GENETİK MARKÖRLER ve ANALİZ METODLARI

GENETİK MARKÖRLER ve
ANALİZ METODLARI
Markör
ü  Çalışılan organizmadaki ilgilenilen diğer özelliklerin
genetiği hakkında bilgi
ü  DNA nın aktif bölgelerinden veya herhangi bir genetik
kodlama fonksiyonuna sahip olmayan DNA dizilerinden
geliştirilebilirler.
Genetik Markör
ü Kalıtım şekilleri, morfolojik, biyokimyasal ve DNA
düzeyinde izlenebilen karakterlere denir.
Moleküler DNA markörleri tekniklerinin
bitki ıslahına entegrasyonu
n 
n 
n 
n 
n 
Arzulanan genlerin çeşitler veya türler
arasındaki hareketini hızlandırmış
Akraba yabani türlerden yeni genlerin
aktarılmasına izin vermiş
Kantitatif karakterlerin analizini mümkün
kılmış
Klonlama çalışmalarını kolaylaştırmış
Birbiriyle çaprazlanmayan bitkiler arasındaki
genetik ilişkileri açığa çıkarmıştır.
Genetik markörlerin kullanım
alanları
n 
n 
n 
n 
Genetik haritaların hazırlanması
Genetik parmak izi analizi
Doğrudan gen etiketlenmesi
Genlerin klonlanması
Genetik markörlerle ilgili
önemli kriterler
n 
n 
n 
n 
n 
n 
n 
Polimorfizm
Lokus sayısı
Haritalar arasında transfer edilebilme
Güvenilirlik
Eş baskınlık
Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenme
fenotipi etkileme
n 
n 
n 
n 
Bütün dokularda gözlenebilme
Allel sayısı
Otomasyona uygunluk
Genomdaki dağılım
Genetik Markör tipi ve analiz
metodları
n 
n 
Morfolojik markörler
Moleküler markörler
1. Protein markör
2. DNA markör
Morphological Marker
• Phenotypic markers
• Naked eye marker
hulled
naked
Black
white
Molecular markers
Resolution power
"   Sequencing (SNPs)
"   Microsatellites (SSRs)
"   Multi-locus fingerprints (RFLP)
"   AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism)
" 
RAPD
(random amplified polymorphic DNA)
" 
allozymes (protein-electrophoresis)
Proteins Markers
Alloenzim:
Birbirinden ayırt edilebilen allelleri
bulunan enzimleri ifade etmektedir.
Izoenzim:
Farklı genler tarafından
üretilen ancak birbirine çok
benzeyen enzimleri ifade
etmektedir.
DNA Markörleri
1 ccacgcgtcc gtgaggactt gcaagcgccg cggatggtgg gctctgtggc tgggaacatg 61 ctgctgcgag ccgcttggag gcgggcgtcg
ttggcggcta cctccttggc cctgggaagg 121 tcctcggtgc ccacccgggg actgcgcctg cgcgtgtaga tcatggcccc cattcgcctg 181
ttcactcaga ggcagaggca gtgctgcgac ctctctacat ggacgtacag gccaccactc 241 ctctggatcc cagagtgctt gatgccatgc
tcccatacct tgtcaactac tatgggaacc 301 ctcattctcg gactcatgca tatggctggg agagcgaggc agccatggaa cgtgctcgcc 361
agcaagtagc atctctgatt ggagctgatc ctcgggagat cattttcact agtggagcta 421 ctgagtccaa caacatagca attaaggtag
gaggagggat ggggatgttg tgtggccgac 481 agttgtgagg ggttgtggga agatggaagc cagaagcaaa aaagagggaa cctgacacta
541 tttctggctt cttgggttta gcgattagtg cccctctctc atttgaactc aactacccat 601 gtctccctag ttctttctct gcctttaaaa
aaaaatgtgt ggaggacagc tttgtggag
Gene A
DNA
M1
M2
MFG
Gene B
MFG
AACCTGAAAAGTTACCCTTTAAAGGCTTAAGGAA AAAGGGTTTAACCAAGGAATTCCATCGGGAATTCCG
DNA markörleri farklı genotiplere ait DNA nükleik asit diziliş
farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyan markörlerdir.
DNA Marker
1.  DNA melez markörleri
2.  PCR temeline dayalı markörler
DNA melez markörleri RFLP
Çeşitli şekillerde etiketlenmiş bir DNA parçasının
araştırılan bir DNA örneğindeki benzer veya aynı
dizilişteki DNA ya melezlenebilmesini baz almaktadır.
Dokulardan izole edilen genomik DNA nın nükleik asit
dizilişlerini tanıyan DNA kesim enzimlerince spesifik olarak
kesilmesi ve prob DNA melezlendiği DNA etrafındaki farklı
kesim yapılarının saptanması esasına dayanır.
DNA/DNA Hybridization
Denaturation
Elevated temperature
Restriction Fragment
Length Polymorphism
Known DNA sequence
RFLP techniques
RFLP Polymorphisms interpretation
1
2
3
4
5
6
MFG
1
2
3
4
5
6
Advantages and disadvantages
•  Avantaj
–  Türler arasında
transferler
mümkündür
–  Ko-dominant
–  Güvenilir
•  Dezavantajları
–  Zaman iş gücü
gerekli
–  Pahalı
–  radioactive probes
kullanımı
Polymerase Chain Reaction
DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlartda DNA
üretilmesini ifade etmektedir.
Çoğaltılan DNA agaroz jel
elektroforezinde yürütülür.
PCR Based markers
" 
Sequencing (SNPs)
"   Microsatellites (SSR)
"   AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism)
"   RAPD (random amplified polymorphic DNA)
RAPD Markers
DNA lar kullanılarak genom üzerinde rasgele
bölgelerin DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir.
n 
n 
n 
n 
n 
Reaksiyon şartlarının spesifik olmaması
rasgele çoğaltıma izin verir.
Bir başlatıcı kullanılır.
Kullanılan başlatıcının DNA üzerinde birbirine
iki yakın bölgeye yapışabildiği genom
bölgelerinin amplifikasyonu yapılır.
DNA agaroz jel elektroforezinde bazı
parçaların bazı genotipde üretilip bazılarında
üretilmediği gözlenir.
Bu işlem açılan bir populasyonda olursa
ebeveynlere ait üretim motiflerine bakarak
döllerin genotip analizi gerçekleştirilir.
RAPD
Avantaj:
ü Çok hızlı sonuç
ü Ucuz az iş gücü
ü Az miktar ve düşük kalitede DNA ihtiyaç
Dezavantaj:
ü  Güveniliriliği sınırlı
ü  Farklı lab da farklı
sonuç vermesi
ü  Dominant özellikteki
markör.
Sorgum yerli çeşitlerinin RAPD Polymorphisms
Sequences of 10mer
RAPD primers
RAPD gel configuration
Name
Sequence
OP A08
OP A15
OP A 17
M
OP A19
OP D02
5’ –GTGACGTAGG- 3’
5’ –TTCCGAACCC- 3’
5’ –GACCGCTTGT- 3’
5’ –CAAACGTCGG- 3’
5’ –GGACCCAACC- 3’
AFLP Markers
ü  RAPD tekniğinin dezavantajlarını gidermek için
geliştirilmiştir.
ü  Genomik DNA önce birisi altı diğeri 4 taban tanıyan iki
kesim enzimi tarafından kesilir.
ü  Kesilen parçaların ucuna nükleotid dizilişi sentetik olan
DNA’ lar eklenir.
ü  Eklenen sentetik DNA nın nükleotid dizilişini de taşıyan
başlatıcı DNA lar kullanımıyla nispeten spesifik DNA
çoğaltımı yapılır.
ü  Ilk aşamada her iki uçdan DNA kesim enzimlerinin
tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici
çoğaltimın yapıldığı ön üretim yapılır.
ü  Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların
kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikici ve
üçüncü nükleotidler için seçim yapılır.
ü  Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğu farklarını dahi
ayırt edebilen poliakrilamid jel elektroforezinde
AFLP Markers
ü Polimorfizm oranı çok yüksektir.
ü RFLP den daha hızlıdır
ü Parmak izi analizine uygundur.
ü Dominant markör verir..
ü Farklı genetik haritalar arasında
transferi güçtür.
SSR (Basit Dizi Tekrarları)
SSR veya mikrosatellitler ökaryotik genomlar boyunca
dağılmış bulunan ve ardışık olarak tekrarlanmakta olan
2-6 nükleotid gruplarından oluşmaktadır.
Sequence
ACTGTCGACACACACACACACGCTAGCT
TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
Primer
(AC)7
ACTGTCGACACACACACACACACGCTAGCT
TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
(AC)8
ACTGTCGACACACACACACACACACACGCTAGCT
TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
(AC)10
ACTGTCGACACACACACACACACACACACACGCTAGCT
TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
(AC)12
SSR polymorphisms
P1
AATCCGGACTAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTTAGCGAATTAGG
P2 AAGGTTATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTAGGCTAGGCG
P1
Gel configuration
P2
SSR primerlerinin üretiminde genel olarak 3 farklı
yaklaşım tercih edilmektedir.
ü  G e n o m i k D N A k ü t ü p h a n e l e r i n i n S S R
oligonükleotidleriyle hibridizasyonu yoluyla gözlenmesi
ü DNA veri bankalarından SSR ların araştırılması
ü Akraba bitki türlerinde geliştirilmiş olan SSR spesifik
primerlerinin kullanımıdır.
Avantaj:
SSR
ü Yüksek oranda polimorfik
ü Eş baskın markör
ü PCR kolaylığı
ü SSR lar bitki genomunda oldukça bol olup uniform
dağılıma sahiptir.
Dezavantaj:
ü  Yeni markörlerin
geliştirilmesinin güçlüğü
Genetic marker characteristics
Characteristics Morphological
markers
Protein
markers
RFLP
markers
RAPD
markers
SSR markers
Number of
loci
Limited
Limited
Almost
unlimited
Unlimited
High
Inheritance
Dominant
Codominant
Codominant
Dominant
Codominant
Positive
features
Visible
Easy to detect
Utilized before Quick assays
the latest
with many
technologies
markers
were available
Well
distributed
within the
genome, many
polymorphism
Negative
features
Possibly
negative
linkage to
other
characters
Possibly tissue
specific
Radioactivity
requirements,
rather
expensive
Long
development
of the
markers,
expensive
High basic
investment
Co-dominant marker
Gel configuration
P1
P2
O1
O2
Polymorphism
-Parent 1 : one band
-Parent 2 : a smaller band
-Offspring 1 : heterozygote = both bands
-Offspring 2 : homozygote parent 1
Dominant marker
Polymorphism
Gel configuration
Parent 1 : one band
P1
P2
O1
O2
-Parent 2 : no band
-Offspring 1 : homozygote parent 1
-Offspring 2 : ????
Desirable properties
ü 
ü 
ü 
ü 
ü 
ü 
ü 
Polymorphic
Co-dominant inheritance
Occurs throughout the genome
Reproducible
Easy, fast and cheap to detect
Selectivity neutral
High resolution with large number of samples