vitis rupestris and
Vitis arizonica.
Theor. Appl. Genet., 109; 1178-1187.
Echt, C.S., Knapp, S. and Liu, B.H. 1992. Genome mapping with non-inbred crosses
using GMendel 2.0. Maize Genet. Coop. Nwsl. 66, 27-29.
Eibach, R. 1994. Investigations about the genetic resources of grapes with regard to
resistance characteristics to powdery mildew (Oidium tuckeri). Vitis, 33; 143150.
Ergül, A., Marasalı, B. and Ağaoğlu, Y. S. 2002. Molecular discrimination and
identification of
some Turkish
grape cultivars (Vitis vinifera L.) by RAPD
markers. Vitis, 41(3); 159-160.
Fischer, B.M., Slakhutdinov, I., Akkurt, M., Eibach, R., Edwards, K.J., Töpher, R. and
Zyprian, E.M. 2004. Quantitative trait locus analysis of fungal disease resistance
factors on a molecular map of grapevine. Theor. Appl. Genet., 108; 501-515.
Galet, P. 1979. A Practical Ampelography. Cornell Univ. Press, Ithaca, NY. 248 p.
Galet, P. 1988. Cépages et vignobles de France, Tome 1. Les vignes Américaines (2nd
ed). Imprimerie Charles Déhan,Montpellier, France, p.56.
Geldermann, H. 1975. Investigations on inheritance of quantitative characters in
animals by gene markers. I. Methods. Theor.Appl. Genet., 46; 319-330.
Georgiady, M., DeScenzo, R., Cain, D.W. and Irelan, N. 2001. Linkage mapping and
QTL mapping in grape. Plant and Animal Genome IX Conference Abst. 1317 Ocak 2001, San Diego, CA, ABD.
Grando, M.S., Frisinghelli, C. and Stefanini, M. 2000. Polymorhism and distribution of
molecular markers in a segregating population derived from the cross
‘Moscato Bianco’ x Vitis riparia.
Proc. of VII. International Symp. on
83
Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France,
6-10 Tem. 1998, Vol
2, Acta Horticulturae. No: 528, 209-213.
Grando, M.S., Bellin, D. Edwards, K.J., Pozzi, C., Stefanini, M. and Velasco, R. 2003.
Molecular linkage maps of Vitis vinifera L. and Vitis riparia Mchx. Theor.
Appl. Genet., 106 (7); 1213-224.
Grant, D. and Shoemaker, R.C. 2001. Plant gene techniques. Encyclopedia of Life
Sciences. p. 1-6.
Grattapaglia, D., Chapparro J., Wilcox, P., McCord, S., Werner, D., Amerson, H,
McKeand, S., Bridgewater, F., Whetten, R., O'Malley, D, and Sederoff, R. 1992.
Mapping in woody plants with RAPD markers. In: Application of RAPD
technology and plant breeding. Plant Sci. Soc. of Am. Madison, WI, p. 37-40.
Gupta, M., Chyi, Y.S., Romero-Severson, J. and Owen, J. 1994. Amplification of DNA
markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simplesequence repeats. Thoer.Appl.Genet., 89; 998-1006.
Haldane, J.B.S. 1919. The combination of linkage values, and the calculation of
distance between the loci of linked markers. J. Genet., 8; 299-309.
Haley, S.D., Afanador, L.K. and Kelly, J.D. 1994. Selection for monogenic resistance
traits with coupling- and repulsion- phase RAPD markers. Crop Sci., 34; 10611066.
Hemmat, M., Weeden, N.F., Manganaris, A.G. and Lawson, D.M. 1994. Molecular
marker linkage map for apple. J. Hered., 85; 4-11.
Hyne, V. and Kearsey, M.J. 1995. QTL analysis: Further uses of marker regression.
Theor. Appl. Genet., 91; 471-476.
Jiang, C. and Zeng, Z. 1995. Multiple trait analysis of genetic mapping for quantitative
trait loci. Genetics, 140; 1111-1127.
Kelly, J.D. 1995. Use of random amplified polymorphic DNA markers in breeding for
major gene resistance to plant pathogens. Hortscience, 30(3); 461-465.
Kosambi, D.D. 1944. The estimation of map distance from recombination values. Ann.
Eugenics, 12; 172-175.
Kozma Jr, P. 2000. Winegrape Breeding for Fungus Disease Resistance. Proc. of VII.
International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France,
6-10 Tem. 1998, Acta Horticulturae, Vol 2, No. 528.
84
Kozma Jr, P. and Dula, T. 2003. Inheritance of resistance to downy mildew and
powdery mildew of hybrid familiy Muscadinia x V. vinifera x V. amurensis x
Franco-American hybrid. Proc. VIIIth Int’l. Congress on Grape. Acta Hort. 603,
457-463.
Lahogue, F., This, P., Adam-Blondon, A-F. and Bouquet, A. 1998. Identification of
markers linked to the seedlessness character in grapevine. Plant and Animal
Genome VI Conference Abst. 18-22 Ocak 2003, San Diego, CA, ABD.
Lander, E.S., Green, P., Abrahamson, J., Barlow, Daly, M.J., Lincoln, S.E. and
Newberg, L. 1987. MAPMAKER, An interactive computer package for
constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural
populations. Genomics, 1; 174-181.
Lander, E.S. and Botstein, D. 1989. Mapping Mendelian factors underlying quantitative
traits using RFLP linkage maps. Genetics, 121; 185-189.
Lodhi, M.A. 1994. Genetic mapping and genome analysis of grape (Vitis sp.). Ph.D.
Thesis, Cornell University, 233 p., New York.
Lodhi, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F. and Reisch, B.I. 1994.. A simple and efficient
method for DNA extraction from grapevine cultivars and Vitis species.
Plant
Mol. Biol. Reptr., 12; 6-13.
Lodhi, M.A., Daly, M. A., Weeden, N.F. and Reisch, B.L 1995. A molecular marker
based linkage map of Vitis. Genome, 38; 786-794.
Luo, S., He, P.C, Zhou, P., and Zheng, XQ. 2001. Identification of molecular genetic
markers tightly linked to downy mildew resistant genes in grape. Acta Genet.
Sin., 28; 76-82.
Luo, S., He, P., Zheng, X. and Zhou, P. 2002. Inheritance of RAPD markers in an
interspesifıc F1 hybrid of grape between Vitis quinquangularis ve V.
vinifera. Scientia Horticulturae, 93; 19-28.
Madini, A., Marino, R., Sevini, F., Di Gaspero, G., Velasco, R. and Grando, M.S. 2003.
Mapping defense-related genes and QTLs in Vitis. Plant and Animal
Genome XI Conference Abst. 11-15 Ocak 2003, San Diego, CA, ABD.
Malyshev, S.V. and Kartel, N.A. 1997. Molecular markers in mapping plant genomes,
Molecular Biology, 31(2); 163-171.
85
Manly, K.F. and Elliot, R.W. 1991. MapManager, a microcomputer program for
analysis of data from recombinant inbred strains. Mammalian Genome, 1; 123126.
Mansur, L.M., Orf, J., and Lark, K.G. 1993. Determining the linkage of quantitative
trait loci for reproductive, morphological, and seed traits of soybean (Glycine
max L.). Theor. Appl. Genet., 86; 907-913.
Marino, R., Sevini, F., Madini, A., Vecchione, A., Perlot, I, Della Serra, A., Versini,
G., Velasco, R., and Grando, M.S. 2003. QTL mapping for disease resistance
and fruit quality in grape. ISHS VIII International Conference on Grape
Genetics and Breeding. Acta Horticulturae, 603; 528-533.
Mauro, M.-C, Strefeler, M., Weeden, N.F. and Reisch B.L 1992. Genetic analysis of
restriction fragment length polymorphisms in Vitis. Journal of Heredity, 83; 1821.
Mejia, N. and Hinrichsen, P. 2003. A new, highly assertive scar marker potentially
useful to assist selection for seddlessness in table grape breeding. Proc. VIIIth
Int’l. Congress on Grape. Acta Hort. 603; 559-564.
Merdinoğlu, D., Wiedeman-Merdinoğlu, S., Coste, P., Dumas, V., Haetty, S., Butterlin,
G. and Greif, C. 2003. Genetic analysis of downy mildew resistance derived
from Muscadinia rotundifolia. ISHS Acta: VIII International Conference on
Grape Genetics and Breeding. Horticulturae, 603; 451-456.
Milutinovic, M., Nikolic, D., Avramov, L. and Rakonjac, V. 2000. Recombination of
some characteristics in F1 generation of grapevine. Proc. of VII. International
Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem.
1998, Vol 2, Acta Horticulturae, 528; 641-644.
Naqvi, N. I., Bonman, J. M., Mackill, D. J., Nelson, R. J. and Chattoo, B. B. 1995.
Identification of RAPD markers linked to a major gene for blast resistance in
rice. Molecular Breeding, 1; 341-348.
Odabaş, F., Köse, B. ve Çelik, H. 2002. Amasya ili Merzifon ilçesinde yetiştirilen bazı
üzüm çeşitlerinin
ampelografik
özelliklerinin
araştırma, Türkiye V. Bağcılık ve Şarapçılık
Nevşehir.
86
belirlenmesi
üzerine
bir
Sempozyumu 5-9 Ekim,
Paran, I. and Michelmore, R.W. 1993. Development of reliable PCR based markers
linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet., 85;
985-993.
Paterson, A.H., Damon, S, Hewitt, J.D., Zamir, D., Rabinowitch, H.D., Lincoln, S.E.
and Lander, E.S. 1991.Mendelian factors underlying quantitative traits in
tomato: Comparison across species, generations, environments. Genetics, 127;
187-197.
Pauquet, L, Bouquet, A., This, P. and Adam-Blondon, A.-F. 2001. Establishment of a
local map of AFLP markers around the powdery mildew resistance gene Runl
in grapevine and assessment of their usefulness for marker assisted selection.
Theor. Appl. Genet., 103; 1201-1210.
Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. 1993. Genetic diagnostics in plant breeding, RAPDs,
microsatellites and machines. TIG, 9(8); 275-280.
Regner, F., Fradossi, A., Eisenheld, C., Stierschneider, I. and Haas, M. 2003. Genetic
analysis of a segregating population derived by a cross of Welschriesling x
Sirius. Proc. VIIIth Int’l. Congress on Grape. Acta Hort., 603; 141-148.
Reisch, B.L, Einset, J. and Pratt, C. 1994. Grapes. In: Janick, J., Moore, J.N. Eds.
Advances in Fruit Breeding. Purdue Univ. Press, West Lafayette, USA.
Reiter, R.S., Williams, J.G.K., Feldman, K.A., Rafalski, A., Tingey, S.V. and Scolnik,
P.A. 1992. Global and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by using
recombinant inbred lines and random amplified polymorphic DNAs.
Proc.Natl.Acad.Sci., USA 89, 1477-1481.
Ren, Z., Lamikanra, O. and Lu, J. 2000. Identification of a RAPD marker closely linked
to the fruit
color in muscadine grapes (Vitis rotundifolia). Proc. of VII.
International Symp. on Grapevine
Genetics
and
Breeding,
Montpellier,
France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2., Acta Horticulturae, 528; 263-266.
Riaz, S., Dnagl, G.S., Edwards, K.J. and Meredith, C.P. 2004. A microsatellite marker
based framework linkage map of Vitis vinifera L. Theor. Appl. Genet., 108;
864-872.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Synthesis of uniformly labeled DNA
probes using random oligonucleotide primers. In: Molecular cloning. 2nd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. pp.10-13.
87
Sevini, F., Marino, R. and Grando, M.S. 2004. Mapping candidate genes and QTLs
For aroma content in grape. Proc. Ist Int’l. Symp. on Grapevine. Acta Hort., 652;
439-446.
Soller, M., Brody, T. and Genizi, A. 1976. On the power of experimental designs for the
detection of linkage between marker loci and quantitative loci in crosses
between inbred lines. Theor.Appl.Genet., 47; 35-39.
Stam, P 1993. Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new
computer package, JoinMap. Plant J., 3; 739-744.
Staub, J.E., Serquen, F,C. and Gupta, M. 1996. Genetic markers, map construction, and
their
application in plant breeding. Hortscience, 31(5); 729-741
Staub, J.E., Kuhns, L.J., May, B. and Grun, P. 1982. Stability of potato tuber isozymes
under different storage regimes. J. Amer. Hort. Sci., 107; 428-432.
Stuber, C.W., Lincoln, S.E., Wolf, D.W., Helentjaris, T. and Lander, E. 1992.
Identification of genetic factors contributing to heterosis in a hybrid from an
elite maize inbred lines using molecular markers. Genetics, 132; 823-839.
Southern, E.M. 1975. Detection of spesific sequences among DNA fragments separated
by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 98; 503-517.
Striem, M.J., Ben-Hayyim, G. and Spiegel-Roy, P. 1996. Identifying molecular genetic
markers associated with seedlessness in grape. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 121
(5); 758-763.
Suiter, K.A., Wendel, J.F. and Case, J.S. 1983. Linkage-1, A pascal computer program
for the detection and analysis of genetic linkage. J. Hered., 74; 203-204.
Tanksley, S.D. 1993. Mapping Polygenes. Annu. Rev. Gent., 27; 205-233.
This, P., Cuisset, C. and Boursiquot, J.M. 1997. Development of stable RAPD markers
for the identification of grapevine rootstocks and the analysis of genetic
relationships. Am.J. Enol. Vitic., 48(4); 492-501.
Thormann, C.E., Ferreira, M.E., Camargo, L.E. Tivang, J.G. and Osborn, T.C. 1994.
Comparison of RFLP and RAPD markers to estimating genetic relationships
within and among cruciferous species. Theor. Appl. Genet., 88; 973-980.
Tulsieram, L. K., Glaubitz, J. C., Kiss, G. and Carlson, J. E. 1992. Single tree genetic
linkage mapping in conifers using haploid DNA from megagametophytes.
Bio/Tech., 10; 686-690.
88
Van Ooijen, J.W. 1992. Segregation of isozyme markers and cold tolerance in an
interspesific backcross of tomato. Theor. Appl. Genet., 66; 241-247.
Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A.,
Pot, J.,
Peleman, J., Kuiper, M. and
Zabeau, M. 1995.
AFLP: a new
technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23 (21); 44074414.
Walker, M.A. and Jin, Y. 2000. Breeding Vitis rupestris x Muscadinia rotundifolia
rootstocks to control Xiphinema index and fanleaf degeneration. Proc. of VII.
International Symp. On Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France,
6-10 Tem. 1998, Vol 2. Acta Horticulturae, 528; 511-515.
Weeden, N.F., Reisch, B.L and Martens, M.E. 1988. Genetic analysis of
isozyme polymorphism in grape. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 113(5); 765-769.
Weeden, N.F., Hemmat, M, Lawson, D.M., Lodhi, M., Bell, R.L., Manganaris, A.G.,
Reisch, B.I., Brown, S.K. and Ye, G.-N. 1994. Development and application
of molecular linkage maps in woody fruit crops. Euphytica, 77; 71-75.
Weising, K., Nybom, H., Wolff, K. and Meyer, W. 1995. DNA fingerprinting in plants
and fungi. CRC Pres, Inc. 322 p.
Williams, J.G.K., Rubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. 1990.
DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nucleic Acid Research, 18(22); 6531-6535.
Ye, G.N., Lodhi, M.A., Weeden, N.F. and Reisch, B.I. 1995. A RAPD linkage map for
grape and identification of major QTL for powdery mildew resistance. BARD
Project. Final BARD Report, US 1888-90. pp 54-67.
Yoshimura, S., A., Yoshimura, S.R., McCouch, M.R., Baraoidan, T.W., Mew, N.
and Nelson, R.J. 1995. Tagging and combining bacterial blight resistance genes
in rice using RAPD and RFLP markers. Molecular Breeding, 1; 375-387.
Zavala, K., Mejia, N., Sagredo, B. and Hinrichsen, P. 2002. Consruction of a linkage
map for apirenic
table grapes and identification of markers linked to
seedlessness. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst. 12-16
Ocak 2002, San Diego, C A, ABD.
89
Zyprian, E., Salakhutdinov, L., Fischer, B., Akkurt, M. and Töpfer, R. 2002. Molecular
mapping of
grapevine and QTL analysis of fungal disease resistances. Plant
and Animal & Microbe Genome x Conference Abst. 12 -16 Ocak 2002,
San Diego, C A, ABD.
Zyprian, E., Eibach, R. and Töpfer, R. 2003. Comparative molecular mapping of fungal
disease resistance and agronomic traits in segregating populations of
grapevine. Plant and Animal Genome XI Conference Abst. 11-15 Ocak 2003,
San Diego, CA, ABD.
Zyprian, E., Eibach, R., Akkurt, M. and Töpfer, R. 2005. Genetic mapping of
SSR Markers in
grapevine
for the
analysis of disease resistance and
flavor compounds. Plant and Animal Genome XIII Conference Abst. 15-19
Ocak 2005, San Diego, CA, ABD.
90
EKLER
EK 1. RAPD analizi ile analiz edilen iki ebeveyn ve 60 F1 bitkisinde taranan primerlere
ait baz dizilişleri
Ek 2. Italia x Mercan populasyonunda yapılan morfolojik ve hastalıklara dayanım
özeliklerine yönelik analiz sonuçları
EK 3. İncelenen karakterlerin normal dağılıma uygunluk grafikleri
EK 4. Italia, Mercan ve Italia x Mercan F1’lerine ait DNA’ların saflık ve miktar
değerleri
EK 5. Bazı primerlere ait PCR bant desenleri
EK 6. LOD 2.0 ve 25 cM maksimum uzaklık değerlerine göre oluşan bağlantı
grupları1
EK 7. Italia çeşidinde LOD 4 ve 5 ve 25 cM maksimum uzaklık değerlerine göre
oluşan bağlantı grupları
EK 8. Mercan üzüm çeşidinde LOD 4 ve 25 cM maksimum uzaklık değerlerinde
oluşan bağlantı grupları
EK 9. LOD 2, 4 ve 5 değerlerine göre Italia ve Mercan haritalarının karşılaştırılması
EK 10. LOD 2 değerine göre bağlantı gruplarına yerleşen markörlerde yapılan Binary
lojistik regresyon ve tek faktörlü Anova analiz sonuçları
91
EK 1. RAPD analizi ile analiz edilen iki ebeveyn ve 60 F1 bitkisinde taranan primerlere
ait baz dizilişleri
İsim
Dizi 5’----------►3’
OPA-1
CAGGCCCTTC
OPA-2
TGCCGAGCTG
OPA-03
AGTCAGCCAC
OPA-04
AATCGGGCTG
OPA-05
AGGGGTCTTG
OPA-06
GGTCCCTGAC
OPA-07
GAAACGGGTG
OPA-08
GTGACGTAGG
OPA-09
GGGTAACGCC
OPA-10
GTGATCGCAG
OPA-11
CAATCGCCGT
OPA-12
TCGGCGATAG
OPA-13
CAGCACCCAC
OPA-14
TCTGTGCTGG
OPA-15
TTCCGAACCC
OPA-16
AGCCAGCGAA
OPA-17
GACCGCTTGT
OPA-18
AGGTGACCGT
OPA-19
CAAACGTCGG
OPA-20
GTTGCGATCC
OPB-01
GTTTCGCTCC
OPB-02
TGATCCCTGG
OPB-03
CATCCCCCTG
OPB-04
GGACTGGAGT
OPB-05
TGCGCCCTTC
OPB-06
TGCTCTGCCC
OPB-07
GGTGACGCAG
OPB-08
GTCCACACGG
OPB-09
TGGGGGACTC
OP B-10
CTGCTGGGAC
OPB-11
GTAGACCCGT
OPB-12
CCTTGACGCA
OPB-13
TTCCCCCGCT
OPB-14
TCCGCTCTGG
92
OPB-15
GGAGGGTGTT
OPB-16
TTTGCCCGGA
OPB-17
AGGGAACGAG
OPB-18
CCACAGCAGT
OPB-19
ACCCCCGAAG
OPB-20
GGACCCTTAC
OPC-01
TTCGAGCCAG
OPC-02
GTGAGGCGTC
OPC-03
GGGGGTCTTT
OPC-04
CCGCATCTAC
OPC-05
GATGACCGCC
OPC-06
GAACGGACTC
OPC-07
GTCCCGACGA
OPC-08
TGGACCGGTG
OPC-09
CTCACCGTCC
OPC-10
TGTCTGGGTG
OPC-11
AAAGCTGCGG
OPC-12
TGTCATCCCC
OPC-13
AAGCCTCGTC
OPC-14
TGCGTGCTTG
OPC-15
GACGGATCAG
OPC-16
CACACTCCAG
OPC-17
TTCCCCCCAG
OPC-18
TGAGTGGGTG
OPC-19
GTTGCCAGCC
OPC-20
ACTTCGCCAC
OPD-01
ACCGCGAAGG
OPD-02
GGACCCAACC
OPD-03
GTCGCCGTCA
OPD-04
TCTGGTGAGG
OPD-05
TGAGCGGACA
OPD-06
ACCTGAACGG
OPD-07
TTGGCACGGG
OPD-08
GTGTGCCCCA
OPD-09
CTCTGGAGAC
OPD-10
GGTCTACACC
OPD-11
AGCGCCATTG
93
OPD-12
CACCGTATCC
OPD-13
GGGGTGACGA
OPD-14
CTTCCCCAAG
OPD-15
CATCCGTGCT
OPD-16
AGGGCGTAAG
OPD-17
TTTCCCACGG
OPD-18
GAGAGCCAAC
OPD-19
CTGGGGACTT
OPD-20
ACCCGGTCAC
OPE-01
CCCAAGGTCC
OPE-02
GGTGCGGGAA
OPE-03
CCAGATGCAC
OPE-04
GTGACATGCC
OPE-05
TCAGGGAGGT
OPE-06
AAGACCCCTC
OPE-07
AGATGCAGCC
OPE-08
TCACCACGGT
OPE-09
CTTCACCCGA
OPE-10
CACCAGGTGA
OPE-11
GAGTCTCAGG
OPE-12
TTATCGCCCC
OPE-13
CCCGATTCGG
OPE-14
TGCGGCTGAG
OPE-15
ACGCACAACC
OPE-16
GGTGACTGTG
OPE-17
CTACTGCCGT
OPE-18
GGACTGCAGA
OPE-19
ACGGCGTATG
OPE-20
AACGGTGACC
OPF-01
ACGGATCCTG
OPF-02
GAGGATCCCT
OPF-03
CCTGATCACC
OPF-04
GGTGATCAGG
OPF-05
CCGAATTCCC
OPF-06
GGGAATTCGG
OPF-07
CCGATATCCC
OPF-08
GGGATATCGG
94
OPF-09
CCAAGCTTCC
OPF-10
GGAAGCTTGG
OP F-11
TTGGTACCCC
OPF-12
ACGGTACCAG
OPF-13
GGCTGCAGAA
OPF-14
TGCTGCAGGT
OPF-15
CCAGTACTCC
OPF-16
GGAGTACTGG
OPF-17
AACCCGGGAA
OPF-18
TTCCCGGGTT
OPF-19
CCTCTAGACC
OPF-20
GGTCTAGAGG
OPH-01
GGTCGGAGAA
OP H-02
TCGGACGTGA
OPH-03
AGACGTCCAC
OP H-04
GGAAGTCGCC
OP H-05
AGTCGTCCCC
OP H-06
ACGCATCGCA
OP H-07
CTGCATCGTG
OP H-08
GAAACACCCC
OP H-09
TGTAGCTGGG
OP H-10
CCTACGTCAG
OP H-11
CTTCCGCAGT
OP H-12
ACGCGCATGT
OP H-13
GACGCCACAC
OP H-14
ACCAGGTTGG
OP H-15
AATGGCGCAG
OP H-16
TCTCAGCTGG
OP H-17
CACTCTCCTC
OP H-18
GAATCGGCCA
OP H-19
CTGACCAGCC
OP H-20
GGGAGACATC
OPI-01
ACCTGGACAC
OPI-02
GGAGGAGAGG
OPI-03
CAGAAGCCCA
OPI-04
CCGCCTAGTC
OPI-05
TGTTCCACGG
95
OPI-06
AAGGCGGCAG
OPI-07
CAGCGACAAG
OPI-08
TTTGCCCGGT
OPI-09
TGGAGAGCAG
OPI-10
ACAACGCGAG
OPI-11
ACATGCCGTG
OPI-12
AGAGGGCACA
OPI-13
CTGGGGCTGA
OPI-14
TGACGGCGGT
OPI-15
TCATCCGAGG
OPI-16
TCTCCGCCCT
OPK-01
CATTCGAGCC
OPK-02
GTCTCCGCAA
OPK-03
CCAGCTTAGG
OPK-04
CCGCCCAAAC
OPK-05
TCTGTCGAGG
OPK-06
CACCTTTCCC
OPK-07
AGCGAGCAAG
OPK-08
GAACACTGGG
OPK-09
CCCTACCGAC
OPK-10
GTGCAACGTG
OPK-11
AATGCCCCAG
OPK-12
TGGCCCTCAC
OPK-13
GGTTGTACCC
OPK-14
CCCGCTACAC
OPK-15
CTCCTGCCAA
OPK-16
GAGCGTCGAA
OPK-17
CCCAGCTGTG
OPK-18
CCTAGTCGAG
OPK-19
CACAGGCGGA
OPK-20
GTGTCGCGAG
OPM-01
GTTGGTGGCT
OPM-02
ACAACGCCTC
OPM-03
GGGGGATGAG
OPM-04
GGCGGTTGTC
OPM-05
GGGAACGTGT
OPM-06
CTGGGCAACT
96
OPM-07
CCGTGACTCA
OPM-08
TCTGTTCCCC
OPM-09
GTCTTGCGGA
OPM-10
TCTGGCGCAC
OPM-11
GTCCACTGTG
OPM-12
GGGACGTTGG
OPM-13
GGTGGTCAAG
OPM-14
AGGGTCGTTC
OPM-15
GACCTACCAC
OPM-16
GTAACCAGCC
OPM-17
TCAGTCCGGG
OPM-18
CACCATCCGT
OPM-19
CCTTCAGGCA
OPM-20
AGGTCTTGGG
OPN-01
CTCACGTTGG
OPN-02
ACCAGGGGCA
OPN-03
GGTACTCCCC
OPN-04
GACCGACCCA
OPN-05
ACTGAACGCC
OPN-06
GAGACGCACA
OPN-07
CAGCCCAGAG
OPN-08
ACCTCAGCTC
OPN-09
TGCCGGCTTG
OPN-10
ACAACTGGGG
OPN-11
TCGCCGCAAA
OPN-12
CACAGACACC
OPN-13
AGCGTCACTC
OPN-14
TCGTGCGGGT
OPN-15
CAGCGACTGT
OPN-16
AAGCGACCTG
OPN-17
CATTGGGGAG
OPN-18
GGTGAGGTCA
OPN-19
GTCCGTACTG
OPN-20
GGTGCTCCGT
OPO-01
GGCACGTAAG
OPO-02
ACGTAGCGTC
OPO-03
CTGTTGCTAC
97
OPO-04
AAGTCCGCTC
OPO-05
CCCAGTCACT
OPO-06
CCACGGGAAG
OPO-07
CAGCACTGAC
OPO-08
CCTCCAGTGT
OPO-09
TCCCACGCAA
OPO-10
TCAGAGCGCC
OPO-11
GACAGGAGGT
OPO-12
CAGTGCTGTG
OPO-13
GTCAGAGTCC
OPO-14
AGCATGGCTC
OPO-15
TGGCGTCCTT
OPO-16
TCGGCGGTTC
OPO-17
GGCTTATGCC
OPO-18
CTCGCTATCC
OPO-19
GGTGCACGTT
OPO-20
ACACACGCTG
OPU-16
CTGCGCTGGA
OPP-17
TGACCCGCCT
OP G-05
CTGAGACGGA
OP G-06
GTGCCTAACC
UBC 204
TTCGGGCCGT
UBC 231
ACACACGCTG
UBC 251
CTTGACGGGG
UBC 237
CGACCAGAGC
UBC 238
CTCTCCAGCA
BC 302
CGGCCCACGT
BC 340
GAGAGGCACC
B 352
CACAACGGGT
B 356
GCGGCCCTCT
BC 374
GGTCAACCCT
B 379
GGGCTAGGGT
B 388
CGGTCGCGTC
B 389
CGCCCGCAGT
B 391
GCGAACCTCG
98
P 33
GTAAAACGACGGCCAGT
P 35
TGCGCAACGTTGTTG'
P 123
GGGATTCGAC
P 166
GTGACGGACT
P 210
AAATGCGGCA
P 232
CCGCTTGTTG
P 250
TGAGCTCCGT
P 255
ACGTTTTCCC
P 313
AAAGCCGTCC
P 325
TACGTGCTGG
P 382
GAACCGGATC
P 394
CGACTCCAAC
P 402
GCGTTGTCCA
P 437
CGGATCGACA
P 443
GCCGTGATAG
K1
GCGACCATGG
K2
CAGGCCATGG
K3
GCCATGGACG
K4
GATGGTACCG
K5
CGCAGGATGG
K6
CGATGACTGG'
K7
GGGATGGCTG
K8
CCCATGGGTG
GTO 4
GTGGTTGCGA
S 34
GATAGCCGAC
S 35
AGTCGCTCAT
S 39
TCGGCCTGCT
S 69
CATCGAACCG
RAPD 1
CGCAGTACTC
RAPD 2
GTCCTCAACG
RAPD 3
CTGATCGTAC
RAPD 4
GTCCTACTCG
RAPD 5
CTACTACTCG
RAPD 6
TCCTCACTAG
RAPD 7
GTGCTTAGCG
RAPD 8
CAGGCCCTTC
99
RAPD 9
CTACACAGGC
SC 1022
GTAGGCGTCG
SC 1023
GGCTCGTACC
SC 1038
GACCCCGGCA
SC 1043
GCCTGGTTAC
SC 1048
CTGGTATGCG
SC 1053
CAGGGGACGA
SC 1065
CAGGGGTGAT
SC 1076
CGCAGACTTG
SC 1077
AGATAGAGGG
SC 1082
GCCGTGAAGT
SC 1093
GCCTCCTACC
100
EK 2. Italia x Mercan populasyonunda yapılan morfolojik ve hastalıklara dayanım özeliklerine yönelik analiz sonuçları
İtalia
Mercan
1
4
7
11
19
46
47
69
71
78
84
89
97
98
101
106
112
119
132
143
149
152
163
174
187
192
193
195
223
225
228
230
237
A1
1
5
5
5
5
5
5
5
3
3
5
5
5
5
5
1
5
3
5
5
3
3
5
5
3
5
5
5
3
5
5
5
3
5
3
A2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
A3
13.Nis
18.Nis
16.Nis
16.Nis
18.Nis
13.Nis
13.Nis
18.Nis
16.Nis
13.Nis
16.Nis
13.Nis
13.Nis
18.Nis
16.Nis
16.Nis
16.Nis
16.Nis
18.Nis
22.Nis
16.Nis
13.Nis
18.Nis
18.Nis
16.Nis
13.Nis
18.Nis
13.Nis
13.Nis
18.Nis
16.Nis
13.Nis
16.Nis
16.Nis
16.Nis
A4
1
2
1
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
2
1
2
2
1
1
1
2
3
1
1
1
2
2
1
2
1
2
2
2
1
A5
2
5
3
2
2
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
A6
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
A7
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
1
5
5
5
5
5
5
5
5
5
A8
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
5
3
3
3
3
3
3
3
3
3
A9
2
1
1
1
1
2
2
2
1
2
2
1
2
1
1
3
1
1
3
1
1
2
2
2
2
3
3
1
1
1
2
2
1
1
2
A10
2
2
2
2
4
4
2
4
2
2
3
2
4
2
3
2
3
2
3
2
2
2
3
3
3
3
4
3
3
4
3
2
4
3
2
101
A11
1
1
2
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
A12
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
A13
3
2
2
1
3
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
A14
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
A15
2
2
3
3
2
2
2
2
3
2
2
3
3
2
2
2
2
3
2
2
1
2
3
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
A16
3
3
2
2
3
3
2
3
1
2
2
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
3
2
2
1
2
1
2
2
3
2
A17
3
2
2
2
3
3
3
3
1
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
3
2
3
3
3
2
2
2
2
3
3
B1
1
1
1
B2
3
2
3
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
3
2
3
3
3
4
2
3
2
3
3
1
1
3
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
3
2
2
1
1
4
B3
B4
18,8
21,2
23,2
19
19,8
21,6
21,4
22,2
22,6
20,2
254
255
256
257
258
260
261
262
263
264
266
267
270
271
272
283
289
295
307
311
314
318
327
328
329
331
419
A1
3
5
5
5
5
5
5
3
5
5
5
3
5
5
5
5
5
5
5
5
3
3
5
5
5
5
A2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
A3
13.Nis
16.Nis
18.Nis
13.Nis
18.Nis
27.Nis
21.Nis
16.Nis
18.Nis
18.Nis
18.Nis
16.Nis
16.Nis
16.Nis
13.Nis
13.Nis
13.Nis
18.Nis
16.Nis
16.Nis
16.Nis
13.Nis
18.Nis
18.Nis
16.Nis
16.Nis
A4
1
2
1
2
2
2
1
1
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
1
1
2
2
2
2
2
A5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
3
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
A6
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
A7
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
A8
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
A9
1
1
1
1
1
1
1
1
3
3
3
3
1
1
3
1
3
3
3
2
3
1
3
3
1
1
A10
2
3
4
3
2
2
4
4
4
2
3
3
2
4
3
2
3
3
3
2
3
3
2
4
3
3
102
A11
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
A12
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
A13
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
3
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
3
3
3
A14
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
A15
2
3
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
A16
2
2
2
1
2
2
2
2
3
2
3
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
1
2
2
3
3
A17
3
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
B1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
B2
3
2
2
2
2
3
4
2
4
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
1
2
3
3
1
4
2
4
2
2
3
B3
B4
23,2
22
20,2
21,2
21,8
21,4
22,6
16,6
22
23,5
21,4
22,4
22
B5
İtalia
Mercan
1
4
7
11
19
46
47
69
71
78
84
89
97
98
101
106
112
119
132
143
149
152
163
174
187
192
193
195
223
225
228
230
237
B6
4
3
B7
11,26
2,6
B8
3
2
B9
3
3
B10
4
3
B11
5
3
B12
3
4
B13
1
2
B14
1
2
B15
4
1
B16
2
1
B17
4
1
B18
1
1
3
3,9
2
4
2
2
5
2
1
1
1
3
2
3
2,8
2
4
2
2
4
2
1
3
1
1
2
1
3
1
3
2
2,6
1,9
3
2,5
2
4
2
3
4
2
3
3,7
2
2
2
2
2
2
3
3,8
2
4
2
2
4
2
1
3
2,5
3
5
1
2
4
2
1
103
1
1
1
2
1
1
1
C1
9
4
4
6
9
1
7,2
2,2
1
5
8
1,8
9
9
2,4
5
7
9
7
3,9
9
5,3
9
8,1
9
C2
4
1
1
3
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
4
1
9
9
5
1
9
9
9
9
9
1
1
1
1
1
2
1
4
1
1
3
1
1
1
1
C3
0,4
0,25
0,2
0
0,1
3
1,2
0,7
0,25
0,35
0,7
0,55
0,75
0,55
1,15
0,95
0,45
0,7
1,15
0,9
0,15
0,05
0,4
0,25
0,1
0,7
0,75
0,25
0,65
0,4
0,05
0,75
0,6
0,65
0,5
B5
254
255
256
257
258
260
261
262
263
264
266
267
270
271
272
283
289
295
307
311
314
318
327
328
329
331
419
B6
3
3
B7
2,7
4,4
B8
4
4
B9
4
4
B10
2
B11
2
B12
2
B13
2
2
B14
2
2
B15
3
B16
1
1
B17
2
1
B18
2
3
3,7
4
4
2
2
3
2
2
3
1
3
2
3
3
3,3
3,6
4
4
4
4
2
2
3
2
4
3
2
2
2
2
1
1
1
1
3
1
1
3
3
3
3
4
3,5
3,6
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
3
2
2
3
2
3
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
3
1
1
1
2
1
1
1
3
2
2
2
2
2
4
4
3
3
4
4
3
4
3
2,5
3,2
3
3,1
3,5
4
4
2
2
2
2
2
3
3,9
4
4
3
3
3
2
2
104
1
4
1
1
1
2
1
2
2
C1
2,2
9
9
7
1,7
9
5
5
9
7
9
1,8
3
9
9
9
9
9
3
9
9
4
3
9
3,7
9
C2
1
1
1
3
1
5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
1
C3
0,4
0,35
0,5
0,35
0,35
0,3
0,55
0,3
0,55
0,65
0,5
0,4
0,15
0,19
0,7
1
1,05
1,2
1,25
1
0,6
1,4
0,7
1,4
0,75
0,45
EK 3. İncelenen karakterlerin normal dağılıma uygunluk grafikleri
Genc yaprak üst yüzey rengi
,999
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
Sürgün ucunda antosiyanin yogunlugu
,80
,50
,20
,05
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
1
2
3
4
5
1
A1
Kolmogorov-Smirnov Normality
StDev:
4,45763
0,970639
N:
59
Test D+: 0,077 D-: 0,093 D : 0,093
Approximate P-Value > 0.15
Average: 1,61017
StDev: 0,525782
Approximate P-Value > 0.15
,999
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
Yaprak sekli
,80
,50
,20
,05
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
1
2
3
2
A9
Average: 1,74576
StDev: 0,842681
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,075 D-: 0,067 D : 0,075
Approximate P-Value > 0.15
Average: 2,84746
StDev: 0,761431
Approximate P-Value > 0.15
Yaprak sapi rengi
,999
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
4
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,062 D-: 0,054 D : 0,062
N: 59
Olgun yaprakta cep genisligi
,80
,50
,20
,05
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
1
2
3
1
A13
Average: 2,25424
StDev: 0,476815
2
3
A15
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,084 D-: 0,085 D : 0,085
N: 59
Approximate P-Value > 0.15
Average: 2,18966
StDev: 0,437573
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,081 D-: 0,080 D : 0,081
N: 58
Approximate P-Value > 0.15
Yaprak sapi tüylülük durumu
sürgün rengi
,999
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
3
A10
N: 59
,80
,50
,20
,05
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
1
2
3
1
A16
N: 59
3
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,089 D-: 0,084 D : 0,089
N: 59
Yaprak formu
Average: 2,25424
StDev: 0,604387
2
A4
Average:
2
3
A17
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,044 D-: 0,069 D : 0,069
Approximate P-Value > 0.15
Average: 2,35593
StDev: 0,517378
N: 59
105
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,085 D-: 0,088 D : 0,088
Approximate P-Value > 0.15
Çiçeklenme zamani
Meyvenin olgunlasma zamani
,99
,95
,95
Probability
,999
,99
Probability
,999
,80
,50
,20
,80
,50
,20
,05
,05
,01
,01
,001
,001
1
2
3
4
16,5
17,5
18,5
19,5
B2
Average: 2,42308
StDev: 0,871018
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,042 D-: 0,035 D : 0,042
N: 52
Approximate P-Value > 0.15
Approximate P-Value: 0,034
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
,999
,80
,50
,20
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
3,0
3,5
4,0
2
3
B6
Approximate P-Value > 0.15
Average: 3,235
StDev: 0,636830
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,103 D-: 0,136 D : 0,136
N: 20
Approximate P-Value > 0.15
Tane etinin yapisi
Tane kabugunun yapisi
,999
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
4
B7
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,093 D-: 0,056 D : 0,093
N: 18
,80
,50
,20
,05
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
2
3
4
2
B8
3
4
5
B9
Average: 3,38889
StDev: 0,916444
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,102 D-: 0,109 D : 0,109
N: 18
Approximate P-Value > 0.15
Average: 3,94444
StDev: 0,539305
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,055 D-: 0,069 D : 0,069
N: 18
Approximate P-Value > 0.15
Salkim uzunlugu
Salkim agirligi
,999
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
23,5
Tek tane agirligi
Average: 3,05556
StDev: 0,235702
,80
,50
,20
,05
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
1
2
3
2,0
B10
2,5
3,0
B11
Average: 2,125
StDev: 0,5
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,067 D-: 0,085 D : 0,085
N: 16
Approximate P-Value > 0.15
Average: 2,375
StDev: 0,5
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,117 D-: 0,113 D : 0,117
N: 16
Approximate P-Value > 0.15
Salkim sikligi
Tane etinin sululugu
,999
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
22,5
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,099 D-: 0,201 D : 0,201
N: 21
,05
,80
,50
,20
,05
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
2
3
4
5
1,0
B12
N: 17
21,5
Average: 21,4429
StDev: 1,59580
Tane sekli
Average: 3,41176
StDev: 0,870260
20,5
B4
1,5
2,0
B14
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,065 D-: 0,074 D : 0,074
Approximate P-Value > 0.15
Average: 1,70588
StDev: 0,469668
N: 17
106
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,110 D-: 0,117 D : 0,117
Approximate P-Value > 0.15
Salkim sekli
Tanede aroma
,99
,95
,95
Probability
,999
,99
Probability
,999
,80
,50
,20
,80
,50
,20
,05
,05
,01
,01
,001
,001
1
2
3
4
1
2
B15
Average: 2,58333
StDev: 1,24011
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,107 D-: 0,132 D : 0,132
N: 12
Approximate P-Value > 0.15
Average: 1,76471
StDev: 0,903425
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,095 D-: 0,091 D : 0,095
N: 17
Approximate P-Value > 0.15
Tane seklinin birörnekligi
Küllemeye dayanim
,999
,999
,99
,99
,95
,95
Probability
Probability
3
B17
,80
,50
,20
,05
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
1,0
1,5
2,0
1
2
3
4
B18
Average: 1,53333
StDev: 0,516398
5
6
7
8
9
C1
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,116 D-: 0,117 D : 0,117
N: 15
Approximate P-Value > 0.15
Average: 6,53966
StDev: 2,87078
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,081 D-: 0,212 D : 0,212
N: 58
Approximate P-Value < 0.01
Kursuni küfe dayanim
Mildiyöye dayanim
,99
,999
,95
,99
Probability
Probability
,999
,80
,50
,20
,05
,95
,80
,50
,20
,05
,01
,01
,001
,001
1
2
3
4
5
0
C2
Average: 1,46
StDev: 1,07305
N: 50
1
2
3
C3
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,147 D-: 0,061 D : 0,147
Approximate P-Value < 0.01
Average: 0,626102
StDev: 0,471249
N: 59
107
Kolmogorov-Smirnov Normality Test
D+: 0,151 D-: 0,092 D : 0,151
Approximate P-Value < 0.01
EK 4. Italia, Mercan ve Italia x Mercan F1’lerine ait DNA’ların saflık ve miktar
değerleri
Genotip
DNA Miktarı (ng/ul)
DNA saflığı (260/280)
Italia
1824,41
1,87
Mercan
1378,06
1,89
F1
1134,47
1,86
F4
1289,36
1,92
F7
1469,24
1,9
F11
945,72
1,84
F19
1823,04
1,87
F46
1671,34
1,89
F47
19,41
1,83
F69
1325,82
1,87
F71
950,3
1,79
F78
1299,8
1,88
F84
1295,44
1,93
F89
1370,77
1,81
F97
1195,56
1,84
F98
2036,81
1,9
F101
1943,94
1,9
F106
1355,24
1,9
F112
1892,81
1,91
F119
1230,84
1,86
F132
811,71
1,85
F143
1793,91
1,87
F149
758,69
1,99
F152
1815,21
1,88
F163
1942,49
1,91
F174
1356,82
1,9
F187
1290,49
1,86
F192
1638,28
1,88
F193
1369,58
1,9
F195
1636,95
1,47
F223
2734,53
1,89
108
F225
1665,12
1,87
F228
1177,32
1,87
F230
1835,62
1,89
F237
1394,34
0,99
F254
1379,25
1,74
F255
1789,36
2,19
F256
1623,55
1,88
F257
342,33
1,81
F258
703,81
1,84
F260
2477,15
1,92
F261
987,65
1,23
F262
2858,99
1,9
F263
869,74
1,64
F264
1610,59
1,86
F266
1609,64
1,83
F267
1168,51
1,85
F270
1609,42
1,84
F271
1522,65
2,77
F272
952,44
1,99
F283
1856,94
1,89
F289
1156,84
1,9
F295
1294,4
1,91
F307
1470,36
1,89
F311
891,52
1,86
F314
1594,55
1,87
F318
1720,81
1,9
F327
1393,7
1,89
F328
1592
1,87
F329
2806,3
1,94
F331
1544,99
1,91
F419
1672,77
1,88
109
EK 5. Bazı primerlere ait PCR bant desenleri
OPI-1 primerine ait DNA bant desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51318, 52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
OPN-13 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51318, 52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
110
OPI- 4 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51318, 52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
OPB-11 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51318, 52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331, L- DNA Ladder)
111
OPB-20 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51318, 52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
OPC-5 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51318, 52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
112
OPC-9 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51318, 52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
OPC-15 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51- 318,
52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
113
OPF-1 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51- 318,
52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
OPO-20 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51- 318,
52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
114
B391 primerine ait DNA desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51- 318,
52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
K3 primerine ait DNA bant desenleri
(I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, 15-101, 16-106, 17-112, 18-119, 19-132, 20-143, 21-149, 22-152, 23-163, 24-187, 25-192, 26-193,
27-195, 28-223, 29-230, 30-237, 31-254, 32-255, 33-256, 34-257, 35-258, 36-260, 37-261, 38-263, 39-264, 40-266, 41-267, 42-270, 43-271, 44-272, 45-283, 46-289, 47-295, 48-307, 49-311, 50-314, 51- 318,
52-327, 53-311, 54-314, 55-327, 56-328, 57-329, 58-331)
115
EK 6. LOD 2.0 ve 25 cM maksimum uzaklık değerlerine göre oluşan bağlantı
grupları1
ITALIA
OPO12c
P166d
B389c
20.3
(17.3)
33.7
(26.8)
31.8
(25.5)
OPI4c
5.3 (5.0)
OPI4d
OPA11b
OPF1b
Bağlantı grubu 1
Bağlantı grubu 2
OPC20
Bağlantı grubu 3
OPB 4
OPB 12a
16.4
(14.3)
34.7
(27.5)
25.9
(21.4)
OPC13c
31.5
(25.3)
OPM 10d
OPK 10b
21.0
(17.8)
OPM 9
B391b
Bağlantı grubu 4
Bağlantı Grubu 5
Bağlantı grubu 6
OPI15d
OPD3a
10.0
(9.2)
34.7
(27.5)
OPD4a
OPC 16a
Bağlantı grubu 7
Bağlantı grubu 8
_____________________________________________
Parentez içindeki değerler Kosambi (1944) haritalama fonksiyonuna göre elde edilmiştir.
1
116
MERCAN
OPC 8
OPF2 b
36.4
(28.6)
OPB7 c
OPE 11
34.7
(27.5)
32.8
(26.2)
35.1
(27.7)
OPK11 b
OPU16 a
OPC13 a
Bağlantı grubu 1
Bağlantı grubu
Bağlantı grubu 3
OPI15 a
OPB11 a
gt04 a
32.2
(25.8)
33.0
(26.3)
33.5
(26.7)
OPN 15
OPK19 c
S35 a
Bağlantı grubu 4
Bağlantı grubu 5
Sc1082 b
7.2
(6.8)
OPM2 a
25.6
(21.3)
Bağlantı grubu 6
OPK10 c
15.0
(13.3)
OPN 6
31.4
(25.3)
OPM10 a
OPN12
OPI9 a
Bağlantı grubu 7
Bağlantı grubu 8
117
Bağlantı grubu 9
EK 7. Italia çeşidinde LOD 4 ve 5 ve 25 cM maksimum uzaklık değerlerine göre
oluşan bağlantı grupları
OPO12c
20.3
(17.3)
OPC 20
16.8
(14.7)
OPI4c
5.3
(5.0)
OPC13 c
OPI4d
Bağlantı grubu1
Bağlantı grubu 2
OPM 10d
OPD 3a
10.0
(9.2)
21.6
(18.3)
OPD 4a
OPM 9
118
EK 8. Mercan üzüm çeşidinde LOD 4 ve 25 cM maksimum uzaklık değerlerinde
oluşan bağlantı grupları
Sc1082 b
OPK10 c
7.2
(6.8)
15.0
(13.3)
OPM2 a
25.6
(21.3)
OPM10 a
OPI9 a
Bağlantı grubu 1
Bağlantı grubu 2
Mercan üzüm çeşidinde LOD 5 ve 25 cM maksimum uzaklık değerlerinde oluşan
bağlantı grupları
OPM2 a
OPK10 c
7.5 (7.0)
sc1082 b
15.0
(13.3)
Bağlantı Grubu 1
OPM10 a
Bağlantı Grubu 2
119
EK 9. LOD 2, 4 ve 5 değerlerine göre Italia ve Mercan haritalarının karşılaştırılması
LOD 2
Toplam
Italia
Mercan
-
256 (217.6)
313.3 (255.5)
39
19
20
14.6 (12.1)
13.5 (11.5)
15.7 (12.8)
17
8
9
47.8 (39.6)
75.3 (56.4)
3
3
Toplam
Italia
Mercan
-
73.9 (64.5)
47.9 (41.3)
14
9
5
8.7 (7.6)
8.2 (7.2)
9.6 (8.3)
6
4
2
25.5 (22.3)
32.9 (28.0)
3
3
Kapsanan toplam uzaklık (cM)
Haritalanan markör sayısı
Markörler arası ortalama uzaklık (cM)
Bağlantı grubu sayısı
En geniş bağlantı grubu (cM)
En geniş bağlantı grubundaki markör
sayısı
LOD 4
Kapsanan toplam uzaklık (cM)
Haritalanan markör sayısı
Markörler arası ortalama uzaklık (cM)
Bağlantı grubu sayısı
En geniş bağlantı grubu (cM)
En geniş bağlantı grubundaki markör
sayısı
120
LOD 5
Toplam
Italia
Mercan
-
73.9 (64.5)
22.5 (20.3)
13
9
4
7.4 (6.5)
8.2 (7.2)
5.6 (5.1)
6
4
2
25.5 (22.3)
15.0 (13.3)
3
2
Kapsanan toplam uzaklık (cM)
Haritalanan markör sayısı
Markörler arası ortalama uzaklık (cM)
Bağlantı grubu sayısı
En geniş bağlantı grubu (cM)
En geniş bağlantı grubundaki markör
sayısı
121
EK 10. LOD 2 değerine göre bağlantı gruplarına yerleşen markörlerde yapılan binary
lojistik regresyon ve tek faktörlü Anova analiz sonuçları
Markör
Karakter
P (<0.05)
IOPI4c
Küllemeye
dayanım
Yaprak sapı
rengi
Çiçeklenme
zamanı
Yaprak şekli
0.013
IOPA11b
IOPC13c
IOPB4
0.050
0.014
IOPB12a
IOPB12a
Tanede aroma
0.040
IOPD3a
Yaprak formu
0.035
MOPE11
Çiçeklenme
zamanı
Tane şekli
birörnekliği
Çiçeklenme
zamanı
Çiçeklenme
zamanı
0.036
MOPK19c
MOPN6
MOPN12
1
0
1
0
1
0
1
0
0.037
Sürgün ucunda 0.038
antosiyanin
yoğunluğu
Yaprak formu 0.013
IOPM10d
Grup
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
0.047
0.023
0.009
Ort ± S.S.
5.669±2.743
7.354±2.743
2.108±0.393
2.400±0.507
2.469±0.915
1.800±0.632
3.038±0.720
Bağlantı
Grubu
2
3
4
5
4.750±0.676
4.161±1.128
2.042±0.806
1.417±0.776
1.143±0.916
2.375±0.378
2.067±0.868
1.417±0.669
2.625±0.833
2.000±0.816
1.750±0.436
1.167±0.408
2.645±0.839
2.050±0.826
2.667±0.777
1.944±0.873
6
8
1
6
9
LOD 4 ve 5 değerine göre bağlantı gruplarına yerleşen markörlerde yapılan binary
lojistik regresyon ve tek faktörlü Anova analiz sonuçları
Markör
Karakter
P (<0.05)
IOPI4c
Küllemeye
dayanım
Çiçeklenme
zamanı
Sürgün ucunda
antosiyanin
yoğunluğu
Yaprak formu
0.013
IOPC13c
IOPM10d
IOPD3a
Grup
1
0
1
0
0.050
0.038
1
0
0.035
1
0
122
Ort ± S.S.
5.669±2.743
7.354±2.743
2.469±0.915
1.800±0.632
4.750±0.676
4.161±1.128
2.067±0.868
1.417±0.669
Bağlantı
Grubu
1
2
3
4
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı: Zeliha YAŞA
Doğum Yeri: Ankara
Doğum Tarihi: 08.02.1972
Medeni Hali: Bekar
Yabancı Dili: İngilizce
Eğitim Durumu
Lise: Ankara Kurtuluş Lisesi 1989
Lisans: Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi 1989- 1993
Yüksek Lisans: University of California, Davis, CA, ABD. 1995-1998
Doktora: Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim
Dalı, 1999-2005.
Çalıştığı Kurum:
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi
Eylül 1998- Şubat 1999
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Mart 1999- devam
123
Download