tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü farmasötik teknoloji ana

T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
FARMASÖTİK TEKNOLOJİ ANA BİLİM DALI
MUKOZAL YOLDAN UYGULANAN AŞI FORMÜLASYONLARININ
GELİŞTİRİLMESİ VE DEĞERLENDİRİLMESİ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Ecz. Meltem KAPLAN
Tez Danışmanı
Prof. Dr. Nevin ÇELEBİ
ANKARA
Mart 2014
T.e. GAzi ONivERSiTESi Saghk Bilimleri Enstitusu Farmasotik Teknoloji Ana Silim Dah Yuksek Lisans Programl
~er~evesinde yurutulmu~ olan bu ~ah~ma a~agldaki juri taraflndan
Yuksek Lisans Tezi olarak kabul edilmi~tir.
Tez Savunma Tarihi : 25/03/2014
in CELEBi
Gazi Oniversitesi Juri Ba~kanl Prof. Dr. imran VURAL
Hacettepe Oniversitesi
Gazi Oniversitesi
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay……………………………………………………………….… i
İçindekiler ................................................................................................. ii
Şekiller ..................................................................................................... ix
Resimler ................................................................................................ xiii
Tablolar .................................................................................................. xiv
Semboller, Kısaltmalar ......................................................................... xvi
1. GİRİŞ ..................................................................................................... 1
2. GENEL BİLGİLER................................................................................. 4
2.1. Genel Bağışıklık .................................................................................. 4
2.1.1. Bağışıklık Sistemi ............................................................................ 4
2.1.2. Bağışıklık Sisteminin Bileşenleri ...................................................... 5
2.1.2.1. Doğal Bağışıklık ............................................................................ 5
2.1.2.2. Kazanılmış Bağışıklık.................................................................... 6
2.1.2.3. Bağışıklık Sisteminin Hücreleri ..................................................... 6
2.1.2.3.1. Lenfositler: ................................................................................. 7
2.1.2.3.1.1. B lenfositler ............................................................................. 7
2.1.2.3.1.2. T lenfositler ............................................................................. 8
2.1.2.3.2. Antijen Sunucu Hücreler .......................................................... 10
2.1.2.3.2.1. Antijenin B ve T Lenfositler Tarafından Tanınması ............... 11
2.1.2.3.2.2. Doğal Öldürücü Hücreler (NK) .............................................. 12
2.1.2.3.2.3. Mononükleer (Tek Çekirdekli) Hücreler................................. 13
2.1.2.3.2.4. Granülositik Hücreler ............................................................ 14
2.1.2.3.2.5. Mast Hücreleri ....................................................................... 14
2.1.2.3.2.6. Dendritik Hücreler ................................................................. 14
2.1.2.4. Bağışıklık Sisteminin Organları ................................................... 15
2.1.2.4.1. Birincil Lenfoid Organlar........................................................... 15
2.1.2.4.2. İkincil Lenfoid Organlar ............................................................ 16
2.2. Mukozal Bağışıklık Sistemi ............................................................... 16
ii
2.2.1. Mukozal bağışıklık yanıtları............................................................ 17
2.2.2. Yaygın mukozal bağışıklık sistemi ................................................. 19
2.2.3. Gastrointestinal Yol ........................................................................ 21
2.2.4. Genital yol ...................................................................................... 22
2.2.5. Nazal bağışıklık sistemi ................................................................. 23
2.2.5.1. Burun .......................................................................................... 23
2.2.5.1.1. Nazal mukosiliyer arınma......................................................... 23
2.2.5.1.2. Nazal Boşluğun Fonksiyonel Özellikleri ve Geçirgenliği........... 24
2.2.6. Hayvanlarda ve insanlarda solunum yolundaki lenfoid yapılar....... 25
2.2.6.1. NALT (Burun Bağlantılı Lenfoid Doku) ........................................ 28
2.3. Mukozal Aşılama Yolları ................................................................... 29
2.3.1. Oral yoldan aşılama: ...................................................................... 30
2.3.1.1. Oral Aşılama için Kullanılan Yöntemler ....................................... 32
2.3.2. Vajinal yoldan aşılama ................................................................... 33
2.3.3. Rektal yoldan aşılama ................................................................... 35
2.3.4. Oküler yoldan aşılama ................................................................... 36
2.3.5. Nazal yoldan aşılama .................................................................... 37
2.3.5.1. Nazal aşılama için ilaç taşıyıcı sistemler ..................................... 38
2.3.5.1.1. Nanopartiküller ......................................................................... 38
2.3.5.1.1.1. Lipit yapılı nanotaşıyıcılar ..................................................... 39
2.3.5.1.1.1.1. Lipozomlar ......................................................................... 39
2.3.5.1.1.1.1.1. Virozom: .......................................................................... 48
2.3.5.1.1.1.2. Jel Çekirdekli Lipozomlar ................................................... 49
2.3.5.1.1.1.3. Kendi Kendine In Situ jelleşen Lipozom Sistem (LIGSLiposome in situ Gelling Systems) ........................................................... 50
2.3.5.1.1.1.4. Jel İçinde Lipozom : ........................................................... 51
2.3.5.1.1.2. Bağışıklık uyarıcı kompleksler (ISCOMs).............................. 52
2.3.5.1.1.3. Sentetik Biyomimetik Supramoleküler BiyovektörTM (SMBV TM)
................................................................................................................. 54
2.3.5.1.2. Polimerik Nanotaşıyıcılar: ........................................................ 55
2.3.5.1.2.1. Biyoparçalanabilir polyester nanopartiküller.......................... 55
iii
2.3.5.1.2.2. Lektinli polimerik nanopartiküller ........................................... 56
2.3.5.1.2.3. Polisakkarit Yapılı Nanopartiküller ........................................ 57
2.3.5.1.3. Biyoparçalanabilir mikropartiküller ........................................... 58
2.3.5.2. Mukozal Adjuvanlar .................................................................... 60
2.4. Ovalbumin......................................................................................... 62
3. GEREÇ VE YÖNTEM .......................................................................... 67
3.1. Gereç ................................................................................................ 67
3.1.1. Etkin Madde ................................................................................... 67
3.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler........................................................ 67
3.1.3. Kullanılan Biyolojik Maddeler: ........................................................ 68
3.1.4. Kullanılan Kitler .............................................................................. 69
3.1.5. Kullanılan Alet ve Malzemeler:....................................................... 69
3.2. Yöntem ............................................................................................. 70
3.2.1. Ovalbumin ile Yapılan in Vitro Çalışmalar ...................................... 70
3.2.1.1. Formülasyonlarda Kullanılan Ovalbumin Miktarının Belirlenmesi 70
3.2.1.2. FT-IR Spektrumu ........................................................................ 71
3.2.1.3. Formülasyonlarda Kullanılan Polimerler ve Yardımcı Maddelerle
OVA’in Etkileşimlerinin Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) ile
İncelenmesi ............................................................................................. 71
3.2.2. Jel Formülasyonlarının Geliştirilmesi için Ön Formülasyon
Çalışmaları .............................................................................................. 71
3.2.2.1. Kitozan Jel Formülasyon Çalışmaları ......................................... 72
3.2.2.1.1. Kitozan ile Hazırlanan Jel Formülasyonuna Ovalbumin
Yüklenmesi .............................................................................................. 75
3.2.2.2. Carbopol® 974P NF Jel Formülasyon Çalışmaları ..................... 75
3.2.2.2.1. Carbopol® 974P NF ile Hazırlanan Jel Formülasyonuna
Ovalbumin Yüklenmesi ............................................................................ 77
3.2.3. Jel Formülasyonlarında Yapılan Kontroller .................................... 77
3.2.3.1. Fiziksel Görünüm ........................................................................ 77
3.2.3.2. pH Ölçümü .................................................................................. 77
3.2.3.3. Akış Özellikleri ve Viskozite Ölçümü ........................................... 78
3.2.4. Lipozom Formülasyon Çalışmaları ................................................ 78
iv
3.2.4.1. Ekstrüksiyon İşlemi ile Lipozomların Partikül Büyüklüklerinin
Ayarlanması ............................................................................................. 81
3.2.4.2. Hazırlanan Lipozomların Karakterizasyonları ............................. 82
3.2.4.2.1. Partikül Büyüklüğü ve Dağılımı ................................................ 82
3.2.4.2.2. Lipozomların Zeta Potansiyellerinin Ölçülmesi ........................ 83
3.2.4.2.3. Lipozomların Yükleme Kapasitesinin Ölçülmesi ...................... 83
3.2.4.2.3.1. Bikinkoninik asit (BCA) Yöntemi* .......................................... 84
3.2.4.2.4. Lipozomların Işık Mikroskobu Görüntüleri ................................ 87
3.2.4.2.5. Lipozomların Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) ile
Görüntülenmesi* ...................................................................................... 87
3.2.4.2.6. Lipozomların Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile
Görüntülenmesi* ...................................................................................... 88
3.2.5. Jel-Lipozom Formülasyonlarının Hazırlanması .............................. 89
3.2.5.1. Jel Çekirdekli Lipozom Formülasyonlarının Geliştirilmesi için ÖnFormülasyon Çalışmaları ......................................................................... 89
3.2.5.2. Jel İçinde Lipozom (Jel Lipozom) Formülasyonları ..................... 90
3.2.5.3. Jel İçinde Lipozom Formülasyonlarının Karakterizasyonları ...... 91
3.2.6. SDS-PAGE Analizi* ....................................................................... 91
3.2.7. Hücre Yaşayabilirliği (Sitotoksisite) Çalışmaları* ........................... 96
3.2.7.1. Hücrelerin Çoğaltılması............................................................... 96
3.2.7.2. Sitotoksisitelerinin Araştırılması .................................................. 97
3.2.8. Fiziksel Stabilite Çalışmaları .......................................................... 98
3.2.9. Jel Formülasyonlarında Mukoadezyon Çalışmaları*: ..................... 99
3.2.10. Jel Formülasyonlarda Yapı Profil Analizi (Texture Profile Analysis)
............................................................................................................... 106
3.3. İstatistiki Hesaplamalar ................................................................... 110
4. BULGULAR....................................................................................... 111
4.1. Ovalbumin ile Yapılan in Vitro Çalışmalar ....................................... 111
4.1.1. FT-IR Spektrumuna Ait Bulgular .................................................. 111
4.1.2. Formülasyonlarda Kullanılan Polimerler ve Yardımcı Maddelerle
OVA’in Etkileşimlerinin Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) ile
İncelenmesine Ait Bulgular .................................................................... 112
v
4.2. Jel Formülasyonlarının Geliştirilmesi için Ön Formülasyon
Çalışmalarına Ait Bulgular ..................................................................... 115
4.2.1. Kitozan Jel Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular ................... 115
4.2.1.1. Fiziksel Görünüm ve pH Ölçümü .............................................. 115
4.2.1.2. Akış Özellikleri ve Viskozite Ölçümü ......................................... 117
4.2.2. Carbopol® 974P NF Jel Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular
............................................................................................................... 119
4.2.2.1. Fiziksel Görünüm ve pH Ölçümü .............................................. 119
4.2.2.2. Akış Özellikleri ve Viskozite Ölçümü ......................................... 120
4.2.2.3. Ovalbumin İçeren Jel Formülasyonlarının Karakterizasyon
Çalışmaları ............................................................................................ 121
4.2.3. Lipozom Formülasyonlarına Ait Bulgular ..................................... 123
4.2.3.1. Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyeli ..................................... 123
4.2.3.2. Lipozomların Yükleme Kapasitesinin Ölçülmesi ....................... 128
4.2.3.3. Lipozomların Işık Mikroskobu Görüntüleri ................................. 128
4.2.3.4. Lipozomların Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) Görüntüleri 130
4.2.3.5. Lipozomların Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Görüntüleri 132
4.2.4. Jel İçinde Lipozom Formülasyonlarının Karakterizasyonları ........ 135
4.2.5. SDS-PAGE Analizi Bulguları........................................................ 137
4.2.5.1. Jel Formülasyonlardaki Ovalbumin’in SDS-PAGE Analizi Bulguları
............................................................................................................... 137
4.2.5.2. Lipozom Formülasyonlardaki Ovalbumin’in SDS-PAGE Analizi
Bulguları ................................................................................................ 138
4.2.5.3. Jel İçinde Lipozom Formülasyonlardaki Ovalbumin’in SDS-PAGE
Analizi Bulguları ..................................................................................... 138
4.2.6. Hücre Yaşayabilirliği (Sitotoksisite) Bulguları ............................... 139
4.2.7. Fiziksel Stabilite Çalışmaları ........................................................ 140
4.2.7.1. Jel Formülasyonların Fiziksel Stabilite Çalışması Bulguları ...... 141
4.2.7.2. Lipozomların Fiziksel Stabilite Çalışması Bulguları ................... 143
4.2.8. Jel Formülasyonlarda Mukoadezyon Çalışmalarına ait Bulgular . 147
4.2.9. Jel Formülasyonlarda Yapı Profil Analizi (Texture Profile Analysis)
Bulguları ................................................................................................ 152
vi
5. TARTIŞMA ........................................................................................ 158
5.1. OVA ile Yapılan In Vitro Çalışmalar ................................................ 158
5.1.1. Ovalbumin’in FT-IR Spektrumuna Ait Bulguların Değerlendirilmesi
............................................................................................................... 158
5.1.2. Formülasyonlarda Kullanılan Polimerler ve Yardımcı Maddelerle
OVA’in Etkileşimlerinin DSC ile İncelenmesi ......................................... 159
5.2. Önformülasyon Çalışmaları ............................................................ 159
5.2.1. Kitozan Jel Formülasyonları......................................................... 159
5.2.2. Carbopol® 974P NF Jel Formülasyonları ..................................... 161
5.3. Ovalbumin İçeren Jel Formülasyonlarının Karakterizasyonu .......... 162
5.4. Lipozom Formülasyonları................................................................ 163
5.4.1. Lipozomların Hazırlanması ve Karakterizasyonu ......................... 164
5.4.2. Ovalbuminin Yükleme Kapasitesinin Değerlendirilmesi ............... 167
5.4.3. Lipozomların Işık Mikroskobu ile Görüntülerinin Değerlendirilmesi
............................................................................................................... 168
5.4.4. Lipozomların Geçirimli Elektron Mikroskobu ve Taramalı Elektron
Mikroskobu ile Görüntülerinin Değerlendirilmesi .................................... 168
5.5.
Jel
İçinde
Lipozom
(Jel-Lipozom)
Formülasyonlarının
Karakterizasyonları ................................................................................ 169
5.6. SDS-PAGE Analizi Bulgularının Değerlendirilmesi ......................... 170
5.7. Hücre Yaşayabilirliği (Sitotoksisite) Çalışmalarının Değerlendirilmesi
............................................................................................................... 172
5.8. Jel ve Lipozom Formülasyonlarının Fiziksel Stabilite Çalışması
Sonuçlarının Değerlendirilmesi .............................................................. 174
5.9. Jel Formülasyonlarda Mukoadezyon Bulgularının Değerlendirilmesi
............................................................................................................... 180
5.10. Jel Formülasyonlarda Yapı Profil Analizi (TPA) Bulgularının
Değerlendirilmesi ................................................................................... 181
6. SONUÇ .............................................................................................. 184
7. ÖZET ................................................................................................. 187
8. ABSTRACT ....................................................................................... 189
9. KAYNAKLAR .................................................................................... 191
10. EKLER ............................................................................................ 219
vii
11. TEŞEKKÜR ..................................................................................... 226
12. ÖZGEÇMİŞ...................................................................................... 229
viii
Şekiller
Şekil 1: insan bağışıklık sistemi ................................................................. 4
Şekil 2: Epitopların şematik gösterimi ...................................................... 12
Şekil 3: Makrofajların gelişimi .................................................................. 13
Şekil 4: Yaygın mukozal bağışıklık sistemi .............................................. 20
Şekil 5: İnsan Peyer plaklarının yapısal görünümü .................................. 21
Şekil 6: Tonsillerin Şematik Gösterimi ..................................................... 26
Şekil 7: NALT’ın bölümlerinin ve hücresel içeriğinin şematik gösterimi.... 28
Şekil 8: Mukozal aşılama yollarının şematik gösterimi ............................. 30
Şekil 9: Lipozomların şematik gösterimi................................................... 40
Şekil 10: Morfolojik özelliklerine göre lipozomlar...................................... 41
Şekil 11: Virozomun şematik görünüşü.................................................... 48
Şekil 12: SMBVTM’nin şematik gösterimi .................................................. 54
Şekil 13: Doğal Ovalbumin’in tersiyer yapısı ............................................ 63
Şekil 14: Lipozom hazırlanma yönteminin şematik gösterimi................... 80
Şekil 15: Mini Extruder (Avanti Polar Lipids®) .......................................... 81
Şekil 16: Lipozom örneklerinin TEM ölçümüne hazırlanışı ...................... 88
Şekil 17: Moleküler ağırlık belirleyicinin bileşimi (ThermoScientific -26681Blue protein Molecular weight marker) .................................................... 93
Şekil 18: Sertlik değerini gösteren tipik bir TPA grafiği .......................... 107
Şekil 19: Kırılganlık değerini gösteren tipik bir TPA grafiği .................... 107
Şekil 20: Adeziflik değerini gösteren tipik bir TPA grafiği ....................... 108
Şekil 21: Elastiklik değerini açıklayan tipik bir TPA grafiği ..................... 109
Şekil 22: Koheziflik değerini açıklayan tipik bir TPA grafiği .................... 109
Şekil 23: Dirençlilik değerini gösteren tipik bir TPA grafiği ..................... 110
Şekil 24: Ovalbumin FT-IR Spektrumu .................................................. 111
Şekil 25: Ovalbumin’e ait termogram ..................................................... 112
ix
Şekil 26: Ovalbuminin, kitozanın ve bunların fiziksel karışımlarının DSC
termogramı ............................................................................................ 113
Şekil 27: Ovalbuminin, Carbopol® 974P NF ’ün ve bunların fiziksel
karışımlarının DSC termogramı ............................................................. 113
Şekil 28: Ovalbuminin, yumurta fosfatidilkolinin ve bunların fiziksel
karışımlarının DSC termogramı ............................................................. 114
Şekil 29: Ovalbuminin, kolesterolün ve bunların fiziksel karışımlarının DSC
termogramı ............................................................................................ 114
Şekil 30: Kitozan ve glasiyel asetik asit içeren jel formülasyonlarının
25°C’deki akış reogramı ........................................................................ 118
Şekil 31: Ovalbumin içermeyen Carbopol® 974P NF ve trietanolamin
içeren jel formülasyonlarının 25°C’deki akış reogramı ........................... 120
Şekil 32: Ovalbumin içeren sonuç jel formülasyonlarına ait akış reogramı
(kayma gerilimi-kayma hızı) ................................................................... 122
Şekil 33: Ovalbumin içeren sonuç jel formülasyonlarına ait akış reogramı
............................................................................................................... 122
Şekil 34: OVA içermeyen lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası
partikül büyüklüğü dağılımları ................................................................ 124
Şekil 35: OVA içeren lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası partikül
büyüklüğü dağılımları............................................................................. 125
Şekil 36: OVA içermeyen lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası zeta
potansiyel grafikleri ................................................................................ 126
Şekil 37: OVA içeren lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası zeta
potansiyel grafikleri ................................................................................ 127
Şekil 38: BCA tayini kalibrasyon doğrusu ve denklemi .......................... 128
Şekil 39: Ovalbumin yüklenmemiş lipozom formülasyonunun ekstrüksiyon
öncesi ışık mikroskobu görüntüsü (x40) ................................................ 129
Şekil 40: Ovalbumin yüklenmiş lipozom formülasyonunun ekstrüksiyon
öncesi ışık mikroskobu görüntüsü (x40) ................................................ 129
x
Şekil 41: OVA içermeyen lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası
yüzey görüntüleri ................................................................................... 130
Şekil 42: OVA içeren lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası yüzey
görüntüleri .............................................................................................. 131
Şekil 43: Ovalbumin yüklenmemiş lipozom formülasyonunun ekstrüksiyon
öncesi ve sonrası SEM görüntüleri ........................................................ 133
Şekil 44: Ovalbumin yüklenmiş lipozom formülasyonunun ekstrüksiyon
öncesi ve sonrası SEM görüntüleri ........................................................ 134
Şekil 45: Ovalbumin içermeyen ve içeren jel içinde lipozom
formülasyonların 25°C’deki akış reogramları ......................................... 136
Şekil 46: Kitozan ve Carbopol® 974P NF jel formülasyonlarındaki
Ovalbumin’in SDS-PAGE analizi sonucu ............................................... 137
Şekil 47: Ovalbumin yüklenmiş lipozom formülasyonuna ait SDS-PAGE
analizi sonucu ........................................................................................ 138
Şekil 48: Ovalbumin yüklenmiş jel içinde lipozom formülasyonuna ait SDSPAGE analizi sonucu ............................................................................. 139
Şekil 49: Formülasyonların Calu-3 hücrelerinin yaşayabilirliğine etkisi .. 140
Şekil 50: OVA içermeyen lipozomun 4°C ve 25°C’taki 7 aylık partikül
büyüklüğü dağılımı grafiği ...................................................................... 145
Şekil 51: OVA içeren lipozomun 4°C ve 25°C’taki 7 aylık partikül
büyüklüğü dağılımı grafiği ...................................................................... 145
Şekil 52: OVA içermeyen lipozomun 4°C ve 25°C’taki 7 aylık zeta
potansiyeli grafiği ................................................................................... 146
Şekil 53: OVA içeren lipozomun 4°C ve 25°C’taki 7 aylık zeta potansiyeli
grafiği ..................................................................................................... 146
Şekil 54: KG12 jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği ................ 147
Şekil 55: OVA-KG12 jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği ....... 148
Şekil 56: CT4 jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği .................. 149
Şekil 57: OVA-CT4 jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği .......... 149
xi
Şekil 58: KL-OVA jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği ............ 150
Şekil 59: Jel formülasyonlara ait mukoadezif kuvvet grafiği ................... 151
Şekil 60: Jel formülasyonlara ait mukoadezif iş grafiği........................... 151
Şekil 61: Jellere ait sertlik grafiği............................................................ 153
Şekil 62: Jellere ait adeziflik grafiği ........................................................ 153
Şekil 63: Jellere ait koheziflik grafiği ...................................................... 154
Şekil 64: Jellere ait elastiklik grafiği ....................................................... 154
Şekil 65: KG12 jel formülasyonuna ait TPA grafiği ................................ 155
Şekil 66: OVA-KG12 jel formülasyonuna ait TPA grafiği........................ 156
Şekil 67: CT4 jel formülasyonuna ait TPA grafiği ................................... 156
Şekil 68: OVA-CT4 jel formülasyonuna ait TPA grafiği .......................... 157
Şekil 69: KL-OVA jel formülasyonuna ait TPA grafiği ............................ 157
xii
Resimler
Resim 1: Koyunun nazal mukozası (kemikten ayrılmadan) ................... 101
Resim 2: Koyunun nazal mukozası (kemikten ayrılırken) ...................... 102
Resim 3: Koyun burun mukozasının proba tutturulması ........................ 102
Resim 4: Mukoadezyon çalışması (prob jele değmeden) ...................... 104
Resim 5: TA.XTplus aleti ile mukoadezyon çalışması ........................... 105
xiii
Tablolar
Tablo 1: Dendritik Hücre Sistemi-Dağılımı ............................................... 15
Tablo 2: Oral olarak uygulanan uluslararası ruhsat almış aşılar .............. 31
Tablo 3: i.n. yoldan, lipozom formülasyonu uygulanarak yapılan bazı
çalışmalar ................................................................................................ 47
Tablo 4: Nazal yoldan ISCOM uygulanarak yapılan bazı çalışmalar ....... 53
Tablo 5: Nazal yoldan SMBVTM uygulanarak yapılan bazı çalışmalar ..... 55
Tablo 6: Nazal yoldan polisakkarit yapılı nanopartikül uygulanarak yapılan
bazı çalışmalar......................................................................................... 58
Tablo 7: OVA içermeyen kitozan-laktik asit jel formülasyonlarına ait önçalışma formülasyonları ........................................................................... 72
Tablo 8: OVA içermeyen Protasan-glasiyel asetik asit jel
formülasyonlarına ait ön çalışma formülasyonları .................................... 73
Tablo 9: OVA içermeyen kitozan-glasiyel asetik asit jel formülasyonlarına
ait ön-çalışma formülasyonları ................................................................. 74
Tablo 10: Ovalbumin içermeyen Carbopol® 974P NF-sodyum hidroksit jel
formülasyonlarına ait ön çalışmalar ......................................................... 76
Tablo 11: Ovalbumin içermeyen Carbopol® 974P NF-trietanolamin jel
formülasyonlarına ait ön çalışmalar ......................................................... 76
Tablo 12: Ovalbumin Standartlarının Hazırlanması ................................. 85
Tablo 13: Sitotoksisite çalışmasında kullanılan formülasyonlar ............... 98
Tablo 14: Fiziksel Çalışma Formülasyonları ............................................ 99
Tablo 15: Ovalbumine ait FT-IR spektrumu verileri................................ 111
Tablo 16: OVA içermeyen kitozan-laktik asit jel formülasyonlarına ait önçalışma formülasyonlarının karakterizasyonları ..................................... 115
Tablo 17: OVA içermeyen Protasan-glasiyel asetik asit jel
formülasyonlarına ait ön-çalışma formülasyonlarının karakterizasyonları
............................................................................................................... 116
xiv
Tablo 18: OVA içermeyen Kitozan-glasiyel asetik asit jel formülasyonlarına
ait ön-çalışma formülasyonlarının karakterizasyonları ........................... 117
Tablo 19: Ovalbumin içermeyen kitozan ve glasiyel asetik asit içeren jel
formülasyonlarının 10 rpm’deki viskozite değerleri ................................ 118
Tablo 20: OVA içermeyen Carbopol® 974P NF -sodyum hidroksit jel
formülasyonlarına ait ön-çalışma formülasyonlarının karakterizasyonları
............................................................................................................... 119
Tablo 21: OVA içermeyen Carbopol® 974P NF- trietanolamin jel
formülasyonlarına ait ön-çalışma formülasyonlarının karakterizasyonları
............................................................................................................... 120
Tablo 22: Carbopol® 974P NF ve trietanolamin içeren jel
formülasyonlarının 10 rpm’deki viskozite değerleri ................................ 121
Tablo 23: Ovalbumin içeren sonuç jel formülasyonlarına ait pH ve viskozite
değerleri ................................................................................................. 121
Tablo 24: Ovalbumin içermeyen ve içeren lipozom formülasyonlarının
partikül büyüklüğü ve zeta potansiyel değerleri ..................................... 123
Tablo 25: Jel içinde lipozom formülasyonların pH, viskozite ve görünümleri
............................................................................................................... 135
Tablo 26: KG12 ve OVA + KG12 jel formülasyonlarına ait fiziksel stabilite
sonuçları ................................................................................................ 141
Tablo 27: CT4 ve OVA + CT4 jel formülasyonlarına ait fiziksel stabilite
sonuçları ................................................................................................ 142
Tablo 28: KL ve KL + OVA jel formülasyonlarına ait fiziksel stabilite
sonuçları ................................................................................................ 143
Tablo 29: Ovalbumin içeren ve içermeyen lipozom formülasyonlarına ait
fiziksel stabilite çalışması sonuçları ....................................................... 144
Tablo 30: Jel formülasyonlarına ait mukoadezyon ölçümünün sonuçları 150
Tablo 31: Jel Formülasyonların mekanik özellikleri................................ 152
xv
Semboller, Kısaltmalar
AUC
Eğri altında kalan alan
BCA
Bikinkoninik asit
C
Konsantrasyon
chol
Kolesterol
CO2
Karbondioksit
Cu
Bakır
DD
Deasetilasyon derecesi
DSC
Diferansiyel Taramalı Kalorimetri
DMF
Dimetil formamid
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DSÖ
Dünya Sağlık Örgütü
EDTA
Etilen diamin tetra asetik asit
egg PC
Yumurta fosfatidil kolin
FBS
Fetal Bovine Serum (Fetal Sığır Serumu)
FT-IR
Fourier Transform Infrared Spektroskopisi
g
Gram
GAc
Glasiyel asetik asit
HCl
Hidroklorik asit
Ig
İmmünoglobulin
IL-2
İnterlökin-2
i.p.
intraperitoneal
kDa
Kilo Dalton
Kg
Kilogram
LİP
Lipozom
xvi
MTT
Metil Tiazol Tetrazolyum Bromür
MWM
Moleküler ağırlık belirleyici
MA
Molekül Ağırlık
µL
Mikrolitre
mPa
Mili Pascal
mV
Mili Volt
N
Newton
NaOH
Sodyum hidroksit
NTA3-DTDA
3-nitrilotriasetik asit-ditetradesilamin
pDNA
Plazmid DNA
PE-PEG2000
Fosfatidiletanolamin-(polietilen glikol)-2000
PLG
Poli (D, L-laktid-ko-glikolid)
POPC
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin
rpm
Dakikada devir sayısı
s
Saniye
SDS
Sodyum dodesil sülfat
SDS-PAGE
Sodyum dodesil sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi
SEM
Taramalı Elektron Mikroskobu
sIgA
Salgılayıcı immünoglobulin A
SS
Standart Sapma
TEM
Geçirimli Elektron Mikroskobu
TMC
N-trimetil kitozan
TPA
Texture Profile Analysis (Yapı Profil Analizi)
TT
Tetanoz Toksoidi
xvii
1. GİRİŞ
Mukozal yolla ilaç verilişi, son yıllarda parenteral yolla ilaç
verilişine kıyasla, ağrılı bir işlem olan enjeksiyonu ve uygulamak için
eğitimli bir sağlık personelini gerektirmemesi, sosyo-ekonomik düzeyi
düşük olan ülkelerde aynı enjektörün birden fazla kişide kullanılabilmesi,
bulaşıcı hastalıkları yayma riskinin mukozal uygulamada olmaması
nedenleriyle oldukça önem kazanmıştır. Bunlara ilaveten, enfeksiyöz
ajanlar vücuda mukozal yüzeylerden girdiği için, mukozal bağışıklık
yanıtları ilk savunma hattını oluşturur. Mukozal bölgelerdeki Mukoza
Bağlantılı Lenfoid Doku (MALT) gibi özgün bağışıklık yapıları ile yaygın
mukozal
bağışıklık
sistemi
kanalıyla
uzaktaki
bölgelerin
de
bağışıklanabilmesi ve mukozal IgA yanıtının yalnızca mukozal aşılama
yoluyla
oluşması
bu
yolla
aşı
uygulamasının
etkin
olabileceğini
düşündürmektedir.
Nazal mukoza, mukozal bağışıklık sisteminin önemli bir
yapısıdır. Bunun nedeni, burundan solunan antijenler için ilk temas noktası
olmasıdır.
Dolayısıyla
mikroorganizmaların,
burundan
yayılımlarının
önlenmesi mümkün olabilmektedir. Nazal yolun kılcal damarlarının fazla
olması, absorpsiyon yüzeyinin geniş olması, hem mukozal hem de
sistemik bağışıklık yanıtlarının oluşturulabilmesi açısından, nazal yol
aşılama için tercih edilmektedir. Ayrıca, nazal yoldan bağışıklama işlemi ile
yaygın mukozal bağışıklık sistemi nedeniyle uzaktaki mukozal bölgelerin
de bağışıklanması sağlanabilmektedir.
Yapılan bilimsel çalışmaların doğrultusunda, ticari olarak da
nazal aşılar geliştirilmiştir. İlk örnek olan nazal sprey formunda canlı
atenüe grip aşısı FluMist® (MedImmune, LLC) ticari markası ile 2003
1
yılında FDA tarafından onay almıştır. Faz I ve Faz II çalışmaları devam
eden nazal aşılar da bulunmaktadır.
Nazal aşılama amacıyla, mikroküreler, nanopartiküller, lipit
bazlı nanotaşıyıcılar (lipozom, ISCOM ve virozom) gibi ilaç taşıyıcı
sistemler kullanılmaktadır. Ayrıca, nazal mukozada etkin maddenin
(antijen) daha uzun sürede kalmasını sağlamak amacıyla da jel
formülasyonları geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu formülasyonlar içinde
biyolojik olarak parçalanabilmesi ve biyolojik olarak uyumlu olması, nazal
epiteldeki sıkı bağlanma yerlerini (tight junctions) açabilmesi ve bağışıklık
sistemini stimüle etmesi nedeniyle kitozan ve türevleri en çok tercih edilen
doğal polimerlerdir.
Tez çalışmamızda etkin madde olarak kullanılan ovalbumin,
model antijen olarak nazal aşı formülasyon çalışmalarında kullanılan bir
proteindir.
Yukarıdaki
bilgilerin
doğrultusunda
tez
çalışmamızın
amaçları:
a) Kitozan ve Carbopol® 974P NF polimerleri ile ovalbumin
içeren en uygun nazal jel formülasyonlarının hazırlanması ve
karakterizasyonları,
b) İlaç
taşıyıcı
sistem
olarak
ovalbumin
içeren
lipozom
formülasyonunun hazırlanması ve karakterizasyonu,
c) Lipozomun nazal mukozada kalış süresini arttırmak için en
uygun lipozom-jel formülasyonunun hazırlanması,
2
d) Jel,
lipozom
ve
lipozom-jel
formülasyonlarının
fiziksel
stabilitelerinin incelenmesi,
e) Ovalbumin içeren jel ve lipozom formülasyonlarının akciğer
adenokarsinoma hücreleri olan Calu-3 hücreleri üzerinde
sitotoksisitelerinin incelenmesi,
f) Ovalbuminin
jel
ve
lipozom
formülasyonlarındaki
bütünlüğünü koruyup korumadığının SDS-PAGE çalışmaları
ile gösterilmesi,
g) Ovalbumin içeren kitozan, Carbopol® 974P NF ve lipozom-jel
formülasyonlarının nazal mukozaya yapışabilme özelliğinin
ve mekanik özelliklerinin saptanmasıdır.
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Genel Bağışıklık
2.1.1. Bağışıklık Sistemi
Bağışıklık
sistemi,
omurgalıları
patojenik
mikroorganizmalardan ve kanserden korumak amacıyla gelişmiştir.
Sonsuz çeşitlilikteki yabancı istilacıları spesifik olarak tanıma ve yok etme
yeteneğine sahip çok çeşitli hücre ve molekül üretebilme kapasitesi vardır
(Şekil 1). Bu hücreler ve moleküller sinir sistemi ile yarışabilecek derecede
karmaşık bir ağ içinde birlikte çalışırlar.
Şekil 1: insan bağışıklık sistemi
1
4
Bir bağışıklık yanıtı işlevsel olarak; tanıma ve cevap olmak
üzere iki aşamadan oluşur2. Bağışıklık yanıtının en önemli özellikleri
kısaca aşağıda verilmiştir3:
• Yabancı antijenleri spesifik olarak tanıma ve bu antijenleri
taşıyan mikroorganizmaları yok etme,
• Büyük antijenik farklılıklara yüksek derecede özgüllük,
• Bağışıklık hafızası oluşturma kapasitesi,
• Vücudun kendi antijenlerine karşı toleranstır.
2.1.2.Bağışıklık Sisteminin Bileşenleri
2.1.2.1. Doğal Bağışıklık
Belirli bir patojene özel olmayan hastalığa karşı direnç
sağlayan mekanizmalardır. Makrofajlar gibi fagositik hücreler, doğal
bağışıklıkta önemli role sahiptir. Doğal bağışıklıkta çeşitli savunma
bariyerleri vardır. Bunlar1:
• Anatomik bariyerler: deri ve mukoz membranlar,
• Fizyolojik
Bariyerler:
sıcaklık,
düşük
pH,
kimyasal
mediyatörler,
• Fagositik/endositik bariyerler,
• Enflamatuvar bariyerlerdir.
5
2.1.2.2.Kazanılmış Bağışıklık
Belli bir patojene özgüldür ve önemli ölçüde hafıza özelliği
vardır. Antijene ilk kez maruz kaldıktan sonra 5-6 gün içinde kazanılmış
bağışıklık yanıtı oluşur. Aynı antijene tekrar maruz kalmak ise, hafıza
yanıtı ile sonuçlanır. İkinci yanıt birinciden daha hızlı, daha güçlü ve
patojeni nötralize etmede ve ortadan kaldırmada daha etkilidir. Kazanılmış
bağışıklığın temel hücreleri, lenfositler, antikorlar ve ürettikleri diğer
hücrelerdir.
Doğal bağışıklık ve kazanılmış bağışıklık ayrı ayrı değil,
birlikte çalışırlar ve tek başına olduğundan daha etkili yanıt oluştururlar.
Kazanılmış bağışıklık, belirli yabancı mikroorganizmaları ve
molekülleri seçici olarak tanıyıp, yok edebilir. Dört adet karakteristik
özelliği vardır4:
1) Antijene özgü olma,
2) Reseptör çeşitliliği,
3) Bağışıklık hafızası,
4) Kendine ait olanı ve olmayanı tanımadır.
Kazanılmış bağışıklık yanıtları; lenf düğümlerinde, dalakta ve
mukoza bağlantılı lenfoid dokuda üretilir 5.
2.1.2.3. Bağışıklık Sisteminin Hücreleri
Etkin bir bağışıklık yanıtı, iki temel hücre grubunu içerir:
6
• Lenfositler,
• Antijen sunucu hücrelerdir.
2.1.2.3.1. Lenfositler:
Kemik iliğinde hematopoez işlemi ile üretilen birçok beyaz
kan hücresinden biridir. Lenfositler, kemik iliğinden çıkar, kan ve lenfatik
sistemlerde dolaşır ve çeşitli lenfoid organlara yerleşir. Lenfositler antijen
bağlayıcı hücre yüzey reseptörleri üretip, sergileyebildikleri için, antijene
özgü olma, çeşitlilik, bağışıklık hafızası ve kendine ait olanı ve olmayanı
tanıma gibi bağışıklık özelliklerinin ortaya çıkmasına aracılık ederler6.
Lenfositler, üç gruba ayrılır2:
• B Lenfositler,
• T lenfositler,
• Doğal Öldürücü Hücreler (NK)’dir.
2.1.2.3.1.1. B lenfositler
B lenfositler, kemik iliğinde olgunlaşır, kemik iliğini terk
ettiklerinde her biri hücre zarında kendine özgü antijen bağlayıcı reseptör
taşır. B-hücre reseptörü, hücre zarına bağlı bir antikor molekülüdür.
Antikorlar glikoproteinlerdir. Bir antikor molekülü, iki aynı ağır polipeptit
zinciri ile iki aynı hafif polipeptit zincirinden oluşur. Bu polipeptit zincirleri,
disülfid bağları ile bir arada tutulur7.
7
Ağır zincirdeki sabit bölgenin aminoasit dizilimi beş adet
immünoglobulin sınıfını (IgG, IgA, IgM, IgD ve IgE), dört adet IgG ve iki
adet de IgA alt sınıfını belirler. Bu sınıf ve alt sınıfların farklı fonksiyonları
vardır8.
Olgunlaşmamış bir B hücresi, daha önce hiç karşılaşmadığı,
hücre zarına bağlı antikor ile eşleşebilen antijenle ilk kez karşılaştığında,
antijenin antikora bağlanması B-hücresinin hızla bölünmesini sağlar.
Böylece hafıza B hücreleri ve efektör B hücreleri (plazma hücreler) oluşur.
Hafıza B hücrelerinin ömrü, olgunlaşmamış hücrelerden
daha fazladır. Ana olgunlaşmamış hücredeki zara bağlı antikorun aynısını
ömür boyu sergilerler.
Plazma hücreleri ise, zara bağlı antikoru sergilemez, bunun
yerine salgılanabilir formda antikor üretirler. Plazma hücreleri, yalnızca
birkaç gün yaşayabilmelerine karşın, bu süre boyunca çok fazla miktarda
antikor salgılarlar. Salgılanan antikorlar, humoral bağışıklığın ana efektör
(etkileyici) molekülleridir9.
2.1.2.3.1.2. T lenfositler
T lenfositler adını olgunlaşma yeri olan timustan alırlar. T
lenfositler de kemik iliğinde oluşur.
Kemik iliğinde olgunlaşan B-
hücrelerinden farklı olarak T-hücreleri, olgunlaşmak için timüs bezine
giderler2,10. Timusta olgunlaşması sırasında, T-hücresi zarında, T-hücre
reseptörü isimli kendine özgü bir antijen bağlayıcı molekül sergiler. Antijeni
tek başına tanıyabilen B-hücrelerindeki zara bağlı antikorların aksine T-
8
hücre reseptörleri sadece majör histokompatibilite kompleksi (MHC) isimli
hücre zarı proteinlerine bağlı antijeni tanıyabilirler. “Antijen sunumu” isimli
bu tanıma olayında rol alan MHC molekülleri hücre zarlarında bulunurlar
ve polimorfiktirler yani genetik çeşitlilikleri fazladır. İki tip MHC molekülü
vardır9:
1) Sınıf I MHC molekülü: Neredeyse tüm çekirdekli hücrelerin
zarında bulunur.
2) Sınıf II MHC molekülü: Sadece antijen sunucu hücreler
tarafından sergilenir.
Olgunlaşmamış bir T-hücresi, bir hücredeki MHC molekülüne
bağlı antijen ile karşılaştığında, T-hücresi çoğalır ve hafıza T-hücrelerine
ve çeşitli efektör T-hücrelerine farklılaşır2.
T hücrelerinin iki alt-tipi vardır11:
1) T-yardımcı hücreler (Th): Yüzeylerinde CD4 hücre zarı
glikoproteinleri
bulundurur.
CD4
+
T
hücreleri
de
salgıladıkları sitokinlere göre Th1 ve Th2 olmak üzere iki
gruba ayrılır.
2) T-sitotoksik hücreler (Tc): Yüzeylerinde CD8 hücre zarı
glikoproteinleri bulundurur.
Bir Th hücre, antijen-MHC sınıf II molekül kompleksini
tanıyarak etkileştiğinde, Th-hücresi aktive olur ve sitokinler olarak
adlandırılan çeşitli büyüme faktörlerini salgılayan efektör hücreler haline
gelir.
Salgılanan sitokinler, B hücrelerini, T hücrelerini, makrofajları ve
9
bağışıklık yanıtında rol alan diğer hücreleri aktive etmede önemli role
sahiptir. Aktive olan Th hücreleri tarafından üretilen sitokinlerin çeşitliliği
farklı tipte bağışıklık yanıtları ile sonuçlanır12.
Th hücresinden kaynaklanan sitokinlerin etkisiyle, antijenMHC sınıf I molekül kompleksini tanıyan Tc hücresi, çoğalır ve sitotoksik T
lenfosit (CTL) isimli efektör hücreye farklılaşır.
Th hücreden farklı olarak, CTL çoğunlukla sitokin salgılamak
yerine sitotoksik aktivite gösterir.
CTL, vücuttaki hücreleri izleme ve
virüsle enfekte hücreler, tümör hücreleri, yabancı doku graft hücreleri gibi
antijen sunan hücreleri yok etme görevleriyle yaşamsal fonksiyona
sahiptir2.
2.1.2.3.2. Antijen Sunucu Hücreler
Bağışıklık sisteminin humoral ve hücre aracılı kollarının
aktivasyonu Th hücreler tarafından üretilen sitokinleri gerektirir.
Th hücreler, sadece antijen sunucu hücrelerin yüzeyindeki
MHC sınıf II molekülleri ile birlikte sunulan antijeni tanırlar. Antijen sunucu
hücreler; makrofajlar, B lenfositler ve dendritik hücrelerdir.
Antijen sunucu hücre öncelikle fagositozla ya da endositozla
antijeni içine alır. Ardından bu antijenin bir parçasını hücre zarında sergiler
ve Sınıf II MHC molekülüne bağlanır13.
10
2.1.2.3.2.1. Antijenin B ve T Lenfositler Tarafından Tanınması
Bağışıklık sistemi tarafından antijenin tanınmasından dört
hücre zarı molekülü sorumludur 5:
1) B hücrelerindeki zara bağlı antikorlar,
2) T hücre reseptörleri,
3) Sınıf I MHC molekülleri,
4) Sınıf II MHC molekülleridir.
Lenfositlerdeki reseptörler tarafından tanınan moleküllere
genel olarak antijen adı verilir. Antijenler, küçük kimyasal yapılardan,
büyük ölçüde kompleks moleküllere kadar farklı yapılarda olabilir 5.
Bağışıklık yanıtı oluşturan antijenlere immünojen denir. Tüm
antijenler doğal olarak immünojenik değildir. Küçük ve immünojenik
olmayan
antijenlere
hapten
denir.
Bunların
bağışıklık
yanıtı
oluşturabilmeleri için taşıyıcı isimli daha büyük immünojenik moleküllere
bağlanabilmeleri gerekir 5.
Karbonhidrat
yapısındaki
antijenlerin
ise
immünojenik
olabilmeleri için proteinlere bağlanmaları gerekir (Haemophilus influenzae
tip B aşısındaki polisakkarit yapısındaki antijenler gibi )5. Genellikle büyük
ve karmaşık yapıda olan antijenler lenfositler tarafından bütünüyle
tanınmazlar2. Zira, hem T hücre hem de B hücre reseptörleri 600 ila 1700
A°’luk bağlanma bölgesine sahiptir5.
Bunun yerine hem B hem de T
lenfositler, antijenik determinant ya da epitop denilen antijendeki belirli
11
bölgeleri tanırlar. Epitoplar, B ve T hücre reseptörlerine bağlanan karmaşık
bir antijendeki immünolojik aktif bölgelerdir2 (Şekil 2).
Şekil 2: Epitopların şematik gösterimi
5
2.1.2.3.2.2. Doğal Öldürücü Hücreler (NK)
Büyük, granüler lenfositlerden oluşur. B ve T hücreleri gibi
yüzey reseptörleri taşımaz. İmmünoglobulin sentezleyemez. Antijen
bağlayıcı reseptör (Ig) sentezleyemediklerinden bağışıklık için özgünlük ve
hafıza özellikleri yoktur. İnsan periferal kanındaki lenfositlerin % 10-15’ini
oluşturur. Doğal Öldürücü Hücreler, tümör hücrelerine karşı ve bazı
virüslerle enfekte hücrelere karşı konağın savunmasında önemlidir14.
12
2.1.2.3.2.3.Mononükleer (Tek Çekirdekli) Hücreler
Mononükleer fagositik sistem, kanda dolaşan monositler ve
dokulardaki makrofajlardan oluşur. Kemik iliğindeki hematopoez sırasında,
granülosit-monosit
projenitör
hücreleri
promonositlere
dönüşür.
Promonositler kemik iliğinden ayrılarak kana girer. Burada olgun
monositlere dönüşür. Monositler kandaki 8 saatlik dolaşımları süresince
çoğalırlar ve dokulara göç ederler ve burada dokuya özgü makrofajlara
dönüşürler15 (Şekil 3).
Şekil 3: Makrofajların gelişimi
16
13
2.1.2.3.2.4. Granülositik Hücreler
Granülositler,
hücresel
morfolojilerine
ve
sitoplazmik
boyanma özelliklerine göre nötrofiller, eozinofiller ve bazofiller olmak üzere
üçe ayrılır9.
2.1.2.3.2.5. Mast Hücreleri
Mast hücre prekürsörleri, kemik iliğinde hematopoez ile
oluşturulur. Kana farklılaşmamış hücreler olarak salınır, kanı terk edip
dokulara girene kadar farklılaşmazlar. Mast hücreleri, deri, çeşitli
organların bağ dokuları, solunum, genitoüriner ve sindirim yollarının
mukozaepitelyal dokuları gibi çok çeşitli organlarda bulunabilir.
Dolaşımdaki bazofiller gibi, bu hücrelerin sitoplazmasındaki
tanecikler histamin ve diğer farmakolojik aktif maddeler içerirler. Mast
hücreleri, kan bazofilleri ile birlikte alerjilerin gelişiminde önemli rol alır 17.
2.1.2.3.2.6. Dendritik Hücreler
Dendritik hücreler hem lenfoid hem de lenfoid olmayan
organları kapsayan bir sistemdir. Tablo 1’de dendritik hücre sistemi
dağılımı görülmektedir.
14
Tablo 1: Dendritik Hücre Sistemi-Dağılımı
Lenfoid Olmayan Organlarda
18
Langerhans hücreleri, interstisiyel
dendritik hücreler
Dolaşımda
Getirici lenfteki ve kandaki dendritik
hücreler
Lenfoid dendritik hücreler, bağlayıcı
Lenfoid Organlarda
(interdigitating) dendritik hücreler
Diğer antijen sunucu hücrelerden farklı olarak üç belirgin
fonsiyonu vardır18:
1) Antijenlerin yakalanması ve sunulması,
2) Lenfoid organların T hücre bağımlı bölgelerine göç edilmesi
ve antijene özgü T hücrelerine bağlanma,
3) T hücre çoğalmasının ve işlevinin indüklenmesini sağlayan
aktivasyon rolüdür.
2.1.2.4. Bağışıklık Sisteminin Organları
Bağışıklık sistemi, vücudun tamamında bulunabilen pek çok
farklı doku ve organdan oluşur. Bu organlar, fonksiyonel olarak iki ana
gruba ayrılır:
2.1.2.4.1. Birincil Lenfoid Organlar
Lenfositlerin
gelişmesi
ve
olgunlaşması
için
uygun
mikroçevre sunarlar. Lenfositlerin olgunlaşma yeri olan timus ve kemik iliği
birincil (merkezi) lenfoid organlardır.
15
2.1.2.4.2. İkincil Lenfoid Organlar
Lenf düğümleri ve dalak en iyi düzenlenmiş ikincil lenfoid
organlardır. Lenfoid foliküller ile T hücre ve B hücre aktivitesi için ayrılmış
bölgelerden oluşurlar. Lifli bir kapsülle çevrelenmişlerdir19.
2.2. Mukozal Bağışıklık Sistemi
Sadece
mukozal
aşılamanın
ardından
lokal
antikorlar
salındığı için mukozal yüzeylerden yayılmaları sırasında patojenleri
nötralize etmek daha etkili bir bağışıklama yolu olarak düşünülmektedir20.
Solunum, sindirim, ürogenital yollar, gözün konjonktivası, iç
kulak, tüm dış salgı bezi kanallarını kaplayan mukoz membranlar birçok
yabancı maddeyi parçalayan güçlü mekanik ve kimyasal temizleme
mekanizmalarına sahiptir. Buna ilaveten, büyük ve yüksek derecede
özelleşmiş doğuştan ve kazanılmış mukozal bağışıklık sistemi bu yüzeyleri
korur. Sağlıklı bir yetişkinde bu lokal bağışıklık sistemi tüm immünositlerin
yaklaşık % 80’ini oluşturur. Bu hücreler çeşitli mukoza bağlantılı lenfoid
dokularda (MALT) toplanır ya da bu dokular arası geçiş yapar ve MALT ile
birlikte en büyük memeli lenfoid organ sistemini oluşturur20.
Mukozal
bağışıklık
sisteminin
üç
ana
fonksiyonu
tehlikeli
mikropların
bulunmaktadır20:
1) Mukozal
membranları
potansiyel
kolonizasyonundan ya da istilasından korumak,
16
2) Sindirilmiş besinden, havadan kaynaklanan maddeden,
ortakçı
proteinleri
mikroorganizmalardan
içeren
kaynaklanan
parçalanmamış
antijenlerin
yabancı
alımını
önlemek,
3) Bu antijenler eğer vücut içine girebilirlerse, olası zararlı
bağışıklık yanıtlarını önlemektir.
Mukozal bağışıklık sistemi, steril ortamda fonksiyon gösteren
ve istilacılara şiddetle yanıt veren sistemik bağışıklık aygıtından farklı
olarak yabancı madde ile dolu organları korur20.
2.2.1. Mukozal bağışıklık yanıtları
Mukoza bağlantılı lenfoid doku (MALT) yüksek derecede
kompartmanlaşmış bağışıklık sistemini temsil eder ve sistemik immün
yapıdan bağımsız olarak işlev yapar20.
Anatomik
olarak
belirlenmiş
lenfoid
kompartmanlardan
oluşur:
• Peyer plakları,
• Mezenterik lenf nodları,
• Apandisit,
• İnce barsaktaki tek foliküller,
• Tonsiller,
• Adenoidler’dir.
17
Bunlar bağışıklık yanıtın başlatıldığı ana mukozal indükleyici
bölgelerdir21.
MALT,
mukozal
organların
ve
dış
salgı
bezlerinin
parankimasındaki çok sayıda lenfoid hücrenin toplandığı yerdir. Bu da
bağışıklık cevabının ortaya çıktığı mukozal efektör bölgeleri oluşturur.
Sistemik lenfoid dokulara oranla MALT daha fazla kompartmanlaşması ile
tutarlı olarak fenotipik ve fonksiyonel olarak farklı B ve T hücreleri ve ek
hücre alt popülasyonlarına sahiptir ve mukozal bölgeler arasında lenfoid
hücre yeniden dolaşımına karşı güçlü kısıtlamalar bulunmaktadır20.
Memelilerin mukozal immün sisteminin çeşitli görevleri vardır:
• Mukozal epitelde istilacı patojenlerin ve inhale edilen
antijenlerin kolonizasyonunu önlemek,
• Makromoleküler absorpsiyona bariyer oluşturmak22,
• Antijeni yakalama mekanizmasının olması22,23,
• Salgılayıcı IgA antikorlarının üretiminin olması22, 24,25,
• Efektör T ve B hücrelerinin lokal ve uzaktaki mukozal
bölgelere dağılımı26,
• İnhale edilen antijenlere karşı zararlı allerjik immün yanıtlara
karşı tolerans mekanizması’dır22,24.
Vücutta en fazla sentez edilen izotip olan s-IgA, mukozal
yüzeylerin savunmasında aşağıdaki nedenlerden dolayı önemlidir:
• Mukozayı korumak için uygun olmasını sağlayan bir özelliği
endojen proteaz aktivitesine dirençli olmasıdır.
18
• Bakteri ya da virüs gibi patojenlere karşı koruma sağlar.
• Mikrobiyal toksinleri nötralize eder.
• Çapraz bağışıklık ve kitlesel koruma sağlar.
Bu
fonksiyonlar,
s-IgA’nın
mukusa
yüksek
afinite
ile
bağlanmasıyla kolaylaşır23.
Etkili mukozal bağışıklık yanıtlarının indüksiyonu için Thücrelerinin aktivasyonu çok önemlidir.
T-hücrelerinin
mukozal
bağışıklık
yanıtlarının
ortaya
çıkmasındaki işlevleri şunlardır:
• B-hücrelerinin IgA üreten hücrelere dönüşümüne yardım
eder.
• Mukozal
bağışıklamanın
her
yönünde
yardımcı
olan
sitokinlerin ve kemokinlerin salımını sağlar24.
• Viral enfeksiyonlardan arınmada yardımcı olur22.
2.2.2. Yaygın mukozal bağışıklık sistemi
Başlangıç duyarlılaştırmasından sonra antijene spesifik B
lenfositler ve T lenfositler nazal bağlantılı lenfoid doku (NALT)’tan bölgesel
lenf nodlarına göç ederler ve lenf yoluyla dolaşıma katılırlar. Buradan da
solunum, gastrointestinal, üreme sistemi ve salgı dokuları (gözyaşı, tükrük,
süt bezleri)’nın lamina propria’sı gibi bağışıklık yanıtlarının ortaya çıktığı
uzaktaki mukozal efektör bölgelere giderler. İndüktif bölgelerden efektör
19
bölgelere kadar olan bu hücre dağılımına yaygın mukozal bağışıklık
sistemi denir22,27 (Şekil 4).
Şekil 4: Yaygın mukozal bağışıklık sistemi
26
20
2.2.3. Gastrointestinal Yol
Gastrointestinal sistemin organize Mukoza Bağlantılı Lenfoid
Doku’su (MALT), Gut Bağlantılı Lenforetiküler Doku (GALT)’dur28. GALT,
daha az organize yapılar olan lamina propria, intraepitelyal lenfositler ile
daha organize yapılar olan, mezenterik lenfoid düğümler, Peyer plakları,
izole lenfoid foliküllerden oluşur.
Bağırsaklarda, üzerinde en fazla çalışma yapılan ikincil
lenfoid organ, Peyer Plaklarıdır29 (Şekil 5). Peyer plakları, ilk kez 1687
yılında de Peyer tarafından tanımlanmıştır. Peyer plakları, bağırsak
duvarındaki özelleşmiş lenf düğümleridir. Peyer plaklarında getirici
(afferent) lenfatik damarlar yoktur, bunun yerine, üzeri özelleşmiş
epitelyum ile kaplı olduğundan, bu epitelyum yardımıyla bağırsak
lümenindeki antijenlerin, lenfoid bölgelere taşınmasını sağlar.
Şekil 5: İnsan Peyer plaklarının yapısal görünümü
30
21
Foliküllerin
üzerini
örten
bu
epitele,
folikül
bağlantılı
epitelyum (FAE) adı verilir. Bu epitelyum villi isimli çıkıntı içermez ve çok
az goblet hücresi içerir30. Bu epitelde M hücreleri adı verilen özelleşmiş
yüzey epitel hücreleri bulunur. M hücreleri, bağırsak lümeninden
makromoleküllerin alınmasını sağlar31. Dolayısıyla, M hücreleri mukozal
bağışıklık sistemine giriş kapısı gibidir. Bu hücreler, izole lenfoid foliküller,
apandisit ve gastrointestinal yolun dışındaki MALT bölgelerinde de
bulunur32. Geniş, intraepitelyal cepleri, B hücreleri, CD4 + T lenfositleri,
makrofajlar ve dendritik hücrelerle doludur33. Bu nedenle, antijenlerin ve
mikroorganizmaların
M
hücrelerinden
geçişi
mukozal
bağışıklık
yanıtlarının oluşumunda önemli bir adımdır. Lamina propria’nın en önemli
efektör görevi öncelikle IgA olmak üzere antikorların salgılanmasıdır.
Bunun yanı sıra çok sayıda CD4 + T ve CD8 + T lenfositleri ile çoğunlukla
IgM sunan B lenfositleri, makrofajlar, dendritik hücreler, eozinofiller, mast
hücreleri, nötrofiller içerir. Gastrointestinal kanal, vücutta en fazla sabit
makrofajın olduğu yerdir 19.
2.2.4. Genital yol
İnsanların genital yolundaki humoral bağışıklık kompartmanı
diğer mukozal bağışıklık sistemi kompartmanlarına göre eşsizdir ve
fonksiyonel olarak farklıdır34. Bunun nedeni, jerminal (germinal) merkez
hücreleri, spermatozoa ve fetuse karşı tolerans ile mikropların tanınması
arasında bir dengenin gerekliliğidir 28.
Baskın izotipi salgılayıcı IgA olan tükürük, gözyaşı, süt ve
bağırsaktaki sıvıların tersine insanlardaki servikal mukusta IgG, IgA’dan
daha fazladır35.
22
Hem erkek hem de kadın genital yol dokuları, bağırsaklardaki
Peyer plaklarda olduğu gibi bağışıklık yanıtının uyarıldığı bölgeleri
içermezler. Bunun sonucunda enfeksiyonlarla uyarılan lokal humoral ve
hücresel bağışıklık yanıtları ya hiç yoktur ya da çok zayıftır. Lokal
intravajinal bağışıklama ile çok az humoral yanıt oluşur34. Bu nedenle
genital yolda bağışıklık yanıtı oluşturmak amacıyla yaygın mukozal
bağışıklık sistemi kullanılır.
Yapılan birçok çalışmada genital yolda bağışıklık yanıtı
oluşturmak için intranazal bağışıklama kullanılmıştır 36-41.
2.2.5. Nazal bağışıklık sistemi
2.2.5.1. Burun
Koku alma, hissetme, mukosiliyer arınma, havadan gelen
partikülleri süzme, giren havayı ısıtma ve nemlendirme gibi fonksiyonlara
sahiptir 42.
2.2.5.1.1. Nazal mukosiliyer arınma
Nazal mukosiliyer arınma, sağlık için ve burnun savunması
için önemli bir fonksiyondur. Mukus, hava kaynaklı partikülleri ve endojen
ürünleri yakalar. Dinlenme halinde iken günde mukozanın cm2’si başına
0,5-1 mL mukus üretilmektedir43.
Nazal mukosiliyer arınmayı etkileyen faktörler aşağıda
verilmiştir:
23
• Silia’nın
Haemophilus
influenzae,
Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas gibi
bakteri ve virüslerle tahrip edilmesi 44,
• Enfeksiyon
bölgelerinde
toplanan
nötrofiller
tarafından
solunum epiteli için toksik olan elastazın üretilmesi45,
• Soğuk algınlığına neden olan virüsler, silia hücresinin
mikrotübüllerini
tahrip
eder,
bunun
sonucunda
mukoz
bezlerde mukus birikimi olur bu da silianın mukusu transferini
zorlaştırır 44.
Nazal salgıların bağışıklık savunmasındaki önemleri, IgA,
IgG, IgM, IgE gibi immunoglobulinleri, lizozim, laktoferrin gibi enzimleri,
kompleman
gibi
koruyucu
proteinleri,
nötrofilleri
ve
lenfositleri
içermelerinden kaynaklanır 42,43.
2.2.5.1.2. Nazal Boşluğun Fonksiyonel Özellikleri ve Geçirgenliği
Nazal damar ağı, nazal boşluğun, koku alma, havayı ısıtma
ve nemlendirme, mukosiliyer arınma, bağışıklık gibi fonksiyonlarını
sağlamak üzere yüksek ölçüde kanlanmaktadır. Burun boşluğunda hücre
başına yaklaşık 400 mikrovili olduğu için, burun boşluğu 150-160 cm2 gibi
büyük bir yüzey alanına sahiptir. Normal fizyolojik koşullar altında nazal
salgıların toplam hacmi günde 15 mL’dir. Tüm bu faktörler, ilaçların nazal
mukozadan büyük oranda ve hızla geçmelerini sağlar.
Nazal boşluk pH’sı yetişkinlerde 5.5-6.5 arasında iken,
çocuklarda 5.0-7.0 arasındadır46.
24
2.2.6. Hayvanlarda ve insanlarda solunum yolundaki lenfoid yapılar
Memelilerin üst solunum yolunda antijen alım prosesi ve
mukozal immün yanıtın indüksiyonu için sunumunu artıracak gelişmiş
organize ikincil lenfoid dokuları bulunmaktadır. Sıçanlar, tavşanlar, fareler
ve kobayların bronşiyal duvarında lenfoid agregatlar vardır (İnce
barsaktaki Peyer plaklarına benzer). Ancak kedi, domuz ve insanlarda
daha az organize agregat bulunmaktadır.
Farelerde yapılan çalışmalara göre üst ve alt solunum
yolunun bağışıklık sistemi üç kısma ayrılır27:
1) Epitelyumun
üzerinde
bir
epitelyal
kompartman
ve
immünokompetan hücreleri içeren altta yatan bağ dokusu,
2) Burun ve bronş bağlantılı epiteldeki lenfoid yapılar (NALT,
BALT), larinks bağlantılı lenfoid doku (LALT),
3) Solunum
sistemindeki
lenf
sıvısını
toplayan
lenf
düğümleri’dir.
Solunum yolundaki epitelyal bariyer dört farklı hücre tipi
içerir27:
1) Alveolar makrofajlar,
2) Dendritik hücreler,
3) M hücreleri (lenfoid yapılarla bağlantılıdır-MALT-mukoza ile
bağlantılı lenfoid doku),
4) Epitel içi lenfositler (Gastrointestinal yoldan farklı olarak
solunum yolunda sınırlıdır)’dir.
25
İnsan farinksinde lenfoid dokuların varlığı 1884 yılında
Waldeyer
tarafından
gösterilmiştir.
Waldeyer
halkası
(Şekil
6);
nazofarengeal tonsiller ya da adenoidler, bir çift palatin tonsil, bir çift tubal
tonsil ve lingual tonsilden oluşan doku halkasıdır47.
Şekil 6: Tonsillerin Şematik Gösterimi
47
Tonsiller, lenfoid hücrelerin agregatlarını içerir ve ince
barsaklardaki Peyer plaklarına benzerler. Waldeyer halkası, çocuklukta
çok iyi gelişir ancak adölesanlıkla birlikte kaybolmaya başlar 27.
Palatin ve nazo faringeal tonsillerin, immün düzenlenme ve
koruma işleminde sürekli bir rolleri vardır. Orofarinksteki konumları gereği,
26
sindirilen ya da solunan antijenlerle yakın temas imkanları olduğu için
mukozal savunma işleminde önemli rolleri vardır 27.
Tonsillerde özelleşmiş epitelyal hücreler vardır. Bu hücreler
morfolojik olarak ince barsaklardaki M-hücrelerine benzerler ve M-hücre
belirleyicisi olan vimentin’e karşı pozitif sonuç verirler48. Antijen alımını ve
kana taşınmasını sağlarlar. İnsan tonsilleri, skuamoz epiteli ile kaplı
olduğu için kesin olarak mukozal doku şeklinde tanımlanmazlar. Kriptler
yüzey alanını artırmanın yanı sıra derin bölgeleri de M hücreleri içerir47. M
hücrelerinin varlığı, besinle ya da mikrobiyolojik olarak alınan antijenlerin
sürekli örneklenmesini ve böylece de sistemik bağışıklık yanıtının ve/veya
toleransın başlatılmasını sağlar. Bu şekilde sunulan antijenler, ince
barsaklardaki
M
hücrelerinden
farklı
olarak
sindirim
prosesinden
etkilenmeyecektir27. Nitekim, nazal aşılamanın intragastrik aşılamadan
daha etkin olduğu çeşitli çalışmalarda görülmüştür49-51.
LALT, küçük çocukların larinksinde gerçek bir fizyolojik
yapıdır ve mukozal immun sistemin düzenli bir parçasıdır. Yapısı ve
lenfosit alt birimlerinin dağılımı GALT’a benzer. LALT; 20 yaşından
küçüklerin %80’ında bulunur, 20 yaşından büyüklerin % 56’sinin epiglot
duvarında bulunur. LALT; mukozal aşılamada BALT’tan daha önemli bir
hedef olabilir. BALT, 20 yaşından küçüklerin %40’ında bulunur, daha yaşlı
insanlarda daha nadirdir 52,53.
27
2.2.6.1.NALT (Burun Bağlantılı Lenfoid Doku)
NALT daha çok fare, sıçan gibi hayvanlarda araştırılmış olan,
mikro katlanmış M-hücreleri içeren epitelyal tabaka ile kaplanmış, B ve T
hücre alanlarını içeren iyi organize olmuş bir yapıdır27 (Şekil 7). Bu
epitelyal hücreler, antijenin nazal boşluktan alınmasını sağlar 54.
B: B hücre, T4: CD4 + T hücre, T8: CD8 + T hücre, IDC: Bağlayıcı (interdigitating)
dendritik hücreler, FDC: Foliküler dendritik hücre, HEV: Yüksek Endotelyal Venül, M:
Mikrokatlanmış epitelyal hücreler
Şekil 7: NALT’ın bölümlerinin ve hücresel içeriğinin şematik gösterimi
55
NALT’ın lenfatik olarak drenajı daha çok derin servikal lenf
nodlarına olurken, daha az da yüzeyel servikal lenf nodlarına olur 56.
Wu ve arkadaşlarının57 yetişkin BALB/c fareleri üzerinde
yaptığı çalışmaya göre, nazal yoldan AgI/II-rCTB, CTB veya CT (kolera
toksini) ile bağışıklanan farelerde, tükürük bezinde görülen antijene
28
spesifik IgA antijen sunucu hücrelerin, nazal yoldan bağışıklama
sonrasında NALT’tan tükürük bezlerine ya da diğer mukozal efektör
bölgelere göç ettiğini göstermektedir. Bu da NALT’ın, immünokompetan
(immün yeterlikli) hücreleri mukozal efektör bölgelere yayabilme özelliğini
göstermektedir.
NALT, insanlarda çok fazla araştırılmamıştır. Bunun nedeni,
insanlarda palatin, lingual ve faringeal tonsiller olduğu için NALT gibi bir
yapının gereksiz olduğu düşüncesi olabilir. Debertin ve arkadaşları58, 0-2
yaş arası çocukların nazal mukozasında da organize bir lenfoid dokunun
olup olmadığını araştırmıştır. Buna göre çocukların % 38’inde NALT
yapısının olduğu saptanmıştır. İlk 2 yaş içerisinde NALT oluşumunun yaş
ile ilgili olmadığı görülmüştür. Ancak, NALT’ın daha büyük çocuklarda,
adölesanlarda ve yetişkinlerde olup olmadığı bilinmemektedir.
2.3. Mukozal Aşılama Yolları
Başlıca mukozal aşılama yolları; oral, nazal, vajinal, rektal ve
oküler yollardır. Şekil 8’de mukozal aşılama yolları şematik olarak
görülmektedir.
29
Şekil 8: Mukozal aşılama yollarının şematik gösterimi
59
2.3.1. Oral yoldan aşılama:
Oral yoldan aşılamanın hem mukozal hem de sistemik
bağışıklık sağlamak, hastalara uygulama kolaylığı, eğitilmiş bir sağlık
personeli gerektirmemesi, ağrılı enjeksiyon yapılmaması ve hasta uyuncu
gibi avantajları vardır60.
En çok kullanılan oral aşı, ilk kez 1961 yılında kullanılmaya
başlanılan üç suşlu (valented) canlı zayıflatılmış Sabin oral polio virüsü
aşısıdır61. Bu aşı birçok ülkeden çocuk felci hastalığının eradikasyonunu
sağlayarak, büyük başarı yakalamıştır. Tablo 2’de oral yoldan uygulanan
ve uluslararası sağlık otoritelerinden ruhsat almış aşılar görülmektedir.
30
Tablo 2: Oral olarak uygulanan uluslararası ruhsat almış aşılar
60
Hastalık ve aşılar
Ticari Adı / Üretici
Koruma Oranı
Çocuk Felci
Ör: OPVERO-Sanofi Pasteur
Hemen
Canlı zayıflatılmış aşı (OPV)
Polio Sabin One and Three-
tamamen
hemen
GSK
Kolera
Kolera toksini B alt birimi +
Dukoral/SBL Vaccin
% 85-90 (ilk 6 ay), %
60 (ilk 3 yaş)
inaktif V.cholerae 01 tam hücre
CVD
103.HgR
canlı
atenüe
Klinik araştırmalarda
Orochol (Berna, SSVI)
V.cholerae 01 suşu
%
60-100,
ancak
endemik
popülasyonlarda
belirgin değil
Tifo
Ty21a canlı atenüe aşı
Vivotif (Berna, SSVI)
İlk 3 yaşta % 67
Rotarix
% 61-92
RotaTeq
3 doz, her bir suşa
Rota Virüsü
Canlı atenüe monovalan insan
rotavirüsü suşu
Atenüe
pentavalan
her
bir
karşı % 59-77
serotipten insan rotavirüs geni
içeren sığır-insan aşısı
Son
çalışılmaktadır.
zamanlarda
Transjenik
da
bitkilerdeki
“yenebilir
hücre
aşılar”
duvarı,
üzerinde
antijeni
mide
asitlerinden koruduğu için oral uygulanan aşılar için ideal sıvağlardır.
Tacket ve arkadaşları62, Escherichia coli’nin Isı-Labil Toksinini (LT-B)
içeren transjenik mısırı 2.1 g’lık 3 doz halinde yetişkin insanlara
uygulamışlar ve IgG ve IgA yanıtları elde etmişlerdir. Tacket63, bir başka
araştırma grubu ile yaptığı çalışmasında epidemik gastroenterite neden
31
olan Norwalk virüsünün kapsid proteinini patateste eksprese etmiştir.
Transjenik patatesler yetişkin insanlarda hem IgG hem de IgA antikorları
oluşturmuştur.
2.3.1.1. Oral Aşılama için Kullanılan Yöntemler
1) Aşı antijeninin yüksek dozda ve tekrarlı olarak verilmesi:
Yüksek dozda antijen gerektirir. Oluşan bağışıklık yanıtı
genellikle salgılayıcı antikor yanıtı olup, serumda yanıt oluşmaz.
Bu
nedenle de kısa süreli yanıt oluşturur. Maliyeti yüksek olduğu için çok fazla
tercih edilmez61.
2) Bağırsaklardaki
M
hücrelerini
hedef
alan
zayıflatılmış
patojenik bakteri kullanılarak yapılan aşılama:
M hücreleri, bağırsak boşluğundaki antijenleri altta yatan
salgılayıcı bağışıklık yanıtlarının başlatıldığı lenfoid dokulara taşıyan bir
kapı olması nedeniyle mukozal bağışıklıkta önemlidir. Bu nedenle M
hücreleri oral yoldan aşı verilişinde öncelikli hedeftir 64.
Bunlardan en fazla çalışılanı lektinlerdir. Lektinler, bitkiler,
bakteriler, mantarlar, balıklar, yılanlar, memeliler gibi birçok organizmada
bulunan, şekere bağlanabilen, bu sayede bitki ve hayvan hücrelerine
yapışan/onları yapıştıran, polisakkarit, glikoprotein ve glikolipitleri çöktüren
protein ya da glikoproteinlerdir 65.
3) Detoksifiye Toksinler ile aşılama:
32
Kolera Toksini ve Eschericia coli Isı-Labil Toksini detoksifiye
edilerek aşı adjuvanı olarak kullanılmıştır66-68. Ancak oral yoldan aşı verilişi
için teknoloji geliştirmek zordur. Çünkü herhangi bir ilaç molekülünün oral
yoldan biyoyararlanımı için gastrointestinal yoldaki epitelyal tabakayı
geçmesi gerekir.
Gastrointestinal yolda üç adet bariyer bulunmaktadır:
1) Fizyolojik bariyer: Toksinler gibi çeşitli moleküllerin geçişini
engelleyerek vücudu korur. Gastrointestinal yolun boşluğu
goblet hücrelerinden salgılanan sulu mukus tabaka ile
kaplıdır. Bir ilaç molekülünün bağırsaktaki epitelyal tabakaya
ulaşabilmesi için 100-150 µm’lik kalınlığa sahip bu mukus
tabakasını geçmesi gerekir. Bu mukus tabakasının altında
ise birbirlerine hücreler arası dar bağlantılarla bağlı kolonsu
epitelyal hücreler vardır. Epitelyal tabakanın altında ise
lamina propria bulunur.
2) Biyokimyasal
bariyer:
Verilen
molekülü
metabolize
edebilecek enzimler bulundurmaktadır.
3) Kimyasal bariyer: Molekülün kimyasal yapısı, çözünürlüğünü
ve permeabilitesini belirler69. Bu nedenle etkili bir oral
aşılama için çok yüksek miktarda antijenle tekrarlı aşılama
yapılması gerekir.
2.3.2. Vajinal yoldan aşılama
Hem kadın hem de erkek genital yol dokuları uyarılabilen
mukozal bölgeler içermezler34. Bu nedenle intravajinal bağışıklama
33
sonrasında yeterli bağışıklık yanıtı oluşmamaktadır. Ancak buna rağmen
serum antikorları az da olsa oluşabilir70.
Di Tommaso
ve
arkadaşları38,
Escherichia
coli ısıya
dayanıksız enterotoksinin detoksifiye edilmesi ile elde edilen LTK63 ve
Ovalbumin (OVA) kullanarak Balb/c farelerine intranazal (i.n.) ve
intravajinal (i.vaj.) uygulama yapmış olup, sistemik ve vajinal bağışıklık
cevaplarını ölçmüşlerdir. Hem i.n. hem de i.vaj. uygulama sonrasında
serumda IgA bağışıklık yanıtı oluşmuştur. Ancak i.n. uygulama sonrasında
LTK63’e karşı (anti-LTK63) daha yüksek konsantrasyonda IgA oluşmuştur.
Vajinal yıkamalarda IgG yanıtı da ölçülmüş olup, her iki uygulama yoluyla
da benzer düzeyde IgG yanıtı ölçülmüştür.
Thapar ve arkadaşlarının71, at kaynaklı ferritin ve adjuvan
olarak da alüminyum hidroksit (AH), muramil dipeptit (MDP), monofosforil
lipit A (MPL), dimetil dioktadesil amonyum bromid (DDA) ve kolera toksin
(CT) kullandığı, farelerin intravajinal ve sistemik olarak aşılandığı bir
çalışmada, vajinal sıvıdaki en yüksek IgG titreleri sistemik aşılama
sonrasında gözlenmiştir. Buna karşılık lokal IgA yanıtları intravajinal
aşılama sonrasında daha yüksek düzeyde ölçülmüştür. Antijen-adjuvan
kompleksinin boyutu, östrojen döngüsünün aşaması, yağda çözünürlük
gibi pek çok faktör aşının vajinal epitelyumdan geçişini etkiler. Bu nedenle
intravajinal aşılamaya karşı oluşan bağışıklık yanıtı, sistemik aşılamadan
daha düşük düzeyde olabilir.
34
2.3.3. Rektal yoldan aşılama
Rektal
bağışıklamanın
bağışıklık
mekanizması
ve
bir
patojene karşı nasıl bir koruma oluşturduğu hakkındaki bilgiler yeterli
değildir.
Ancak
rektal
bağışıklamanın
mantığı,
rektal
mukozanın
lenfoepitelyal yapılar içermesidir. Buna ilaveten rektal aşılama ile
enzimatik parçalanma daha az olabilir ve verilen antijenin vücut
sıvılarındaki seyrelme oranı daha az olabilir72.
Rektal bağışıklama sonrasında insanlarda sistemik olarak
serumda ve lokal olarak rektal bölgede IgA ve IgG bağışıklık yanıtı
oluşmaktadır. Ancak rektal bölgedeki yanıtlar, rektal uygulama sonrasında
nazal ve vajinal uygulamaya göre daha yüksek düzeyde gözlenmiştir.
Buna karşılık sistemik bağışıklık yanıtları rektal uygulama
sonrasında düşük bulunmuştur 73.
Kobay ve makaklarda (macaque) Mycobacterium bovis ile
yapılan çalışmalarda rektal uygulama sonrasında hücresel bağışıklık
yanıtları da elde edilmiştir. Bu yanıtlar, parenteral uygulama sonrasında
elde edilen hücresel bağışıklık yanıtları ile hemen hemen benzerdir74.
İnsanlara
oral
yolla
ve
rektal
yolla
uygulanan
canlı
zayıflatılmış Salmonella thphi Ty21a aşısı sonrasında rektal uygulama
yapılan insanların gözyaşında IgG antikoru saptanmış olup, IgA antikor
yanıtında belirgin bir artış saptanmamıştır. Oral yolla aşılanan grupta ise
hem gözyaşında IgG yanıtı bulunmamış, hem de IgA yanıtında artış
görülmemiştir. Nazal salgılarda rektal yolla aşılanan grupta hem IgA hem
35
de IgG yanıtlarında önemli bir artış olurken, oral yolla aşılanan grupta her
iki antikorda da belirgin düzeyde artış olmamıştır. Tükürükte hem rektal
hem de oral yolla aşı uygulanan gruplarda hem IgG hem de IgA
gözlenmiştir, ancak oral yolla aşı uygulanan grupta tükürükteki bağışıklık
yanıtı daha fazla ortaya çıkmıştır. Rektumda rektal yolla aşı uygulanan
grupta IgA yanıtları belirgin olarak artmıştır. Vajinal salgılarda hem rektal
hem de oral yolla bağışıklık yanıtı oluşmuştur. Ancak oral yolla uygulama
sonrasında IgA antikor yanıtları belirgin olarak artmıştır. Bağırsak
salgılarında her iki yolla uygulamada da IgA yanıtları oluşmuştur. Buna
ilaveten serumda rektal uygulamada hem IgA hem de IgG’de belirgin artış
görülürken, oral uygulama sonrasında yalnızca IgG antikorlarında artış
olmuştur. Buna göre rektal uygulama sonrasında yaygın mukozal
bağışıklık sistemi nedeniyle, yalnızca uygulama yerinde değil, vücuttaki
birçok mukozal bölgede de bağışıklık yanıtı oluşmaktadır75.
2.3.4. Oküler yoldan aşılama
Gözde M hücrelerini içeren konjonktiva bağlantılı lenfoid
dokular vardır
. Gözyaşı bezi gözyaşının dolayısıyla da sIgA’nın ana
76-79
kaynağıdır. Konjonktivada T ve B hücreleri ile IgA’yı eksprese eden
plazma hücreleri bulunmaktadır80.
Bu yolla aşılama tavşan, kobay, fare gibi hayvanlarda
denenmiştir. Adjuvan kullanılarak yapılan oküler bağışıklama sonrasında
IgA ile hücresel bağışıklık yanıtları elde edilmiştir
. Ayrıca Herpes
80,81
simplex virüsü ile oküler aşılama, Herpes simplex virüsü ile latent
enfeksiyonda terapötik amaçla da denenmiştir ve konjonktivit, iritis,
keratitis gibi göz enfeksiyonlarına karşı koruyucu olduğu görülmüştür
80,82
.
36
Elde edilen sonuçlar, oküler yolun insanlarda da aşılama amacıyla
kullanılabileğini düşündürmektedir.
2.3.5. Nazal yoldan aşılama
Bağırsak, solunum ve genital yolda yaygın enfeksiyöz
hastalığa yol açan tüm viral, bakteriyel ve parazitik ajanlar mukozal
membranların geniş yüzey alanından girer ya da enfekte ederler. Nazal
mukoza, solunan antijenlerin ilk temas noktası olduğu için mukozal immun
sistemin önemli bir koludur.
Nazal yoldan aşılamanın üstünlükleri şöyle sıralanabilir:
• Kolay ulaşılabilirdir.
• Yüksek oranda damarlanma vardır.
• Nazal epiteli kaplayan çok sayıda mikrovilinin varlığı, geniş
bir absorpsiyon yüzeyi oluşturur.
• İntranazal bağışıklama sonrasında hem mukozal hem de
sistemik (humoral ve hücresel) immun yanıtlar indüklenebilir.
• Yaygın mukozal immün sistemi sayesinde immün cevap
uzaktaki mukozal bölgelerde indüklenebilir.
• Büyük popülasyon gruplarının kolay bağışıklanmasında
kullanılabilir.
• Nazal bağışıklama enfeksiyonun potansiyel kaynağı olan
iğneler ve enjektörler gerektirmemektedir 22.
• İ.n. bağışıklamada antijenler midedeki gibi düşük pH’lara ve
salınan parçalayıcı enzimlere maruz kalmadıkları için daha
küçük dozları yeterli olabilir83.
37
• Nazal mukoza, inhale edilen makromoleküllerin ilk temas
noktasıdır, nazal boşluğun tabanında NALT (insanlarda
Waldeyer halkası) bulunur 84.
• Nazal epitelyum zayıf olup, altta kan damarları, servikal lenf
nodları ve lenfoid nodlar bulunur ki bu da makromolekülün
epitelden geçebilirse doğrudan bu yapılara ulaşmasını
sağlar85.
Antijenler,
intranazal
olarak
verildiklerinde
zayıf
immünojenisiteleri veya immünolojik toleransı indüklemeleri nedeniyle
bağışıklık yanıtını uyarmaları düşük olmuştur. Bunun yanı sıra, mukus,
mukosiliyer arınma86 ve her ne kadar mide-bağırsaktaki ve karaciğerdeki
metabolizma olmasa da nazal mukozadaki oksidatif ve oksidatif olmayan
enzimler46, 87, 88 nazal yoldan verilen antijenlerin etkinliğini azaltır. Bunun
üstesinden gelebilmek için salım sistemleri, adjuvanlar, mukozal yüzeylere
hedefleme gibi çeşitli stratejiler geliştirilmiştir.
2.3.5.1. Nazal aşılama için ilaç taşıyıcı sistemler
2.3.5.1.1. Nanopartiküller
Nanotaşıyıcılar, peptit, protein ya da nükleik asit yapısındaki
antijenleri enkapsüle ederek korumaları, nano taşıyıcıların mukoza ile
etkileşimlerini artırmaları, antijenleri lenfoid dokulara yönlendirmeleri
bakımından mukozal aşılamada önemli bir potansiyeldir89.
38
2.3.5.1.1.1. Lipit yapılı nanotaşıyıcılar
2.3.5.1.1.1.1. Lipozomlar
Tez çalışmamız kapsamında nazal yoldan uygulanmak üzere
lipozom hazırlanması amaçlandığı için lipozomlarla ilgili bilgiler diğer
taşıyıcı sistemlere göre daha ayrıntılı verilmiştir. Lipozomlar, iki tabakalı
fosfolipit küresel veziküllerin sulu süspansiyonlarıdır. Lipit molekülleri,
hidrofilik bir baş grubu ve hidrofobik bir kuyruktan oluşur. Lipozom
oluşumu sırasında çözünen lipit molekülleri, ortamdaki çözünürlüklerinin
azaltılması ile bimoleküler lipit yapılarına kendiliklerinden dönüşürler.
Lipitlerin hidrofilik baş grupları sulu faza, hidrofobik hidrokarbon kısımları
ise ikili tabakada birbirine yönelir.
Lipozomlar, ilacı bir, iki ya da üç kompartmanda taşıyabilir.
Suda çözünen ajanları merkezdeki sulu çekirdekte, yağda çözünen
ajanları membranda, peptit ve küçük proteinleri yağ-su arafazında
taşırlar90. Lipozomlar şematik olarak Şekil 9’da görülmektedir.
39
a.
b.
c.
d.
Fosfolipit molekülleri
İki tabakalı zara dönüşüm
Lipozoma dönüşüm
İki tabakalı yapının detaylı görüntüsü
Şekil 9: Lipozomların şematik gösterimi
91
En çok kullanılan lipitler fosfolipitler olup özellikle de yüksüz
(nötral) fosfatidil kolin kullanılır. Bunun yanı sıra, eksi yüklü fosfatidik asit,
fosfatidil gliserol, fosfatidil serin ve fosfatidil etanolamin kullanılır91. Lipitler,
hidrofobik bölgelerinin yağ asidi zincirlerindeki farklı kombinasyonlara göre
çok farklı çeşide sahiptir92.
Lipozomlar, morfolojik olarak, boyutlarına göre ve ikili zar
tabakalarının sayısına göre sınıflandırılırlar.
Lipozomların morfolojik
özelliklerine göre sınıflandırılmaları Şekil 10’da görülmektedir.
Tek tabakalı (unilamel) veziküller; küçük, büyük ve dev olmak
üzere üç boyut tipine ayrılır. Çok tabakalı (multilamel) veziküller, tek
tabakalı veziküllerden farklı fiziksel özelliklere sahiptir ve ilaç salım sistemi
olarak yaygın kullanılırlar.
40
Şekil 10: Morfolojik özelliklerine göre lipozomlar
91
Lipozomların hazırlanmasında en çok kullanılan yöntemlere
ait bilgiler aşağıda verilmiştir:
• Film Hidrasyon Yöntemi:
Çok tabakalı veziküllerin hazırlanmasında en fazla kullanılan
yöntemdir. Bu yöntemde yağ çözeltisi evaporatör ya da daha büyük ölçekli
üretim için püskürterek kurutma yöntemi ile veya liyofilizasyon ile kurutulur.
Daha sonra numune, tampon gibi bir hidrasyon ortamı ile
mekanik olarak karıştırılır91. Hidrasyon adımı, yağın jel-sıvı kristal geçiş
sıcaklığının (Tc) üzerindeki bir sıcaklıkta veya yağ karışımında en yüksek
sıcaklıkta eriyen bileşenin jel-sıvı kristal geçiş sıcaklığının (Tc) üzerindeki
bir sıcaklıkta olur. Enkapsüle edilecek etkin maddeler çözünürlüklerine
göre ya sulu tampona ya da yağları içeren organik çözücüye katılır90.
41
Bunun sonucunda mikrometre boyutundaki çok tabakalı veziküller
kendiliğinden oluşur. Çok tabakalı veziküller, çeşitli mekanik yöntemlerle
tek tabakalı veziküllere dönüştürülebilir91. Film hidrasyon yönteminin
sakıncaları, düşük iç hacim, düşük enkapsülasyon etkinliği, olası
degradasyon, partiküllerin boyutlarının heterojen olmasıdır 90,91.
Lipozomların partikül büyüklüğünü küçültmek ve ayarlamak
için en çok sonikasyon ve ekstrüksiyon teknikleri kullanılmaktadır:
o Sonikasyon:
Sonikasyon, lipozomların boyutunu küçültmede kullanılan
basit bir yöntemdir93. Çok tabakalı veziküllerden, küçük tek tabakalı vezikül
elde etmek için, banyo tipi sonikatör ya da inert bir atmosferde prob tipi
sonikatör
kullanılır.
Sonikasyonun
dezavantajları,
düşük
iç
hacim
nedeniyle lipozom içine alınan madde miktarının az olması, enkapsüle
edilecek maddelerin veya fosfolipitlerin degrade olabilmesi, prob ucundan
metal kontaminasyonu, küçük tek tabakalı veziküllerle birlikte, çok tabakalı
veziküllerin de kalabilmesidir 90.
o Ekstrüksiyon:
Ekstrüksiyon, belli boyutta tek tabakalı lipozomlar oluşturmak
için uygun bir yöntemdir94. Bu yöntemde de çok tabakalı veziküller, küçük
tek tabakalı veziküllere dönüştürülür. Hazırlanan çok tabakalı veziküller,
basınç altında çok küçük por açıklığına sahip, polikarbon membran
filtrelerden geçirilir. Uygun por açıklığına sahip membran filtreler
kullanılarak istenilen boyutta lipozom elde edilebilir. Çok tabakalı
42
veziküller, membrandan geçerken tabakaları soyulur. Böylece homojen
boyutta lipozomlar elde edilir90, 91, 95.
• Solvan Enjeksiyonu:
o Eter infüzyon yöntemi:
Lipitlerin,
dietil
eter
veya
eter/metanoldeki
çözeltileri
enkapsüle edilecek etkin maddenin sulu çözeltisine 55-65°C sıcaklıkta ya
da düşük basınç altında yavaşça enjekte edilir. Eterin vakum yardımıyla
giderilmesi sonucu lipozomlar oluşur. Yöntemin dezavantajları, oluşan
lipozomların partikül boyutlarının heterojen olması ve enkapsüle edilecek
maddenin organik solvana ya da yüksek sıcaklığa maruz kalmasıdır.
o Etanol enjeksiyon yöntemi:
Lipitin etanoldeki çözeltisinin çok miktardaki tampona hızla
enjekte edilmesiyle çok tabakalı veziküller elde edilir. Bu yöntemin
dezavantajları, oluşan lipozomların boyutlarının heterojen olması, seyreltik
olması, etanolün su ile azeotrop oluşturması nedeniyle uzaklaştırılmasının
güç
olması,
etanol ile
biyolojik
olarak
aktif
maddelerin
inaktive
olabilmesidir90.
• Dondurma çözme döngüsü:
Küçük tek tabakalı veziküller hızla dondurulur ve yavaşça
eritilir. Kısa bir sonikasyonun ardından agrege olmuş madde büyük tek
tabakalı veziküllere dönüşür. Dondurma ve ardından çözme esnasında
43
küçük tek tabakalı veziküller birleşerek büyük tek tabakalı vezikülleri
oluşturur 90.
• Hidrasyon, Dehidrasyon ve Şişme:
Hidrasyon/dehidrasyon yöntemleri kuru lipit filmlerin sulu
ortama maruz kalmaları sonucu şişmelerine dayanır. Dehidrate filmdeki
tampon tuzlarının varlığı nedeniyle oluşan ozmotik basınç farkı, suyun ikili
tabakalar ve lameller arasında kalmasını, böylece lipozom oluşumunu
sağlar. Bu yöntemle, çok tabakalı ve dev tek tabakalı lipozomlar
oluşturulur. Bu yöntem diğer yöntemlere nazaran daha hızlı lipozom
oluşumunu sağlar ve yüksek verimde tek tabakalı veziküller oluşur 91.
• Deterjan diyalizi:
Deterjanlar, kritik misel konsantrasyonlarında lipitleri çözmek
için kullanılır. Deterjan diyalizle giderildikten sonra, miseller fosfolipit
bakımından zenginleşir ve büyük tek tabakalı lipozom oluşturmak üzere
birleşirler. Deterjan diyalizi yönteminin avantajları, verimin yüksek olması
ve boyutu homojen olan lipozomların üretimidir. Dezavantajı ise, deterjan
kalıntılarının lipozomlar içinde kalmasıdır90.
• Ters evaporasyon:
Öncelikle organik çözücüde (dietil eter veya izopropil eter
veya izopropil eter ile kloroform karışımı) fosfolipit içeren faz ile sulu
tampon fazının karıştırılması ile yağ içinde su emülsiyonu oluşur. Daha
sonra, organik çözücüler düşük basınç altında uçurulur ve viskoz bir jel
44
oluşur.
Lipozomlar,
rotavaporda
düşük
basınç
altında
çözücünün
uçurulması sırasında oluşur. Bu yöntemin sakıncası, enkapsüle edilecek
materyalin organik çözücüye ve kısa süreli sonikasyona maruz kalmasıdır.
Bu koşullar, bazı proteinlerin, DNA zincirlerinin denatürasyonuna ve
oluşan veziküllerin boyut dağılımının heterojen olmasına yol açabilir 90.
• Elektroformasyon:
Bazı lipit karışımlarını vezikül şekline getirebilmek için
şişirmek çok zordur. Elektroformasyon yöntemi ile lipit film şişirilirken bir
elektrik alanı uygulanır ve bu problemin üstesinden gelinir. Elektrik alanın,
ikili tabakalar arasında dalgalanma yaratarak lamellerin ayrılmasını,
böylece
de
vezikül
oluşumunu
sağladığı
düşünülmektedir.
Elektroformasyon için, filmlerin optimum kalınlığı 25-50 µm’dir. Bu
yöntemle elde edilen dev tek tabakalı lipozomlar, standart yöntemlerle
elde
edilenlere
göre
daha
büyüktür
ve
kendi
kendine
lipozom
oluşturamayan lipitler bile bu yöntemle lipozom oluşturmak üzere
birleştirilebilir91.
Lipozomların aşı taşıyıcı sistem olarak kullanılmalarının
üstünlükleri aşağıda sıralanmıştır:
1) Amaca uygun partikül büyüklüğü ve çeşitli fosfolipitler ile
antijenlerin hücrelere optimum salımı sağlanabilir.
2) Antijen içteki sulu kompartmana hapsedilebilir ya da yüzeye
bağlanabilir.
3) Lipozomları, sitokinlerle, kolera toksini gibi adjuvanlarla ya da
immünomodülatörlerle vererek adjuvanlıkları geliştirilebilir.
45
4) Fosfolipitlerden oluştukları için, lipozomlar insanlar için
güvenlidir.
5) In vivo olarak tercihen profesyonel antijen sunan hücreler
olan makrofajları hedeflerler 22.
6) Protein yapısındaki maddeleri parçalanmaktan korur96.
7) Aşıların mukozal membrandan geçişi artırırlar96.
8) Lipozomlar pozitif yüklü hale getirilerek negatif yüklü olan
mukozal yüzeylerden absorpsiyonları artırılabilir97.
Lipozomların potansiyel aşı salım kapasiteleri i.n. olarak
verilen protein ve peptit antijenleri ya da DNA aşıları için gösterilmiştir.
DNA aşılarının olduğu durumda pozitif yüklü lipitten oluşan katyonik lipitplazmid DNA kompleksleri i.n. veriliş sonrası hem humoral hem de
hücresel bağışıklık yanıtlarını arttırmışlardır98.
Lipozomal formülasyon olarak tavşanlara intranazal olarak
tetanoz toksoidi verildiğinde, çözelti olarak verilişe kıyasla daha yüksek
düzeyde mukozal sIgA (salgılanan IgA) oluşmuştur. Buna karşılık tetanoz
toksoidi ve CpG-ODN (bakteriyel DNA ve sentetik oligodeoksinükleotidler)
çözelti olarak verildiğinde daha yüksek düzeyde serum IgG ve antitoksin
titreleri oluşturmuştur. Lipozom içinde enkapsüle edilmiş olan tetanoz
toksoidi, CpG-ODN ile ko-enkapsüle edilerek tavşanlara uygulandığında
ise
serum
IgG
yanıtları
artmıştır
ancak
nazal
sIgA
yanıtları
baskılanmıştır . Lipozomal grip virüsü subunit aşısı farelere intranazal
99
olarak verildiğinde, antijenin tek başına verilişine göre artmış serum IgG
cevabı ve nazal mukozada sIgA oluşturduğu saptanmıştır100.
İnaktif tam hücreli kızamık virüsü lipozom formülasyonu ile
farelere intranazal verildiğinde tek başına verilişe kıyasla daha yüksek
46
düzeyde serum IgG oluşturmuştur. Buna ilaveten lipozom içinde intranazal
verilen antijen burunda ve akciğerlerde sIgA oluşturmuş iken, antijen tek
başına verildiğinde sIgA oluşmamıştır. Lipozomlar i.m. verildiğinde serum
IgG’de artış olmasına karşın, mukozal sIgA oluşmamıştır101. Bunlara
ilaveten lipozom formülasyonu ile ve i.n. olarak kullanılan aşılarla yapılan
bazı çalışmalar Tablo 3’te verilmiştir.
Tablo 3: i.n. yoldan, lipozom formülasyonu uygulanarak yapılan bazı çalışmalar
Antijen
Tür
Yorum
Streptococcus
mutans’tan elde
edilen glukozil
transferaz
Photinus
pyralis’ten elde
edilen lusiferaz
Bacillus
anthracis’ten
elde edilen
koruyucu antijen
(PA)
İnsan
Nazal yıkamada anti-GTF IgA1 artmıştır. Serumda
IgM ve IgA artmıştır, ancak IgG’de artış olmamıştır.
Fare
Yersinia pestis
Dişi
C57BL
/6 fare
HIV yüzey
glikoproteini
gp160
Balb/C
fareler
Rekombinant
Meningokokal
OpaB ve OpaJ
proteinleri
Balb/C
fareler
Serum ve vajinada lipozom ile verilen DNA, çıplak
DNA’ya nazaran daha yüksek düzeyde IgA ve IgG
oluşturmuştur.
Lipozom-protamin-DNA partikülleri içine bağlanmış
PA nazal olarak verildiğinde serumda IgG ve IgM,
nazal ve akciğer mukozal salgılarında IgA
oluşmuştur. Oluşan bağışıklık yanıtları, PA adjuvan
olarak kolera toksini kullanılarak nazal yoldan
verildiğindeki ve adjuvan olarak alüminyum hidroksit
kullanılarak s.c. verildiğindeki oluşan yanıtlarla
benzer olmuştur.
Lipozom formülasyonu içindeki ölü tam hücre aşı
daha yüksek düzeyde mukozal (nazal ve akciğer
yıkamalarında IgG ve IgA) ve sistemik (serumda
IgG) humoral bağışıklık yanıtı oluşturmuştur.
Lipozom formülasyonunun sistemik hücresel
bağışıklık yanıtı oluşturduğuna dair kanıtlar vardır.
Lipozom ile Sendai virüsten elde edilen füzyon
proteinlerinin birleşiminden oluşan sisteme antijen
yüklenmiştir. Lipozom içinde antijenin uygulanması
ile serumda nötralize edici IgG, mukozal bölgelerde
ise IgA artışı olmuştur. Ayrıca hem sistemik hem de
mukozal bölgelerde Th1 ve Th2 bağışıklık yanıtı
indüklenmiştir.
Daha yüksek bağışıklık yanıtı elde edebilmek için
lipozomlarla birlikte MPL, LPS, EtxB adjuvanları
kullanılmıştır. Tüm formülasyonlar ile nazal IgA ve
serumda da IgG oluşmuştur ancak en yüksek
bağışıklık yanıtı LPS adjuvanı ile oluşmuştur.
Dişi
Balb/C
fareler
Ref.
[102]
[103]
[104]
[105]
[106]
[107]
[108]
47
2.3.5.1.1.1.1.1. Virozom:
Çift
tabakası
arasında
viral
zarf
glikoproteini
içeren
lipozomlara virozomlar denir. Virozomlar, biyolojik bariyerleri artmış
immünojenisite ile geçerler. Parenteral olarak kullanılan ve ruhsat almış
virozomal aşılar bulunmaktadır (hepatit A virüsü (Epaxal®) ve grip (Inflexal
V®))109. Virozom Şekil 11’de şematik olarak görülmektedir.
Şekil 11: Virozomun şematik görünüşü
İnfluenza
virozomları
kullanılarak
110
kabakulak
virüsü
antijenlerini eksprese eden plazmid DNA vektörünün, Escheriagen (E. Coli
ısıya duyarlı toksin) adjuvanı varlığında i.n. olarak farelere uygulanması
sonucunda mukozal ve sistemik bağışıklık yanıtları oluşmuştur111.
HLT (ısıya duyarlı toksin) adjuvanı ile formüle edilen,
virozomal üç adet grip virüsü suşu içeren aşı dağ gelinciklerine
uygulanmış ve serumda yüksek düzeyde bağışıklık yanıtı elde edilmiştir.
48
Oluşan bağışıklık yanıtları parenteral (i.m.) uygulanan aşı ile hemen
hemen eşit düzeydedir109.
Virozomal
aşılar
klinik
çalışmalarda
da
i.n.
olarak
denenmiştir. I.n. virozomal grip aşısı akut otitis media teşhisi konmuş
çocuklara uygulanmış ve %43,7’lik bir etkinlik saptanmıştır112. HLT
adjuvanı (ısıya duyarlı toksin) ile formüle edilen, virozomal üç adet grip
virüsü suşu içeren aşının sağlıklı yetişkin gönüllülerde Faz II klinik
çalışmaları yapılmış, humoral ve hücresel bağışıklık yanıtlara ilaveten,
nazal yıkamalarda nötralize edici IgA yanıtları tespit edilmiştir113.
Klinik ölçekte, lipozom üretim işlemleri, saflık ve güvenlilik
için kalite kontrol testleri insanlarda aşı salımı için lipozomların
ruhsatlanmasının önünü açmaktadır22.
2.3.5.1.1.1.2. Jel Çekirdekli Lipozomlar
Lipozomların, stabil olmamaları ve içlerindeki biyoaktifin
erken salınabilmesi gibi problemlerin üstesinden gelebilmek amacıyla jel
çekirdekli lipozomlar hazırlanmıştır. Bu sistemde polimer çekirdek, iskelet
görevi görür ve veziküllere mekanik destek sağlar. Jel çekirdekli
lipozomlar, lipozomların tüm avantajlarını sağlamanın yanı sıra stabil
olmama sorununun üstesinden gelirler ve uzatılmış bir süre için kontrollü
salım sağlarlar.
Jel çekirdekli lipozomlar, sulu hidrasyon sıvılarındaki bir
polimerin ya da polimere ait bir monomer biriminin, vezikül içine alınması
ve spesifik iyonların ya da düşük molekül ağırlıklı çapraz bağlama
49
ajanlarının varlığında radyasyon, pH veya sıcaklık etkisiyle polimerleşmesi
yoluyla hazırlanır. Antijenin jel çekirdekli lipozomlardan salımı ise vezikül
çekirdeğindeki polimerin ya da polimer konsantrasyonunun değiştirilmesi
ile kontrol edilebilir114-116.
2.3.5.1.1.1.3. Kendi Kendine In Situ jelleşen Lipozom Sistem (LIGSLiposome in situ Gelling Systems)
Tiwari ve ark85. poliakrilik asit (PAA) bir jelin içerisinde jel
çekirdekli lipozomu disperse ederek lipozom in situ jelleşen sistemi
geliştirmişlerdir. Poliakrilik asitin pH’ya bağlı jelleşme özelliğinden
yararlanarak, polimer çözeltisinin (pH 4.2’de çözelti halinde) intranazal
uygulanması sonucunda polimerin nazal mukoza pH’sında (7.4 ya da 6.8)
jelleşmesi ve enjeksiyon yerinde bir depo oluşturması, bunun da hidrojele
hapsedilmiş
biyoaktif
için
uzatılmış
salım
sağlaması
temeline
dayanmaktadır.
LIGS’e
hapsedilmiş
biyoaktifin
salımı
üç
aşamada
olmaktadır :
85
1) Protein antijenin hidrojelden salımı,
2) Lipozomların PAA hidrojelden salımı,
3) Jel çekirdekli lipozomlara hapsedilmiş biyoaktifin salımı’dır.
HBsAg içeren LIGS, jel çekirdekli lipozom ve konvansiyonel
lipozom nazal yoldan Balb/c farelerine uygulanmış, LIGS ve jel çekirdekli
lipozomların belirgin olarak daha yüksek düzeyde bağışıklık yanıtı
oluşturduğu gözlemlenmiştir85.
50
2.3.5.1.1.1.4. Jel İçinde Lipozom :
Lipozomların, sıvı ve akışkan yapıda olmaları, stabil
olmamaları ve içlerindeki biyoaktifin erken salınabilmesi gibi problemlerin
üstesinden
gelebilmek
ve
mukozal
yüzeylerde
daha
uzun
süre
kalabilmeleri amacıyla lipozomların jeller içinde disperse edilmesi ile yeni
formülasyonlar tasarlanmıştır.
Pavelic ve arkadaşları117, 5 farklı yöntemle kalsein içeren
lipozom formülasyonları hazırlamıştır. Bunlardan optimal sonuç veren iki
yöntemle hazırlanan lipozomlar, %1 Carbopol®
ve Carbopol® 980
hidrojelde disperse edilmiştir. Serbest kalseine göre, jellerde disperse
edilmiş lipozomdan etkin madde daha yavaş salınmış ve stabilitesi de
daha iyi olmuştur.
Yine aynı grubun, kloramfenikol ile hazırladıkları lipozomal
formülasyonu
Carbopol®
jelde
disperse
etmeleri
sonucunda
formülasyonun stabilitesi artmıştır ve uzatılmış salım sağlanmıştır118.
Fattal ve arkadaşları119, lipozomlara enkapsüle ettikleri
oligonükleotidleri %27’lik poloksamer 407 jelde disperse etmişlerdir.
Oküler dağılımı ve camsı cisimden temizlenmesi tavşanlarda ölçülmüştür.
Lipozom tek başına verilişe kıyasla poloksamer jel ile kombine edilerek
verildiğinde camsı cisimdeki kalış süresi artmıştır.
51
2.3.5.1.1.2. Bağışıklık uyarıcı kompleksler (ISCOMs)
Bağışıklık uyarıcı kompleksler, negatif yüklü, kafes şeklinde
yapılardır. Quillaja saponaria’dan elde edilen Quil A’nın kolesterol ve
fosfolipitlerle karıştırılması ile oluşurlar ve içlerine hidrofobik değişkeni olan
antijenler bağlanabilir. ISCOM’ların en göze çarpan özellikleri Th-1 tipi
yanıt olan güçlü T-hücre yanıtını indüklemeleridir. Buna karşılık insanlarda
aşı salım sistemi olarak kullanılmalarının sakıncası toksisiteleridir.
Saponinlerin ve Quil A’nın düşük dozlarda bile güçlü hemolitik ve sitolitik
aktivite gösterdiği bilinmektedir. Sonuç olarak, Quil A’nın adjuvan
özellikteki
ancak
çalışılmaktadır22.
toksisitesi
Tablo
4’te
olmayan
ISCOM
fraksiyonları
ile
yapılmış
izole
bazı
edilmeye
çalışmalar
görülmektedir.
52
Tablo 4: Nazal yoldan ISCOM uygulanarak yapılan bazı çalışmalar
Antijen
Tür
Mycoplasma
mycoides subsp.
mycoides
Dişi
Balb/c
fare
Influenza A virüsü
Balb/c
fare
Influenza subünit
antijen
A/PR/8/34(H IN1)
Dişi
NMRI
fare
Respiratuvar
sinsitiyal virüsü
(RSV) zarf
antijenleri
Dişi
Balb/c
fare
Hepatit B yüzey
antijeni (HBsAg)
Balb/c
fare
Yorum
Ref.
Nazal yoldan bağışıklama ile ISCOM içinde ve
tam hücre olarak verilen antijene karşı bağışıklık
yanıtı ölçülmüştür. ISCOM ile elde edilen IgG
yanıtı serumda 40-100 kat,akciğerlerde 3 kat daha
yüksek olmuştur. IgA yanıtı ise hem serumda hem
de akciğerlerde ISCOM ile 60 kat daha yüksek
bulunmuştur.
Nazal yoldan tek doz ISCOM verildiğinde IgG, iki
doz verildiğinde IgM ve IgG salgılayıcı hücreler
gözlenmesine karşın, IgA salgılayıcı hücreler
gözlenmemiştir. Akciğerde doğal öldürücü hücre
aktivitesinde artış olmuştur. İn vitro çalışmalarda
destek aşılaması sonrasında akciğerlerde IgG ve
IgA salgılayıcı hücre sayısı 10 kat artmıştır. 2 doz
ISCOM verildiğinde T öldürücü hücre prekürsör
sayısı 10 kat artmıştır.
ISCOM içindeki antijen tek doz verildiğinde, s.c.
yolla verilişte i.n. verilişe kıyasla daha yüksek
düzeyde antikor yanıtı oluşmuştur. Ancak ikişer
doz verildiğinde her iki yolla da yüksek düzeyde
antikor yanıtı ve enfeksiyona karşı koruma
gözlenmiştir.
RSV, ISCOM içinde i.n. olarak verildiğinde üst
solunum yollarında (ÜSY) ve akciğerde (AC)
yüksek düzeyde IgA oluşturmuştur. S.c. yolla
verildiğinde ise ÜSY’de çok az düzeyde,
akciğerlerde ise hiç IgA oluşturmamıştır. Yine i.n.
yolla verilen ISCOM’da, s.c. yolla verilen ISCOM’a
göre daha erken, daha yüksek düzeyde ve daha
uzun süreli serum IgM ve IgG1 antikor yanıtları
oluşmuştur.İnaktif virüs s.c. yolla verildiğinde, i.n.
yolla verilen ISCOM’a göre daha yüksek düzeyde
serum IgA oluşmuştur. Ancak s.c. yolla verilen
ISCOM ile hiç serum IgA oluşmamıştır.
Yüksek miktarda 3 doz ISCOM içinde HBsAg
nazal olarak verildiğinde alüminyum adjuvanı ile
birlikte verilen (alum-HBsAg) HBsAg ile yaklaşık
aynı düzeyde serum IgG oluşturmuştur. Ancak
hücresel bağışıklık yanıt ve mukozal salgılardaki
sIgA düzeyi i.n. ISCOM aşılaması ile daha yüksek
düzeyde olmuştur.
[120]
[121]
[122]
[123]
[124]
53
2.3.5.1.1.3. Sentetik Biyomimetik Supramoleküler BiyovektörTM (SMBV TM)
Biovector Therapuetics S.A. isimli Fransız şirketi tarafından,
özellikle nazal aşılama için geliştirilmiştir. SMBVTM taşıyıcılar, polisakkarit
bir çekirdek ve lipozom bir zardan oluşur125. Küreseldir ve 60-80 nm
boyutundadır.
Bu
da
virüslere
benzetilmelerini,
böylece
antijenik
özelliklerinin doğrulanmasını ve aşı salım sistemi olarak kullanılma
potansiyellerini gösterir 126. Şekil 12’de şematik olarak gösterilmektedir.
TM
a)Virüs
b) Antijen ile Yüklü SMBV
TM
126
Şekil 12: SMBV ’nin şematik gösterimi
SMBVTM, pozitif yüklü olması nedeniyle negatif yüklü nazal
mukozada daha fazla tutunabilir. Antijenlerle bağlandığında içine aldığı
maddeyi proteolizden koruyarak nazal dokuya salımı dolayısıyla da
immünojenisiteyi
artırır126-128.
Tablo
5’te
nazal
yoldan
SMBVTM
uygulanarak yapılan bazı çalışmalar görülmektedir.
54
Tablo 5: Nazal yoldan SMBV
Antijen
Fare
Kuduz
antijeni
Balb/c fare,
OF1 fare,
genetiği
değiştirilmiş
fare
Dişi Balb/c
fare
Influenza
suşları
uygulanarak yapılan bazı çalışmalar
Tür
Influenza A
HBsAg
βgalaktozidaz
TM
İnsan
Yorum
Ref.
Influenza A-SMBV
i.n verildiğinde, serumdaki
IgG yanıtları s.c. verilişle benzer bulunmuştur. S.c.
verilişte hiç IgA yanıtı yokken, Influenza A-SMBV
TM
i.n verildiğinde güçlü mukozal IgA yanıtı
oluşmuştur.5 ay boyunca serum ve mukozal
bağışıklık yanıtları korunmuştur.
Biyovektörün (BV) varlığında kuduz antijenlerinin
immünojenisitesi, antijenin ve BV’nin yalnız
başlarına verilişine göre artmıştır.
[126]
3 mcg serbest antijen i.m. verildiğinde oluşan
serum IgG’yi elde edebilmek için i.n. 3 doz ve 10
TM
mcg HBsAg SMBV verilmelidir. i.n. HBsAgSMBV TM verildiğinde belirgin sitotoksik T lenfosit
aktivitesi gözlenmiştir. 3 doz 5 mcg βTM
galaktozidaz-SMBV i.n verildiğinde ve i.m.
verildiğinde serum IgG yanıtları yaklaşık benzer
TM
olmuştur. Her iki antijen de SMBV ile
verildiğinde nazal ve vajinal yıkamada spesifik IgA
yanıtları, tek başlarına verilişe göre belirgin
derecede yüksek olmuştur.
Serum antikor yanıtları az olsa da artan antijen
dozu ile artmıştır. Nazal IgA yanıtları ise belirgin
derecede artmıştır. Burun akıntısı dışında advers
etkilerde plasebodan farklı bir advers etki
görülmemiştir.
[129]
TM
[127]
[130]
2.3.5.1.2. Polimerik Nanotaşıyıcılar:
2.3.5.1.2.1. Biyoparçalanabilir polyester nanopartiküller
Daha çok polilaktik asit (PLA), polilaktik ko-glikolik asit
(PLGA) ve kopolimerleri ile çalışmalar yapılmıştır. Tetanoz toksoidinin,
PLA mikrokürelerine adsorbe edilmesi ile elde edilen aşı nazal yoldan
kobaylara, sıçanlara ve tavşanlara verilmiştir. Mikrokürelerin partikül
büyüklüğü 100 nm-1,6 µm arasında değişmektedir. Serbest antijene göre
PLA mikrokürelere adsorbe tetanoz toksoidi ile yüksek düzeyde serum IgG
antikoru oluşmuştur. Destek dozu verildikten sonra daha kısa sürede
55
bağışıklık cevabı oluşmuştur. Bu da hafıza IgG antikorunun oluştuğunu
göstermektedir131. Bu polimerler, antijenin nazal mukozadan geçişini de
artırmaktadır. Bu geçiş nanopartikülün boyutu küçüldükçe artmaktadır. 200
nm’den 10 µm’ye kadar yapılan çalışmalarda, kana ve dokulara geçiş 200
nm olan partiküllerde daha yüksek düzeyde olmuştur132.
PLA nanopartikülleri PEG (polietilen glikol) ile kaplandığında,
farelerde elde edilen antikor düzeyleri PLA ile elde edilene göre daha
yüksek ve daha uzun süreli bulunmuştur. PEG ile kaplamanın PLA
partiküllerinin mukozal sıvılardaki stabilitesini artırdığı düşünülmektedir133.
PLGA (poli-laktik ko-glikolik asit)’e, poli sülfobütil poli vinil
alkol
bağlanarak
daha
hidrofobik
ve
negatif
yüklü
bir
poliester
hazırlanmıştır. Böylece proteinlerin pozitif yüklü kısımları ile elektrostatik
bir çekim oluşması ve antijenin nanopartiküle daha yüksek verimde
yüklenmesi amaçlanmıştır. Daha yüksek miktarda antijenin yüklenmesi
sağlandığı gibi, farelerde çözelti halindeki aşıya göre daha yüksek
düzeyde IgG ve IgA oluşmuştur134,135. Plazmid DNA aşılarının stabilite
problemlerinin
üstesinden
gelebilmek
için
PLGA,
poliooksietilen
(poloksamer, poloksamin) ile karıştırılmıştır. 100-200 nm arasında,
mukozadan geçiş için uygun boyutta nanopartiküller elde edilmiştir. Nazal
yoldan farelere uygulandığında çıplak plazmid DNA’ya göre belirgin
düzeyde yüksek miktarda IgG oluşmuştur136.
2.3.5.1.2.2. Lektinli polimerik nanopartiküller
Lektinler, bitkilerden, hayvanlardan ve mikroorganizmalardan
izole edilen proteinler ya da glikoproteinler olup, spesifik olarak
56
karbonhidratlara bağlanır137. Bu özellikleri sayesinde mukozal yüzeylerdeki
karbonhidratlara bağlanarak, biyoadezifliği artıracakları düşünülmektedir.
Belli
lektinler
yapılabilir
kullanılarak
solunum
yoluna
hedeflendirmeler
138,139
.
Hamsterlara i.n. olarak M hücrelerine seçici bağlanan lektin
ile kontrol lektin paralel olarak verildiğinde, M hücrelerine seçici bağlanan
lektin folikül bağlantılı epiteli hedeflemiştir. Tek başına verilen antijene
göre lektin ile verilen antijen spesifik serum IgG yanıtını uyarmıştır140.
HIV-1 (İnsan bağışıklık yetmezlik virüsü)’e spesifik olarak
bağlanabilen Concanavalin A isimli lektin nanokürelere bağlanarak, HIV
virüsünün antijenlerini yakalaması sağlanarak hazırlanan nanotaşıyıcı
(HIV-NS) farelere nazal yoldan uygulandığında genital mukozada IgA ve
dalakta sitotoksik T hücre uyarımı etkin bir şekilde yapılmıştır141. Aynı
taşıyıcıların etkinliği primatlarda da nazal yoldan uygulanarak denenmiştir
ve makaklarda (macaque) simian/insan bağışıklık yetmezlik virüsü
(SHIV)’ne karşı etkin mukozal bağışıklık yanıtları oluşmuştur142. Hayvan
modellerindeki başarılarına karşın, bu nano taşıyıcıların sakıncası,
polistiren ve polistiren metakrilat polimerlerinden oluşan çekirdekleri
nedeniyle biyoparçalanabilir olmamalarıdır143.
2.3.5.1.2.3. Polisakkarit Yapılı Nanopartiküller
Daha çok kitozan ve türevleri ile çalışmalar yapılmıştır.
Kitozan, glukozamin, N-asetil glukozamin kopolimerlerinden oluşan
katyonik bir polisakkarit olup, biyoadezif bir yapıya sahiptir. Hücreler arası
boşlukları açarak mukozal transportu artırır. Toksisitesi azdır ve insanlar
57
tarafından iyi tolere edilebilir144. Tablo 6’da nazal yoldan polisakkarit yapılı
nanopartikül uygulanarak yapılan bazı çalışmalar görülmektedir.
Tablo 6: Nazal yoldan polisakkarit yapılı nanopartikül uygulanarak yapılan bazı
çalışmalar
Antijen
Tür
Yorum
Ref.
Hepatit B yüzey
proteinlerini
kodlayan plazmid
DNA
Tetanoz toksoidi
Balb/c
fareleri
Kitozan nanopartikülleri
Serum IgG, IgA, IFN-γ, IL-2
[145]
Fare
[146]
Respiratuvar
sinsitiyal virüs
(RSV) antijenlerini
kodlayan plazmid
DNA
Yeşil floresan
protein (GFP)
genini kodlayan
plazmid DNA
Monovalan
infulenza A alt
birim H3N2
Balb/c
fareleri
Düşük molekül ağırlıklı kitozan
nanopartikülleri, yüksek düzeyde IgG
(nanopartiküllerin adjuvan etkisi), uzun süreli
IgA
Kitozan DNA nanoküreler, Serum IgG,
mukozal IgA, IFN-γ, sitotoksik T-lenfosit
Balb/c
fareleri
Tiyollenmiş kitozan, pDNA’yı etkin bir şekilde
bağlamış ve eksprese etmiştir.
[148]
C57BL/6
fare
[149]
Tetanoz toksoidi
Balb/c
fareleri
Trimetil kitozan (TMC) nanopartiküller, antijen
yükleme etkinliği %78, serum HI (hemaglütinin
inhibisyon) ve serum IgG, IgG1, IgG2a,
mukozal sIgA
Mono N-karboksimetil kitozan (MCC), Ntrimetil kitozan (TMC), kitozan nanopartiküller,
TMC ve kitozan nanopartiküller ile MCC’ye
göre daha yüksek düzeyde serum IgG
oluşmuştur.
[147]
[150]
2.3.5.1.3. Biyoparçalanabilir mikropartiküller
Son yıllarda mikropartiküllerin hazırlanmasında en çok
kullanılan polimer poli (laktik ko-glikolik asit)ler (PLGA) olmuştur.
PLGA mikropartikülleri, laktik ve glikolik asitlerin (D, L ya da
DL izomerlerinin) polimerlerine dayanır. Polilaktid ve poliglikolid polimerleri
enzimatik olmayan hidroliz ile laktik asit ve glikolik asit üretirler.
58
Bunlar da herhangi bir enflamasyona neden olmadan vücudu
terk eder. PLGA mikropartikülleri, ilaç salımında ve emilebilen sutur
materyali
olarak
insan
kullanımı
için
güvenlidir151.
Polilaktidin
parçalanması poliglikolidden daha yavaştır. Bu nedenle aşı geliştirmede
bu iki polimerin farklı oranlardaki karışımını kullanmak avantajlı olabilir.
Çünkü bağışıklık yanıtında doğrudan etkisi olan antijenin salım hızı
avantajlı olabilir 22.
PLGA mikropartiküllerinin intranazal yoldan aşı taşıyıcısı
olarak kullanıldığı birçok çalışma yapılmıştır.
Kobayların poli (L-laktik asit) mikropartiküllerine adsorbe
tetanoz toksoidi (TT) ile i.n. bağışıklanması ile serbest toksoide göre TTspesifik sistemik ve mukozal antikor yanıtı artmıştır152.
Bordatella pertussis antijenleri poli (DL-laktid-ko-glikolid)
mikrokürelerine enkapsüle edilerek farelere intranazal verildiğinde, aerosol
olarak hastalık etkeninin verilmesine karşı bellirgin koruyucu yanıt
oluşturmuştur 153.
PLGA
mikropartikülleri
içine
enkapsüle
edilmiş
insan
parainfluenza tip 3 virüsünün i.n. verilişi koruyucu bağışıklık yanıtının
indüksiyonunu sağlamıştır154.
Poli laktik asit mikrokürelerine enkapsüle edilen Yersinia
pestis antijenleri farelere intranazal verildiğinde koruyucu bağışıklık
sağlanmıştır155.
59
Ancak, içe hapsedilen antijenin saklama süresince olan
stabilitesi, mukozal epitelyum tarafından mikropartiküllerin alım etkinliği ve
insanlarda kullanım için steril preperatların üretimi gibi birçok endişe
bulunmaktadır22.
2.3.5.2. Mukozal Adjuvanlar
Mukozal yoldan verilen antijenler genellikle immünojenik
değildir. Bağışıklık yanıtını artırmak için adjuvanlarla birlikte verilirler.
Mukozal yoldan kullanılan adjuvanlar aşağıda verilmiştir:
• Bakteriyel toksinler,
• Sitokinler,
• Muramil dipeptit (MDP),
• CpG oligodinükleotidler,
• Avridin,
• Monofosforil lipit A,
• Alum,
• MF59156,
• Kemokinler157,158,
• Virüs benzeri partiküller’dir.
Bakteriyel toksinlerden kolera toksini (CT) ve E.coli ısıya
karşı labil toksini (LT) toksik olduğu için B birimleri izole edilmiştir ve CTB
ve LTB olmak üzere adjuvan olarak kullanılmışlardır. Influenza virüsü
A/Puerto Rico/8/34 suşundan elde edilen antijen alt birimi, LTB ile birlikte
nazal yoldan verildiğinde serumda, burun ve akciğer salgılarında, antijenin
tek başına nazal yoldan verilişine kıyasla daha yüksek düzeyde antiviral
60
IgG ve IgA oluşturmuştur. Ayrıca intranazal viral uyarıma (challenge) karşı
da fareler korunmuştur159.
CT (kolera toksini)’ye benzer etkinliğe sahip ve daha az
toksisiteye sahip adjuvanlar olarak sitokinler denenmiştir. IL-1α sırasıyla
IL-18, IL-12 veya IL-12 ve GM-CSF (granülosit-makrofaj koloni stimüle
edici
faktör)
ile
kombine
halde
Balb/c
farelerine
nazal
yoldan
uygulandığında güçlü mukozal ve sistemik yanıtlar oluşmuştur160.
Sitozin-fosfat-guanozin (CpG) motifleri içeren bakteriyel DNA
sentetik oligodeoksinükleotidler (CpG ODN) içerecek şekilde HSV-1
(Herpes simplex virüs)’in rekombinant glikoprotein B antijeni ile birlikte
C57BL/6 farelerine nazal yoldan verildiğinde güçlü vajinal IgA ve sistemik
IgG2a yanıtları oluşmuştur. Bunlara ilaveten sistemik ve mukozal CTL
(sitotoksik T lenfositleri) de oluşmuştur. HSV-2 ile yapılan ölümcül vajinal
uyarıma (challenge) karşılık, farelerin % 50’si korunmuştur161.
Birkaç adjuvanı birarada intranazal olarak uygulamanın da
bağışıklık yanıtlarını artırdığı görülmüştür. Örneğin, MDP nazal yoldan çok
fazla kullanılan bir adjuvan olmasa da CTB ile veya kitozan klorürle birlikte
nazal yoldan Balb/c farelere verildiğinde bağışıklık yanıtlarını belirgin
düzeyde artırmıştır162.
Virüs benzeri partiküller (VLP) de hem taşıyıcı hem de
adjuvan olarak kullanılmışlardır. Norwalk VLP nazal yoldan verildiğinde,
serum IgG ve fekal IgA oluşturma açısından, oral yoldan verilişe kıyasla
daha etkin bulunmuştur163.
61
CCR7 (dendritik hücre reseptörü) ligandları gibi kemokinlerin,
ikincil lenfoid organlarda dendritik hücrelerin T-hücre alanlarına gitmesini
sağlama ve RANTES (mukozadaki epitelyal ve lenfoid hücreler tarafından
üretilen bir kemokin) gibi kimyasal olarak çekici (chemoattractant)
maddelerin monosit, T-hücre ve doğal öldürücü hücre çekici özellikleri
nedeniyle
mukozal
adjuvan
olarak
kullanıldıkları
çalışmalar
ümit
vericidir157,158.
2.4. Ovalbumin
Tavuk
yumurtasının
akından
elde
edilen
albümindir.
Beyazımsı sarımsı toz yapısında, suda çözünebilen bir maddedir. Fosforile
edilmiş glikoprotein yapısındadır. Toplam molekül ağırlığı 44,3 kDa’dır. 84
°C’de denatüre olur164. İzoelektrik noktası 4.7’dir165. Serpin proteinleri
ailesine mensuptur, buna rağmen bu aileye ait bir özellik olan proteaz
inhibitörü özelliğine sahip değildir166. 385 civarında amino asitten oluşan
bir amino asit dizilimine sahiptir
. Şekil 13’te doğal ovalbuminin tersiyer
167
yapısı görülmektedir.
62
Şekil 13: Doğal Ovalbumin’in tersiyer yapısı
168
Ovalbumin, çalışmamızda model antijen olarak kullanılmıştır.
Ovalbumin’in model antijen olarak kullanıldığı çok çeşitli
çalışmalar yapılmıştır. Boonyo ve arkadaşları169, farklı moleküler ağırlığa
sahip kitozanlar ile üç farklı kuaternizasyon derecesine sahip trimetil
kitozan (TMC-20, TMC-40, TMC-60) ile ovalbumin (OVA) içeren sulu
çözeltiler hazırlamışlardır. Dişi Balb/c farelerine (6-8 haftalık) 100 µg/ 30
µL OVA olacak şekilde, kontrol çözeltisi ve 5 farklı özellikte kitozan
çözeltisi ile hazırlanan formülasyonlar, 0, 7 ve 14. günlerde mikropipet
yardımıyla nazal yoldan verilmiştir. Pozitif kontrol grubuna ise, boyun
bölgesinden s.c. olarak 100 µg OVA içeren 200 µL alüminyum
63
süspansiyonu
uygulanmıştır.
Yüksek
molekül
ağırlıklı
(MA)
ve
deasetilasyon derecesi (DD) daha yüksek olan kitozan, düşük MA ile
düşük DD’li kitozana ve kontrol çözeltisine göre daha yüksek düzeyde
serum IgG ve sIgA oluşturmuştur. TMC-40 ise TMC-20, TMC-60 ve diğer
iki kitozana göre daha yüksek düzeyde serum IgG ve sIgA oluşturmuştur.
Pozitif kontrol olarak s.c. uygulanan formülasyon, yüksek düzeyde serum
IgG oluşturmasına karşın, sIgA oluşturamamıştır169.
N-trimetil
kitozan
(TMC)
nanopartiküllere
ovalbumin
yüklenerek yapılan çalışmada, ovalbumin önemli miktarda yüklenebilmiştir
ve
nanopartiküllerin
nanopartiküllerin
yüzeyi
nazal
pozitif
mukozaya
yükle
yüklenmiştir.
yapışmasını
Bu
da
kolaylaştırmıştır.
Ovalbumin yüklü N-trimetil kitozan nanopartiküller Calu-3 hücrelerinde
sitotoksisite
göstermemiştir170.
Nanopartiküllere
alternatif
olarak,
ovalbumin molekülü TMC’ye konjuge edilerek Balb/c farelerine i.m. olarak
verildiğinde dendritik hücreler tarafından etkin bir şekilde alınmıştır.
İmmünojenisitesi konjuge olmamış ovalbumine göre daha yüksek olmuş
hatta neredeyse nanopartikül kadar olmuştur171.
Antijen olarak OVA’nın kullanıldığı trimetil kitozan ile çapraz
bağlayıcı olarak tripolifosfat ya da metillenmemiş CpG DNA’nın kullanıldığı
iki nanopartiküler sistem, Balb/c farelerine nazal yoldan verilerek bağışıklık
yanıtları açısından karşılaştırılmıştır. Serum IgG ve mukozal IgA yanıtları
yaklaşık aynı düzeyde olmuştur. Ancak IgG2a düzeyi ve dalakta OVA
spesifik IFN-γ üretici T hücrelerinin sayısı CpG’nin bağlayıcı olarak
kullanıldığı nanopartikülde daha fazla olmuştur172.
OVA
içeren
silika
nanopartikülleri,
uzatılmış
salım
sağlanması amacıyla kitozan jel içine eklenmiştir. Nanopartiküller yaklaşık
64
300 nm boyutunda ve negatif zeta potansiyele sahiptir. Jel sistemler (Quil
A adjuvan içeren ya da içermeyen nanopartikül + OVA içeren veya OVA
içeren) transjenik farelere s.c. verildiğinde humoral ve hücresel bağışıklık
yanıtı oluşturmuştur. OVA yüklenmiş nanopartikül + Quil A içeren jel, OVA
ve Quil A içeren jele göre belirgin derecede CD4 + T hücre artışı
sağlamıştır173.
Adjuvan olarak kolera toksininin (CT) kullanıldığı OVA içeren
kitozan nanopartikülleri ve kitozan kaplı emülsiyon sıçanlara i.n. ve
intraperitoneal (i.p.) olarak verilmiştir. Nanopartiküller, hem i.n. hem de i.p.
yolla benzer düzeyde IgG oluşturmuştur. IgA yanıtları ise nanopartikül
formülasyonunda, kontrol grubu olan çözelti halindeki OVA ve CT’ye göre
daha
yüksek
düzeyde
oluşmuştur.
Emülsiyon
formülasyonu
i.n.
verildiğinde hem IgG hem de IgA yanıtları, kontrol grubuna göre belirgin
düzeyde daha yüksektir174.
Poli (D, L-laktid-ko-glikolid) (PLG) polimerleri ile hazırlanan
mikropartiküller içine hapsedilen OVA, Balb/c farelerine s.c. olarak
verildiğinde serum IgG yanıtı, serbest OVA’ya göre çok yüksek olmuştur.
Bunun yanısıra, küçük partiküller (1,5 µm) büyük partiküllere (72,6 µm)
göre, mikropartiküllere hapsedilenler adsorbe edilenlere göre daha fazla
serum IgG yanıtı oluşturmuştur175.
Ovalbumin, palmitik asit ya da fosfatidil etanolamin ile
bağlanarak ISCOM içine alınmış ve in vitro özellikleri değerlendirilmiştir.
Buna göre hidrofilik etkin maddelerin modifiye edilerek ISCOM matrisinin
içine
alınmasının
mümkün
olduğu
ve
aşı
formülasyonu
olarak
kullanılabileceği sonucuna varılmıştır176. ISCOM içinde OVA formülasyonu
farelere nazal yoldan verildiğinde ise, yüksek düzeyde serum IgG ve
65
mukozal IgA oluşmuştur177. Yine ISCOM içinde OVA formülasyonu
farelere oral yoldan verildiğinde ince bağırsaklarda IgA ve serumda da IgG
oluşmuştur. Bununla birlikte sitotoksik T lenfosit yanıtı da oluşmuş olup,
oral tolerans oluşmamıştır178.
Tüm
oluşturabilme
ve
bu
çalışmalar,
dolayısıyla
Ovalbumin’in
model
antijen
bağışıklık
olarak
yanıtı
kullanılabilme
potansiyelini göstermektedir.
66
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Gereç
3.1.1. Etkin Madde
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin)
Sigma, Amerika
3.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler
%8 Precise Protein Gel
Thermo Scientific, Amerika
1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholine
Avanti Polar Lipids, Amerika
BCA Reaktif A (Sodyum karbonat, sodyum
Thermo Scientific, Amerika
bikarbonat, bikinkoninik asit, sodyum tartrat)
BCA Reaktif B (% 4 bakır sülfat)
Thermo Scientific, Amerika
Bromofenol blue
Sigma, Amerika
BuphTM-Tris-HEPES-SDS
Thermo Scientific, Amerika
Carbopol® 974P NF
Noveon, Cleveland, OH
Chitosan (≥%75 deasetile )
Sigma, Amerika
Dimetil formamid (DMF)
Applichem GmBH, Almanya
Dipotasyum hidrojen fosfat
Sigma, Almanya
DMEM (Dulbecco's Modified
Eagle's Medium)
Biochrom, Almanya
FBS (Fetal Bovine Serum)
Biochrom, Almanya
Glasiyel Asetik Asit
Merck, Almanya
Gliserin
Sigma, Amerika
67
L-Glutamin (200 mM)
Biochrom, Almanya
Kloroform
Merck, Almanya
Kolesterol
Sigma, Amerika
Laktik asit
Merck, Almanya
L-alpha-Phosphatidyl choline (from egg yolk)
Sigma, Amerika
Metanol
Merck, Almanya
Moleküler ağırlık belirleyicisi
Sigma, Amerika
(Molecular weight marker, MWM) MTT
Sigma, Amerika
Penisilin/Streptomisin
Biochrom, Almanya
Potasyum dihidrojen fosfat
J.T. Baker, Hollanda
Protasan UP G 213 (Kitozan glutamat)
Novamatrix, Norveç
Sodyum dodesil sülfat
Sigma, Amerika
Sodyum klorür
Emir Kimya, Ankara
Trietanolamin
Aklar Kimya, Ankara
Tripsin-EDTA çözeltisi (% 0.05-%0.02), PBS içinde
Biochrom AG, Almanya
Ca++, Mg++ içermeyen
Tris HCl
Sigma, Amerika
Uranil asetat (% 1)
Merck, Darmstadt
3.1.3. Kullanılan Biyolojik Maddeler:
Calu-3; Lung Adenocarcinoma; Human
(Homo sapiens) hücre dizisi (ATCC-HTB-55)
ATCC, Amerika
68
3.1.4. Kullanılan Kitler
Pierce® BCA Protein Miktar Tayin Kiti
Thermo Scientific,
Amerika
3.1.5. Kullanılan Alet ve Malzemeler:
Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC 60)
Shimadzu, Japonya
Distile su ünitesi (NS serisi)
Nüve, Türkiye
Etüv
Heraeus, Almanya
Foto-ışık mikroskop, DCM 4000
Leica, Almanya
FT-IR Spektrofotometresi
Mattson 1000 FTIR,
Amerika
Hassas Terazi (AW 320)
Schimadzu, Filipinler
Manyetik karıştırıcı
Snijders, Hollanda
Mekanik karıştırıcı
Heidolph, Almanya
Mikroplaka Okuyucu
VersaMax, Molecular
Devices Co., ABD
Mini-Extruder
Avanti Polar Lipids,
Amerika
Mini-Protean® 3 Cell (SDS-PAGE)
Bio-Rad, Amerika
Nukleopor polikarbonat membran
Whatman, Amerika
(0.2, 0.4, 0.8 µm)
Otomatik mikropipet
Isolab, Almanya
Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyeli
Malvern Zeta Sizer,
Aleti (Nano ZS)
İngiltere
69
pH metre
Jenco 6173, Amerika
Rotavapor
Heidolph, Almanya
Santrifüj Aleti
Jouan KR 221
TA. XT. Plus Texture Analyzer
Stable Micro Systems,
İngiltere
FEI Tecnai G2
Geçirimli Elektron Mikroskobu
Spirit Bio, Amerika
Taramalı Elektron Mikroskobu
FEI Quanta 400 F,
Amerika
Ultrasonik banyo
Brasonic 221, Almanya
Viskozimetre Programmable, DV-III + Rheometer TC- Brookfield, Amerika
502 Temperature Controller
Vorteks (NM 110)
Nüve, Türkiye
3.2. Yöntem
3.2.1. Ovalbumin ile Yapılan in Vitro Çalışmalar
3.2.1.1. Formülasyonlarda Kullanılan Ovalbumin Miktarının Belirlenmesi
Nazal yoldan uygulanmak üzere planlanan jel ve lipozom
formülasyonlarında antijen olarak model madde ovalbumin seçildi.
Literatür171-173
incelemeleri
sonucunda
formülasyonlarda
kullanılacak olan OVA miktarı her bir burun deliğine 5 µL olacak şekilde,
toplamda 10 µL için 20 µg olarak kararlaştırıldı.
70
3.2.1.2. FT-IR Spektrumu
OVA’nın yaklaşık olarak 1 mg’ı 200 mg potasyum bromür ile
karıştırıldı. Toz karışımı, 1000 kg.cm-3’lük basınç altında sıkıştırıldı ve elde
edilen ovalbumin potasyum bromür karışımı disklerin FT-IR (Fourier
Transform Infrared spectroscopy) spektrumu alındı.
3.2.1.3. Formülasyonlarda Kullanılan Polimerler ve Yardımcı Maddelerle
OVA’in Etkileşimlerinin Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) ile
İncelenmesi
Dakikada 10°C tarama hızında, sıcaklık 200°C’a kadar
çıkarıldı. 2.3 mg OVA, alüminyum örnek kabına konularak, ısıtma
hücresine yerleştirildi. Azot atmosferi varlığında, 0-200°C sıcaklık
aralığında ovalbuminin termogramı alındı. Buna ilaveten, formülasyonlarda
kullanılan yardımcı maddelerle etkileşimlerinin incelenmesi için, jel
formülasyonlarda kullanılan kitozan ve Carbopol® 974P NF ile lipozom
formülasyonlarda kullanılan yumurta fosfatidil kolin ve kolesterol 1:1 (a/a)
oranda ovalbumin ile karıştırılarak termogramları alındı.
3.2.2. Jel
Formülasyonlarının
Geliştirilmesi
için
Ön
Formülasyon
Çalışmaları
Çalışmamızda, jel formülasyonlarının burundan kullanıma
uygun kıvamda ve pH (pH 5-7)’da olması için; kitozan jellerin oluşmasında
jelleşme ajanı olarak glasiyel asetik asit ve laktik asit ile Carbopol® 974P
NF jellerin hazırlanmasında sodyum hidroksit ve trietanolamin çeşitli
konsantrasyonlarda denendi. Bu ön çalışmalar için hazırlanan jellere
71
ovalbumin ilave edilmedi. Hazırlanan bu jel formülasyonlarının in vitro
karakterizasyon çalışmaları yapılarak, en uygun jel formülasyonları seçildi.
3.2.2.1. Kitozan Jel Formülasyon Çalışmaları
Kitozan
jel
formülasyonlarının
hazırlanması
sırasında
kullanılacak olan distile suyun yarısına glasiyel asetik asit (% 0.1/ 0.2/ 0.3/
0.4/ 0.5/ 1/ 5 h/h) veya laktik asit (% 0.1/ 0.5/ 1/ 1.5/ 2/ 3 h/h) eklendi. Asitsu karışımına kitozan eklenerek 200 rpm’de 10 dakika karıştırıldıktan
sonra suyun kalanı ilave edildi ve toplamda 2 saat olacak şekilde 500
rpm’de karıştırıldı. Jel, oluşan hava kabarcıklarının çıkması için 24 saat 28°C’lik
buzdolabında
bekletildi.
Farklı
kitozan
ve
laktik
asit
konsantrasyonları kullanılarak hazırlanan jel formülasyonları Tablo 7’de
verilmiştir.
Tablo 7: OVA içermeyen kitozan-laktik asit jel formülasyonlarına ait ön-çalışma
formülasyonları
Formülasyon Kodu
% Kitozan (g/mL)
% Laktik asit (mL/mL)
KL1
0.5
0.1
KL2
0.5
0.5
KL3
0.5
1
KL4
0.5
2
KL5
1
0.1
KL6
1
0.5
KL7
1
1
KL8
1
1.5
KL9
1
2
KL10
1
3
KL11
2
0.1
KL12
2
0.5
KL13
2
1
KL14
2
1.5
KL15
2
2
KL16
2
3
72
Kitozan ve laktik asit ile hazırlanan jellerin pH’sı veya
viskozitesi burundan uygulama açısından çok uygun olmadığı için kitozan
ve laktik asit ile nazal jel hazırlanmasından vazgeçilip, kitozan ve glasiyel
asetik asit ile jel hazırlama çalışmaları yapıldı.
Ayrıca, kitozanın diğer bir tipi olan Protasan ile de jel
formülasyonu
hazırlanmaya
çalışıldı.
Tablo
8’de
görülen
konsantrasyonlarda Protasan ve glasiyel asetik asit kullanılarak hazırlanan
jel
formülasyonları
yapılan
karakterizasyon
çalışmaları
sonucunda
burundan uygulama açısından uygun bulunmadı.
Tablo 8: OVA içermeyen Protasan-glasiyel asetik asit jel formülasyonlarına ait ön
çalışma formülasyonları
Formülasyon Kodu
% Protasan (g/mL)
% GAc (mL/mL)
PG1
3
0.3
PG2
3
0.2
PG3
2
0.3
PG4
2
0.4
Farklı kitozan ve glasiyel asetik asit konsantrasyonları
kullanılarak hazırlanan jel formülasyonları Tablo 9’da verilmiştir.
73
Tablo 9: OVA içermeyen kitozan-glasiyel asetik asit jel formülasyonlarına ait önçalışma formülasyonları
Formülasyon Kodu
% Kitozan (g/mL)
% GAc (mL/mL)
KG1
1
0.1
KG2
1
0.2
KG3
1
0.3
KG4
1
0.4
KG5
1
0.5
KG6
1
1
KG7
1
5
KG8
2
0.1
KG9
2
0.2
KG10
2
0.3
KG11
2
0.4
KG12
2
0.5
KG13
2
1
KG14
2
5
KG15
3
0.3
KG16
3
0.4
KG17
3
1
Burundan kullanılmak üzere hazırlanan kitozan jellerin
pH’sının burun pH’sı olan 5-7 aralığında olması için en uygun kitozan
oranı ile asit oranı ve tipi belirlendi. Sekiz farklı Kayma Hızı’nda
viskoziteleri ölçüldü.
Tüm bu çalışmaların sonucunda, %2 kitozan ve % 0,5
glasiyel asetik asitten oluşan KG12, tezimizde kullanılacak formülasyon
olarak seçildi.
74
3.2.2.1.1. Kitozan ile Hazırlanan Jel Formülasyonuna Ovalbumin
Yüklenmesi
Ön formülasyon çalışmalarında tespit edilen, en uygun pH ve
viskoziteye sahip olan kitozan jel formülasyonuna (KG12) ovalbumin
eklenerek in vitro karakterizasyon çalışmaları yapıldı.
Kullanılacak olan distile suyun yarısına % 0.5 (h/h) glasiyel
asetik asit eklendi. Asit-su karışımına kitozan eklenerek 200 rpm’de 10
dakika karıştırıldı. Daha sonra 2 mg/mL konsantrasyonda OVA eklenmiş
olan suyun kalanı ilave edildi ve toplamda 2 saat olacak şekilde 500
rpm’de karıştırıldı. Jel, oluşan hava kabarcıklarının çıkması için 24 saat 28°C’lik buzdolabında bekletildi.
3.2.2.2. Carbopol® 974P NF Jel Formülasyon Çalışmaları
Carbopol® 974P NF ile jel formülasyonu hazırlanmasında
jelleştirici ajan olarak sodyum hidroksit ve trietanolamin denendi.
Kullanılacak olan distile suya gerekli miktar Carbopol® 974P
NF yavaş yavaş ilave edildi. Hız 400 rpm’e çıkarıldı ve 60 dakika
karıştırıldı. Belli konsantrasyonda sodyum hidroksit veya trietanolamin
damla damla ilave edildi ve berrak jel oluşması sağlandı.
Farklı
Carbopol®
974P
NF
ve
sodyum
hidroksit
konsantrasyonları kullanılarak hazırlanan jel formülasyonları Tablo 10’da
verilmiştir.
75
®
Tablo 10: Ovalbumin içermeyen Carbopol 974P NF-sodyum hidroksit jel
formülasyonlarına ait ön çalışmalar
% Carbopol® 974P NF
Formülasyon Kodu
(g/mL)
%NaOH (mL/mL)
CN1
0.2
2 (20-30 damla)
CN2
0.3
1 (20-25 damla)
CN3
0.3
2 (12 damla)
CN4
0.3
10 (6 damla)
CN5
0.4
0.5 (34 damla)
CN6
0.4
10 (3 damla)
CN7
0.5
10 (4 damla)
CN8
0.8
10 (6 damla)
Carbopol® 974P NF ve sodyum hidroksit kullanılarak
hazırlanan jellerin pH’sı nispeten düşük olduğu için, baz olarak
trietanolamin denendi.
Farklı Carbopol® 974P NF ve trietanolamin konsantrasyonları
kullanılarak hazırlanan jel formülasyonları Tablo 11’de verilmiştir.
®
Tablo 11: Ovalbumin içermeyen Carbopol 974P NF-trietanolamin jel
formülasyonlarına ait ön çalışmalar
% Carbopol® 974P NF
Formülasyon Kodu
(g/mL)
% TEA (mL/mL)
CT1
0.3
1 (50 damla)
CT2
0.25
100 (2 damla)
CT3
0.25
50 (5 damla)
CT4
0.25
50 (3 damla)
CT5
0.2
50 (3 damla)
CT6
0.3
10 (15 damla)
76
Carbopol® 974P NF ve trietanolamin içeren jellerden pH ve
kıvam açısından en uygun sonuçların alındığı %0.25 Carbopol® 974P NF
ve 3 damla % 50 trietanolamin içeren (CT4) formülasyonun kullanılmasına
karar verildi.
3.2.2.2.1. Carbopol® 974P NF ile Hazırlanan Jel Formülasyonuna
Ovalbumin Yüklenmesi
Ön formülasyon çalışmalarında tespit edilen, en uygun pH ve
viskoziteye sahip olan Carbopol® 974P NF jel formülasyonuna ovalbumin
eklenerek in vitro karakterizasyon çalışmaları yapıldı.
Kullanılacak olan distile suya 2 mg/mL konsantrasyonda
OVA eklendi. 200 rpm’de karışırken, gerekli miktar Carbopol® 974P NF
yavaş yavaş ilave edildi. Hız 400 rpm’e çıkarıldı ve 60 dakika karıştırıldı. 3
damla % 50 Trietanolamin ilave edildi ve berrak jel oluşması sağlandı.
3.2.3. Jel Formülasyonlarında Yapılan Kontroller
3.2.3.1. Fiziksel Görünüm
Hazırlanan
jel
formülasyonlarının
fiziksel
görünüşü,
berraklığı, rengi ve akışkanlığı gözle incelenerek, değerlendirildi.
3.2.3.2. pH Ölçümü
Jel formülasyonlarına ait pH değerleri, Jenco 6173 pH
metresi ile ölçüldü.
77
3.2.3.3. Akış Özellikleri ve Viskozite Ölçümü
Jel formülasyonların akış özellikleri ve viskoziteleri oda
sıcaklığında Brookfield Programmable, DV-III viskozimetresi (spindle no:
52) ile üç tekrarlı olarak ölçüldü. Her örnekten 0.5 mL alınarak değişik
dönme hızlarında (rpm) ölçümler yapıldı. Kayma gerilimine karşı kayma
hızı grafiğe geçirilerek formülasyonların akış özellikleri belirlendi.
3.2.4. Lipozom Formülasyon Çalışmaları
Jel
formülasyonlarının
formülasyonlarına
uygulanabileceği
ilaveten,
nazal
düşünülerek,
yolla
tez
lipozom
çalışmamız
kapsamında lipozom formülasyonu geliştirilmeye çalışıldı.
Çalışmamızda film-hidrasyon yöntemi kullanılarak lipozomlar
hazırlandı. Fosfolipid olarak L-alpha-Phosphatidyl choline (yumurta
fosfatidil kolin) ve stabilite artırıcı olarak da kolesterol kullanıldı.
Lipozomların hazırlanmasında literatürden179 yararlanılarak
burun pH’sına uygun olması için pH 6.8 izotonik fosfat tamponu180
kullanıldı.
Yumurta fosfatidil kolin (egg PC) ve kolesterol (chol) 7:3
molar oranında tartılarak, kloroform:metanol (2:1 h/h) karışımında yuvarlak
balonda çözüldü. Rotavaporda 45°C’de, 2 saat boyunca vakum altında
kurutuldu. Oluşan ince film tabaka, 2 mg/mL OVA içeren (veya etkin
madde içermeyen lipozomlar için OVA içermeyen) pH 6.8 izotonik fosfat
tamponu ile yine aynı sıcaklıkta 5-10 dakika hidrate edildi. Manuel olarak
78
çalkalanarak lipozom oluşumu sağlandı. 10 dakika vorteks, 20 dakika da
ultrasonik
banyoda
sonikasyon
uygulanarak
lipozomların
partikül
büyüklükleri küçültüldü. Böylece çok tabakalı (multi lamellar) veziküller
oluşturuldu. Hem partikül büyüklüğünü küçültmek hem de küçük tek
tabakalı lipozomlar elde etmek için ekstrüksiyon yöntemi kullanıldı.
Lipozom hazırlanmasında kullanılan yöntem Şekil 14’te şematik olarak
gösterilmiştir.
Hazırlanan lipozom formülasyonunun içeriği şu şekildedir:
Rx
Egg PC…………………………………………………23,2 mg
Kolesterol………………………………………………5 mg
Kloroform : metanol (2:1 h/h)………………………....5 mL
pH 6.8 PBS tamponu*………………………………...10 mL
*OVA içeren ya da içermeyen
79
Egg PC:Chol
(7:3 molar)
5 mL Kloroform: Metanol (2:1)
~45°C'de rotavaporda
çözücü uçuruldu
Kuru lipid film oluştu
Lipid filme ovalbumin içeren veya içermeyen pH 6.8
izotonik fosfat tamponu eklendi.
10 dakika vorteks
uygulandı
20 dakika ultrasonik banyoda
bekletildi.
Lipozom süspansiyonu elde
edildi
Ekstrüksiyon işlemi ile lipozom süspansiyonu
homojen hale getirildi.
Şekil 14: Lipozom hazırlanma yönteminin şematik gösterimi
80
3.2.4.1. Ekstrüksiyon İşlemi ile Lipozomların
Partikül Büyüklüklerinin
Ayarlanması
Literatürlerde132,
181
farelerde ve sıçanlarda 100-200 nm
boyutundaki partiküllerin, mikrometre boyutundaki partiküllere göre nazal
mukozadan alımının (uptake) daha yüksek olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle
yaklaşık 150-200 nm boyutlarında lipozomların elde edilmesine karar
verildi.
Hazırlanan lipozomların partikül büyüklükleri ekstrüksiyon
işlemiyle belli bir büyüklüğe getirildi. Bunun için Mini-Extruder aleti
kullanıldı (Şekil 15).
Hazırlanan lipozom süspansiyonuna, Mini-Extruder aleti ile
üçer adet 800 nm, 400 nm ve 200 nm’lik gözenek genişliğine sahip
polikarbonat
membranlar
kullanılarak
12
kez
ekstrüksiyon
işlemi
uygulanmıştır.
Şekil 15: Mini Extruder (Avanti Polar Lipids )
®
81
Öncelikle membran destek diskleri pH 6.8 izotonik fosfat
tamponu ile hidrate edilerek alete yerleştirildi. İki adet destek diskinin
üzerine üç adet 800 nm’lik gözenek genişliğine sahip membran, bunun
üzerine de yine iki adet destek diski yerleştirilerek 12 defa süzme işlemi
yapıldı. Aynı işlem 400 nm’lik ve 200 nm’lik üçer adet membranla da
gerçekleştirildi.
Böylece
partikül
büyüklükleri
ayarlanan
lipozomun
karakterizasyon işlemlerine geçildi.
3.2.4.2. Hazırlanan Lipozomların Karakterizasyonları
3.2.4.2.1. Partikül Büyüklüğü ve Dağılımı
Lipozomların nazal mukozadan daha fazla alınabildiği
(uptake) partikül boyutu olan 100-200 nm’lik boyutun elde edilip
edilmediğini görebilmek için, ovalbumin içeren ve içermeyen lipozomların,
ekstrüksiyon öncesinde ve sonrasında, Malvern Zeta Sizer kullanılarak
partikül büyüklüğü belirlendi.
Aletin küvetinde, pH 6.8 izotonik fosfat tamponu içinde bir
damla lipozom süspansiyonu disperse edilerek ölçümler alındı.
Malvern Zeta Sizer, ışın saçılımı (laser diffraction) prensibine
göre ölçüm yapmaktadır. Işın demeti, partiküle çarptığında saçılan
ışınların açılarının yoğunluğuna göre partikül büyüklüğü belirlenir. Bu
yöntemle, özelikle de partikül büyüklüğü 0,6 nm-6 µm, molekül ağırlığı ise,
1000-2.107 Dalton aralığında olan partiküllerin ölçümü yapılabilir. Çözelti
içindeki partiküllerin büyüklüğü ölçülebildiği gibi, emülsiyonların da boyutu
ölçülebilir. Bu cihaz, molekül ağırlığı belirlenmesinde ve zeta potansiyel
82
ölçümünde de kullanılmaktadır. Cihazla, partikül büyüklüğü 5 nm-104 nm
aralığındaki partiküllerin zeta potansiyel ölçümleri yapılabilir. Partikül
büyüklüğü ve zeta potansiyel ölçümlerinden yararlanılarak, hazırlanan
formülasyonların
stabiliteleri
de
değerlendirilebilir.
Biz
de
stabilite
çalışmalarımız süresince lipozom süspansiyonunun içindeki lipozomların
partikül büyüklüğü ve zeta potansiyelindeki olası değişimleri gözlemlemek
amacıyla Malvern Zeta Sizer cihazını kullandık.
3.2.4.2.2. Lipozomların Zeta Potansiyellerinin Ölçülmesi
Hazırlanan
lipozom
formülasyonlarının
ekstrüksiyon
öncesinde ve sonrasında zeta potansiyelleri ölçüldü. Bunun için Malvern
Zeta Sizer aleti kullanıldı. Oda sıcaklığında pH 6.8 izotonik fosfat tamponu
içine beş damla lipozom süspansiyonu damlatılarak ölçümler yapıldı.
3.2.4.2.3. Lipozomların Yükleme Kapasitesinin Ölçülmesi
Hazırlanan lipozom formülasyonları 13000 rpm’de 20 dakika
santrifüjlenerek, lipozomlar ile sulu tampon fazı ayrıştırıldı. Sulu fazdaki
OVA miktarı Bikinkoninik asit (BCA) yöntemi ile tayin edildi. Ölçülen miktar,
total OVA miktarından çıkarılarak lipozomlarda tutulan OVA miktarı
hesaplandı.
Yükleme
kapasitesinin
hesaplanmasında
şu
formül
kullanılmıştır:
𝑌ü𝑘𝑙𝑒𝑚𝑒 𝑘𝑎𝑝𝑎𝑠𝑖𝑡𝑒𝑠𝑖 (%) =
𝐶𝑡𝑜𝑝𝑙𝑎𝑚−𝐶𝑠𝑢𝑙𝑢 çö𝑧𝑒𝑙𝑡𝑖
𝐶𝑡𝑜𝑝𝑙𝑎𝑚
𝑥100
83
3.2.4.2.3.1. Bikinkoninik asit (BCA) Yöntemi*
Lipozom formülasyonundaki ovalbumin, protein yapısında
olduğu için miktar tayininde BCA yönteminden yararlandık.
İlk kez Smith ve ark.182 tarafından tanımlanan BCA
(bikinkoninik asit) yöntemine göre, bikinkoninik asit, alkali ortamda Cu+1 ile
koyu mor renkli kompleks oluşturan suda çözünen bir bileşiktir. Bu
yöntem, biüre reaksiyonuna dayanır.
Cu+2 + Protein
Alkali ortam
Cu+1
Biüre reaksiyonu sonucu oluşan Cu+1 iyonlarının iki molekül
BCA ile şelasyonu sonucu mor renkli bir reaksiyon ürünü oluşur.
Cu+1
BCA
Mor renkli reaksiyon ürünü
BCA
Suda çözünebilen bu kompleks, 562 nm’de çok yüksek
absorbans
verir.
Bu
absorbans
20-2000
µg/mL
protein
konsantrasyonunda, protein konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak artar.
*BCA çalışmaları Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji ABD’da gerçekleştirilmiştir.
Katkılarından dolayı Prof.Dr. İmran VURAL’a ve araştırma görevlisi Dr. Ecz. Can SARISÖZEN’e teşekkür
ederiz.
84
Bir
protein
standardının
bilinen
konsantrasyonlarda
seyreltmeleri hazırlanarak standart absorpsiyon doğrusu elde edilir. Bu
doğrudan yararlanılarak, numunedeki bilinmeyen protein konsantrasyonu
belirlenir183. Yöntem, BCA reaktifinin, noniyonik deterjanlarla ve tampon
tuzlarıyla etkileşim göstermemesi, reaktifin ve oluşan kromoforun stabil
olması ve tek adımlı bir analiz olması nedeniyle Lowry protein analizine
göre daha fazla tercih edilir182, 184.
BCA
tayininde
kalibrasyon
doğrusu
aşağıdaki
gibi
oluşturuldu:
Formülasyonlarımızda model antijen olarak ovalbumin kullandığımız için,
BCA tayininde de protein standardı olarak 2 mg/mL konsantrasyonda
ovalbuminin pH 6.8 izotonik fosfat tamponundaki çözeltisi hazırlanarak, bu
stok çözeltiden seyreltmeler yapıldı. Yapılan seyreltmeler Tablo 12’de
görülmektedir. Ardından çalışma reaktifi hazırlandı.
Tablo 12: Ovalbumin Standartlarının Hazırlanması
Son Ovalbumin
STOK Ovalbumin
Tampon Çözeltisi
Konsantrasyonu
Çözeltisi
(µL)
(µg/mL)
(µL)
0
0
2000
25
25
1975
125
125
1875
250
250
1750
500
500
1500
750
750
1250
1000
1000
1000
1500
1500
500
2000
2000
0
85
Çalışma reaktifi: 50 birim BCA Reaktif A:1 birim BCA Reaktif B
BCA Reaktif A: 0.1 M sodyum hidroksit içinde sodyum
karbonat, sodyum bikarbonat, bikinkoninik asit ve sodyum tartarat
çözeltisidir.
BCA Reaktif B: % 4’lük bakır sülfat çözeltisi
Yöntem, hem test tüpü ile hem de mikroplaka yöntemi ile
yapılabilmesine karşın, biz mikroplaka yöntemini kullandık. Her bir örnek
için üçer tekrarlı çalışıldı.
Çalışma protokolü aşağıdaki gibidir:
• Her bir standart ve numuneden 25 µL alınarak, üçer tekrarlı
olacak şekilde mikroplaka kuyucuklarına ekilir.
• Her bir kuyucuğa 200 µL çalışma reaktifi eklenir.
• Mikroplaka 30 saniye süresince hafifçe çalkalanıp, karışması
sağlanır.
• Mikroplakanın üstü kapatılarak, 37°C’ta 30 dakika inkübe
edilir.
• Bu sürenin sonunda, mikroplaka oda sıcaklığına getirilerek
562 nm’de absorbansı ölçülür.
Yukarıdaki
işlemlerden
sonra
elde
edilen
absorbans
değerleri, standartların konsantrasyon değerlerine karşı doğrusal grafiğe
geçirilerek kalibrasyon doğrusu oluşturuldu. Böylece lipozoma yüklenen
ovalbumin miktarı tayin edildi.
86
3.2.4.2.4. Lipozomların Işık Mikroskobu Görüntüleri
Ovalbumin
yüklenmiş
ve
yüklenmemiş
lipozom
formülasyonunun ekstrüksiyon öncesi görüntüsü Leica DCM 4000
mikroskobu ile görüntülendi. Büyütme oranı olarak 40x kullanıldı. Böylece
lipozom oluşumunun gerçekleşip gerçekleşmediği görülmek istendi.
Ekstrüksiyon işlemi sonrası partikül boyutu çok küçüldüğü için ışık
mikroskobu ile görülemedi.
3.2.4.2.5. Lipozomların Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) ile
Görüntülenmesi*
Ovalbumin
yüklenmiş
ve
yüklenmemiş
lipozom
formülasyonunun ekstrüksiyon işlemi öncesi ve sonrası morfolojik yüzey
görüntüleri FEI Tecnai G2 Spirit Bio isimli Geçirimli Elektron Mikroskobu ile
görüntülendi.
Bunun için 400 mesh karbon film kaplı bakır ızgara üzerine
sıvı haldeki lipozom süspansiyonundan 5 µL damlatıldı. Karbon film kaplı
bakır ızgara formülasyonu taşımak için kullanıldı, ayrıca iletkenliğe de
engel olmadığından ölçüm için uygundur.
*TEM ölçümleri Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi.
87
Birkaç dakika kuruması beklendikten sonra sıvının fazlası
filtre kağıdı ile çekildi ve boyanması için 50 µL’lik % 1’lik uranil asetat
damlası üzerine konuldu. 3-4 dakika boyanması beklendikten sonra fazla
boyanın uzaklaştırılması için 3-4 dakika da 50 µL su üzerinde bekletildi.
Numuneler, kurutulmak üzere filtre kağıdı üzerine alındı ve 24 saat
kurutuldu. 24 saat sonra 80 kV’ta ölçümler yapıldı*. Örneklerin ölçüme
hazırlanışı şematik olarak Şekil 16’da görülmektedir.
Şekil 16: Lipozom örneklerinin TEM ölçümüne hazırlanışı
3.2.4.2.6. Lipozomların Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile
Görüntülenmesi*
Ovalbumin
yüklenmiş
ve
yüklenmemiş
lipozom
formülasyonunun ekstrüksiyon işlemi öncesi ve sonrası yüzey görüntüleri
ve genel görüntüleri Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile de alındı. FEI
Quanta 400 F kullanılarak ölçümler gerçekleştirildi*.
*SEM ölçümleri Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi.
88
Lipozom formülasyonları, ölçümden bir gün önce karbon bant
üzerine damlatılarak oda sıcaklığında kurutuldu. Kurutulduktan sonra
örnekler altın paladyum ile 10 nanometre kalınlığında kaplanarak
görüntülendi.
3.2.5.Jel-Lipozom Formülasyonlarının Hazırlanması
3.2.5.1. Jel Çekirdekli Lipozom Formülasyonlarının Geliştirilmesi için ÖnFormülasyon Çalışmaları
Literatürden
hazırlanmaya çalışıldı
yararlanılarak
jel
çekirdekli
lipozom
85, 114, 115
. Jel Çekirdekli Lipozomlar ve Lipozom in
situ jelleşen sistem sırasıyla 2.3.5.1.1.1.2 ve 2.3.5.1.1.1.3 bölümlerinde
anlatılmıştır. Bu sistemlere göre sıvı formunda verilen formülasyon vücut
sistemi içinde jelleşecektir.
pH 4.2’deki Carbopol® çözeltisi ve antijen lipozom içine
enkapsüle edilir. pH 7.4 izotonik fosfat tamponuna karşı diyaliz edilerek
jelleşmesi sağlanır 85, 114, 115.
Film
hidrasyon
yöntemi
ile
jel
çekirdekli
lipozom
oluşturabilmek için, 7:3 molar oranında 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3Phosphocholine ile kolesterol karışımından oluşan lipid filme 2 mL pH 4.2
izotonik fosfat tamponu içinde %1 Carbopol® 974P NF eklendi. 20 dakika
ultrasonik banyoda tutuldu ancak sonuçta pelte görünümünde bir yapı
oluştu.
89
Bir başka denemede, 7:3 molar oranında 1,2-Dipalmitoyl-snGlycero-3- Phosphocholine ile kolesterol karışımına pH 4.2 izotonik fosfat
tamponunda % 0.3’lük Carbopol® 974P NF çözeltisinden 2 mL eklendi.
Balonun ağzı kapatılıp buzdolabında 20 dakika bekletildi. 4°C’lik ultrasonik
banyoda 3 dakika sonike edildi. Rotavapora bağlandı. 25 dakika süresince
çözücüler uçuruldu. 10 mL pH 7.4 izotonik fosfat tamponu eklendi, 15
dakika ultrasonik banyoda sonike edildi. Ancak sonuçta yine pelteli bir yapı
oluştu.
Başka bir denemede oluşturulan lipid filme %0.3 PAA içeren
5 mL pH 4.2 izotonik fosfat tamponu eklendi. 10 dakika vorteks uygulandı,
20 dakika da ultrasonik banyoda bekletildi. Lipozom görünümü oluştu
ancak burun pH’sına uygun olması açısından pH 7.4 ile hazırlandığında
Carbopol® 974P NF jelleştiği için, pelteli bir yapı oluştu. Yapılan denemeler
sonucunda
jel
çekirdekli
lipozom
formülasyonunun
hazırlanması
gerçekleştirilememiştir. Bu nedenle çalışmamızda, jel içinde lipozom
formülasyonu hazırlanmasına karar verildi.
3.2.5.2. Jel İçinde Lipozom (Jel Lipozom) Formülasyonları
En iyi sonucun alındığı jellerin içine bölüm 3.2.4’te anlatıldığı
gibi hazırlanan lipozom süspansiyonu katılarak, nazal yoldan ovalbuminin
daha uzun süreli salımı hedeflendi.
Bunun için Carbopol® 974P NF ve kitozan ile hazırlanan jel
formülasyonları denendi. Ancak kitozan ile hazırlanan jel formülasyonu ile
daha iyi sonuçlar elde edildiği için kitozan ile hazırlanan jele lipozom
90
süspansiyonu eklenmesi sonucu elde edilen formülasyon ile çalışmalar
sürdürüldü.
Lipozom
süspansiyonu,
13000
g’de
20
dakika
santrifüjlendikten sonra, üst fazdaki bağlanmamış etkin maddeyi içeren
sulu çözelti atıldı ve alt faz 10 mL tampon çözelti ile tekrar disperse edildi.
Bu süspansiyon en iyi sonuçların alındığı kitozan ile glasiyel asetik asitten
oluşan jele 1 birim lipozom, 10 birim jel olacak şekilde ilave edilerek 400
rpm’de 30 dakika karıştırıldı.
Formülasyon İçeriği
Formülasyon Kodu
KL jel
% 2 kitozan + %0.5 GAc + boş lipozom
KL - OVA jel
% 2 kitozan + %0.5 GAc + OVA + lipozom
3.2.5.3. Jel İçinde Lipozom Formülasyonlarının Karakterizasyonları
Hazırlanan formülasyonların pH, viskozite ve akış özellikleri
ile görünümleri 3.2.3 bölümünde anlatıldığı gibi incelendi.
3.2.6. SDS-PAGE Analizi*
Formülasyonlardaki OVA’nın yapısal bütünlüğünü koruyup
korumadığını görmek amacıyla SDS-PAGE analizi yapılmıştır.
*SDS-PAGE
çalışmaları
Hacettepe
Üniversitesi
Eczacılık
Fakültesi,
Farmasötik
Teknoloji
ABD’da
gerçekleştirildi. Katkılarından dolayı Prof. Dr. İmran VURAL’a ve araştırma görevlisi Dr. Can SARISÖZEN’e
teşekkür ederiz.
91
Makromoleküllerin
bir
elektriksel
alanda
ayrılmalarına
elektroforez denir. SDS-PAGE ise bir tür elektroforez olup, destek ortamı
olarak poliakrilamid jelin, proteinleri denatüre etmek için ise sodyum
dodesil sülfat isimli anyonik deterjanın kullanıldığı analitik bir yöntemdir.
Lauril sülfat olarak da adlandırılan SDS çözündürüldüğünde
geniş bir pH aralığında moleküllerinin negatif yükle yüklendiği bir
deterjandır. Bir polipeptid zinciri, bağıl moleküler kütlesi oranında SDS ile
bağlanır. SDS birçok karmaşık yapıya sahip proteinin ikincil ve üçüncül
yapısını bozarak doğrusal olmasını ve proteinlerin eşit oranda eksi yükle
yüklenmesini sağlar. Bu sayede proteinler bir elektrik alanda eksi yüklü
katottan artı yüklü elektrod olan anoda göç ederler.
Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi, jel bir
matrikste elektroforetik mobiliteleri %1 kadar farklı olan proteinleri
moleküler boyutlarına göre ayırmaya yarar.
Her bir protein, boyutuna bağlı olarak jel matrikste farklı
ilerler. Kısa proteinler jelin porlarından kolay geçerken, uzun proteinler
geçişte daha fazla dirençle karşılaşır. Bu nedenle küçük proteinler jelde
daha aşağılara kadar ilerlerken, daha büyük proteinler başlangıç
noktasına daha yakın kısımlarda kalırlar. Böylece proteinler kabaca
boyutlarına dolayısıyla molekül ağırlıklarına göre ayrıştırılabilirler.
Çalışmamızda jel formülasyonlardaki ovalbuminin yapısal
bütünlüğünü koruyup korumadığını değerlendirebilmek için SDS-PAGE
çalışması yapıldı.
92
İçinde farklı molekül ağırlığına sahip proteinleri bulunduran
“moleküler ağırlık belirleyici (molecular weight marker, MWM)” ile
ovalbumin
içeren
örneğimizin
oluşturduğu
bant
karşılaştırılarak,
örneğimizdeki ovalbuminin molekül ağırlık çizgisinde olup olmadığı
belirlendi. Böylece ovalbuminin yapısında değişim olup olmadığı incelendi.
Moleküler ağırlık belirleyicinin bileşimi Şekil 17’de görülmektedir.
Şekil 17: Moleküler ağırlık belirleyicinin bileşimi (ThermoScientific -26681- Blue
protein Molecular weight marker)
SDS-PAGE’te Kullanılan Kimyasal Bileşenler şunlardır:
Jel:
% 8 Precise Protein Gel,
Yükleme (Running) Tamponu:
93
BupHTM Tris-HEPES-SDS, pH 8 ± 0.5
Numune (Sample) Tamponu (5x):
0.5 M Tris HCl pH 6.8………………………….1.75 mL
Gliserin…………………………………………..4.5 mL
SDS (1 mL Tris-HCl’de 0,25 g)………………..5 mL
% 0.25 Bromofenol blue……………………….0.5 mL
0.5 M Tris HCl (pH 6.8)’nin Hazırlanması:
12.1 g Tris bazı 150 mL distile suda çözülür. pH, konsantre
HCl ile 6.8’e ayarlanır. Toplam hacim distile su ile 200 mL’ye tamamlanır.
Boyama Çözeltisi:
Coomassie Brilliant Blue………………………………..0.25 g
Metanol…………………………………………………....40 mL
Asetik Asit………………………………………………....10 mL
Distile su…………………………………………………..50 mL
94
Yıkama Çözeltisi:
Metanol……………………………………………………250 mL
Distile su…………………………………………………..250 mL
Asetik Asit…………………………………………………50 mL
SDS-PAGE çalışmaları sırasında aşağıdaki protokol izlendi:
• Bir paket BupHTM Tris-HEPES-SDS Yükleme (Running)
Tamponu 500 mL ultra saf suda çözüldü.
• % 8 Precise Protein Gel isimli kullanıma hazır jel kabından
çıkarılarak, jel koşturucu aparata takıldı.
• 10 µL Moleküler Ağırlık Belirleyici ilk kuyucuğa eklendi.
• 80 µL örnek, 10 µL numune tamponu ile karıştırıldı. Bu
karışımdan 10 µL boşluklara enjekte edildi.
• Hücrenin içine 125 mL, dışına 375 mL Yükleme (Running)
Tamponu eklenerek, elektroforez işlemi başlatıldı.
• 120 voltta 1 saat sürüklendi.
• Bu
sürenin
sonunda
numuneler bitiş çizgisine
kadar
sürüklendi.
• Jel, camların arasından çıkarıldı ve boyama çözeltisine
kondu. Bir saat boyunca bekletildi. Ardından yıkama
çözeltisine konarak 24 saat bekletildi.
• Yıkanan jelin fotoğrafı çekildi.
95
3.2.7. Hücre Yaşayabilirliği (Sitotoksisite) Çalışmaları*
Calu-3 hücre dizisi akciğer adenokarsinom hücreleri olduğu
için, solunum yolu epitel hücreleri için bir hücre kültürü modelidir185,186. Bu
nedenle, tez çalışmamızda nazal aşı uygulandığında olası sitotoksisiteyi
değerlendirebilmek için Calu-3 hücreleri kullanıldı.
3.2.7.1. Hücrelerin Çoğaltılması
Hücreler ortam içerisinde 25 cm2’ lik yüzey alanına sahip
hücre kültürü kaplarında, 37°C’ de %5 CO2 içeren inkübatörlerde
büyütüldü.
Calu-3 hücreleri için kullanılan hücre kültürü ortamı:
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)
%10 FBS (Fetal Bovine Serum) (h/h)
50 U/mL Penisilin
50 μg/mL Streptomisin
2 mM L-Glutamin
*Sitotoksisite
çalışmalarında katkılarından dolayı Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmasötik
Teknoloji ABD öğretim üyesi Prof. Dr. İmran VURAL’a teşekkür ederiz.
96
Hücreler konfluent hale geldiklerinde (kabın yüzeyinin %80’
ini
kapladıklarında)
pasajlandı.
Hücrelerin
kapların
yüzeyinden
kaldırılmaları için tripsinizasyon işlemi uygulandı. Bu işlemde hücrelere
%0,005 tripsin ve %0.002 EDTA içeren çözelti uygulandı ve inkübatörde
hücreler kabın yüzeyinden ayrılana kadar bekletildi. Hücreler kabın
yüzeyinden ayrıldıktan sonra ortamdaki tripsin ve EDTA ‘yı inaktive etmek
için, hücre süspansiyonu ortam içeren tüplere koyularak santrifüj edildi.
Süpernatant atıldıktan sonra kalan hücre pelleti gerekli miktarda ortam ile
süspande edildi ve gerekli analizler uygulandı.
3.2.7.2. Sitotoksisitelerinin Araştırılması
Tripsinizasyon uygulanan hücreler sayılarak 96 kuyucuklu
hücre kültürü plaklarının her bir kuyucuğa 5000 hücre/100 μL olacak
şekilde ekim yapıldı. Hücreler bir gün boyunca plakların tabanına
tutunmaları için inkübatörde tutuldu. Bu süre sonunda hücrelerin
üzerlerindeki ortam atıldı. Hazırlanan formülasyonlar 50 µg OVA içerecek
şekilde
hücreler
için
kullanılan
ortamlar
içerisinde
gerekli
konsantrasyonlarda hazırlandı ve hücrelere uygulandı. Kontrol grubu
olarak ovalbumin çözeltisinin ve ortamın uygulandığı hücreler kullanıldı.
Hücrelere uygulama sonrasında 24 saatlik inkübasyon
(37°C’de % 5 CO2) süresi uygulandı. Bu sürenin sonunda canlılık tayin
yöntemi olan MTT yöntemine göre işlemlere devam edildi.
Metil Tiazol Tetrazolyum Bromür (MTT) ile in vitro hücre
canlılığının incelenmesinde, inkübasyon (37°C’de % 5 CO2) süresi
sonunda kuyucuklara 25 µL MTT çözeltisi ilave edildi (izotonik fosfat
97
tamponu içinde, 5 mg/mL). Dört saat inkübasyonu takiben kuyucukların
üzerine 80 µL %45 dimetil formamid (DMF) içinde çözülmüş sodyum
dodesil sülfat (SDS) çözeltisi (% 23, pH 4.7) ilave edildi ve bir gece
inkübatörde bırakıldı. Bu sürenin sonunda plakalar alınarak mikroplaka
okuyucuda 570 nm’de kuyucuklardaki çözeltilerin absorbansları okundu.
Sonuçlar değerlendirilirken, kontrol grubunun canlılığı %100
kabul edilerek karşılaştırmalı olarak grafiklendi ve gerekli istatistiksel
analizler yapılarak gruplar arasındaki farklılıklara bakıldı. Sitotoksisite
çalışmalarında incelenen formülasyonlar Tablo 13’te görülmektedir.
Tablo 13: Sitotoksisite çalışmasında kullanılan formülasyonlar
Formülasyon
Formülasyon İçeriği
Kodu
KG12
% 2 kitozan + % 0.5 glasiyel asetik asit
OVA-KG12
% 2 kitozan + % 0.5 glasiyel asetik asit + 2 mg/mL OVA
®
CT4
% 0.25 Carbopol 974P NF + % 50 Trietanol amin (3 damla)
®
OVA-CT4
% 0.25 Carbopol 974P NF + % 50 Trietanol amin (3 damla) + 2
mg/mL OVA
LİP
7:3 molar egg PC:kolesterol
LİP-OVA
7:3 molar egg PC:kolesterol + 2mg/mL OVA
OVA Çözeltisi
pH 6.8 izotonik fosfat tamponu içinde 2 mg/mL OVA
3.2.8. Fiziksel Stabilite Çalışmaları
En uygun formülasyon olarak seçilen jel ve lipozom
formülasyonları 7 ay süreyle 4°C ve 25°C koşullarında bekletilerek, 0.gün,
7. Gün, 15. Gün, 30. Gün, 60. Gün, 90. Gün, 4. Ay, 5. Ay ve 7. Ay jellerin
pH ve viskozite, lipozomların ise partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli gibi
özellikleri
incelenerek,
formülasyonların
fiziksel
stabiliteleri
98
değerlendirilmiştir. Stabilite çalışmaları yapılan formülasyonlar Tablo 14’te
görülmektedir.
Tablo 14: Fiziksel Çalışma Formülasyonları
Formülasyon İçeriği
Formülasyon
Kodu
KG12
% 2 kitozan + % 0.5 glasiyel asetik asit
OVA-KG12
% 2 kitozan + % 0.5 glasiyel asetik asit + 2 mg/mL OVA
®
CT4
% 0.25 Carbopol 974P NF + % 50 Trietanol amin (3 damla)
OVA-CT4
% 0.25 Carbopol
®
974P NF + % 50 Trietanol amin (3 damla) + 2
mg/mL OVA
KL
% 2 kitozan + % 0.5 glasiyel asetik asit + lipozom
KL-OVA
% 2 kitozan + % 0.5 glasiyel asetik asit + lipozom + OVA
LİP
Ovalbumin içermeyen lipozom
LİP-OVA
Ovalbumin içeren lipozom
3.2.9. Jel Formülasyonlarında Mukoadezyon Çalışmaları*:
Nazal uygulamada mukoadezyon, polimerik materyalin nazal
epitelyal yüzeye
(biyoadezyon) ya da nazal mukusa (mucoadhesion)
yapışmasıdır187. Mukus, hem birincil (disülfit bağları) hem de ikincil
bağlarla (elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler) birarada tutulur. Mukus,
makromoleküler zincirlerin hidrojen bağları ve elektrostatik etkileşimler de
dahil olmak üzere fiziksel etkileşimlerin olduğu karmaşık bir sistemdir. Bu
nedenle, biyoadezif polimer ile mukus arayüzündeki adezyon polimer
polimer ara-yüzlerindeki adezyon
ile
açıklanabilir188.
Biyoadezyonu
açıklayan teoriler, elektrostatik etkileşim, adsorpsiyon teorisi, ıslanma
teorisi ve biyolojik arayüzden zincir penetrasyonudur189-191.
*Mukoadezyon ve TPA çalışmalarındaki katkılarından dolayı Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmasötik
Teknoloji ABD araştırma görevlisi Dr. Fatmanur Tuğcu DEMİRÖZ’e teşekkür ederiz.
99
Mukoadezyonda sırasıyla polimer ıslanır ve şişer, polimer ile
nazal mukozanın teması artar. Şişen mukoadezif polimer zincirleri ile
mukusun protein zincirleri arasında kimyasal etkileşimler olur ve polimer
dokuların arasından içeri girer188.
Polimerin ıslanması ve şişmesi mukoadezyonda önemli rol
oynar. Böylece polimer zincirleri serbest kalarak, biyolojik doku ile
etkileşime girer. Polimerin hidrasyonu ile polimer zincirindeki hidrojen
bağları ayrışır. Polimer ile suyun etkileşimi, polimer-polimer etkileşiminden
daha fazla olduğunda serbest polimer zincirleri biyolojik doku ile etkileşme
olanağı bulur188. Polimer ile biyolojik doku (mukus da dahil) arasında van
der Waals, hidrojen, hidrofobik ve elektrostatik kuvvetler ikincil kimyasal
bağlar oluşturarak polimer ile mukoza arasında adezyonu sağlar187, 192.
Hazırladığımız
formülasyonların
mukoadezif
özelliklerini
belirlemek için bölümümüzde varolan TA.XTPlus Texture Analyzer (Stable
Micro Systems, UK) cihazı kullanılmıştır. Bu cihaz ile kitozan (OVA-KG12),
Carbopol® 974P NF
(OVA-CT4) ve jel -lipozom (KL - OVA jel)
formülasyonlarının mukozaya yapışabilme özelliklerini saptamak için
mukoadezyon çalışmaları yapıldı. Jellerin mukoadezif performanslarını
değerlendirebilmek için model hayvan olarak koyun nazal mukozası
seçildi. Koyun mukozası mezbahadan temin edildi.
Yöntem belli miktarda jel formülasyonuna üstten prob
yardımıyla dokunan belli çaptaki koyun nazal mukozasının jelden
ayrılması yani kopması için gereken kuvvetin ölçülmesi esasına
dayanmaktadır. Bu kuvvet değerinden yola çıkılarak mukoadezyon işi
hesaplandı.
100
Koyunun sakrifiye edilmesinin hemen ardından, nazal
mukoza dikkatlice koyunun nazal boşluğundan ayrılarak, % 0.9’luk serum
fizyolojik içine konuldu. Nazal mukoza altta yatan kemikten bistüri
yardımıyla ayrıldı.
Mukozanın ayrılması işlemi hayvanın sakrifiye edilmesinden
sonra 2 saat içinde gerçekleştirildi (Resim 1, 2).
Resim 1: Koyunun nazal mukozası (kemikten ayrılmadan)
101
Resim 2: Koyunun nazal mukozası (kemikten ayrılırken)
Ardından mukozanın proba tutturulması işlemine geçildi.
Mukoza, proba siyanoakrilat yapısındaki bir yapıştırıcı ile yapıştırıldı. İple
bağlanarak sıkıca tutturulması sağlandı (Resim 3).
Resim 3: Koyun burun mukozasının proba tutturulması
102
2 dakika kadar yapıştırıcının kuruması beklendikten sonra,
37°C’lik su banyosunda bulunan daldırma sıvısında (pH 6.8 izotonik fosfat
tamponu)
5
dakika
bekletilerek,
sıcaklığı
ayarlandı.
37°C’lik
su
banyosunda bekletilerek sıcaklıkları ayarlanan jellerden bir miktar (0.5 mL)
alınarak, probun belli bir hızla inerek dokunacağı yüzeye ince bir tabaka
halinde sürüldü. Jel sürülürken, hava kabarcığı olmamasına ve her
seferinde eşit miktarda jel sürülmesine dikkat edildi (Resim 4).
Bölümümüzde daha önce yapılan jel ve lipozom jel
formülasyonlarının mukoadezif özelliklerinin incelendiği bir çalışmada
TA.XTPlus Texture Analyzer cihazı kullanılmış ve bu cihaza ait test
parametreleri belirlenerek valide edilmiştir193. Bu çalışma esas alınarak
çalışmamız şu şekilde yapılmıştır:
Nazal mukozayı taşıyan prob 1 mm/saniye hızla jele
dokundu ve 150 sn bekletildi. Bu süre boyunca prob, jel yüzeye 0.2 N
kuvvet uygulayacak şekilde ayarlandı. Çalışmalar, 6 paralel deney
şeklinde yapıldı. Prob jelin yüzeyinden ayrılırken oluşan kopma kuvveti ve
yapılan mukoadezyon işi aletin Texture Exponent 32, versiyon 5.0.8.0
yazılım programı tarafından ölçülerek, hesaplamaları yapıldı (Resim 5).
103
Resim 4: Mukoadezyon çalışması (prob jele değmeden)
104
Resim 5: TA.XTplus aleti ile mukoadezyon çalışması
Burada yapılan iş, kuvvet-mesafe grafiğinde, eğri altında
kalan alan olan AUC’den yararlanılarak hesaplanır.
Mukoadezyon İşi = AUC/𝜋𝑟 2
105
𝜋𝑟 2 : Jel ile temas eden mukozal yüzeyin alanı
3.2.10. Jel Formülasyonlarda Yapı Profil Analizi (Texture Profile Analysis)
Tüm jel formülasyonların mekanik özellikleri yazılım kontrollü
bir penetrometre olan TA.XTPlus Texture analyzer (Stable Micro Systems,
UK) cihazı ile 37±0.5°C’de incelendi. Bölümümüzde jeller üzerinde yapılan
benzer çalışma193 esas alınarak jellerin yapı profil analizi şu şekilde
gerçekleştirildi:
Ovalbumin içeren ve içermeyen jel formülasyonları yaklaşık 8
cm yükseklikte olacak şekilde 25 mL’lik beherlere konarak, hava
kabarcıklarının çıkması için sıcaklığı 37°C’a ayarlanmış ultrasonik su
banyosunda 20 dakika bekletildi. 10 mm çapındaki prob ile her bir
formülasyona belli hızda (2 mm/s) ve belli derinliğe kadar (15 mm) ikişer
kez baskı uygulandı. İki baskı arasındaki süre 15 sn olacak şekilde
ayarlandı. Her bir çalışma 6’şar kez tekrarlandı. Ölçüm sonunda elde
edilen veriler, cihazın Texture Exponent 32, versiyon 5.0.8.0 yazılım
programı kullanılarak hesaplandı. Bu hesaplamalara göre, jellerin sertliği,
kırılganlığı, adezifliği, elastikliği, kohezifliği, yapışkanlığı (sakızımsılık),
dirençliliği (resilience) değerlendirildi.
Sertlik; belli bir deformasyonu sağlamak için gereken kuvvet
ya da ilk baskı döngüsündeki maksimum pike tekabül eden kuvvettir (Şekil
18).
106
Şekil 18: Sertlik değerini gösteren tipik bir TPA grafiği
Kırılganlık (fracturability); TPA eğrisindeki ilk belirgin
kırılmadaki kuvvet olarak tanımlanır. Birimi kg, g ya da N’dur (Şekil 19).
Şekil 19: Kırılganlık değerini gösteren tipik bir TPA grafiği
107
Adeziflik; ilk baskı döngüsündeki negatif kuvvet alanıdır.
Jelin yüzeyi ile probun yüzeyi arasındaki çekici kuvvetleri yenmek için
gereken iş olarak tanımlanır. Şekil 20’de görüldüğü gibi, probun birinci
batma periyodundan sonra ilk geri çekme periyodu süresince elde edilen
eğrinin altında kalan alan (AUC2-3) adeziflik değerini vermektedir.
Adeziflik işinin birimi Newton x s’dir.
Şekil 20: Adeziflik değerini gösteren tipik bir TPA grafiği
Elastiklik; ard arda gelen baskıların olduğu durumda, ikinci
baskı döngüsündeki maksimum yapısal deformasyonun olması için
gereken sürenin, birinci baskı döngüsündeki gereken süreye oranıdır.
Şekil 21’de görülen, Süre (2)’ nin Süre (1)’e oranıdır.
108
Şekil 21: Elastiklik değerini açıklayan tipik bir TPA grafiği
Koheziflik; ard arda gelen baskıların olduğu durumda, ikinci
baskı döngüsündeki pozitif kuvvet alanının, birinci baskı döngüsündeki
pozitif kuvvet alanına oranıdır. Şekil 22’de görülen, Alan (2)’nin Alan (1)’e
oranıdır.
Şekil 22: Koheziflik değerini açıklayan tipik bir TPA grafiği
109
Yapışkanlık
(Sakızımsılık,
Gumminess),
sertlik
ile
koheziflik değerinin çarpımına eşittir. Kohezifliği yüksek olan maddelerin
yapışkanlığı da yüksektir. Bu parametrenin birimi yoktur.
Dirençlilik (resilience), jelin deformasyondan nasıl eski
haline döndüğünün ölçümüdür.
Dirençlilik, Şekil 23’te 2:3 alanının 1:2
alanına oranıdır. Bu parametrenin birimi yoktur.
Şekil 23: Dirençlilik değerini gösteren tipik bir TPA grafiği
3.2.11.İstatistiki Hesaplamalar
Tez çalışmamız için yapılan istatistiki hesaplamalar, IBM
SPSS 21.0 programı kullanılarak yapılmıştır.
110
4. BULGULAR
4.1. Ovalbumin ile Yapılan in Vitro Çalışmalar
4.1.1. FT-IR Spektrumuna Ait Bulgular
OVA’nin, Bölüm 3.2.1.2’de anlatıldığı şekilde alınan FT-IR
(Fourier Transform Infrared spectroscopy) spektrumu Şekil 24’te, bu
spektruma ait veriler ise Tablo 15’te görülmektedir.
Şekil 24: Ovalbumin FT-IR Spektrumu
Tablo 15: Ovalbumine ait FT-IR spektrumu verileri
Fonksiyonel Grup
Karakteristik Absorpsiyon
Bandı [Dalga Sayısı (cm )]
-1
O-H Gerilim
3274.76
-C-H, =C-H Gerilim
3067.09; 2930.88
C=O Gerilim (Amit-I, β-sheet yapısı)
1632.64
N-H eğilim, C-N gerilim, C=O eğilim (Amit-II)
1515.07
C-H eğilim
1449.04; 1390.66
Amit-III, N-H eğilim, C-N
α-heliks yapısı
1309.88
gerilim
Amit-III
1236.22
S-S gerilim
538.31
111
4.1.2. Formülasyonlarda Kullanılan Polimerler ve Yardımcı Maddelerle
OVA’in Etkileşimlerinin Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) ile
İncelenmesine Ait Bulgular
Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) Analizi Bölüm
3.2.1.3’te anlatıldığı gibi yapılmıştır. Ovalbumin’e ait termogram Şekil 25’te
görülmektedir. Şekilden de görüldüğü gibi endotermik pik 66.91°C’dedir.
Şekil 25: Ovalbumin’e ait termogram
OVA’in yardımcı maddelerle etkileşimlerini görmek için,
OVA’in 1:1 (a/a) oranında kitozan, Carbopol® 974P NF, yumurta fosfatidil
kolin ve kolesterol ile karıştırılmasıyla alınan termogramlar Şekil 26-29’da
görülmektedir. Termogramlardan da görüldüğü gibi yardımcı maddelerle
ovalbumin arasında herhangi bir etkileşmenin olmadığı saptandı.
112
Şekil 26: Ovalbuminin, kitozanın ve bunların fiziksel karışımlarının DSC termogramı
Şekil 27: Ovalbuminin, Carbopol 974P NF ’ün ve bunların fiziksel karışımlarının
®
DSC termogramı
113
Şekil 28: Ovalbuminin, yumurta fosfatidilkolinin ve bunların fiziksel karışımlarının
DSC termogramı
Şekil 29: Ovalbuminin, kolesterolün ve bunların fiziksel karışımlarının DSC
termogramı
114
4.2. Jel Formülasyonlarının Geliştirilmesi için Ön Formülasyon
Çalışmalarına Ait Bulgular
4.2.1. Kitozan Jel Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular
4.2.1.1. Fiziksel Görünüm ve pH Ölçümü
Bölüm 3.2.2.1’de verilen hazırlama yöntemine göre kitozan
ve
laktik
asit
kullanılarak
hazırlanan
ovalbumin
içermeyen
jel
formülasyonlarının ön formülasyon çalışmaları sırasında ölçülen pH
değerleri ve fiziksel görünümleri Tablo 16’da görülmektedir.
Tablo 16: OVA içermeyen kitozan-laktik asit jel formülasyonlarına ait ön-çalışma
formülasyonlarının karakterizasyonları
Formülasyon Kodu
pH
Görünüm
KL1
3.73
Çok az bulanık, viskozitesi düşük
KL2
3.15
Çok az bulanık, viskozitesi düşük
KL3
2.80
Çok az bulanık, viskozitesi düşük
KL4
2.60
Çok az bulanık, viskozitesi düşük
KL5
5.00
Çok bulanık, viskozitesi düşük
KL6
4.90
Çok bulanık, viskozitesi düşük
KL7
3.13
Çok az bulanık, viskozitesi düşük
KL8
2.90
Bulanıklık yok
KL9
2.60
Çok az bulanık, viskozitesi düşük
KL10
2.50
Bulanıklık yok
KL11
5.45
Çok bulanık, jel oluşmamış
KL12
5.02
Çok bulanık
KL13
2.80
Bulanık
KL14
2.80
Bulanıklık yok
KL15
2.58
Bulanık
KL16
2.60
Bulanıklık yok
115
Kitozan ve laktik asit ile hazırlanan jellerin pH’sı ve/veya
viskozitesi burundan uygulama açısından çok uygun olmadığı için kitozan
ve laktik asit ile nazal jel hazırlanmasından vazgeçildi.
Bölüm 3.2.2.1’de verilen hazırlama yöntemine göre Protasan
ve glasiyel asetik asit kullanılarak hazırlanan etkin madde içermeyen jel
formülasyonlarının ön formülasyon çalışmaları sırasında ölçülen pH
değerleri ve fiziksel görünümleri Tablo 17’de görülmektedir.
Tablo 17: OVA içermeyen Protasan-glasiyel asetik asit jel formülasyonlarına ait önçalışma formülasyonlarının karakterizasyonları
Formülasyon
Kodu
pH
Görünüm
PG1
3.78
Jel oluşmadı
PG2
3.83
PG3
3.73
PG4
3.60
Jel oluşmadı
Jel oluşmadı
Jel oluşmadı
Kullanılan oranlarda Protasan ve glasiyel asetik asit ile jel
oluşmamıştır. Bu nedenle polimer olarak protasan kullanılmasından da
vazgeçildi.
Bölüm 3.2.2.1’de verilen hazırlama yöntemine göre kitozan
ve glasiyel asetik asit kullanılarak hazırlanan ovalbumin içermeyen jel
formülasyonlarının ön formülasyon çalışmaları sırasında ölçülen pH
değerleri ve fiziksel görünümleri Tablo 18’de görülmektedir.
116
Tablo 18: OVA içermeyen Kitozan-glasiyel asetik asit jel formülasyonlarına ait önçalışma formülasyonlarının karakterizasyonları
pH
Görünüm
KG1
4.26
Çok az bulanık
KG2
3.92
Çok az bulanık
KG3
3.74
Çok az bulanık
KG4
3.60
Çok az bulanık
KG5
3.50
Çok az bulanık
KG6
3.40
Bulanıklık yok
KG7
2.90
Bulanıklık yok
KG8
5.98
Çok bulanık
KG9
5.97
Bulanık
KG10
5.96
Çok az bulanık
KG11
5.86
Çok az bulanık
KG12
5.57
Bulanıklık yok
KG13
3.30
Bulanıklık yok
KG14
2.80
Bulanıklık yok
KG15
5.97
Bulanık
KG16
5.74
Çok viskoz
KG17
4.04
Çok viskoz
Formülasyon
Kodu
4.2.1.2. Akış Özellikleri ve Viskozite Ölçümü
Ön
formülasyon
çalışmaları
sırasında
hazırlanan
jel
formülasyonlarından pH değerleri, akışkanlıkları ve görünümleri dikkate
alınarak seçilen formülasyonların viskozitesi ve akış özellikleri ölçülmüştür.
Kitozan ve glasiyel asetik asit içeren, Tablo 9’da içerikleri verilen jel
formülasyonlara ait akış reogramı Şekil 30’da görülmektedir
117
200
180
Kayma Hızı (1/s)
160
140
120
KG9
100
KG10
80
KG11
60
KG12
40
20
0
0
50
100
150
Kayma Gerilimi
200
250
(N/m2)
Şekil 30: Kitozan ve glasiyel asetik asit içeren jel formülasyonlarının 25°C’deki akış
reogramı
10 rpm’de (Kayma hızı: 20 s-1) ve spindle 52 kullanılarak
ölçülen viskozite değerleri Tablo 19’da görülmektedir.
Tablo 19: Ovalbumin içermeyen kitozan ve glasiyel asetik asit içeren jel
formülasyonlarının 10 rpm’deki viskozite değerleri
Jel
Viskozite
Formülasyonları
(mPa.s)
KG9
1358.46±30.4
KG10
2756.693±60
KG11
2766.63±102
KG12
3150.98±19.9
Kitozan ve glasiyel asetik asit içeren jellerden pH ve kıvam
açısından en uygun sonuçların alındığı %2 kitozan ve % 0.5 glasiyel asetik
asit (KG12) formülasyonunun kullanılmasına karar verildi.
118
4.2.2. Carbopol® 974P NF Jel Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular
4.2.2.1. Fiziksel Görünüm ve pH Ölçümü
Bölüm
3.2.2.2’de
verilen
hazırlama
yöntemine
göre
Carbopol 974P NF ve sodyum hidroksit kullanılarak hazırlanan ovalbumin
®
içermeyen jel formülasyonlarının ön formülasyon çalışmaları sırasında
ölçülen pH değerleri ve fiziksel görünümleri Tablo 20’de görülmektedir.
®
Tablo 20: OVA içermeyen Carbopol 974P NF -sodyum hidroksit jel
formülasyonlarına ait ön-çalışma formülasyonlarının karakterizasyonları
Formülasyon
Kodu
pH
Görünüm
CN1
7.50
Berrak, Viskozitesi uygun
CN2
5.50
Berrak, çok viskoz
CN3
4.99
Berrak, Viskozitesi uygun
CN4
4.50
Berrak,Viskozitesi çok düşük
CN5
3.88
Berrak, Viskozitesi uygun
CN6
4.26
Berrak, Viskozitesi uygun
CN7
4.25
Berrak, çok viskoz
CN8
4.22
Berrak, viskoz
Carbopol® 974P NF ve sodyum hidroksit kullanılarak
hazırlanan jellerin pH’sı nispeten düşük olduğu için, baz olarak
trietanolamin denendi.
Bölüm
3.2.2.2’de
verilen
hazırlama
yöntemine
göre
Carbopol® 974P NF ve trietanolamin kullanılarak hazırlanan ovalbumin
içermeyen jel formülasyonlarının ön formülasyon çalışmaları sırasında
ölçülen pH değerleri ve fiziksel görünümleri Tablo 21’de görülmektedir.
119
Tablo 21: OVA içermeyen Carbopol 974P NF- trietanolamin jel formülasyonlarına
ait ön-çalışma formülasyonlarının karakterizasyonları
®
Formülasyon
Kodu
pH
Görünüm
CT1
4.10
Berrak, Viskozitesi uygun
CT2
6.31
Berrak, Çok Viskoz
CT3
5.77
Berrak, Çok Viskoz
CT4
6.33
Berrak, Viskozitesi uygun
CT5
5.61
Berrak, Viskozitesi uygun
CT6
7.36
Berrak, Viskozitesi uygun
4.2.2.2. Akış Özellikleri ve Viskozite Ölçümü
Ön
formülasyon
çalışmaları
sırasında
hazırlanan
jel
formülasyonlarından pH değerleri, akışkanlıkları ve görünümleri dikkate
alınarak seçilenlerin viskozitesi ve akış özellikleri ölçülmüştür. Carbopol®
974P NF ve trietanolamin içeren, Tablo 11’de içerikleri verilen jel
formülasyonlara ait akış reogramı Şekil 31’de görülmektedir.
250
Kayma Hızı (1/s)
200
150
CT2
CT3
100
CT4
50
CT5
0
0
50
100
Kayma Gerilimi
150
200
(N/m2)
Şekil 31: Ovalbumin içermeyen Carbopol 974P NF ve trietanolamin içeren jel
®
formülasyonlarının 25°C’deki akış reogramı
120
10 rpm’de (Kayma hızı: 20 s-1) ve spindle 52 kullanılarak
ölçülen viskozite değerleri Tablo 22’de görülmektedir.
Tablo 22: Carbopol 974P NF ve trietanolamin içeren jel formülasyonlarının 10
rpm’deki viskozite değerleri
®
Jel
Viskozite
Formülasyonları (mPa.s)
CT2
4512.76±95
CT3
4622.1±19.9
CT4
4015.76±9.9
CT5
3061.52±9.9
Carbopol® 974P NF ve trietanolamin içeren jellerden pH ve
kıvam açısından en uygun sonuçların alındığı %0.25 Carbopol® 974P NF
ve 3 damla % 50 trietanolamin içeren formülasyonun kullanılmasına karar
verildi.
4.2.2.3. Ovalbumin
İçeren
Jel
Formülasyonlarının
Karakterizasyon
Çalışmaları
Yapılan ön-çalışmalar sonucunda pH, görünüm ve viskozite
açısından en uygun sonuçların alındığı formülasyonlara Bölüm 3.2.2.1.1.
ve 3.2.2.2.1’de açıklandığı gibi ovalbumin eklenerek tez çalışmamızda
kullanıldı. Bu formülasyonlara ait karakterizasyon çalışmaları sonuçları
Tablo 23’te ve Şekil 32-33’te görülmektedir.
Tablo 23: Ovalbumin içeren sonuç jel formülasyonlarına ait pH ve 10 rpm (Kayma
-1
hızı: 20 s )’deki viskozite değerleri
Jel Formülasyonları
pH
Viskozite (mPa.s)
OVA-KG12
5,64
2952,18 ± 9,94
OVA-CT4
5,98
3157,6 ± 5,74
121
250
Kayma Hızı (1/s)
200
150
OVA-KG12
100
OVA-CT4
50
0
0
50
100
150
Kayma Gerilimi
200
250
(N/m2)
Şekil 32: Ovalbumin içeren sonuç jel formülasyonlarına ait akış reogramı (kayma
gerilimi-kayma hızı)
3500
viskozite (mPa.s)
3000
2500
2000
OVA-KG12
1500
OVA-CT4
1000
500
0
0
50
100
150
200
250
300
Kayma Hızı (1/s)
Şekil 33: Ovalbumin içeren sonuç jel formülasyonlarına ait akış reogramı
(kayma hızı-viskozite)
122
4.2.3. Lipozom Formülasyonlarına Ait Bulgular
4.2.3.1. Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyeli
Ovalbumin
içermeyen
ve
içeren
lipozomların
bölüm
3.2.4.2.1’de ve 3.2.4.2.2’de anlatıldığı gibi ekstrüksiyon öncesinde ve
sonrasında, partikül büyüklüğü ve zeta potansiyel değerleri ölçüldü, bu
değerler Tablo 24’te, partikül büyüklüğü ve zeta potansiyel grafikleri ise
Şekil 34-37’de görülmektedir.
Tablo 24: Ovalbumin içermeyen ve içeren lipozom formülasyonlarının partikül
büyüklüğü ve zeta potansiyel değerleri
Ekstrüksiyon Sonrası
Ekstrüksiyon Öncesi
Partikül
Polidispersite
Zeta
Partikül
Polidispersite
Zeta
Büyüklüğü
İndeksi±SS
Potansiyeli
Büyüklüğü
İndeksi±SS
Potansiyeli
(mV) ±SS
(nm) ±SS
(nm)±SS
OVA
(mV) ±SS
7176,6±752.5
1.00
-2.9± 0.79
256±9.64
0.293±0.06
-14±0.6
3643.3±757
0.835±0.18
-8.45±8.27
204.3±6.1
0.282±0.04
-5.33±2.01
içermeyen
OVA
içeren
123
1.
Paralel
2.
Paralel
3.
Paralel
Eks.
Önce
Eks.
Sonra
Şekil 34: OVA içermeyen lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası partikül büyüklüğü dağılımları
124
1.
Paralel
2.
Paralel
3.
Paralel
Eks.
Önce
Eks.
Sonra
Şekil 35: OVA içeren lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası partikül büyüklüğü dağılımları
125
1.
Paralel
2.
Paralel
3.
Paralel
Eks.
Önce
Eks.
Sonra
Şekil 36: OVA içermeyen lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası zeta potansiyel grafikleri
126
1. Paralel
2. Paralel
3. Paralel
Eks.
Önce
Eks.
Sonra
Şekil 37: OVA içeren lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası zeta potansiyel grafikleri
127
4.2.3.2. Lipozomların Yükleme Kapasitesinin Ölçülmesi
Yükleme kapasitesine ait çalışmalar Bölüm 3.2.4.2.3’te
anlatıldığı gibi yapıldı. BCA yöntemine göre lipozoma yüklenen ovalbumin
miktarı hesaplandı. BCA yönteminin uygulanması sonucu elde edilen
kalibrasyon doğrusu ve denklemi Şekil 38’de görülmektedir.
2,5
y = 0,0011x + 0,1129
R² = 0,9939
Absorbans
2
1,5
A
1
Linear (A)
0,5
0
0
500
1000
1500
2000
2500
Konsantrasyon (mcg/mL)
Şekil 38: BCA tayini kalibrasyon doğrusu ve denklemi
Buna
göre
hazırlanan
lipozoma
ovalbuminin
yükleme
yüklenmiş
lipozom
kapasitesi % 73.15±% 0.21 bulunmuştur.
4.2.3.3. Lipozomların Işık Mikroskobu Görüntüleri
Ovalbumin
yüklenmemiş
ve
formülasyonunun ekstrüksiyon öncesi görüntüleri sırasıyla Şekil 39-40’ta
verilmiştir.
128
Şekil 39: Ovalbumin yüklenmemiş lipozom formülasyonunun ekstrüksiyon öncesi
ışık mikroskobu görüntüsü (x40)
Şekil 40: Ovalbumin yüklenmiş lipozom formülasyonunun ekstrüksiyon öncesi ışık
mikroskobu görüntüsü (x40)
Lipozom formülasyonlarının ekstrüksiyon öncesinde çok
tabakalı lipozom oldukları görülmektedir. Ekstrüksiyon sonrası partikül
boyutu çok küçülen lipozomlar ışık mikroskobu ile görüntülenememiştir.
129
4.2.3.4. Lipozomların Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) Görüntüleri
Ovalbumin
yüklenmiş
ve
yüklenmemiş
lipozom
formülasyonunun ekstrüksiyon işlemi öncesi ve sonrası, Bölüm 3.2.4.2.5’te
anlatıldığı gibi alınan yüzey özelliklerine ilişkin TEM görüntüleri Şekil 4142’de görülmektedir.
OVA İçermeyen Lipozomların TEM Görüntüleri
Eks.
Önce
Ölçek büyütme:9300x
Ölçek büyütme:13000x
Ölçek büyütme:13000x
Ölçek büyütme:98000x
Eks.
Sonra
Şekil 41: OVA içermeyen lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası yüzey
görüntüleri
130
OVA İçeren Lipozomların TEM Görüntüleri
Eks.
Önce
Ölçek büyütme:6800x
Ölçek büyütme:4800x
Ölçek büyütme:9300x
Ölçek büyütme:30000x
Eks.
Sonra
Ölçek büyütme:49000x
Şekil 42: OVA içeren lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve sonrası yüzey görüntüleri
131
Ekstrüksiyon öncesinde boyutun 2.4-7 µm civarlarındayken,
ekstrüksiyon sonrasınde 200 nm’lere düştüğü TEM görüntülerinde
görülmektedir.
4.2.3.5. Lipozomların Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Görüntüleri
Ovalbumin
formülasyonunun
yüklenmiş
ekstrüksiyon
işlemi
ve
yüklenmemiş
öncesi
ve
sonrası,
lipozom
Bölüm
3.2.4.2.6’da anlatıldığı gibi alınan yüzey özelliklerine ilişkin SEM
görüntüleri Şekil 43-44’te görülmektedir.
132
OVA İçermeyen Lipozomların SEM Görüntüleri
Eks.
Önce
Eks.
Sonra
Şekil 43: Ovalbumin yüklenmemiş lipozom formülasyonunun ekstrüksiyon öncesi
ve sonrası SEM görüntüleri
133
Eks.
Önce
Eks.
Sonra
Şekil 44: Ovalbumin yüklenmiş lipozom formülasyonunun ekstrüksiyon öncesi ve
sonrası SEM görüntüleri
134
4.2.4.Jel İçinde Lipozom Formülasyonlarının Karakterizasyonları
Ovalbumin
içermeyen
ve
içeren
jel
içinde
lipozom
formülasyonların pH, viskozite ve görünümleri Tablo 25’te, akış reogramı
ise şekil 45’te görülmektedir.
Tablo 25: Jel içinde lipozom formülasyonlarının pH, viskozite ve görünümleri
Formülasyon
Görünüm
pH
Viskozite
KL* Jel
Şeffaf
5.74
2302.76±44.8
KL*-OVA Jel
Şeffaf
5.71
2478.373±30.4
Kodu
*KL: Kitozan (KG12) - lipozom jel
135
Kayma Hızı-Kayma Gerilimi
300
Kayma Hızı (1/s)
250
200
150
KL
100
KL-OVA
50
0
0
50
100
Kayma Gerilimi
150
200
(N/m2)
Kayma Hızı-Viskozite
3000
viskozite (mPa.s)
2500
2000
1500
KL
1000
KL-OVA
500
0
0
50
100
150
200
250
300
Kayma Hızı (1/s)
Şekil 45: Ovalbumin içermeyen ve içeren jel içinde lipozom formülasyonların
25°C’deki akış reogramları
136
4.2.5. SDS-PAGE Analizi Bulguları
4.2.5.1. Jel Formülasyonlardaki Ovalbumin’in SDS-PAGE Analizi Bulguları
Ovalbumin’in
formülasyonlarında
kitozan
bütünlüğünü
ve
Carbopol®
koruyup
974P
korumadığını
NF
jel
göstermek
amacıyla SDS-PAGE analizi gerçekleştirildi. SDS-PAGE analizi, Bölüm
3.2.6’da detaylı olarak anlatılmıştır. Jel formülasyonlarına ait SDS-PAGE
analizi bulguları Şekil 46’da görülmektedir.
Şekil 46: Kitozan ve Carbopol 974P NF jel formülasyonlarındaki Ovalbumin’in
®
SDS-PAGE analizi sonucu
Her iki jel formülasyonunda da Ovalbumin bütünlüğünü korumuştur.
137
4.2.5.2. Lipozom Formülasyonlardaki Ovalbumin’in SDS-PAGE Analizi
Bulguları
Ovalbumin’in lipozom formülasyonunda bütünlüğünü koruyup
korumadığını göstermek amacıyla Bölüm 3.2.6’da anlatıldığı gibi SDSPAGE analizi gerçekleştirildi. Lipozom formülasyonuna ait SDS-PAGE
analizi bulgusu Şekil 47’de görülmektedir.
Şekil 47: Ovalbumin yüklenmiş lipozom formülasyonuna ait SDS-PAGE analizi
sonucu
Hazırladığımız
lipozom
formülasyonunda
Ovalbumin
bütünlüğünü korumuştur.
4.2.5.3. Jel İçinde Lipozom Formülasyonlardaki Ovalbumin’in SDS-PAGE
Analizi Bulguları
Bölüm 3.2.6’de anlatılan adımlar izlenmesine karşın, jel
içinde lipozom formülasyonları SDS-PAGE tankındaki jele başarıyla
138
uygulanamamış,
jel
kuyucuğa
uygulanan
numunede
katılaşma,
topaklanma gözlenmiştir. Analiz sonrasında Şekil 48’de görülen yerde jel
içinde lipozom içindeki OVA bandı çıkması gerekirken, OVA bandı
gözlenememiştir.
Şekil 48: Ovalbumin yüklenmiş jel içinde lipozom formülasyonuna ait SDS-PAGE
analizi sonucu
Bu durum, jel içinde lipozom formülasyonlarında ovalbuminin
yapısal bütünlüğünü koruyamadığını değil, formülasyonun SDS-PAGE
jeline uygulanamadığını göstermektedir.
4.2.6. Hücre Yaşayabilirliği (Sitotoksisite) Bulguları
Hazırlanan
yaşayabilirliğine
jel
etkisinin
ve
lipozom
formülasyonlarının
değerlendirilebilmesi
amacıyla
hücre
akciğer
adenokarsinom hücreleri olan Calu-3 hücre dizisi ve MTT kullanılarak,
bölüm 3.2.7’de anlatıldığı gibi sitotoksisite analizi yapılmıştır. Bu analize ait
bulgular Şekil 49’da görülmektedir.
139
120
% Yaşayabilirlik
100
80
60
40
20
0
OVA
çözeltisi
KG12
OVA-KG12
LİP
LİP-OVA
CT4
CT4-OVA
Şekil 49: Formülasyonların Calu-3 hücrelerinin yaşayabilirliğine etkisi
Hücre yaşayabilirliği, OVA içeren formülasyonlar ile muamele
edilen hücreler tarafından üretilen formazan miktarının, kontrol hücreleri
tarafından üretilen miktara oranı ile değerlendirilir. Burada kontrol grubu
olarak ovalbumin çözeltisi uygulanan hücre dizisi seçilmiştir. Kontrol
grubunun yaşayabilirliği % 100 varsayılarak, diğer formülasyonların %
yaşayabilirliği hesaplanmıştır. Buna göre hazırlanan formülasyonların
Calu-3 hücrelerine karşı güvenli olduğu söylenebilir.
4.2.7. Fiziksel Stabilite Çalışmaları
Jel ve lipozom formülasyonlarının 7 ay süreyle 4°C, 25°C
koşullarında bekletilerek, 0. Gün, 7. Gün, 15. Gün, 30. Gün, 60. Gün, 90.
140
Gün, 4. Ay, 5. Ay ve 7. Ay’daki fiziksel stabilite verileri ilerleyen bölümlerde
sunulmaktadır.
4.2.7.1. Jel Formülasyonların Fiziksel Stabilite Çalışması Bulguları
Jel
formülasyonlar
üzerinde
yapılan
fiziksel
stabilite
çalışmalarına ait pH ve 10 rpm’deki viskozite bulguları Tablo 26-28’de
görülmektedir.
Tablo 26: KG12 ve OVA + KG12 jel formülasyonlarına ait fiziksel stabilite sonuçları
4°C
25°C
Viskozite
Formülasyon
KG12
OVA - KG12
Zaman
Viskozite
pH
(mPa.s)±SS
pH
(mPa.s) ±SS
0. gün
5.57
3150.98±19.9
5.64
3121.16±29.82
7. gün
5.60
2962.12±9.94
5.70
2471.7±5.74
15. gün
5.65
2312.706±11.47
5.67
1706.36±11.47
1. ay
5.71
2693.74±17.2
5.72
1928.36±39.76
2. ay
5.87
2431.986±84.5
5.80
1606.96±40.17
3. ay
5.66
2455.18±26.3
5.80
2004.57±25.01
4. ay
5.63
2309.39±50.03
5.69
1229.25±11.47
5. ay
5.71
2591.03±15.18
5.80
1381.66±9.94
7. ay
5.96
2571.15±15.18
5.96
1394.91±5.74
0. gün
5.64
2952.18±9.94
5.53
2760.006±5.74
7. gün
5.69
2017.82±19.8
5.51
1043.7±9.94
15. gün
5.75
1593.713±20.7
5.49
791.886±5.74
1. ay
5.86
887.973±25.01
5.58
675.92±9.94
2. ay
5.93
712.36±30.4
5.63
619.593±40.2
3. ay
5.77
761.7±14.75
5.51
709.05±5.74
4. ay
5.69
Ölçülmedi
5.52
Ölçülmedi
5. ay
5.79
Ölçülmedi
5.61
Ölçülmedi
7. ay
6.07
Ölçülmedi
5.79
Ölçülmedi
141
Tablo 27: CT4 ve OVA + CT4 jel formülasyonlarına ait fiziksel stabilite sonuçları
4°C
25°C
Viskozite
Formülasyon
CT4
OVA - CT4
Zaman
Viskozite
pH
(mPa.s) ±SS
pH
(mPa.s) ±SS
0. gün
6.86
3836.84±55.3
6.33
3472.373±15.2
7. gün
6.87
4469.68±34.9
6.31
3465.75±11.5
15. gün
6.69
5006.446±22.95
6.36
4065.46±45.5
1. ay
6.70
2544.64±19.8
6.14
3800.393±20.7
2. ay
6.56
3982.6±5.74
6.33
3744.06±34.9
3. ay
6.40
4608.85±99.6
6.25
3873.29±5.74
4. ay
6.40
4436.55±15.2
6.14
4168.17±30.4
5. ay
6.53
3926.3±9.94
6.20
4121.79±50.03
7. ay
6.66
5218,5
6.14
2862.72±26.3
0. gün
5.98
3157.606±5.7
6.21
2982
7. gün
5.99
3273.573±15.2
6.27
3392.85±28.7
15. gün
5.97
3863.346±5.7
6.23
3001.88±34.4
1. ay
6.00
3008.506±30.4
6.26
2431.986±35
2. ay
6.09
3985.94±45.5
6.37
1447.926±35
3. ay
6.03
3641.35±34.9
6.20
1378.35±5.7
4. ay
6.17
3293.45±74.6
6.30
1544.01±15.2
5. ay
6.20
3455.81±34.9
6.41
1391.6±45.5
7. ay
6.45
4575.71±5.74
6.90
2395.54±29.8
142
Tablo 28: KL ve KL + OVA jel formülasyonlarına ait fiziksel stabilite sonuçları
4°C
Formülasyon
Zaman
pH
25°C
Viskozite
pH
(mPa.s)
KL
KL - OVA
Viskozite
(mPa.s)
0. gün
5,74
2302.76±44.8
5,76
2567.83±20.7
7. gün
5,76
2243.126±15.2
5,76
2233.18±30.36
15. gün
5,86
1815.706±5.74
5,69
1570.52±49.7
1. ay
5,95
2365.72±69.9
5,77
1739.5±29.8
2. ay
6,04
1901.853±11.47
5,85
815,08
3. ay
5,87
2209.99±5.74
5,74
699.11±34.9
4. ay
5,78
1739.5±39.76
6,13
Ölçülmedi
5. ay
5,87
1580.46±59.6
Ölçülmedi
Ölçülmedi
7. ay
6,12
1636.79±5.74
Ölçülmedi
Ölçülmedi
0. gün
5,71
2478.373±30.4
5,65
2415,42
7. gün
5,72
2077,46
5,65
1474.43±20.7
15. gün
5,75
1166.293±34.9
5,59
1103.34±26.3
1. ay
5,84
834.96±19.8
5,68
778.63±5.74
2. ay
5,94
606.34±26.3
5,74
483.746±15.2
3. ay
5,76
513.57±5.74
5,6
390.97±5.74
4. ay
5,73
619.59±54.7
5,62
Ölçülmedi
5. ay
5,8
785.26±26.3
5,71
Ölçülmedi
7. ay
6,04
473.81±5.74
5,87
Ölçülmedi
4.2.7.2. Lipozomların Fiziksel Stabilite Çalışması Bulguları
Ovalbumin içeren ve içermeyen lipozom formülasyonlarına
ait 7 aylık stabilite çalışması sonuçları Tablo 29 ve Şekil 50-53’te
görülmektedir.
143
Tablo 29: Ovalbumin içeren ve içermeyen lipozom formülasyonlarına ait fiziksel stabilite çalışması sonuçları
4°C
Formülasyon
Zaman
Partikül
Polidispersite
Büyüklüğü (nm)
Indeksi±SS
25°C
Zeta Potansiyeli Partikül Büyüklüğü
(mV) ±SS
(nm) ±SS
Polidispersite
Zeta Potansiyeli
Indeksi±SS
(mV) ±SS
±SS
LİP
LİP-OVA
0. gün
256±9.64
0.293±0.06
-14±0.6
222±6.24
0.3±0.05
-8.15±1.34
7. gün
213.3±8.5
0.271±0.035
-5.25±2.85
216±5.29
0.292±0.028
-5.06±0.6
15. gün
203.3±1.15
0.23±0.019
-8.2±4.2
224.3±10.1
0.358±0.06
-4.77±0.9
1. ay
258.3±3.79
0.32±0.07
-7.7±1.09
234.3±1.53
0.229±0.025
-10.5±4.09
2. ay
251±1.73
0.276±0.0072
-10.37±2.75
193±2
0.135±0.0128
-10.6±0.436
3. ay
236.6±5.03
0.285±0.042
-7.436±0.14
192.3±3.05
0.185±0.023
-15.023±5.34
4. ay
200.3±6.028
0.215±0.0075
-5.38±0.91
238.6±7.77
0.3036±0.074
-13.6±0.25
5. ay
223.6±6.35
0.2183±0.056
-13.06±2.85
210±5
0.2436±0.027
-10.75±0.785
7. ay
213.3±1.155
0.233±0.034
-5.263±1.006
186.3±1.53
0.1697±0.053
-9.12±1.186
0. gün
204.3±6.1
0.282±0.04
-5.33±2.01
185±6.08
0.27±0.032
-16.5±1.5
7. gün
191.6±12.7
0.296±0.03
-3.32±0.22
181±4.58
0.324±0.04
-3.97±1.2
15. gün
183.3±10.7
0.25±0.02
-8.48±0.71
185.3±10.5
0.383±0.02
-4.51±0.6
1. ay
224.3±11.9
0.36±0.023
-4.8±1.44
199.6±2.52
0.283±0.008
-8.13±0.875
2. ay
199.6±2.3
0.319±0.03
-3.91±0.685
286.6±9.073
0.246±0.056
-6,75±1,87
3. ay
206.6±22.6
0.346±0.041
-8.54±0.7
203.6±11.9
0.302±0.048
-8,77±3,4
4. ay
200.6±5.13
0.283±0.064
-13.1±1.75
187.3±17
0.287±0.075
-7.743±0.123
5. ay
206±9
0.215±0.051
-11.26±0.61
198.3±5.5
0.302±0.062
-10.83±0.153
7. ay
197±6
0.281±0.049
-5.92±3.8
201.6±12.09
0.344±0.07
-8.053±0.625
144
Şekil 50: OVA içermeyen lipozomun 4°C ve 25°C’taki 7 aylık partikül büyüklüğü
dağılımı grafiği
Şekil 51: OVA içeren lipozomun 4°C ve 25°C’taki 7 aylık partikül büyüklüğü dağılımı
grafiği
145
LİP Zeta Potansiyeli
0
-5
0. 7. 15. 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 5. ay 7.ay
gün gün gün
-10
Zeta Potansiyeli (mV)-4 C
Zeta Potansiyeli (mV)-25 C
-15
-20
-25
Şekil 52: OVA içermeyen lipozomun 4°C ve 25°C’taki 7 aylık zeta potansiyeli grafiği
LİP-OVA Zeta Potansiyeli
0
-2
-4
0. 7. 15. 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 5. ay 7.ay
gün gün gün
-6
-8
-10
-12
Zeta Potansiyeli (mV)-4 C
Zeta Potansiyeli (mV)-25 C
-14
-16
-18
-20
Şekil 53: OVA içeren lipozomun 4°C ve 25°C’taki 7 aylık zeta potansiyeli grafiği
146
4.2.8. Jel Formülasyonlarda Mukoadezyon Çalışmalarına ait Bulgular
Formülasyonların
burun
mukozasında
kalış
sürelerinin
artması, etkinliklerini artırıcı bir faktördür. Bu nedenle, hazırlanan jel
formülasyonlarının nazal mukozaya adezyonları bölüm 3.2.9’da anlatıldığı
gibi yapıldı. Koyun burun mukozası kullanılarak yapılan mukoadezyon
çalışmasına ait bulgular Şekil 54-60 ile Tablo 30’da sunulmaktadır.
Şekil 54: KG12 jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği
147
Şekil 55: OVA-KG12 jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği
148
Şekil 56: CT4 jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği
Şekil 57: OVA-CT4 jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği
149
Şekil 58: KL-OVA jel formülasyonuna ait kuvvet-mesafe grafiği
Tablo 30: Jel formülasyonlarına ait mukoadezyon ölçümünün sonuçları
Formülasyonlar
Kuvvet (N)
İş(N.mm)
Mukoadezyon İşi(N.mm/cm )
KG12
0.217±0.018
0.038±0.012
0.012±0.027
OVA-KG!2
0.1405±0.027
0.079±0.009
0.025±0.027
CT4
0.116±0.012
0.052±0.011
0.017±0.004
OVA-CT4
0.122±0.003
0.055±0.011
0.017±0.003
KL-OVA
0.264±0.019
0.033±0.012
0.010±0.004
2
150
Mukoadhezif Kuvvet (N)
0,3
0,25
0,2
0,15
Kuvvet (N)
0,1
0,05
0
KG12
OVA-KG!2
CT4
OVA-CT4
KL-OVA
Şekil 59: Jel formülasyonlara ait mukoadezif kuvvet grafiği
Mukoadezyon İşi(N.mm/cm2)
0,06
0,05
0,04
0,03
Mukoadezyon
İşi(N.mm/cm2)
0,02
0,01
0
-0,01
KG12
OVA-KG!2
CT4
OVA-CT4
KL-OVA
-0,02
Şekil 60: Jel formülasyonlara ait mukoadezif iş grafiği
151
4.2.9. Jel Formülasyonlarda Yapı Profil Analizi (Texture Profile Analysis)
Bulguları
Jellerin mekanik özelliklerinin belirlenebilmesi için Bölüm
3.2.10’da anlatıldığı gibi TPA yöntemi kullanılarak jellerin, sertlik,
kırılganlık, adheziflik,
elastiklik, koheziflik, yapışkanlık (sakızımsılık),
dirençlilik (resilience) gibi özellikleri incelenmiştir (Tablo 31 ve Şekil 6169).
Tablo 31: Jel Formülasyonların mekanik özellikleri
152
Sertlik (g)
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
181,677
137,129
Sertlik (g)
42,7
KG12
34,49
27,842
OVA-KG12
CT4
OVA-CT4
KL-OVA
Şekil 61: Jellere ait sertlik grafiği
Adeziflik (g.s)
0
-20
-40
KG12
OVA-KG12
-19,447
-19,289
CT4
OVA-CT4
KL-OVA
-17,188
-60
Adheziflik (g.s)
-80
-100
-120
-140
-109,3
-124,39
-160
Şekil 62: Jellere ait adeziflik grafiği
153
Koheziflik
1,2
1
0,8
0,6
Koheziflik
0,4
0,2
0
KG12
OVA-KG12
CT4
OVA-CT4
KL-OVA
Şekil 63: Jellere ait koheziflik grafiği
Elastiklik
1,2
1
0,8
0,6
Elastiklik
0,4
0,2
0
KG12
OVA-KG12
CT4
OVA-CT4
KL-OVA
Şekil 64: Jellere ait elastiklik grafiği
154
Şekil 65: KG12 jel formülasyonuna ait TPA grafiği
155
Şekil 66: OVA-KG12 jel formülasyonuna ait TPA grafiği
Şekil 67: CT4 jel formülasyonuna ait TPA grafiği
156
Şekil 68: OVA-CT4 jel formülasyonuna ait TPA grafiği
Şekil 69: KL-OVA jel formülasyonuna ait TPA grafiği
157
5. TARTIŞMA
Aşılar, hastalıkların önlenmesinde toplum sağlığı açısından
oldukça önemlidir. Yıllar önce yaşamın doğal bir parçası olan ve birçok
ölüme neden olan hastalıklar son yıllarda geliştirilen aşılar sayesinde
önlenebilmektedir. Özellikle, sosyo-ekonomik durumu düşük olan ve
gelişmekte olan ülkelerdeki bulaşıcı hastalıkların önlenmesi amacı ile
Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) çeşitli aşılama programlarını organize
etmektedir.
Aşılamada daha kolay ve daha etkili uygulama yolları ve yeni
formülasyonların geliştirilmesi ile toplum sağlığının korunmasına katkı
sağlanmaktadır.
Nazal aşılamanın diğer aşılama yollarına göre üstünlükleri
dikkate alınarak, tez çalışmamızda model antijen olarak ovalbuminin nazal
aşı formülasyonları geliştirilmeye çalışılmıştır.
Tez çalışması kapsamında yapılan tüm çalışmalar deneysel
çalışmalardan elde edilen bulgular doğrultusunda değerlendirilecektir.
5.1. OVA ile Yapılan In Vitro Çalışmalar
5.1.1. Ovalbumin’in FT-IR Spektrumuna Ait Bulguların Değerlendirilmesi
OVA yaklaşık 385 amino asitten oluşan makromoleküler
yapıda bir proteindir. Şekil 24’te görülen 1632.64 cm-1 absorpsiyon bandı
C=O gerilim bandını göstermekte olup, Amit-I, β tabakalı yapıyı ve
158
1309.88 cm-1 absorpsiyon bandı da Amit-III bağı ile N-H eğilim, C-N
gerilim bantları ile α heliks yapısını göstermektedir. Bulunan sonuçlar,
literatür ile uyumludur194.
5.1.2. Formülasyonlarda Kullanılan Polimerler ve Yardımcı Maddelerle
OVA’in Etkileşimlerinin DSC ile İncelenmesi
OVA ile ayrı ayrı kitozan, Carbopol® 974P NF, yumurta
fosfatidil kolin ve kolesterol 1:1 (a/a) oranlarında karıştırılarak hazırlanan
fiziksel karışımlarının DSC termogramları (Şekil 25-29) incelendiğinde;
OVA
protein
yapısında
olduğu
için
spesifik
bir
endotermik
pik
gözlenememiştir. Şekil 26-29’da görüldüğü gibi kitozan, Carbopol 974P
®
NF, yumurta fosfatidil kolin ve kolesterol ile OVA’nın herhangi bir etkileşimi
bulunmamaktadır.
5.2. Önformülasyon Çalışmaları
Nazal yolla uygulamada nazal mukozaya uygun pH’da (pH
5-7) ve antijen olarak OVA’in nazal mukozada daha uzun süre kalışını
sağlamak amacıyla uygun viskozitede jel formülasyonları geliştirilmeye
çalışılmıştır.
5.2.1. Kitozan Jel Formülasyonları
Kitozan ve diğer bir tipi olan Protasan® ile jelleşme ajanı
olarak laktik asit ve glasiyel asetik asit kullanılarak jel formülasyonları
hazırlanmış ve karakterize edilmiştir.
159
Kitozan ile laktik asitin çeşitli konsantrasyonları kullanılarak
hazırlanan jellerden, kitozan miktarı sabit tutulup laktik asit miktarı düşük
tutulduğunda pH, burun pH’sına yakın olmuştur ancak viskozite çok düşük
olup, jelleşme gerçekleşmemiştir. Laktik asit miktarı artırıldığında ise
jelleşme olmuştur. Ancak oluşan jeller burun pH’sına göre çok asidik
olmuştur. Bu durumun burunda irritasyona yol açabileceği düşünülmüştür.
Farklı kitozan ve farklı laktik asit oranları denenerek hazırlanan 16 adet
formülasyon ile hedeflenen pH değerine ve viskoziteye ulaşılamamıştır. Bu
nedenle kitozan ve laktik asit ile jel hazırlanmasından vazgeçilmiştir.
Jelleşme ajanı olarak glasiyel asetik asit kullanılarak
hazırlanan 17 adet jel formülasyonundan istenilen pH ve viskoziteye sahip
formülasyonlar elde edilmiştir. KG9, KG10, KG11 ve KG12 kodlu jellerin
pH değerleri sırasıyla 5.97, 5.96, 5.86 ve 5.57’dir.
Şekil 30’daki kayma gerilimine karşı kayma hızı reogramında
da görüldüğü gibi jeller pseudoplastik akış özelliği göstermektedir. Kitozan
konsantrasyonu sabit tutularak, glasiyel asetik asit oranı % 0.2’den %
0.5’e
kadar
arttırıldığında
viskozite
değerlerinin
arttığı
(p<0.05)
saptanmıştır (Tablo 18).
Protasan®’ın denendiği formülasyonlarda farklı glasiyel asetik
asit oranları denendiği halde jel oluşumu gözlenmemiştir. Kullanılan
kitozanların farklı molekül ağırlığında ve farklı deasetilasyon derecelerine
sahip olmalarından dolayı jelleşmenin olmadığı düşünülmektedir.
Yapılan ön formülasyon çalışmaları sonucunda, hazırlanan
formülasyonlar arasında görünüş, kıvam ve pH değerleri açısından en
160
uygun formülasyon % 2 kitozan, % 0.5 Glasiyel asetik asit içeriği ile KG12
bulunmuştur. Bundan sonra tez çalışmalarımıza bu formülasyon ile devam
edilmiştir.
5.2.2. Carbopol® 974P NF Jel Formülasyonları
Jel formülasyonlarının hazırlanmasında en çok kullanılan
polimerlerden biri olan Carbopol®, polialkanileter ya da divinil glikol ile
bağlanmış akrilik asidin yüksek molekül ağırlığındaki sentetik polimeridir.
Sodyum hidroksit, trietanolamin gibi polar organik aminler ve lauril, stearil
aminlerle nötralize edilerek jel oluşturulur 195.
Tez çalışmamızda farklı Carbopol® 974P NF oranları (% 0.2,
0.3, 0.4, 0.5, 0.8) kullanılarak sodyum hidroksit (NaOH) ile nötralizasyon
yapılıp, jeller oluşturuldu. Carbopol® 974P NF ve sodyum hidroksit
kullanılarak hazırlanan ovalbumin içermeyen jel formülasyonlarında,
Carbopol® 974P NF miktarı sabit tutularak hazırlanan jellerde NaOH
miktarı arttıkça jellerin görünümünün berraklaştığı ancak viskozitesinin çok
fazla arttığı gözlenmiştir. NaOH miktarı düşük tutulduğunda ise hem pH
düşük olmuştur hem de kıvamları burundan uygulama açışından uygun
olmamıştır.
Carbopol®
974P
NF
ile
yapılan
önformülasyon
çalışmalarımıza trietanolamin jelleşme ajanı alınarak devam edilmiştir.
Denenen
trietanolamin
konsantrasyonlarından
en
rahat
%
50’lik
trietanolamin ile çalışılabilmiştir.
161
Bölüm 3.2.2.2’de açıklandığı gibi hazırlanan Carbopol® 974P
NF jellerin pH değerleri 4.10 ile 7.36 arasında bulunmuştur. % 0.3
Carbopol® 974P NF ile hazırlanan jellerin pH değerleri nazal uygulama için
uygun bulunmamıştır. CT2, CT3, CT4 ve CT5 kodlu Carbopol® 974P NF
jeller de kitozan jeller gibi pseudoplastik akış özellikleri göstermiştir.
Hazırlanan Carbopol® 974P NF jellerin viskozite değerleri,
Carbopol® 974P NF ve trietanolamin oranlarına bağlı olarak değişmiştir.
Jellere ilave edilen trietanolamin miktarına bağlı olarak viskozite
değerlerinin arttığı (p<0.05) saptanmıştır (Tablo 22).
Önformülasyon
çalışmalarımız
sonucunda
CT4
kodlu
Carbopol® 974P NF (% 0.25 Carbopol® 974P NF ve %50 trietanolamin)
jelin uygun olduğu görülmüştür.
5.3. Ovalbumin İçeren Jel Formülasyonlarının Karakterizasyonu
Önformülasyon çalışmalarımız sonucunda pH, görünüm ve
viskozite açısından en uygun bulduğumuz kitozan jel ve Carbopol® 974P
NF jel formülasyonlarına antijen model madde olarak seçtiğimiz ovalbumin
ekleyerek sonuç jel formülasyonları sırasıyla Bölüm 3.2.2.1.1 ve
3.2.2.2.1’de açıklandığı gibi hazırlandı.
Ovalbumin içeren kitozan jel formülasyonunun pH değeri
5.64, Carbopol® 974P NF jel formülasyonunun ise 5.98 olarak ölçülmüştür.
Her iki jelin de pH değerleri burnun fizyolojik pH’sına uygundur.
162
Ovalbumin içeren Carbopol® 974P NF jelin viskozitesi
(3157.6 ± 5.74), kitozan jele (2952.18 ± 9.94) göre daha yüksek
değerdedir. Bunun da kullanılan farklı polimer tiplerinden kaynaklandığı
düşünülmektedir.
Ovalbumin içeren jel formülasyonlarının akış özelliğinin
doğrusal olmadığı, pseudoplastik akış özelliğinde olduğu gözlenmiştir.
Jellerin viskozitesi burunda kalış süreci açısından ve herhangi bir
uygulama aleti ile uygulanma açısından uygundur.
5.4. Lipozom Formülasyonları
Tez çalışmamızda jel formülasyonların yanı sıra lipozom
formülasyonunun da geliştirilmesi amaçlanmıştır. Mukozal bağışıklık
yanıtlarını arttırmanın bir yolu da lipozom taşıyıcı sistemlerdir196.
Lipozomlar, daha çok sistemik bağışıklık amacıyla kullanılmalarına karşın,
son zamanlarda oral197-200 ve intranazal201-203 veriliş sonucunda etkili
mukozal bağışıklık yanıtları oluşturduğu görülmüştür. Ayrıca OVA da
protein yapısında olduğu için lipozom içine yüklenmesinin stabilitesini
arttırabileceği düşünülmüştür.
Son zamanlarda jel çekirdekli lipozom formülasyonlarının da
intranazal aşı olarak uygulanabileceği literatürde görülmüştür85,
114, 115
.
Bölüm 3.2.5.1’de açıklandığı gibi jel çekirdekli lipozom formülasyonu
hazırlanmaya
çalışılmıştır.
Yapılan
ön
çalışmalar
sonucunda
film
hidrasyon yöntemi ile hazırlanan lipozomların Carbopol 974P NF ile jel
®
çekirdekli lipozomları elde edilememiştir. Lipozomların nazal yoldan daha
etkin
uygulanabilmesi
ve
burunda
kalış
süresini
arttırmak
için
163
çalışmamızda Bölüm 3.2.5.2’de açıklandığı gibi jel içinde lipozom
formülasyonu hazırlanmıştır. Bu amaçla da hazırlanan lipozomların
kitozan jel içinde disperse edilmesi düşünülmüştür.
5.4.1. Lipozomların Hazırlanması ve Karakterizasyonu
Ovalbumin içermeyen ve içeren formülasyonlar, Bölüm
3.2.4’te anlatıldığı gibi film hidrasyon yöntemine göre hazırlandı.
Lipozomların
hazırlanmasında
yumurta
fosfatidil
kolini
yanında
lipozomların fiziksel stabilitesini arttırmak için kolesterol de kullanılmıştır.
Lipozom formülasyonlarında homojen ve istenen partikül büyüklüğünü
sağlamak için ekstrüksiyon işlemi uygulanmıştır.
Nazal mukozadan ilaç taşıyıcı sistemlerin verilişinde partikül
büyüklüğü önemlidir. Yapılan çalışmalarda farelerde ve sıçanlarda 100200 nm boyutunda partiküllerin nazal mukozadan geçişinin (uptake)
yüksek olduğu saptanmıştır132,
. Bu bağlamda biz de lipozomların
181
partikül büyüklüğünü küçültmek için ekstrüksiyon işlemini uyguladık.
Lipozomların partikül büyüklüğünü istenen boyuta getirebilmek için değişik
por
büyüklüğüne
sahip
polikarbonat
membran
filtreler
yardımıyla
ekstrüksiyon işlemi uygulandı.
Ovalbumin
içermeyen
lipozomların
ortalama
partikül
büyüklüğü ekstrüksiyon işlemi öncesi 7176.6 ± 752.5 nm iken ekstrüksiyon
işlemi sonucu 256 ± 9.64 nm olarak bulunmuştur (Tablo 24). Ekstrüksiyon
işlemi öncesinde partikül büyüklüğü dağılımları homojen olmadığı için
standart sapma büyüktür. Ekstrüksiyon işlemi sonrasında ise partikül
büyüklüğü dağılımı homojenleştiği için standart sapma da azalmaktadır.
164
Aynı sonuç ovalbumin içeren lipozomlarla yapılan ölçümlerde de
gözlenmiştir.
Ovalbumin içeren lipozomların ortalama partikül büyüklüğü
ekstrüksiyon işlemi öncesi 3643.3 ± 757 nm iken ekstrüksiyon işlemi
sonucu 204.3 ± 6.1 nm olarak ölçülmüştür (Tablo 24). OVA içeren ve
içermeyen lipozomların ekstrüksiyon işlemi öncesi partikül büyüklükleri,
ekstrüksiyon işlemi sonrası partikül büyüklüklerine göre anlamlı olarak
büyük bulunmuştur (p<0.05).
Polidispersite indeksi kolloidal sistemlerde partikül büyüklüğü
dağılımının
homojenliği
hakkında
bilgi
vermektedir.
Polidispersite
indeksinin ekstrüksiyon işlemi sonrasında OVA içermeyen lipozomlarda
0.293±0.06 ve OVA içeren lipozomlarda 0.282±0.04 olması partikül
büyüklüğü dağılımının homojen olduğunu göstermektedir.
Polidispersite
indeksinin
küçük
olması
(<0.2)
vezikül
popülasyonunun homojen olduğunu gösterirken, büyük olması (>0.3)
heterojenisitenin yüksek olduğunu gösterir204. Hazırladığımız lipozomlar
0.2’den büyük, 0.3’ten küçük polidispersite indeksine sahip olduğu için,
nispeten
homojen
partikül
dağılımına
sahip
olduğu
söylenebilir.
Ekstrüksiyon sırasında membrandan geçiş sayısı artırılarak daha küçük
polidispersite indeksine sahip lipozomlar elde edilebilir.
Zeta potansiyel ölçümleri, kolloidal sistemlerin stabilitesi
hakkında bilgi vermektedir. Dayanıklı kolloidal sistemlerin zeta potansiyeli
- 25 mV ile + 25 mV değerleri arasındadır205. Ovalbumin içermeyen
lipozomların ekstrüksiyon işlemi öncesi zeta potansiyeli -2.9 ± 0.79 mV
165
iken, ekstrüksiyon işlemi sonrasında -14 ± 0.6 mV olarak ölçülmüştür.
Ovalbumin içeren lipozomların ekstrüksiyon işlemi öncesi zeta potansiyeli
-8.45 ± 8.27 mV iken, ekstrüksiyon işlemi sonrasında -5.33 ± 2.01 mV
olarak ölçülmüştür. Zeta potansiyellerin negatif değerde olması lipozom
formülasyonlarında
yer
alan
yumurta
fosfatidil
kolinden
kaynaklanmaktadır206. Ayrıca, lipozomların negatif zeta potansiyelleri
fosfatidilkolindeki
fosfat
gruplarının
iyonizasyonundan
da
kaynaklanmaktadır 207.
Çalışmamızda
ekstrüksiyondan
önce
ovalbumin
içeren
lipozomların zeta potansiyel değeri (-8.45 ± 8.27 mV), ovalbumin
içermeyen lipozomların zeta potansiyel değerine (-2.9 ± 0.79 mV) göre
daha yüksek ölçülmüştür. Ekstrüksiyon sonrasında ise, ovalbumin içeren
lipozomların zeta potansiyeli (-5.33 ± 2.01 mV), ovalbumin içermeyen
lipozomların zeta potansiyeline (-14 ± 0.6 mV) göre daha düşük
bulunmuştur.
Ovalbumin içermeyen lipozomların ekstrüksiyon öncesi zeta
potansiyeli -2.9 ± 0.79 mV iken, ekstrüksiyon sonrası artmış ve -14 ± 0.6
mV olarak ölçülmüştür.
Ovalbumin içeren lipozomların ekstrüksiyon öncesindeki zeta
potansiyeli
(-8.45
±
8.27
mV),
ekstrüksiyon
sonrasındaki
zeta
potansiyeline (-5.33 ± 2.01 mV) göre daha yüksek bulunmuştur .
Lipozomların
zeta
potansiyel
değerine,
konsantrasyonu208, etkin madde209 ve yardımcı maddelerin210,
fosfolipit
211
etkisi
bulunmaktadır. Protein yapısında olan hemoglobinin PEG lipozomlarının
166
zeta potansiyeli -7.16 ± 0.33 mV olarak bulunmuştur212. 5-florourasil ile
yapılan bir çalışmada da hazırlanan lipozomların zeta potansiyeli -6.4 ±
0.8 mV olarak ölçülmüştür213. Bu çalışmalarda lipozomların zeta
potansiyelinin
negatif
değerde
bulunması
bizim
çalışmamızı
da
desteklemektedir. Bununla birlikte Yanasarn165 ve arkadaşlarının yaptığı
çalışmada negatif yüklü lipozomlara ovalbumin yüklendiğinde bağışıklık
yanıtları güçlü bir şekilde uyarılmıştır. Ancak yazarlara göre tüm negatif
yüklü lipozomlar için bu durum geçerli olmayabilir. Güçlü adjuvan aktivitesi
için spesifik proteinler ve spesifik negatif yüklü lipozomlar gerekmektedir.
5.4.2. Ovalbuminin Yükleme Kapasitesinin Değerlendirilmesi
Bölüm 3.2.4.2.3’te anlatıldığı gibi lipozomlara yüklenen
ovalbumin miktarı BCA yöntemine göre tayin edildi ve % 73.15± % 0.21
olarak bulundu.
Li ve arkadaşlarının214 yaptığı bir çalışmada, film hidrasyon
ve ters faz evaporasyon yöntemi ile fosfolipit S 100 ve kolesterolden
hazırlanan
lipozomlardan
ovalbumin
film
hidrasyonla
hazırlanan
lipozomlara 47.9% ± 8.9% , ters faz evaporasyon yöntemi ile hazırlanan
lipozomlara 77.9% ± 19.2%, oranında enkapsüle olmuştur. Bu da
hazırlama yönteminin etkin maddenin yüklenme etkinliği üzerindeki etkisini
göstermektedir.
Bu
sonuçlar,
bizim
bulduğumuz
sonuçları
desteklemektedir. Literatürde film yöntemi ile hazırlanan lipozomlarda
yükleme kapasitesi 47.9% ± 8.9% iken, çalışmamızda aynı yöntemle %
73.15± % 0.21 sonucu ile daha fazla bir yükleme kapasitesi bulduk. Bu
farklılığın, hazırlama yönteminin ve lipozomlarda kullanılan lipitlerin farklı
olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir.
167
Schubert ve arkadaşlarının215 yaptığı bir çalışmada yumurta
fosfatidil kolin ve kolesterol (7:3 molar) ile hazırlanan lipozomlara inülin ve
dekstran gibi polisakkaritler yüklenmiş ve yükleme kapasitesinin artırılması
için lipozomlar, iç hacmi artırıcı deterjanlar ile formüle edilmiştir. Bu
durumda bile yükleme kapasitesi en fazla % 46.8 bulunmuştur. Bunun
sebebi, lipozomları hazırlama yönteminin ve içe hapsedilen maddelerin
fizikokimyasal özelliklerinin farklı olması olabilir. Altin ve arkadaşlarının216
yaptığı bir çalışmada, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
(POPC), antijenin hedeflendirilmesini sağlayan 3(nitrilotriacetic acid)ditetradecylamine (NTA3-DTDA) gibi şelatörlerle ve stabilite artırıcı
fosfatidiletanolamin-(polietilen glikol)-2000 (PE-PEG2000) ile formüle
edildiğinde, ovalbuminin enkapsülasyon etkinliği % 85 olmuştur. Bunun da
kullanılan farklı fosfolipidlerle ovalbuminin elektrostatik etkileşiminin farklı
olmasından kaynaklanabileceği düşünülmektedir.
5.4.3. Lipozomların Işık Mikroskobu ile Görüntülerinin Değerlendirilmesi
Bölüm 3.2.4.2.4’te anlatıldığı üzere hazırlanan ovalbumin
yüklenmemiş ve ovalbumin yüklenmiş lipozomların ışık mikroskobu ile
görüntüleri
değerlendirildiğinde,
lipozomların
çok
tabakalı
olduğu
anlaşılmıştır (Şekil 39-40).
5.4.4. Lipozomların Geçirimli Elektron Mikroskobu ve Taramalı Elektron
Mikroskobu ile Görüntülerinin Değerlendirilmesi
Bölüm 3.2.4.2.5’te anlatıldığı gibi ovalbumin içermeyen ve
ovalbumin içeren lipozomların ekstrüksiyon öncesi ve ekstrüksiyon sonrası
TEM görüntüleri incelendiğinde lipozomların küresel şekilde oldukları ve
168
partikül büyüklüğü analizlerimizle paralel partikül büyüklüklerinde oldukları
gözlenmiştir. Ekstrüksiyon işlemi sonrası partikül büyüklüklerinin (~ 200250 nm) küçüldüğü görülmüştür (Şekil 41-42).
Lipozomların SEM görüntüleri değerlendirildiğinde küresele
yakın şekilde oldukları görülmüştür. Ovalbumin içermeyen ve ovalbumin
içeren lipozomların ekstrüksiyon sonrası partikül büyüklüklerinin küçüldüğü
saptanmıştır (Şekil 43, 44). Bu sonuçlar da TEM sonuçlarımızı
desteklemektedir.
5.5. Jel
İçinde
Lipozom
(Jel-Lipozom)
Formülasyonlarının
Karakterizasyonları
Önformülasyon çalışmalarımız sonucunda pH, görünüm ve
viskozite açısından en uygun bulduğumuz kitozan jel (KG12) ve Carbopol®
974P NF (CT4) jel formülasyonlarına lipozom süspansiyonları 1:10 (h/h)
oranında disperse edildi.
Carbopol®
süspansiyonu
disperse
974P
NF
edildiğinde,
jel
jel
formülasyonu
yapı
içine
bozuldu.
Bu
lipozom
sonuç,
Carbopol®’ün yapısındaki polialkenil eterin ve divinil glikolün, lipozomun
yapısındaki lipitler üzerinde deterjan etkisi göstermiş olabilmesinden ve
böylece lipitlerle polimerin fizikokimyasal etkileşiminden kaynaklanıyor
olabilir. Bu nedenle lipozom, kitozan jel içine disperse edilerek
çalışmalarımıza devam edildi.
169
Ovalbumin yüklenmiş ve yüklenmemiş lipozom, kitozan jele
1:10 (h/h) oranında disperse edildiğinde kıvamı başlangıçtaki jele göre
daha akışkan ancak jel yapısını koruyan bir formülasyon elde edildi.
Ovalbumin
yüklenmemiş
lipozomun
eklendiği
jel
ile
ovalbumin yüklenmiş lipozomun eklendiği jelin pH’ları sırasıyla 5.74 ve
5.71 değerlerindedir. Bu pH değerleri burnun fizyolojik pH’sına uygundur.
Viskozite değerleri de sırasıyla 2302.76 ± 44.8 ile 2478.373 ± 30.4’tür.
Kitozan jele lipozom eklendiğinde viskozite değerlerinde azalma olduğu
görülmüştür.
Ovalbumin
yüklenmemiş
lipozomun
eklendiği
jel
ile
ovalbumin yüklenmiş lipozomun eklendiği jel pseudoplastik akış özelliği
göstermektedir (Şekil 45). Akış reogramından da görüldüğü gibi, kayma
hızı arttıkça viskozite azalmaktadır. Çok sayıdaki doğal ve sentetik polimer
pseudoplastik akış özelliği göstermektedir 217.
5.6. SDS-PAGE Analizi Bulgularının Değerlendirilmesi
Hazırlama yönteminin ve formülasyona giren maddelerin
proteinin yapısal bütünlüğü ve dolayısıyla antijenik özelliği üzerindeki
etkisini değerlendirmek amacıyla SDS-PAGE analizi Bölüm 3.2.6’da
anlatıldığı gibi hazırlanan tüm formülasyonlar için yapılmıştır. Bölüm
2.3.5.3’te özellikleri verilen OVA, toplam molekül ağırlığı 44,3 kDa olan bir
proteindir. Kitozan, Carbopol® 974P NF jel ve lipozom formülasyonlarının
oluşturduğu bant, standart ovalbumin çözeltisinin oluşturduğu bant ile aynı
seviyede olup, molekül ağırlık belirleyicinin 47kDa’da verdiği bantın hemen
altındadır. Bu da yaklaşık 44.3 kDa’da bir bant oluştuğunu dolayısıyla
170
ovalbuminin formülasyonlara yüklenebildiğini ve formülasyonlarda yapısal
bütünlüğünü koruduğunu göstermektedir. Formülasyonları hazırlama
yöntemi, fiziksel ve kimyasal stres ovalbuminin yapısını etkilememiştir.
Ovalbumin
çözeltisine
ve
jellere
göre,
lipozom
formülasyonunun oluşturduğu bandın rengi daha açıktır (Şekil 46, 47).
Yapılan bir çalışmada
IL-2 ile hazırlanan lipozomlarda da SDS-PAGE
bantlarında, IL-2 çözeltilerine göre azalma görülmüştür 218.
Lipozom-jel
formülasyonunda
ise
SDS-PAGE
jeline
uygulanma anında topaklanma ve katılaşma olmuş olup, kuyucuğa
formülasyon eklenememiştir. Bu nedenle de herhangi bir protein bandı
oluşmamıştır.
Bantların, standart ovalbumin çözeltisi ile tamamen aynı
görünümde olması formülasyonlardaki yardımcı maddelerle kovalent
agregatların
oluşmadığını,
başka
bir
deyişle
etkileşim
olmadığını
göstermektedir.
Amidi ve arkadaşlarının170 yaptığı çalışmada nazal uygulama
için
N-trimetil
kitozan
ile
hazırlanan
nanopartiküllerin
SDS-PAGE
analizinde de oluşan tek bir ovalbumin bandı, ovalbuminin kitozan ile
etkileşmediği bulgumuzu desteklemektedir.
Li ve arkadaşlarının214 yaptığı bir çalışmada, film hidrasyon
ve ters faz evaporasyon yöntemi ile fosfolipit S 100 ve kolesterolden
hazırlanan lipozomlardaki ovalbumin, SDS-PAGE’te 40 ve 45 KDa olmak
üzere iki bant halinde görülmüştür. Bu bantlar, yaklaşık 43 KDa molekül
171
ağırlığına sahip ovalbuminin tanımlanması için spesifik bantlardır. Ayrıca
iki farklı yöntemle hazırlanan lipozomlarda ovalbumin bantlarının hemen
hemen benzer olması hazırlama yönteminin ovalbuminin bütünlüğünü
etkilemediğini düşündürmektedir.
Protein yapısında olan IL-2’nin de lipozom formülasyonunun
SDS-PAGE çalışmalarında IL-2’nin lipozoma tutunduğu ve IL-2’nin
parçalanmadığı, yapısal bütünlüğünü koruduğu gösterilmiştir218. Bu
sonuçlar bizim çalışmalarımızı da desteklemektedir.
5.7. Hücre
Yaşayabilirliği
(Sitotoksisite)
Çalışmalarının
Değerlendirilmesi
Hazırladığımız formülasyonun nazal mukoza hücrelerinin
yaşayabilirliğine etkisini değerlendirmek amacıyla akciğer adenokarsinoma
hücreleri olan Calu-3 hücreleri üzerinde Bölüm 3.2.7’de anlatıldığı gibi
MTT yöntemiyle sitotoksisite çalışmaları yapıldı. Şekil 49’dan da görüldüğü
gibi hazırladığımız formülasyonların hiçbiri, ovalbumin çözeltisi olan
kontrol grubunun hücre yaşayabilirliği oranı % 100 varsayılığında, Calu-3
hücreleri üzerinde sitotoksik etki göstermemiştir (p>0.05). Akrilamid
polimerlerinin219 biyolojik olarak uyumlu olduğu literatür çalışmalarında da
bildirilmiştir.
Vllasaliu ve arkadaşlarının220 yaptığı çalışmada kitozanın
hücre
yaşayabilirliğini
azaltma
oranı
Calu-3
hücrelerinde,
Caco-2
hücrelerine oranla daha fazla olmuştur. Buradan farklı bölgelerdeki
hücrelerin kitozana olan duyarlılıklarının farklı olduğu görülmektedir.
172
15
mg/mL
konsantrasyonda
kitozan
çözeltisi
Calu-3
hücrelerinin yaşayabilirliğini % 30 oranında azaltmaktadır. Aynı çalışmada
trimetil kitozan 20 (TMC20-%20 metillenmiş) ve trimetil kitozan 60
metillenmiş)
(TMC60-%60
sağlamıştır
yaklaşık
%102
hücre
yaşayabilirliği
. Bizim formülasyonlarımızda 20 mg/mL konsantrasyonda
221
kitozan kullanılmıştır. Ovalbumin içermeyen kitozan jel, kontrol grubuna
göre %85 civarında hücre yaşayabilirliği sağlarken, ovalbumin içeren
kitozan jel kontrol grubuna göre % 100 hücre yaşayabilirliği sağlamıştır.
Hücre
yaşayabilirliklerindeki
farklılıkları
doğrudan
kıyaslayabilmek
mümkün değildir. Bunun nedeni, kullanılan farklı molekül ağırlığında, farklı
tuz içerikli ve farklı deasetilasyon derecelerinde kitozan tiplerinin,
deneysel koşulların hücrelerin duyarlılığını etkilemelerindeki farklılıktır.
Huang222 ve arkadaşlarının yaptığı çalışmaya göre kitozanın
deasetilasyon
derecesi
%88’den
%
61’e
düştükçe
sitotoksisitesi
azalmaktadır.
% 88 deasetilasyon derecesine sahip kitozan içeren
yaklaşık 1 mg/mL konsantrasyondaki nanopartikül hücre yaşayabilirliğini
%
70
oranında
azaltmıştır.
Bizim
kullandığımız
kitozan
%
75
deasetilasyon derecesine sahiptir. Literatürle de uyumlu olarak hücre
yaşayabilirliğini azaltma oranı daha düşüktür.
Grenha223 ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada kitozan
nanopartiküllerinin Calu-3 hücre yaşayabilirliğini en fazla azaltma oranı %
20’dir. Bu değer, Amidi170 ve arkadaşlarının TMC ile yaptığı çalışmada, 20
mg/mL TMC çözeltisinin Calu-3 hücrelerinin yaşayabilirliğini % 30
oranında azalttığı yönündeki sonuçla da paraleldir.
173
Partiküllerin yüzey yükünün sitotoksisiteye etkisini araştıran
bir
çalışmada224,
PLGA-kitozan
(+32
mV)
nanopartikülü,
PLGA-
poloksamer (-24 mV) ve PLGA-polivinil alkol (-5 mV) nanopartikülüne göre
en
fazla
hücre
yaşayabilirliğini
sağlamıştır.
Bununla
birlikte
tüm
nanopartikül formülasyonları da Calu-3 hücrelerinde hücre yaşayabilirliğini
en
fazla
%40
oranında
azaltmıştır.
OVA
içeren
lipozom
formülasyonumuzun zeta potansiyeli -5.33 ± 2.01 mV olup, kontrol
grubuna göre yaklaşık %15 oranında hücre yaşayabilirliğini azaltmıştır.
Elde ettiğimiz bu sonuç da literatür ile paralellik göstermektedir.
5.8. Jel ve Lipozom Formülasyonlarının Fiziksel Stabilite Çalışması
Sonuçlarının Değerlendirilmesi
Tez çalışmamız için hazırlanan jeller (kitozan ve Carbopol®
974P NF jeller), lipozom ve jel lipozom formülasyonları, 4° C ve 25°C’ta
saklanarak, 7 ay boyunca jellerde pH ve viskozite; lipozomlarda ise
partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli ölçümleri yapılmıştır (Şekil 50-53,
Tablo 26-29).
Ovalbumin yüklenmemiş kitozan formülasyonlarının pH
değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de 5.57-5.96 aralığında; 25°C’de 5.645.96 aralığındadır. Ovalbumin yüklenmiş kitozan formülasyonlarının pH
değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de 5.64-6.07 aralığında; 25°C’de 5.495.79 aralığındadır.
Ovalbumin
yüklenmemiş
Carbopol®
974P
NF
formülasyonlarının pH değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de 6.40-6.87
aralığında; 25°C’de 6.14-6.36 aralığındadır. OVA yüklenmiş Carbopol®
174
974P NF formülasyonlarının pH değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de
5.97-6.45 aralığında; 25°C’de 6.20-6.90 aralığındadır.
Ovalbumin yüklenmemiş jel lipozom formülasyonlarının pH
değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de 5.74-6.12 aralığındadır. 25°C’de ise
formülasyonun görünümünde bozulmalar başladığı için 4. aya kadar
ölçülen pH değeri 5.69-6.13 aralığındadır. Formülasyon görünümündeki
bozulma saklama kabının kapağındaki paslanmadan ve bu paslanmanın
formülasyonla etkileşiminden kaynaklanmıştır.
Ovalbumin yüklenmiş jel lipozom formülasyonlarının pH
değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de 5.71-6.04 aralığında; 25°C’de ise
5.59-5.87 aralığındadır.
Ölçülen
pH
değerlerinden
de
görüldüğü
gibi
tüm
formülasyonlar 7 aylık süre boyunca burnun fizyolojik pH’sı olan 5-7
aralığında kalmıştır.
Ovalbumin yüklenmemiş kitozan formülasyonlarının viskozite
değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de 2309.39 ± 50.03 - 3150.98 ± 19.9
aralığında; 25°C’de 1229.25 ± 11.47 - 3121.16 ± 29.82 aralığındadır.
Ovalbumin yüklenmiş kitozan formülasyonlarının viskozite değerleri,
kıvamdaki azalma nedeniyle 3 aylık süre boyunca ölçülmüş olup, 4°C’de
712.36 ± 30.4 – 2952.18 ± 9.94 aralığında; 25°C’de 619.593 ± 40.2 –
2760.006 ± 5.74 aralığındadır. Tablo 26’daki sonuçlardan da görüldüğü
gibi 25°C’de saklanan kitozan formülasyonlarının viskozitesinde zamanla
azalma olmuştur (p<0.05).
175
Ovalbumin
yüklenmemiş
Carbopol®
974P
NF
jel
formülasyonlarının viskozite değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de
2544.64 ± 19.8 – 5218.5 aralığında; 25°C’de 2862.72 ± 26.3 – 4168.17 ±
30.4 aralığındadır. Ovalbumin yüklenmiş Carbopol® 974P NF jel
formülasyonlarının viskozite değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de
3008.506 ± 30.4 – 4575.71 ± 5.74 aralığında; 25°C’de 1378.35 ± 5.7 –
3392.85 ± 28.7 aralığındadır. Carbopol® 974P NF jel formülasyonları
kıvam açısından da kitozan jel ve jel lipozom formülasyonlarına nazaran 7
aylık süre boyunca daha stabil bir görünüm sergilemiştir. Bununla birlikte
3 aylık saklama süresi boyunca viskoziteleri değerlendirildiğinde, 4°C’de
saklanan CT4 ile OVA-CT4 ile 25°C’de saklanan CT4’ün viskozitesinde
anlamlı olarak artış gözlenirken (p<0.05), 25°C’de saklanan OVA-CT4’ün
viskozitesinde anlamlı olarak azalma gözlenmiştir (p<0.05) .
Ovalbumin yüklenmemiş jel lipozom formülasyonlarının
viskozite değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de 1580.46 ± 59.6 – 2365.72
± 69.9 aralığında; 25°C’de ise kıvamdaki azalma ve saklama kabının
kapağı ile etkileşim nedeniyle 3 aylık süre boyunca ölçülmüş olup 699.11
± 34.9 – 2567.83 ± 20.7 aralığındadır. Ovalbumin yüklenmiş jel lipozom
formülasyonlarının viskozite değerleri 7 aylık süre boyunca 4°C’de 473.81
± 5.74
– 2478.373 ± 30.4 aralığında; 25°C’de ise kıvamdaki azalma
nedeniyle 3 aylık süre boyunca ölçülmüş olup 390.97 ± 5.74 – 2415.42
aralığındadır. Jel lipozom formülasyonlarının 3 aylık saklama süresi
boyunca viskoziteleri değerlendirildiğinde, KL’nin 4°C’de saklanması
sonucunda viskozitesindeki değişim anlamlı değilken (p>0.05), 25°C’de
saklanması sonucunda viskozitesindeki azalma anlamlıdır (p<0.05).
Benzer şekilde KL-OVA, hem 4°C’de hem de 25°C’ de saklandığında 3
ayın sonunda viskozitesi anlamlı olarak azalmıştır (p<0.05).
176
Genel olarak tüm jellerde viskozite zamanla azalırken, en
fazla azalma 25°C’ta saklanan jellerde olmuştur. Buradan sıcaklık
artışının jellerin stabilitesini olumsuz yönde etkilediği sonucu çıkarılabilir.
Düşük sıcaklıklarda makromoleküller hidrate olur ve polimer-polimer
etkileşimi olur. Sıcaklık yükseldiğinde polimerler zamanla hidrate oldukları
suyu kaybederler ve viskoziteleri zamanla azalır225. Buna karşılık tüm
jellerin pH’sı burnun fizyolojik pH’sına uygun bir aralıkta kalmıştır.
Tablo 26-28 incelendiğinde kitozan ile hazırlanan jellerde
zamanla viskozitede azalma görülürken, Carbopol® 974P NF ile
hazırlanan jellerin viskozitesi daha durağandır. Bu sonuçlar, polimer
tiplerinin formülasyonun stabilitesini etkilediğini düşündürmüştür.
Ovalbumin içeren ve içermeyen jel lipozom ve ovalbumin
içeren kitozan formülasyonları 3. aya kadar berrak ve uygun kıvamda
iken, 3. aydan sonra berraklıkları ve kıvamları azalmaya başlamıştır.
Ovalbumin içermeyen kitozan jel ile ovalbumin içeren ve içermeyen
Carbopol® 974P NF jel formülasyonları ise 7 ay boyunca berraklık ve
kıvam açısından belirgin değişme göstermemiştir.
Bölüm
3.2.8’de
açıklandığı
gibi
lipozomların
fiziksel
stabilitesi, partikül büyüklüğü ve zeta potansiyel değerleri açısından
değerlendirilmiştir. Lipozom formülasyonlarının stabilite çalışmaları nazal
ortam pH ve iyonik ortamını taklit edebilmek amacıyla pH 6.8 fosfat
tamponunda yapılmıştır. Ovalbumin yüklenmiş ve yüklenmemiş lipozom
formülasyonlarının partikül büyüklüğü dağılımları 7 aylık süre boyunca
181-286.6 arasında değişmiştir (Tablo 29, Şekil 50-53). Bu değişiklik,
lipozomun saklanması sırasında agregatlar olabileceğini göstermektedir.
177
Buna karşın partikül büyüklüğündeki dalgalanma zeta potansiyeldeki
dalgalanma kadar fazla olmamıştır. 7 aylık saklama süresi boyunca zeta
potansiyelinde görülen bu dalgalanma, partiküllerin yüzey yüklerindeki
değişimi, bu da partiküllerin birbiriyle etkileşimini ve agregatların
oluşumunu
destekler
niteliktedir.
OVA
yüklenmemiş
lipozom
formülasyonları 3 aylık saklama süresi boyunca değerlendirildiğinde,
4°C’de saklandığında partikül büyüklüğündeki değişme ikinci aya kadar
zeta potansiyelindeki değişme ise üçüncü aya kadar anlamlı değildir
(p>0.05).
OVA
yüklenmemiş
lipozom
formülasyonları
25°C’de
saklandığında ise partikül büyüklüğündeki değişme birinci aya kadar
anlamlı değilken, zeta potansiyelindeki değişme üçüncü aya kadar anlamlı
değildir (p>0.05). OVA yüklenmiş lipozomlar 4°C’de saklandığında partikül
büyüklüğündeki değişiklik üçüncü aya kadar anlamlı değilken (p>0.05),
zeta potansiyelindeki değişiklik ikinci aya kadar anlamlı değildir (p>0.05).
OVA yüklenmiş lipozomlar 25°C’de saklandığında partikül büyüklüğündeki
değişiklik
üçüncü
aya
kadar
anlamlı
değilken
(p>0.05),
zeta
potansiyelinde üçüncü ay sonunda anlamlı azalma olmuştur (p<0.05).
Zeta potansiyel, kolloidal bir sistemin stabilitesini belirleyen
bir unsurdur. Stabil bir kolloidde partiküller arasında mesafe bulunmakta
olup, iyi disperse olmuştur. Partiküllerin yüzey yükü fazla ise, birbirlerini
iter ve kolloidal sistemde ayrık biçimde dağılır. Yüzey yükü sıfıra yakınsa,
Brown hareketleri nedeniyle partiküller birbirine yapışır226. Çalışmamızda
Ovalbumin yüklenmiş ve yüklenmemiş lipozomların zeta potansiyelleri 3.32±0.22 ile -16.5±1.5 arasında değişmiştir. Partikül büyüklüğünün 7
aylık saklama sürecindeki değişkenliği de zeta potasiyelinin zaman zaman
sıfıra yaklaşmasından kaynaklanmış olabilir.
178
Lipozomların ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanımı stabilite
problemleri nedeniyle kısıtlıdır. Lipozom stabilitesi, fiziksel, kimyasal ve
biyolojik stabilite olmak üzere üçe ayrılabilir. Bu üç stabilite türü birbiriyle
bağlantılıdır.
Lipozomların
raf
ömrü
boyunca
stabiliteleri
partikül
büyüklüğü dağılımı, enkapsülasyon etkinliği ve bileşenlerin degredasyonu
ile ölçülür. Partikül büyüklüğü dağılımı, pH ve iyonik güç optimize edilerek
lipozom
süspansiyonlarının
stabiliteleri
artırılabilir227.
Lipozomların
biyolojik stabilitesi lipozomlarla etkileşime girebilen protein gibi ajanlara ve
uygulama yoluna bağlıdır. Ovalbumin yüklenmiş lipozom, ovalbumin
yüklenmemiş lipozoma göre partikül büyüklüğü ve zeta potansiyelini
belirgin biçimde değiştirmemiştir.
Lipozomların stabilitelerini etkileyen bir faktör de sıcaklıktır.
Yapılan bir çalışmada,
pH, partikül büyüklüğü ve zeta potansiyel
açısından değerlendirilen lipozomlar için 4°C’deki stabilite, 25°C’deki
stabiliteye göre daha yüksek bulunmuştur226. Bizim çalışmamızda iki farklı
sıcaklıkta
saklanan
lipozomların
özellikleri
açısından
stabilite
değişimindeki farklılık çok belirgin değildir.
Lipozomların stabilitesini etkileyen diğer bir faktör de lipit
bileşimidir. Du Plessis ve arkadaşlarının226 yaptığı bir çalışmada,
stabiliteleri açısından sıralandığında yumurta fosfatidil kolin/kolesterol
/stearilamin (SA) < yumurta fosfatidil kolin / kolesterol /fosfatidil serin (PS)
< sığır beyin seramidleri (CM)/ kolesterol /palmitik asit (PA)/kolesteril
sülfat < yumurta fosfatidil kolin / kolesterol / kolesteril sülfat bileşiminden
oluşan lipozomlar şeklinde olmuştur.
179
5.9. Jel
Formülasyonlarda
Mukoadezyon
Bulgularının
Değerlendirilmesi
Jel
formülasyonlarda
mukoadezyon
çalışmaları
3.2.9’da anlatıldığı gibi yapılmıştır. Majithiya ve arkadaşlarının
Bölüm
228
yaptığı
çalışmaya göre iki dakikalık temas süresi optimum mukoadezif gücü
vermektedir. Bu çalışmaya göre temas süresini arttırmak mukoadezif gücü
etkilememiştir, azaltmak ise polimer zincirlerinin müsin ile bağ oluşturması
için gerekli zamanı karşılamamaktadır. Literatürle uyumlu olarak, iki buçuk
dakikalık
temas
süresi
ile
yaptığımız
çalışmamızla
optimum
mukozadezifliği elde etmeyi hedefledik.
Mukoadezyon, polimerin özelliklerine, biyolojik dokuya ve
çevreleyen ortama bağlı olan komplike bir olaydır. Bu nedenle teorik
modellemelerin sınırlı bilgi sağladığı gerçeği kabul edilmelidir.
Çalışmamızda Carbopol® 974P NF jel ve jel lipozom
formülasyonuna göre en yüksek mukoadezyon işi OVA yüklenmiş
kitozanda görülmüştür ve değeri 0.025±0.027 N.mm/cm2’dir (Tablo 30).
Ovalbumin içermeyen kitozan jel (KG12) formülasyonunun
mukoadezyon işi 0.012±0.027 N.mm/cm2 olarak bulunurken, OVA içeren
kitozan jel (OVA-KG12) formülasyonu için 0.025±0.027 N.mm/cm2
bulunmuştur. Carbopol® 974P NF jel ile yapılan çalışmalarda ise
ovalbumin içeren ve içermeyen jellerde mukoadezyon işi yakın değerlerde
bulunmuştur. OVA yüklenmiş lipozom jelin (KL-OVA) mukoadezyon işi
0.010±0.004 bulunmuştur.
180
Ovalbumin
yüklenmiş
kitozan
jelin
mukoadezyon
işi,
ovalbumin yüklenmemiş kitozan jele göre daha yüksek bulunmuştur. Bu
da ovalbumin yüklenmiş kitozan jelin nazal mukozaya daha iyi yapışacağı
yönünde yorumlanabilir.
5.10. Jel Formülasyonlarda Yapı Profil Analizi (TPA) Bulgularının
Değerlendirilmesi
Yapı
profil
analizi
(TPA)
değerlendirmelerinde,
nazal
uygulama açısından önemli olan parametreler; sertlik, adeziflik, koheziflik
ve elastikliktir. Çalışmalarımızda bunlarla ilgili bulgular değerlendirilerek
yorumlanacaktır.
Adeziflik, jelin yüzeyi ile probun yüzeyi arasındaki çekici
kuvvetleri yenmek için yapılan iştir229. Adezifliğin yüksek olması, jelin
mukozada daha uzun süre kalmasını ve jelin uygulama sonrasında tekrar
eski haline gelebilmesini sağlar230.
En yüksek mukoadezyon işi ovalbumin yüklenmiş kitozan
jelde çıkmasına karşın, adeziflik değeri ovalbumin yüklenmiş ve
yüklenmemiş Carbopol® 974P NF jelden daha düşüktür. Bu sonuç,
kitozanın zayıf ve kısa süreli mukoadezyonu olduğunu bildiren daha
önceden yapılan çalışmalarla örtüşmektedir231,232. Bununla birlikte birçok
çalışmada kitozanın biyoadezif olduğu ve hücre zarındaki sıkı bağlanma
yerlerini açarak, etkin maddenin transportunu sağladığı ifade edilmiştir233. Kitozandaki pozitif yüklü amino grupları, mukozadaki negatif yüklü
236
bölgelerle etkileşir, bu da mukoadezyona katkı sağlar187.
181
Jellerin adeziflik değerleri incelendiğinde büyükten küçüğe
göre
sıralanışları
sırasıyla
OVA-CT4>CT4>KG12>OVA-KG12>KL-
OVA’dır.
Carbopol®’ün yapısındaki karboksil gruplarının çok yüksek
oranda
olması
nedeniyle,
mukoz
membrandaki
oligosakkarit
zincirlerindeki şeker kalıntılarıyla hidrojen bağı oluşturur, polimer ile
mukoz membran arasında güçlü bir bağ oluşur228. Bu da TPA
ölçümümüzde adeziflik değerinin yüksek olması ile örtüşmektedir.
Yarı-katı formülasyonlar nazal yoldan bir şırınga ya da
aplikatör ile uygulanabilir. Jelin birincil ambalajdan çıkarılmasında, istenen
bölgeye uygulanabilmesinde ve uygulama bölgesinde kalabilmesinde jelin
mekanik özelliklerinin önemli rolü vardır.
Sertlik, jellerde deformasyon oluşturmak için gereken
kuvvetin ölçülmesi ile hesaplanır.
büyükten
küçüğe
sıralanışı
Sertlik değeri açısından jellerin
sırasıyla;
CT4>OVA-CT4>KG12>OVA-
KG12>KL-OVA (Tablo 31)’dır.
Jelin sertliği düşük olursa, jellerin ambalajından çıkarılması
ve istenen bölgeye uygulanması için gereken iş azalır. Ancak çok düşük
olursa jel formülasyonun uygulama bölgesinde kalış süresi azalır. Bu
nedenle uygun terapötik etki için jeller optimum sertlik değerine sahip
olmalıdır230, 237.
Elastiklik, belirli bir zamanda baskı sonucu deformasyona
uğrayan jelin eski haline gelişini ifade eder. TPA’da elastikliğin sayısal
182
değeri arttığında jelin elastikliğinin azaldığı bildirilmiştir238-240. Elastiklik
sayısal değeri açısından jellerin büyükten küçüğe sıralanışı; CT4>OVACT4> KL-OVA> OVA-KG12>KG12. Buna göre KG12’nin elastikliği en
büyük iken, CT4’ün elastikliği en küçüktür. Peppas ve arkadaşları189
tarafından yapılan bir çalışmada, polimer ile mukozal yüzey arasındaki
güçlü biyoadezyon için yüksek elastiklik gerektiği bildirilmiştir. Bu da
KG12’nin nazal mukozaya biyoadezyonunun daha güçlü olacağını
düşündürmektedir. OVA-KG12’nin elastikliği de CT4, OVA-CT4 ve KLOVA’ya
göre
daha
yüksektir.
Bu
sonuç
OVA-KG12
açısından
mukoadezyon sonucunu desteklemektedir. Bununla birlikte TuğcuDemiröz ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada da kitozan ile hazırlanan
jelin elastikliği, hidroksipropil metil selüloz veya poloksamerle hazırlanan
jellere göre daha yüksektir 240.
Adeziflik gibi kohezifliğin yüksek olması da, jelin mukozada
daha uzun süre kalmasını ve jelin uygulama sonrasında tekrar eski haline
gelebilmesini sağlar230. Adeziflik, polimerin mukoza ile bağ yapmasını
tanımlarken, koheziflik polimerin kendi molekülleriyle yaptığı bağı
tanımlar237.
Jellerin koheziflik değerleri değerlendirildiğinde, jellerin
büyükten küçüğe sıralanışı sırasıyla; CT4> KG12 >OVA-KG12> KL-OVA
>OVA-CT4’tür.
183
6. SONUÇ
Çalışmamızda, nazal yoldan aşı uygulanması amacıyla,
model
antijen
olarak
ovalbumin
kullanılarak
jel
ve
lipozom
formülasyonlarının geliştirilmesi ve fizikokimyasal karakterizasyonlarının
yapılması amaçlanmıştır. Bu amaçla yapılan deneysel çalışmalarda elde
edilen sonuçlar aşağıda özetlenmektedir:
•
%2 kitozan, % 0.25 Carbopol® 974P NF jeller ile % 2
kitozana
lipozomun disperse edilmesiyle
hazırlanan
jellerin pH ve viskozite açısından nazal uygulamaya
uygun olduğu tespit edildi.
•
Hazırlanan
tüm
jellerin
pseudoplastik
akış
özelliği
gösterdiği saptandı.
•
Lipozom
formülasyonlarının
partikül
büyüklüğünün
ekstrüksiyon işlemi yardımıyla küçültülebildiği görüldü.
•
Lipozomlar burundan uygulama açısından uygun boyuta
(~250 nm) getirildi.
•
Zeta potansiyelinin negatif değerde olduğu, ektrüksiyon
işlemi sonrasında ve stabilite çalışmaları süresince de
negatif değerde kaldığı görüldü.
•
TEM ve SEM görüntüleri değerlendirildiğinde hazırlanan
lipozom formülasyonlarının küresel görünümde olduğu
görüldü.
•
Antijenin yüksek miktarda (~% 73) yüklenmesi sağlandı.
•
SDS-PAGE analizi sonuçlarına göre hazırlanan kitozan
ve
Carbopol®
formülasyonunda
974P
NF
antijenin
jellerde
ve
bütünlüğünü
lipozom
koruduğu
saptandı.
184
•
Akciğer adenokarsinoma hücreleri olan Calu-3 hücreleri
ile
yapılan
çalışmalarda
formülasyonlar
hücre
yaşayabilirliğini olumsuz yönde etkilemedi.
•
Hazırlanan jel formülasyonları pH açısından 7 aylık
saklama süresi boyunca hem 4°C hem de 25°C’de nazal
pH’ya uygun aralıkta kalmıştır. Viskozite değerleri ise
zamanla
azalmış
olup,
25°C’de
saklanan
jel
formülasyonlarında viskozite değerlerindeki azalmanın
daha belirgin olduğu görüldü.
•
Stabilite
çalışması
sonuçlarına
göre,
lipozom
formülasyonlarının partikül büyüklüğü dağılımı ve zeta
potansiyel değerleri 7 aylık saklama süresi boyunca
değişkenlik
göstermiştir.
Bu
da
zamanla
lipozom
formülasyonlarının agrege olabildiğini göstermektedir. Bu
durumun çalkalama ile azaltılabileceği düşünülmektedir.
•
Jellerin koyun nazal mukozasına mukoadezyon işi
değerlendirildiğinde,
en
yüksek
mukoadezyon
işi
ovalbumin yüklenmiş kitozanda tespit edildi.
•
Jellerin mekanik özellikleri değerlendirildiğinde Carbopol®
974P NF jelin adezifliği, sertliği, kitozan jel ve jel lipozoma
göre daha yüksek bulunmuştur. Bu da Carbopol® 974P
NF jelin nazal mukozaya kitozan jelden daha fazla
tutunabileceğini
göstermektedir.
Kitozan
jelin
ise
elastikliği Carbopol® 974P NF jele göre daha yüksektir.
Bu da kitozan jelin ambalajdan çıkma ve uygulanma
açısından
kolaylık
sağlayacağını
göstermektedir.
Koheziflik değeri ise tüm jellerde benzer düzeylerde
bulundu.
185
Sonuç olarak jel ve lipozom formülasyonlar nazal yoldan
uygulanacak aşılar için uygun taşıyıcı sistemler olarak kullanılabilir.
Böylece, parenteral yoldan uygulamanın ağrı, yalnızca sistemik bağışıklık
yanıtı oluşması ve sosyo-ekonomik düzeyi düşük ülkelerde aynı iğnenin
birden çok kişide kullanılması nedeniyle oluşacak bulaşıcı hastalıklar gibi
sakıncaları
önlenebilir.
Geliştirilen
formülasyonların
immünojenik
etkinliğinin değerlendirilmesi için in vivo hayvan deneylerinin yapılması
önerilir.
186
7. ÖZET
Mukozal Yoldan Uygulanan Aşı Formülasyonlarının Geliştirilmesi ve
Değerlendirilmesi
Çalışmamızın amacı, nazal yoldan uygulanmak üzere model
antijen ovalbumin (OVA) içeren jel ve lipozom formülasyonlarını
hazırlayarak, karakteristik özelliklerinin belirlenmesidir. Jel formülasyonları,
yapılan ön-formülasyon çalışmaları sonucunda kitozan (2 % a/h) ve
Carbopol® 974P NF (0,25% a/h) olarak seçilmiştir. Lipozom formülasyonu
lipit film hidrasyonu yöntemi ile yumurta fosfatidil kolin kullanılarak
hazırlanmıştır. Hazırlanan lipozom formülasyonu, kitozan jelde disperse
edilerek (1:10 h/h) jel lipozom formülasyonları da hazırlanmış ve
karakterize edilmiştir.
Jellerin pH, viskozite ve reolojik özellikleri; lipozomların ise
partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli, morfoloji ve enkapsülasyon etkinliği
gibi fiziksel özellikleri değerlendirilmiştir. Ovalbuminin formülasyonlarda
yapısal bütünlüğünü koruduğu
doğrulanmıştır.
Hem
SDS-PAGE
ovalbumin
içeren
elektroforez analizi ile
hem
de
içermeyen
formülasyonların fiziksel stabiliteleri yedi aylık süre boyunca iki farklı
saklama koşulunda (4ºC ve 25ºC) belirlenmiştir. Ovalbumin içeren
formülasyonların sitotoksisiteleri Calu-3 insan akciğer adenokarsinoma
hücre dizisi üzerinde değerlendirilmiştir. Jellerin nazal mukoadezyon
çalışmaları koyun nazal mukozası kullanılarak gerçekleştirilmiş olup,
mekanik özellikleri TA.XTPlus Texture Analyzer ile ölçülmüştür.
Hazırlanan jellerin pH’sı burnun fizyolojik pH aralığı olan 57 aralığında olup, mukozal uygulama için uygun viskozitededir
187
(2302.76-3157.6 mPa.s). Lipozom formülasyonları nazal uygulamaya
uygun partikül büyüklüğüne (~250 nm), yüksek antijen yükleme
etkinliğine (~%73) ve negatif zeta potansiyeline (-5.33 mV ila -16.5 mV)
sahiptir.
Hazırlanan
formülasyonların
hiçbirisinin
insan
Calu-3
hücrelerine karşı sitotoksik olmadığı saptanmıştır. Yapılan fiziksel
stabilite çalışmalarına göre jellerin pH değerleri nazal uygulama
açısından uygun aralıkta (5-7) kalmıştır ancak viskozitelerinde zamanla
azalma görülmüştür. Lipozom formülasyonlarının partikül büyüklüğü
dağılımı
ve
zeta
potansiyelinde
yedi
ay
boyunca
değişkenlik
gözlenmiştir. Hazırlanan jellerin tamamının mekanik ve mukoadezif
özellikleri nazal uygulamaya uygun bulunmuştur. Yapılan bu ön
çalışmalarla, jellerin ve lipozomların nazal aşı salım sistemi olarak
uygulanabileceği sonucuna varılmıştır.
Anahtar kelimeler: Calu-3 hücre dizisi, Carbopol® 974P NF jel, Kitozan
jel, lipozom, nazal aşı, ovalbumin.
188
8. ABSTRACT
Development and Evaluation of Vaccine Formulations Delivered by
Mucosal Route
The aim of this study was to prepare and characterize the
gels and liposomes containing the model antigen ovalbumin (OVA) to be
delivered by nasal route. The gel formulations were prepared using
chitosan (2 % w/v) and Carbopol® 974P NF (0,25% w/v) selected after preformulation studies. The liposome formulation was prepared by lipid film
hydration method using egg-phosphatidylcholine. By dispersing the
prepared liposome formulation in chitosan gel system (1:10 v/v), gel
liposome formulation was also prepared and characterised.
The physical properties of the gels, including the pH,
viscosity, rheological characteristics; and the physical properties of the
liposomes
including
size,
zeta
potential,
morphology,
and
encapsulation efficiency were evaluated. The structural integrity of the
OVA in the formulations was confirmed by SDS-PAGE electrophoresis
analysis. The physical stability of the formulations both containing OVA
and not containing OVA were determined at two different storage
conditions (4ºC and 25ºC) for a period of seven months. The cytotoxicity
of
the
formulations
adecocarcinoma
cell
containing
lines
ovalbumin
Calu-3
was
using
also
human
evaluated.
lung
Nasal
mucoadhesion studies of the gels were performed using sheep nasal
mucosa and mechanical properties of the gels were measured by
TA.XTPlus Texture Analyzer.
189
The prepared gels have pH between 5-7 which is in the pH
range of the nose and appropriate viscosity (2302.76-3157.6 mPa.s) for
mucosal administration. Liposome formulations have appropriate
particle size (~250 nm) for nasal administration, high loading efficiency
(~%73) and negative zeta potential (-5.33 mV ila -16.5 mV). It has been
determined that none of the formulations are cytotoxic to human Calu-3
cells. It has been seen that pH of the gels were appropriate for nasal
delivery (5-7) during physical stability studies, but viscosities decreased
with time. Size and zeta potential of the liposome formulations were
variable during seven months. All of the gels have appropriate
mechanical and mucoadhesive properties for nasal administration.
Results from this pre-studies indicate that gels and liposomes can be
used as nasal vaccine delivery systems.
Key words: Calu-3 cell line, Carbopol® 974P NF gel, Chitosan gel,
liposome, nasal vaccine, ovalbumin.
190
9. KAYNAKLAR
1. Stuart E. Turvey, David H. Broide. Innate immunity. J Allergy Clin
Immunol 2010; 125: 24-32.
2. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. Kuby Immunology. 4th ed.
Newyork: W. H. Freeman and Company; 2001.
3. Paul WE, editörler. Fundamental Immunology. 4th ed. Philadelphia:
Lippincott-Raven Publishers; 1999.
4. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al. Principles of innate and
adaptive immunity. Immunobiology: The Immune System in Health
and Disease. 5th edition. New York: Garland Science; 2001.
5. Delves PJ, Roitt IM. The Immune System. First of two parts. N Engl J
Med 2000; 343(1):37-49.
6. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Lymphocytes and the Cellular
Basis of Adaptive Immunity. İçinde: Molecular Biology of the Cell. 4th
edition. New York: Garland Science; 2002.
7. Edelman GM. Antibody structure and molecular immunology. Ann N Y
Acad Sci 1971; 190: 5-25.
8. Bengtén E, Wilson M, Miller N, Clem LW, Pilström L, Warr GW.
Immunoglobulin isotypes: structure, function and genetics. Curr Top
Microbiol Immunol 2000; 248:189-219.
9. Singer S, Losos J. The immune system. İçinde: Johnson GB, Raven
PH, editörler. Biology. 6th ed. 1147-1172.
10. Adkins B, Mueller C, Okada CY, Reichert RA, Weissman IL,
Spangrude GJ. Early events in T-cell maturation. Annu Rev Immunol
1987; 5: 325-65.
11. Mosmann TR, Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1,
Th2 and more. Immunol Today 1996;17(3):138-46.
191
12. Romagnani S. Type 1 T helper and type 2 T helper cells: functions,
regulation and role in protection and disease. Int J Clin Lab
Res 1991;21(2):152-8.
13. Hamilos DL. Antigen presenting cells. Immunol Res 1989;8:98-117.
14. Robertson MJ, Ritz J. Biology and clinical relevance of human natural
killer cells. Blood 1990;76(12):2421-38.
15. van
Furth
R, Cohn
ZA, Hirsch
JG, Humphrey
JH, Spector
WG, Langevoort HL. The mononuclear phagocyte system: a new
classification of macrophages, monocytes, and their precursor cells.
Bull World Health Organ 1972;46(6):845-52.
16. Rickard AJ, Young MJ. Corticosteroid receptors, macrophages and
cardiovascular disease. J Mol Endocrinol 2009;42(6):449-59.
17. Galli SJ, Nakae S, Tsai M. Mast cells in the development of adaptive
immune responses. Nat Immunol 2005;6(2):135-42.
18. Steinman
RM.
The
dendritic
cell
system
and
its
role
in
immunogenicity. Annu Rev Immunol 1991; 9:271-96.
19. Lewis DE, Harriman GR, Blutt SE. Organization of the immune
system. içinde: Rich RR, Fleisher TA, Shearer WT, Schroeder HW,
Frew AJ, Weyand CM, editörler. Clinical Immunology Principles and
Practice. 3rd ed. Philadelphia: Mosby Elsevier; 2008.s. 17-38.
20. Holmgren J, Czerkinsky C. Mucosal immunity and vaccines. Nat Med
2005; 11 (4): S45-S53.
21. Brandtzaeg P, Baekkevold ES, Farstad IN, Jahnsen FL, Johansen
FE, Nilsen EM, Yamanaka T. Regional specialization in the mucosal
immune system: what happens in the microcompartments?. Immunol
Today 1999 ;20(3):141-51.
22. Partidos CD. Intranasal vaccines: forthcoming challenges. PSTT
2000; 3 (8): 273–281.
192
23. Brandtzaeg P. Induction of secretory immunity and memory at
mucosal surfaces. Vaccine 2007;25(30):5467-84.
24. James SP. Mucosal immunity. İçinde: Delves PJ, Roitt IM, editörler.
Encyclopedia of immunology. 2nd ed. Michigan: Academic Press;
1998.s. 1780-86.
25. McGhee JR, Mestecky J, Dertzbaugh MT, Eldridge JH, Hirasawa
M, Kiyono H. The mucosal immune system: from fundamental
concepts to vaccine development. Vaccine 1992;10(2):75-88.
26. Brandtzaeg P, Farstad IN, Haraldsen G. Regional specialization in the
mucosal immune system: primed cells do not always home along the
same track. Immunol Today 1999;20(6):267-77.
27. Davis SS. Nasal vaccines. Adv Drug Deliv Rev 2001; 51(1-3):21-42.
28. Rich RR. The human immune response. içinde: Rich RR, Fleisher TA,
Shearer WT, Schroeder HW, Frew AJ, Weyand CM, editörler. Clinical
Immunology Principles and Practice. 3rd ed. Philadelphia: Mosby
Elsevier; 2008.s. 3-15.
29. Newberry RD, Lorenz RG. Organizing a mucosal defense. Immunol
Rev 2005; 206:6-21.
30. MacDonald TT. The mucosal immune system. Parasite Immunol 2003
;25(5):235-46.
31. Rosner AJ, Keren DF. Demonstration of M cells in the specialized
follicle-associated epithelium overlying isolated lymphoid follicles in
the gut. J Leukoc Biol 1984;35(4):397-404.
32. Corr SC, Gahan CC, Hill C. M-cells: origin, morphology and role in
mucosal immunity and microbial pathogenesis. FEMS Immunol Med
Microbiol 2008; 52:2–12.
33. Siebers A, Finlay BB. M cells and the pathogenesis of mucosal and
systemic infections, Trends Microbiol 1996; 4 (1):22-29.
193
34. Mestecky J, Moldoveanu Z, Russell MW. Immunologic uniqueness of
the genital tract: challenge for vaccine development. Am J Reprod
Immunol 2005 ;53(5):208-14.
35. Mestecky J, Fultz PN. Mucosal immune system of the human genital
tract. J Infect Dis 1999;179 (Suppl 3):S470-4.
36. Bergquist C, Johansson EL, Lagergård T, Holmgren J and Rudin A.
Intranasal vaccination of humans with recombinant cholera toxin B
subunit induces systemic and local antibody responses in the upper
respiratory tract and the vagina. Infect Immun 1997; 65(7):2676-84.
37. Haneberg B , Kendall D , Amerongen HM, Apter FM , Kraehenbuhl JP
, Neutra MR. Induction of Specific Immunoglobulin A in the Small
Intestine, Colon-Rectum, and Vagina Measured by a New Method for
Collection of Secretions from Local Mucosal Surfaces. Infect
Immun 1994; 62(1): 15–23.
38. Di Tommaso A, Saletti G,
Pizza M,
Rappuoli R,
Dougan
G, Abrignani S, Douce G, De Magistris MT. Induction of AntigenSpecific Antibodies in Vaginal Secretions by Using a Nontoxic Mutant
of Heat-Labile Enterotoxin as a Mucosal Adjuvant. Infect Immun
1996; 64(3):974–979.
39. Gallichan WS, Rosenthal KL. Specific secretory immune responses in
the female genital tract following intranasal immunization with a
recombinant adenovirus expressing glycoprotein B of herpes simplex
virus. Vaccine 1995 ;13(16):1589-95.
40. Hopkins S, Kraehenbuhl JP, Schödel F, Potts A, Peterson D, De
Gandi P, Nardelli-Haefliger D.
A
Recombinant
Salmonella
typhimurium Vaccine Induces Local Immunity by Four Different
Routes of Immunization. Infect Immun1995; 63 (9):3279-3286.
41. Russell MW, Moldoveanu Z, White PL, Sibert GJ, Mestecky J,
Michalek S. Salivary, Nasal, Genital, and Systemic Antibody
194
Responses in Monkeys Immunized Intranasally with a Bacterial
Protein Antigen and the Cholera Toxin B Subunit. Infect Immun1996;
64 (4):1272-1283.
42. Jones N. The nose and paranasal sinuses physiology and anatomy.
Adv Drug Deliv Rev 2001;51(1-3):5-19.
43. Quraishi MS, Jones NS, Mason J. The rheology of nasal mucus: a
review. Clin Otolaryngol Allied Sci 1998;23(5):403-13.
44. Lale AM, Mason JD, Jones NS. Mucociliary transport and its
assessment: a review. Clin Otolaryngol Allied Sci 1998;23(5):388-96.
45. Amitani R, Wilson R, Rutman A, Read R, Ward C, Burnett D, Stockley
RA, Cole PJ. Effects of human neutrophil elastase and Pseudomonas
aeruginosa proteinases on human respiratory epithelium. Am J Respir
Cell Mol Biol 1991 ;4(1):26-32.
46. Arora P, Sharma S, Garg S. Permeability issues in nasal drug
delivery. Drug Discov Today 2002;7(18):967-75.
47. Perry
M, Whyte
A.
Immunology
of
the
tonsils.
Immunol
Today 1998;19(9):414-21.
48. Gebert A. Identification of M-cells in the rabbit tonsil by vimentin
immunohistochemistry and in vivo protein transport. Histochem Cell
Biol 1995;104:211-220.
49. Hirabayashi Y, Kurata H, Funato H, Nagamine T, Aizawa C, Tamura
S, Shimada K, Kurata T. Comparison of intranasal inoculation of
influenza HA vaccine combined with cholera toxin B subunit with oral
or parenteral vaccination. Vaccine 1990;8(3):243-8.
50. Kanesaki T, Murphy BR, Collins PL, Ogra PL. Effectiveness of enteric
immunization in the development of secretory immunoglobulin A
response and the outcome of infection with respiratory syncytial virus.
J Virol 1991;65(2):657-63.
195
51. Wu HY, Russell MW. Induction of mucosal immunity by intranasal
application of a streptococcal surface protein antigen with the cholera
toxin B subunit. Infect Immun 1993; 61(1): 314-322.
52. Hiller AS, Kracke A, Tschernig T, Kasper M, Kleemann WJ, Tröger
HD, Pabst R. Comparison of the immunohistology of mucosaassociated lymphoid tissue in the larynx and lungs in cases of sudden
infant death and controls. Int J Legal Med 1997;110(6):316-22.
53. Hiller AS, Tschernig T, Kleemann WJ, Pabst R. Bronchus-associated
lymphoid tissue (BALT) and larynx-associated lymphoid tissue (LALT)
are found at different frequencies in children, adolescents and adults.
Scand J Immunol 1998;47(2):159-62.
54. Zuercher AW, Coffin SE, Thurnheer MC, Fundova P, Cebra JJ.
Nasal-Associated Lymphoid Tissue Is a Mucosal Inductive Site for
Virus-Specific Humoral and Cellular Immune Responses. J Immunol
2002; 168:1796-1803.
55. Kuper
CF, Koornstra
PJ, Hameleers
DM, Biewenga
J, Spit
BJ, Duijvestijn AM, van Breda Vriesman PJ, Sminia T. The role of
nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol Today 1992;13(6):219-24.
56. Koornstra PJ, de Jong FI, Vlek LF, Marres EH, van Breda Vriesman
PJ. The Waldeyer ring equivalent in the rat. A model for analysis of
oronasopharyngeal
immune
responses.
Acta
Otolaryngol 1991;111(3):591-9.
57. Wu HY, Nguyen HH, Russell MW. Nasal lymphoid tissue (NALT) as a
mucosal immune inductive site. Scand J Immunol 1997;46(5):506-13.
58. Debertin AS, Tschernig T, Tönjes H, Kleemann WJ, Tröger HD, Pabst
R.
Nasal-associated
lymphoid
tissue
(NALT):
frequency
and
localization in young children. Clin Exp Immunol 2003;134(3):503-7.
59. Lycke N. Recent progress in mucosal vaccine development: potential
and limitations. Nat Rev Immunol 2012;12(8):592-605.
196
60. Aziz MA, Midha S, Waheed SM, Bhatnagar R. Oral vaccines: new
needs, new possibilities. Bioessays 2007;29(6):591-604.
61. Russell-Jones
GJ.
Oral
vaccine
delivery.
J
Control
Release 2000;65(1-2):49-54.
62. Tacket
CO, Pasetti MF, Edelman
R, Howard
JA, Streatfield S.
Immunogenicity of recombinant LT-B delivered orally to humans in
transgenic corn. Vaccine 2004;22(31-32):4385-9.
63. Tacket CO, Mason HS, Losonsky G, Estes MK, Levine MM, Arntzen
CJ. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine
delivered in transgenic potatoes. J Infect Dis 2000;182(1):302-5.
64. Jepson
MA,
Clark
MK, Simmons NL,
MA,
Foster
N,
Mason
CM,
Bennett
Hirst BH. Targeting to intestinal M cells. J
Anat 1996; 189: 507–516.
65. Goldstein IJ, Hughes RC, Monsigny M, Osawa T, Sharon N. What
should be called a lectin. Nature 1980; 285: 66.
66. Dickinson BL, Clements JD. Dissociation of Escherichia coli heatlabile enterotoxin adjuvanticity from ADP-ribosyltransferase activity.
Infect Immun 1995;63(5):1617-23.
67. Holmgren J, Lycke N, Czerkinsky C. Cholera toxin and cholera B
subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems.
Vaccine 1993;11(12):1179-84.
68. Douce G, Giannelli V, Pizza M, Lewis D, Everest P, Rappuoli R,
Dougan G. Genetically Detoxified Mutants of Heat-Labile Toxin from
Escherichia coli Are Able To Act as Oral Adjuvants. Infect
Immun 1999; 67(9): 4400–4406.
69. Calcagno AM, Siahaan TJ. Physiological, Biochemical, and Chemical
Barriers to Oral Drug Delivery. içinde: Wang B, Siahaan TJ, Soltero
R, editörler. Drug Delivery: Principles and Applications. 1st ed.
Hoboken: John Wiley & Sons, Inc.; 2005. s. 15-27.
197
70. Wu HY, Russell MW. Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization,
and compartmentalization of the common mucosal immune system.
Immunol Res 1997;16(2):187-201.
71. Thapar MA, Parr EL, Parr MB. The effect of adjuvants on antibody
titers in mouse vaginal fluid after intravaginal immunization. J Reprod
Immunol 1990 ;17(3):207-16.
72. Parez, N, Fourgeux C, Mohamed A, Dubuquoy C, Pillot M, Dehee A,
Charpilienne A, Poncet D, Schwartz-Cornil I, Garbarg-Chenon
A. Rectal immunization with rotavirus virus-like particles induces
systemic and mucosal humoral immune responses and protects mice
against rotavirus infection. J Virol 2006; 80 (4):1752-1761.
73. Kozlowski
PA, Williams
SB, Lynch
RM, Flanigan
TP, Patterson
RR, Cu-Uvin S, Neutra MR. Differential induction of mucosal and
systemic antibody responses in women after nasal, rectal, or vaginal
immunization:
influence
of
the
menstrual
cycle.
J
Immunol 2002;169(1):566-74.
74. Abolhassani M, Lagranderie M, Chavarot P, Balazuc AM, Marchal G.
Mycobacterium bovis BCG induces similar immune responses and
protection by rectal and parenteral immunization routes. Infect
Immun 2000;68(10):5657-62.
75. Kantele A, Hakkinen M, Moldoveanu Z, Lu A, Savilahti E, Alvarez RD,
Michalek S, Mestecky J. Differences in Immune Responses Induced
by Oral and Rectal Immunizations with Salmonella typhi Ty21a:
Evidence for Compartmentalization within the Common Mucosal
Immune System in Humans. Infect Immun 1998; 66 (12), 5630–5635.
76. Liu H, Meagher CK, Moore CP, Phillips TE. M cells in the follicleassociated epithelium of the rabbit conjunctiva preferentially bind and
translocate latex beads. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46(11):421723.
198
77. Meagher CK, Liu H, Moore CP, Phillips TE. Conjunctival M cells
selectively bind and translocate Maackia amurensis leukoagglutinin.
Exp Eye Res 2005;80(4):545-53.
78. Petris CK, Golomb M, Phillips TE. Bacterial transcytosis across
conjunctival M cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48(5):2172-7.
79. Cain
C, Phillips
TE.
Developmental
changes
in
conjunctiva-
associated lymphoid tissue of the rabbit. Invest Ophthalmol Vis
Sci 2008;49(2):644-9.
80. Nesburn
AB, Burke
RL, Ghiasi
H, Slanina
SM, Wechsler
SL.
Therapeutic periocular vaccination with a subunit vaccine induces
higher levels of herpes simplex virus-specific tear secretory
immunoglobulin A than systemic vaccination and provides protection
against recurrent spontaneous ocular shedding of virus in latently
infected rabbits. Virology 1998;252(1):200-9.
81. Da Costa Martins R, Gamazo C, Sánchez-Martínez M, Barberán
M, Peñuelas I, Irache JM. Conjunctival vaccination against Brucella
ovis
in
mice
with
mannosylated
nanoparticles.
J
Control
Release 2012;162(3):553-60.
82. Nesburn AB, Slanina S, Burke RL, Ghiasi H, Bahri S, Wechsler SL.
Local Periocular Vaccination Protects against Eye Disease More
Effectively Than Systemic Vaccination following Primary Ocular
Herpes Simplex Virus Infection in Rabbits. J Virol 1998; 72(10):
7715–7721.
83. Vajdy M, O'Hagan DT. Microparticles for intranasal immunization. Adv
Drug Deliv Rev 2001;51:127-41.
84. Illum L, Davis SS. Nasal vaccination: a non-invasive vaccine delivery
method that holds great promise for the future. Adv Drug Deliv
Rev 2001; 51:1-3.
199
85. Tiwari S, Goyal AK, Mishra N, Vaidya B, Mehta A, Dube D, Vyas SP.
Liposome in situ gelling system: Novel carrier based vaccine adjuvant
for intranasal delivery of recombinant protein vaccine. Proc Vaccinol
2009; 1 (1), 148−163.
86. Illum L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J
Control Release 2003;87:187-98.
87. Dimova S, Brewster ME, Noppe M, Jorissen M, Augustijns P. The use
of human nasal in vitro cell systems during drug discovery and
development. Toxicol In Vitro 2005;19(1):107-22.
88. Krishnamoorthy R, Mitra AK. Prodrugs for nasal drug delivery. Adv
Drug Deliv Rev 1998;29:135-146.
89. Csaba N, Garcia-Fuentes M, Alonso MJ. Nanoparticles for nasal
vaccination. Adv Drug Deliv Rev 2009;61(2):140-57.
90. Sipai ABM, Vandana Y, Mamatha Y, Prasanth VV. Liposomes: an
Overview. JPSI 2012;1(1):13−21.
91. Jesorka A, Orwar O. Liposomes: technologies and analytical
applications. Annu Rev Anal Chem 2008;1:801-32.
92. Fahy E, Subramaniam S, Brown HA, Glass CK, Merrill AH Jr, Murphy
RC, Raetz CR, Russell DW, Seyama Y, Shaw W, Shimizu T, Spener
F, van Meer G, VanNieuwenhze MS, White SH, Witztum JL, Dennis
EA. A comprehensive classification system for lipids. J Lipid
Res 2005;46:839-61.
93. Woodbury DJ, Richardson ES, Grigg AW, Welling RD, Knudson BH.
Reducing liposome size with ultrasound: bimodal size distributions. J
Liposome Res 2006; 16:57–80.
94. Berger N, Sachse A, Bender J, Schubert R, Brandl M. Filter extrusion
of liposomes using different devices: comparison of liposome size,
encapsulation
efficiency,
and
process
characteristics.
Int
J
Pharm 2001;223:55-68.
200
95. Mui B, Chow L, Hope MJ. Extrusion technique to generate liposomes
of defined size. Methods Enzymol 2003;367:3-14.
96. Chen KH, Di Sabatino M, Albertini B, Passerini N, Kett VL. The effect
of polymer coatings on physicochemical properties of spray-dried
liposomes for nasal delivery of BSA. Eur J Pharm Sci 2013;50:312-22.
97. Law SL, Huang KJ, Chou VH, Cherng JY. Enhancement of nasal
absorption
of
calcitonin
loaded
in
liposomes.
J
Liposome
Res 2001;11(2-3):165-74.
98. Klavinskis LS, Barnfield C, Gao L, Parker S. Intranasal immunization
with plasmid DNA-lipid complexes elicits mucosal immunity in the
female genital and rectal tracts. J Immunol 1999;162:254-62.
99. Tafaghodi M, Jaafari MR, Sajadi Tabassi SA. Nasal immunization
studies using liposomes loaded with tetanus toxoid and CpG-ODN. Eur
J Pharm Biopharm 2006;64:138-45.
100. de
Haan
A, Geerligs
HJ, Huchshorn
JP, van
Scharrenburg
GJ, Palache AM, Wilschut J. Mucosal immunoadjuvant activity of
liposomes: induction of systemic IgG and secretory IgA responses in
mice by intranasal immunization with an influenza subunit vaccine and
coadministered liposomes. Vaccine 1995;13(2):155-62.
101. de Haan A, Tomee JFC, Huchshorn JP, Wilschut J. Liposomes as
an immunoadjuvant system for stimulation of mucosal and systemic
antibody responses against inactivated measles virus administered
intranasally to mice. Vaccine 1995;13(14):1320-24.
102. Childers NK, Tong G, Michalek SM. Nasal immunization of humans
with dehydrated liposomes containing Streptococcus mutans antigen.
Oral Microbiol Immunol 1997;12:329-335.
103. Childers NK, Tong G, Mitchell S, Kirk K, Russell MW, Michalek SM.
A controlled clinical study of the effect of nasal immunization with a
Streptococcus mutans antigen alone or incorporated into liposomes
201
on induction of immune responses. Infect Immun 1999; 67 (2): 618623.
104. Klavinskis LS, Gao L, Barnfield C, Lehner T, Parker S. Mucosal
immunization with DNA-liposome complexes. Vaccine 1997;15
(8):818-820.
105. Sloat BR, Cui Z. Strong mucosal and systemic immunities induced
by nasal immunization with anthrax protective antigen protein
incorporated in liposome–protamine–DNA particles. Pharm Res 2006;
23 (2): 262–269.
106. Baca-Estrada ME, Foldvari M, Snider M, Harding K, Kournikakis B,
Babiuk LA, Griebel P. Intranasal immunization with liposomeformulated Yersinia pestis vaccine enhances mucosal immune
responses. Vaccine 2000; 18: 2203–2211.
107. Sakaue G, Hiroi T, Nakagawa Y, Someya K, Iwatani K, Sawa Y,
Takahashi H, Honda M, Kunisawa J, Kiyono H. HIV mucosal vaccine:
Nasal immunization with gp160-encapsulated hemagglutinating virus
of Japan-liposome induces antigen specific CTLs and neutralizing
antibody responses. J Immunol 2003; 170: 495–502.
108. de Jonge MI, Hamstra HJ, Jiskoot W, Roholl P, Williams NA,
Dankert J, Van Alphen L, van der Ley P. Intranasal immunisation of
mice with liposomes containing recombinant meningococcal OpaB
and OpaJ proteins. Vaccine 2004; 22: 4021–4028.
109. Lambkin R, Oxford JS, Bossuyt S, Mann A, Metcalfe IC, Herzog C,
Viret JF, Glück R. Strong local and systemic protective immunity
induced in the ferret model by an intranasal virosome-formulated
influenza subunit vaccine. Vaccine 2004; 22: 4390-4396.
110. A new frontier in vaccinology [internette]. 2009 [23 Eylül 2013
okundu].URL:http://www.crucell.com/Technology__Virosome_Technology_-_Description
202
111. Cusi MG, Zurbriggen R, Valassina M, Bianchi S, Durrer P, Valensin
PE,
Donati M, Glück R. Intranasal immunization with mumps
virus DNA vaccine
delivered
by
mucosal and systemic immunity.
influenza
virosomes
elicits
Virology 2000; 277:111-118.
112. Marchisio P, Cavagna R, Maspes B, Gironi S, Esposito S,
Lambertini L, Massimini A, Herzog C, Principi N. Efficacy of intranasal
virosomal influenza vaccine in the prevention of recurrent acute otitis
media in children. Clin Infect Dis 2002; 35: 168-174.
113. Durrer P, Glück U, Spyr C, Lang AB, Zurbriggen R, Herzog C,
Gluck R. Mucosal antibody response induced with a nasal virosomebased influenza vaccine. Vaccine 2003; 21: 4328-4334.
114. Tiwari S, Goyal AK, Mishra N, Khatri K, Vaidya B, Mehta A, Wu
Y, Vyas SP. Development and characterization of novel carrier gel
core liposomes based transmission blocking malaria vaccine. J
Control Release 2009;140(2):157-65.
115. Tiwari S, Goyal AK, Khatri K, Mishra N, Vyas SP. Gel core
liposomes: an advanced carrier for improved vaccine delivery. J
Microencapsul 2009;26(1):75-82.
116. Viallat A, Dalous J, Abkarian M. Giant Lipid Vesicles Filled with a
Gel: Shape Instability Induced by Osmotic Shrinkage. Biophys J 2004;
86:2179–2187.
117. Pavelić Z, Skalko-Basnet N, Schubert R. Liposomal gels for vaginal
drug delivery. Int J Pharm 2001;219:139-49.
118. Pavelić Z, Skalko-Basnet N, Jalsenjak I. Liposomal gel with
chloramphenicol:
characterisation
and
in
vitro
release.
Acta
Pharm 2004;54(4):319-30.
119. Fattal E, De Rosa G, Bochot A. Gel and solid matrix systems for the
controlled delivery of drug carrier-associated nucleic acids. Int J
Pharm 2004;277:25-30.
203
120. Abusugra I, Morein B. ISCOM is an efficient mucosal delivery system
for Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (MmmSC) antigens
inducing high mucosal and systemic antibody responses. FEMS
Immunol Med Microbiol 1999;23:5-12.
121. Jones PD, Hla RT, Morein B, Lovgren K, Ada GL. Cellular immuneresponses in the murine lung to local immunization with influenza A
virus glycoproteins in micelles and immunostimulatory complexes
(ISCOMs). Scand J Immunol 1988; 27: 645-652.
122. Lövgren K, Kaberg H, Morein B. An experimental influenza subunit
vaccine (ISCOM) — induction of protective immunity to challenge
infection in mice after intranasal or subcutaneous administration. Clin
Exp Immunol 1990;82 : 435-439.
123. Hu KF, Elvander M, Merza M, Akerblom L, Brandenburg A, Morein
B. The immunostimulating complex (ISCOM) is an efficient mucosal
delivery system for respiratory syncytial virus (RSV) envelope
antigens inducing high local and systemic antibody responses. Clin
Exp Immunol 1998;113: 235-243.
124. Pandey RS, Dixit VK. Evaluation of ISCOM vaccines for mucosal
immunization against hepatitis B. J Drug Target 2010;18(4):282-91.
125. De
Miguel
I, Imbertie
L, Rieumajou
V, Major
M, Kravtzoff
R, Betbeder D. Proofs of the structure of lipid coated nanoparticles
(SMBV) used as drug carriers. Pharm Res 2000;17(7):817-24.
126. von Hoegen P. Synthetic biomimetic supra molecular Biovector
(SMBV) particles for nasal vaccine delivery.
Adv Drug Deliv
Rev 2001;51:113-25.
127. Castignolles N, Morgeaux S, GontierJallet C, Samain D, Betbeder D,
Perrin P. A new family of carriers (biovectors) enhances the
immunogenicity of rabies antigens. Vaccine 1996;14:1353–1360.
204
128. Castignolles N, Betbeder D, Ioualalen K, Merten O, Leclerc C,
Samain D, Perrin P. Stabilization and enhancement of interleukin-2
in-vitro bioactivity by new carriers - supramolecular biovectors.
Vaccine 1994;12: 1413–1418.
129. Debin A, Kravtzoff R, Santiago JV, Cazales L, Sperandio S, Melber K,
Janowicz Z, Betbeder D, Moynier M. Intranasal immunization with
recombinant antigens associated with new cationic particles induces
strong mucosal as well as systemic antibody and CTL responses.
Vaccine 2002; 20: 2752–2763.
130. Halperin SA, Smith B, Clarke K, Treanor J, Mabrouk T, Germain M.
Phase I, randomized, controlled trial to study the reactogenicity and
immunogenicity of a nasal, inactivated trivalent influenza virus
vaccine in healthy adults. Hum Vaccin 2005;1: 37–42.
131. Almeida AJ, Alpar HO, Brown MR. Immune response to nasal
delivery of antigenically intact tetanus toxoid associated with poly(llactic acid) microspheres in rats, rabbits and guinea-pigs. J Pharm
Pharmacol 1993;45: 198–203.
132. Vila A, Sanchez A, Evora C, Soriano I, McCallion O, Alonso MJ. PLAPEG particles as nasal protein carriers: the influence of the particle
size. Int J Pharm 2005;292 :43–52.
133. Vila A, Sanchez A, Evora C, Soriano I, Jato JLV, Alonso MJ. PEGPLA nanoparticles as carriers for nasal vaccine delivery. J Aerosol
Med 2004; 17: 174–185.
134. Jung T, Kamm W, Breitenbach A, Hungerer KD, Hundt E, Kissel T.
Tetanus toxoid loaded nanoparticles from sulfobutylated poly(vinyl
alcohol)-graft-poly
(lactide-co-glycolide):
evaluation
of
antibody
response after oral and nasal application in mice. Pharm Res 2001;
18 (3): 352–360.
205
135. Jung T, Kamm W, Breitenbach A, Klebe G, Kissel T. Loading of
Tetanus Toxoid to Biodegradable Nanoparticles from Branched
Poly(Sulfobutyl-Polyvinyl
Alcohol)-g-(Lactide-Co-Glycolide)
Nanoparticles by Protein Adsorption: A Mechanistic Study. Pharm
Res 2002;19(8):1105-1113
136. Csaba
N,
Sanchez
A,
Alonso
MJ.
PLGA:Poloxamer
and
PLGA:Poloxamine blend nanostructures as carriers for nasal gene
delivery. J Control Release 2006;113:164–172.
137. Sharon N. Lectin-carbohydrate complexes of plants and animals: an
atomic view. Trends Biochem Sci 1993; 18: 221–226.
138. Gebert
A.
M-cells
in
the
rabbit
tonsil
exhibit
distinctive
glycoconjugates in their apical membranes. J Histochem Cytochem
1996;44:1033–1042.
139. Jeong KI, Uetsuka K, Nakayama H, Doi K. Glycoconjugate
expression in follicle-associated epithelium (FAE) covering the nasalassociated lymphoid tissue (NALT) in specific pathogen-free and
conventional rats. Exp Anim 1999; 48 (1): 23–29.
140. Giannasca PJ, Boden JA, Monath TP. Targeted delivery of antigen to
hamster nasal lymphoid tissue with M-cell directed lectins. Infect
Immun 1997; 65 (10):4288–4298.
141. Kawamura M, Wang X, Uto T, Sato K, Ueno M, Akagi T, Hiraishi K,
Matsuyama T, Akashi M, Baba M. Induction of dendritic cell-mediated
immune responses against HIV-1 by antigen-capturing nanospheres
in mice. J Med Virol 2005;76:7–15.
142. Miyake A, Akagi T, Enose Y, Ueno M, Kawamura M, Horiuchi R,
Hiraishi K, Adachi M, Serizawa T, Narayan O, Akashi M, Baba M,
Hayami M. Induction of HIV specific antibody response and protection
against vaginal SHIV transmission by intranasal immunization with
206
inactivated SHIV-capturing nanospheres in macaques. J Med Virol
2004;73:368–377.
143. Soppimath
KS, Aminabhavi
TM, Kulkarni
AR, Rudzinski
WE.
Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices. J
Control Release 2001;70:1-20.
144. Illum L, Jabbal-Gill I, Hinchcliffe M, Fisher AN, Davis SS. Chitosan as
a novel nasal delivery system for vaccines. Adv Drug Deliv
Rev 2001;51:81-96.
145. Khatri K, Goyal AK, Gupta PN, Mishra N, Vyas SP. Plasmid DNA
loaded chitosan nanoparticles for nasal mucosal immunization
against hepatitis B. Int J Pharm 2008;354: 235–241.
146. Vila A, Sánchez A, Janes K, Behrens I, Kissel T, Vila Jato JL, Alonso
MJ. Low molecular weight chitosan nanoparticles as new carriers for
nasal
vaccine
delivery
in
mice.
Eur
J
Pharm
Biopharm 2004;57(1):123-31.
147. Kumar M, Behera AK, Lockey RF, Zhang J, Bhullar G, De La Cruz
CP, Chen LC, Leong KW, Huang SK, Mohapatra SS. Intranasal Gene
Transfer by Chitosan–DNA Nanospheres Protects BALB/c Mice
Against Acute Respiratory Syncytial Virus Infection. Hum Gene
Ther 2002;13(12):1415-25.
148. Lee D, Zhang W, Shirley SA, Kong X, Hellermann GR, Lockey RF,
Mohapatra SS. Thiolated chitosan/DNA nanocomplexes exhibit
enhanced and sustained gene delivery. Pharm Res 2007;24(1):157–
167.
149. Amidi M, Romeijn SG, Verhoef JC, Junginger HE, Bungener L,
Huckriede A, Crommelin DJ, Jiskoot W. N-trimethyl chitosan (TMC)
nanoparticles loaded with influenza subunit antigen for intranasal
vaccination: biological properties and immunogenicity in a mouse
model. Vaccine 2007; 25:144–153.
207
150. Sayin B, Somavarapu S, Li XW, Thanou M, Sesardic D, Alpar HO,
Senel S. Mono-N-carboxymethyl chitosan (MCC) and N-trimethyl
chitosan (TMC) nanoparticles for non-invasive vaccine delivery. Int J
Pharm 2008; 363:139–148.
151. Yamaguchi K, Anderson JM. In vivo biocompatibility studies of
medisorb@ 65/35 D,L-lactide/glycolide copolymer microspheres. J
Control Release 1993; 24:81-93.
152. Almeida AJ, Alpar HO, Brown MR.
Immune response to nasal
delivery of antigenically intact tetanus toxoid associated with poly(Llactic acid) microspheres in rats, rabbits and guinea-pigs. J Pharm
Pharmacol 1993;45(3):198-203.
153. Shahin R, Leef M, Eldridge J, Hudson M, Gilley R. Adjuvanticity
and Protective Immunity Elicited by Bordetella pertussis Antigens
Encapsulated in Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres. Infect
Immun 1995; 63(4): 1195–1200.
154. Ray
R, Novak
M, Duncan
JD, Matsuoka
Y, Compans
RW.
Microencapsulated human parainfluenza virus induces a protective
immune response. J Infect Dis 1993;167(3):752-5.
155. Eyles JE, Sharp GJ, Williamson ED, Spiers ID, Alpar HO. Intra nasal
administration of poly-lactic acid microsphere co-encapsulated
Yersinia pestis subunits confers protection from pneumonic plague in
the mouse. Vaccine 1998 ;16(7):698-707.
156. Chen H. Recent advances in mucosal vaccine development. J
Control Release 2000;67:117-28.
157. Eo SK, Lee S, Kumaragur U, Rouse BT. Immunopotentiation of DNA
vaccine against herpes simplex virus via co-delivery of plasmid DNA
expressing CCR7 ligands. Vaccine 2001;19:4685–93.
208
158. Lilliard JWJ, Boyaka PN, Taub DD, McGhee JR. RANTES
potentiates antigen-specific mucosal immune responses. J Immunol
2001;166:162–9.
159. de Haan L, Verweij W, Holtrop M, et al. Nasal or intramuscular
immunization of mice with influenza subunit antigen and the B subunit
of Escherichia coli heat-labile toxin induces IgA- or IgG-mediated
protective mucosal immunity. Vaccine 2001;19:2898–907.
160. Staats HF, Bradney CP, Gwinn WM, et al. Cytokine requirements for
induction of systemic and mucosal CTL after nasal immunization. J
Immunol 2001;167:5386–94.
161. Gallichan WS, Woolstencroft RN, Guarasci T, McCluskie MJ, Davis
HL, Rosenthal
KL.
Intranasal
Immunization
with
CpG
Oligodeoxynucleotides as an Adjuvant Dramatically Increases IgA
and Protection Against Herpes Simplex Virus-2 in the Genital Tract. J
Immunol 2001;166(5):3451-7.
162. Moschos SA, Bramwell VW, Somavarapu S, Alpar HO. Adjuvant
synergy: The effects of nasal coadministration of adjuvants. Immunol
Cell Biol 2004 ;82(6):628-37.
163. Guerrero RA, Ball JM, Krater SS, Pacheco SE, Clemens JD, Estes
MK.
Recombinant
Norwalk
virus-like
particles
administered
intranasally to mice induce systemic and mucosal (fecal and vaginal)
immune responses. J Virol 2001;75:9713–22.
164. Albumin from chicken egg White (A5503) Product Information Sigma
[internette],
2011
[06
Ağustos
2012
okundu].
URL:
http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/a5503pis.pdf
165. Yanasarn N, Sloat BR, Cui Z. Negatively charged liposomes show
potent adjuvant activity when simply admixed with protein antigens.
Mol Pharm 2011 ;8(4):1174-85.
209
166. Remold-O'Donnell E. The ovalbumin family of serpin proteins. FEBS
Lett 1993;315(2):105-8.
167. Nisbet AD, Saundry RH, Moir AJ, Fothergill LA, Fothergill JE. The
Complete
Amino
acid
sequence
of
hen
ovalbumin.
Eur
J
Biochem. 1981 Apr;115(2):335-45.
168. Huntington JA, Stein PE. Structure and properties of ovalbumin. J
Chromatogr B Biomed Sci Appl 2001;756:189-98.
169. Boonyo W, Junginger HE, Waranuch N, Polnok A, Pitaksuteepong T.
Chitosan and trimethyl chitosan chloride (TMC) as adjuvants for
inducing immune responses to ovalbumin in mice following nasal
administration. J Control Release 2007;121(3):168-75.
170. Amidi
M, Romeijn
SG, Borchard
G, Junginger
HE, Hennink
WE, Jiskoot W. Preparation and characterization of protein-loaded Ntrimethyl chitosan nanoparticles as nasal delivery system. J Control
Release 2006;111:107-16.
171. Slütter B, Soema PC, Ding Z, Verheul R, Hennink W, Jiskoot W.
Conjugation
of
ovalbumin
to
trimethyl
chitosan
improves
immunogenicity of the antigen. J Control Release 2010;143(2):20714.
172. Slütter B, Jiskoot W. Dual role of CpG as immune modulator and
physical crosslinker in ovalbumin loaded N-trimethyl chitosan (TMC)
nanoparticles
for
nasal
vaccination.
J
Control
Release 2010;148(1):117-21.
173. Gordon S, Teichmann E, Young K, Finnie K, Rades T, Hook S. In
vitro and in vivo investigation of thermosensitive chitosan hydrogels
containing silica nanoparticles for vaccine delivery. Eur J Pharm
Sci 2010;41(2):360-8.
210
174. Nagamoto T, Hattori Y, Takayama K, Maitani Y. Novel chitosan
particles and chitosan-coated emulsions inducing immune response
via intranasal vaccine delivery. Pharm Res 2004;21(4):671-4.
175. O'Hagan DT, Jeffery H, Davis SS. Long-term antibody responses in
mice following subcutaneous immunization with ovalbumin entrapped
in biodegradable microparticles. Vaccine 1993;11(9):965-9.
176. Demana PH, Davies NM, Berger B, Rades T. Incorporation of
ovalbumin into ISCOMs and related colloidal particles prepared by the
lipid film hydration method. Int J Pharm 2004;278(2):263-74.
177. Ekström J, Hu KF, Bengtsson KL, Morein B. ISCOM and ISCOMmatrix enhance by intranasal route the IgA responses to OVA and
rCTB in local and remote mucosal secretions. Vaccine 1999;17:
2690-701.
178. Mowat AM, Maloy KJ, Donachie AM. Immune-stimulating complexes
as adjuvants for inducing local and systemic immunity after oral
immunization with protein antigen. Immunology 1993;80:527.
179. Harikarnpakdee S, Lipipun V, Sutanthavibul N, Ritthidej GC. Spray
dried mucoadhesive microspheres: preparation and transport through
nasal cell monolayer. AAPS PharmSciTech 2006; 7(1): E79-E88.
180. Council of Europe. Avrupa Farmakopesi 5.0. Council of Europe;
2004.
181. Brooking J, Davis SS, Illum L. Transport of nanoparticles across the
rat nasal mucosa. J Drug Targeting 2001; 9: 267–279.
182. Smith
PK, Krohn
RI, Hermanson
GT, Mallia
AK, Gartner
FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC.
Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem
1985;150(1):76-85.
211
183. PierceTM BCA Protein Assay Kit Instructions Thermo Scientific
[internette].
2013
[22
Haziran
2013
okundu].
URL:
https://www.piercenet.com/instructions/2161296.pdf
184. Wiechelman KJ, Braun RD, Fitzpatrick JD. Investigation of the
bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups
responsible for color formation. Anal Biochem 1988;175(1):231-7.
185. Zhu Y, Chidekel A, Shaffer TH. Cultured Human Airway Epithelial
Cells (Calu-3): A Model of Human Respiratory Function, Structure,
and Inflammatory Responses. Crit Care Res Pract 2010; 2010: 1-8.
186. Dimova S, Brewster ME, Noppe M, Jorissen M, Augustijns P. The
use of human nasal in vitro cell systems during drug discovery and
development. Toxicol In Vitro 2005;19(1):107-22.
187. Jiang L, Gao L, Wang X, Tang L, Ma J. The application of
mucoadhesive polymers in nasal drug delivery. Drug Dev Ind
Pharm 2010;36(3):323-36.
188. Jimenez-Castellanos MR, Zia H, Rhodes CT. Mucoadhesive drug
delivery systems. Drug Dev Ind Pharm 1993; 19:143–94.
189. Peppas NA, Buri PA. Surface, interfacial and molecular aspects of
polymer bioadhesion on soft tissues. J Control Release 1985;2:257–
275.
190. Jabbari E, Wisniewski N, Peppas NA. Evidence of mucoadhesion by
chain interpenetration at a poly (acrylic acid)/mucin interface using
ATR-FTIR spectroscopy. J Control Release 1993; 26:99–108.
191. Park H, Robinson JR. Mechanisms of mucoadhesion of poly(acrylic
acid) hydrogels. Pharm Res 1987; 4: 457-464.
192. Accili
D, Menghi
G, Bonacucina
G, Martino
PD, Palmieri
GF.
Mucoadhesion dependence of pharmaceutical polymers on mucosa
characteristics. Eur J Pharm Sci 2004;22(4):225-34.
212
193. Demiröz FT. Kontrollü salım yapan biyoadezif yeni vajinal ilaç
şekillleri üzerinde çalışmalar. Doktora tezi. Ankara: Gazi Üniversitesi;
2009.
194. Rudra A, Santra K, Mukheriee B. Poly [D, L-lactide-co-glycolide]
Microspheres as a Delivery System of Protein Ovalbumin Used as a
Model Protein Drug. Trens Appl Sci Res 2011; 6: 47-56.
195. Wade A, Weller PJ. Editörler. Pharmaceutical excipients. 2nd. Ed.
London: 1994.
196. Gregoriadis G. Immunological adjuvants: a role for liposomes.
Immunol Today 1990;11(3):89-97.
197. Aramaki Y, Tomizawa H, Hara T, Yachi K, Kikuchi H, Tsuchiya S.
Stability of liposomes in vitro and their uptake by rat Payer's patches
following oral administration. Pharm Res 1993;10:1228±31.
198. Childers NK, Michalek SM, Denys F, McGhee JR. Characterization of
liposomes for oral vaccines. Adv Exp Med Biol 1987;216B:1771-80.
199. Pierce NF, Sacci JBJ. Enhanced mucosal priming by cholera toxin
and procholeragenoid with a lipoidal amine adjuvant (avridine)
delivered in liposomes. Infect Immun 1984;44:469-73.
200. Jackson S, Mestecky J, Childers NK, Michalek SM. Liposomes
containing anti-idiotypic antibodies: an oral vaccine to induce
protective secretory immune responses specific for pathogens of
mucosal surfaces. Infect Immun 1990;58:1932-6.
201. Abraham E. Intranasal immunization with bacterial polysaccharide
containing liposomes enhances antigen-specific pulmonary secretory
antibody response. Vaccine 1992;10:461-8.
202. de Haan A, Renegar KB, Small PA, Wilschutt J. Induction of a
secretory IgA response in the murine female urogenital tract by
immunization of the lungs with liposome-supplemented viral subunit
antigen. Vaccine 1995;1995:613-6.
213
203. Reddin KM, Easterbrook TJ, Eley SM, Russell P, Mobsby VA, Jones
DH, Farrar GH, Williamson ED, Robinson A. Comparison of the
immunological
and
protective
responses
elicited
by
microencapsulated formulations of the F1 antigen from Yersinia
pestis. Vaccine 1998;16:761-7.
204. Kim JY, Kim JK, Park JS, Byun Y, Kim CK. The use of PEGylated
liposomes to prolong circulation lifetimes of tissue plasminogen
activator. Biomaterials 2009;30(29):5751-6.
205. Patil S, Sandberg A, Heckert E, Self W, Seal S. Protein adsorption
and cellular uptake of cerium oxide nanoparticles as a function of zeta
potential. Biomaterials 2007; 28 (31): 460-467.
206. Salvati A, Ristori S, Pietrangeli D, Oberdisse J, Calamai L, Martini
G, Ricciardi
G.
Insertion
of
a
magnesium(II)-
octacarboranyl(hexylsulfanyl) porphyrazine into liposomes: a physicochemical study. Biophys Chem 2007; 131: 43-51.
207. Mura
P, Maestrelli
F, González-Rodríguez
ML, Michelacci
I, Ghelardini C, Rabasco AM. Development, characterization and in
vivo evaluation of benzocaine-loaded liposomes. Eur J Pharm
Biopharm 2007;67(1):86-95.
208. Lindner LH, Hossann M, Vogeser M, Teichert N, Wachholz K, Eibl
H, Hiddemann W, Issels RD. Dual role of hexadecylphosphocholine
(miltefosine) in thermosensitive liposomes: active ingredient and
mediator of drug release. J Control Release 2008;125(2):112-20.
209. Awad D, Tabod I, Lutz S, Wessolowski H, Gabel D. Interaction of
Na2B12H11SH with liposomes: Influence on zeta potential and particle
size. J Organomet Chem 2005; 690(11):2732-2735.
210. González-Rodríguez ML, Barros LB, Palma J, González-Rodríguez
PL, Rabasco AM. Application of statistical experimental design to
214
study the formulation variables influencing the coating process of
lidocaine liposomes. Int J Pharm 2007;337:336-45.
211. Mu X, Zhong Z. Preparation and properties of poly(vinyl alcohol)stabilized liposomes. Int J Pharm 2006;318:55-61.
212. Centis V, Vermette P. Physico-chemical properties and cytotoxicity
assessment
of
PEG-modified
liposomes
containing
human
hemoglobin. Colloids Surf B Biointerfaces 2008;65(2):239-46.
213. Sun W, Zhang N, Li A, Zou W, Xu W. Preparation and evaluation of
N(3)-O-toluyl-fluorouracil-loaded
liposomes.
Int
J
Pharm 2008;353:243-50.
214. Li
N, Peng
LH, Chen
X, Nakagawa
S, Gao
JQ.
Effective
transcutaneous immunization by antigen-loaded flexible liposome in
vivo. Int J Nanomedicine 2011;6:3241-50.
215. Schubert R, Wolburg H, Schmidt KH, Roth HJ. Loading of preformed
liposomes with high trapping efficiency by detergent-induced
formation of transient membrane holes. Chem Phys Lipids 1991; 58:
121-129.
216. Altin JG, Parish CR. Liposomal vaccines—targeting the delivery of
antigen. Methods 2006;40(1):39-52.
217. Martin A. Rheology. İçinde: Martin A, Rustamante P, Chun AC,
editörler. Physical Pharmacy. 4th Ed. Philadelphia: Lea&Febiger;
1993. s. 453-476.
218. Cilek A. İnterlökin 2’nin pulmoner yoldan uygulanabilecek lipozom
formülasyonunun geliştirilmesi ve in vitro-in vivo değerlendirilmesi.
Doktora tezi. Ankara: Gazi Üniversitesi; 2008.
219. Karadag E, Saraydin D, Cetinkaya S, Guven O. In vitro swelling
studies and preliminary biocompatibility evaluation of acrylamidebased hydrogels. Biomaterials 1996;17:67–70.
215
220. Vllasaliu
D, Casettari
L, Fowler
R, Exposito-Harris
R, Garnett
M, Illum L, Stolnik S. Absorption-promoting effects of chitosan in
airway and intestinal cell lines: A comparative study. Int J
Pharm 2012;430:151-60.
221. Florea BI, Thanou M, Junginger HE, Borchard G. Enhancement of
bronchial octreotide absorption by chitosan and N-trimethylchitosan
shows linear in vitro/in vivo correlation. J Control Release 2005; 110:
353–361.
222. Huang M, Khor E, Lim LY. Uptake and cytotoxicity of chitosan
molecules and nanoparticles: effects of molecular weight and degree
of deacetylation. Pharm Res 2004; 21: 344–353.
223. Grenha A, Grainger CI, Dailey LA, Seijo B, Martin GP, RemuñánLópez C, Forbes B. Chitosan nanoparticles are compatible with
respiratory epithelial cells in vitro. Eur J Pharm Sci 2007;31(2):73-84.
224. Mura S, Hillaireau H, Nicolas J, Le Droumaguet B, Gueutin C, Zanna
S, Tsapis N, Fattal E. Influence of surface charge on the potential
toxicity
of
PLGA
nanoparticles
towards
Calu-3
cells.
Int
J
Nanomedicine 2011;6:2591-605.
225. Ruel-Gariépy E, Leroux JC. In situ-forming hydrogels--review of
temperature-sensitive
systems.
Eur
J
Pharm
Biopharm 2004;58(2):409-26.
226. du Plessis J, Ramachandran C, Weiner N, Muller DG. The influence
of lipid composition and lamellarity of liposomes on the physical
stability of liposomes upon storage. Int J Pharm 1996; 127(2):273278.
227. Yadav AV, Murthy MS, Shete AS, Sakhare S. Stability Aspects of
Liposomes. Ind J Pharm Edu Res 2011;45( 4): 402-413.
216
228. Majithiya
RJ,
Ghosh,
PK,
Umrethia
ML,
Murthy
RS.
Thermoreversible-mucoadhesive gel for nasal delivery of sumatriptan.
AAPS PharmSciTech 2006;7(3):E1-E7.
229. Basu S,
Bandyopadhyay AK. Comparative Study between
Conventional and Thermoreversible Mucoadhesive Nasal Gels of
Midazolam Hydrochloride. Sci Technol 2012; 2(2): 8-15.
230. Tan YTF, Peh KK, Al-Hanbali O. Effect of Carbopol and
polyvinylpyrrolidone on the mechanical, rheological and release
properties of bioadhesive polyethylene glycol gels. AAPS PharmSci
Tech 2000; 1: 1-10.
231. Grabovac V, Guggi D, Bernkop-Schnürch A. Comparison of the
mucoadhesive properties of various polymers. Adv Drug Deliv Rev
2005; 57:1713–23.
232. Lehr CM, Bouwstra JA, Schacht EH, Junginger HE. In vitro
evaluation of mucoadhesive properties of chitosan and some other
natural polymers. Int J Pharm 1992; 78: 43 – 48.
233. Artursson P, Lindmark T, Davis SS, Illum L. Effect of chitosan on the
permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2).
Pharm Res 1994 ;11(9):1358-61.
234. Dodane V, Amin Khan M, Merwin JR. Effect of chitosan on epithelial
permeability and structure. Int J Pharm 1999;182(1):21-32.
235. Schipper
NG, Olsson
KM, Artursson P.
S, Hoogstraate
JA, deBoer
AG, Vårum
Chitosans as absorption enhancers for poorly
absorbable drugs 2: mechanism of absorption enhancement. Pharm
Res 1997;14(7):923-9.
236. Illum L. Nasal drug delivery: new developments and strategies. Drug
Discov Today 2002;7(23):1184-9.
217
237. Jones DS, Woolfson AD, Brown AF. Textural, viscoelastic and
mucoadhesive properties of pharmaceutical gels composed of
cellulose polymers. Int J Pharm 1997;151: 223 - 233.
238. Cevher E,Sensoy D, Taha MAM, Araman A. Effect of Thiolated
Polymers to Textural and Mucoadhesive Properties of Vaginal Gel
Formulations Prepared with Polycarbophil and Chitosan. AAPS
PharmSciTech 2008;9(3):953-65.
239. Amasya G, Karavana SY, Şen T, Baloğlu E, Tarımcı N. Bioadhesive
and mechanical properties of triamcinolone acetonide buccal gels.
Turk J Pharm Sci 2012; 9(1): 1-12.
240. Tuğcu-Demiröz F, Acartürk F, Erdoğan D. Development of longacting bioadhesive vaginal gels of oxybutynin: formulation, in vitro and
in vivo evaluations. Int J Pharm 2013;457(1):25-39.
218
10. EKLER
219
EK 1: EVALUATION OF IN VITRO CYTOTOXICITY OF NASAL
OVALBUMIN FORMULATIONS ON CALU-3 CELLS
220
EVALUATION OF IN VITRO CYTOTOXICITY OF NASAL
OVALBUMIN FORMULATIONS ON CALU-3 CELLS
Nevin ÇELEBİ1, Meltem KAPLAN1, İmran VURAL2
1
Gazi University, Faculty of Pharmacy, Department of
Pharmaceutical Technology, Ankara, Turkey
2
Hacettepe University, Faculty of Pharmacy, Department of
Pharmaceutical Technology, Ankara, Turkey
Vaccination through nasal route is an advantageous and
efficient way to prevent both respiratory and other mucosal sites diseases.
However, it is important to evaluate the biocompatibility of the applied
formulations to nasal epithelium. The aim of this study was to evaluate the
cytotoxicity of novel nasal vaccine formulations of gels and liposomes
containing ovalbumin (OVA) as model antigen using human respiratory
epithelial cell lines Calu 3. The gel formulations were prepared using
chitosan (2 % w/v) and Carbopol® 974P NF (0,25% w/v). The liposome
formulation was prepared by lipid film hydration method using eggphosphatidylcholine.
For cytotoxicity assay, the cells were grown in the complete
DMEM medium. Cells were seeded at 5 x 103 cells/well onto the 96-well
plates and incubated overnight. The following day, gel and liposome
formulations containing 50 μg of OVA were added to the wells. As a
control group, only the medium treated cells were used. Then, the plates
were incubated for 24 hours. 25 µL of MTT solution (5 mg/mL) was added
and the plates were again incubated for 4 hours. Hereafter, MTT solvent
221
was added to solubilize formazan crystals. Plates were read at 570 nm
using a microplate reader.
Cell viability is expressed as the ratio of the amount of
formazan produced by cells treated with OVA containing formulations to
those produced by nontreated control cells. Considering the average
growth in this group as 100% all other calculations were performed.
Percentage cell viability values were found close to this value for all
formulations. Results may suggest that prepared formulations are safe
towards Calu-3 cells.
222
223
EK 2:
224
225
11. TEŞEKKÜR
Yüksek lisans tez çalışmalarımı planlayan ve yöneten, her
türlü sorunuma çözüm bulan, tüm iyi niyetiyle yardımlarını esirgemeyen,
birlikte katıldığımız toplantılarda dostluğunu gördüğüm, beni tüm kalbiyle
sahiplenip, benimseyen sevgili hocam Prof. Dr. Nevin ÇELEBİ’ye,
BCA, Sitotoksisite ve SDS-PAGE analizlerimde bizzat
ilgilenerek yardım ve katkılarını esirgemeyen, lisans dönemimden de hiçbir
zaman unutamadığım, göklerden iyilik elçisi olarak indirildiğine inandığım
“özel insan” sevgili hocam Prof. Dr. İmran VURAL’a
Lipozom hazırlama aşamasında bizzat benimle çalışarak
lipozom hazırlanmasını öğreten, her yardıma ihtiyacım olduğunda elinden
gelen desteği hiç çekinmeden veren sevgili hocam Prof. Dr. Tuncer
DEĞİM’e,
İşten geç saatlerde çıkıp geldiğimiz ders döneminde, anne
şefkatiyle bizlere elleriyle çay-pasta hazırlayıp getiren, tez çalışmalarım
süresince bilimsel bilgi ve desteğini esirgemeyen sevgili hocam Prof. Dr.
Zeliha Gül DEĞİM’e,
Mesai dışı, akşam saatlerinde büyük bir fedakarlık örneği
göstererek ders anlatan sevgili hocalarım Prof. Dr. Füsun ACARTÜRK’e,
Prof. Dr. Sevgi TAKKA’ya, Prof. Dr. İlbeyi AĞABEYOĞLU’na, Prof. Dr.
Tanver DOĞANAY’a, Prof. Dr. Figen TIRNAKSIZ’a ve Doç. Dr. Zeynep
Şafak TEKSİN’e,
226
Akademisyen olmak için doğduğuna inandığım, her türlü
konuda tüm iyi niyeti ve sabrıyla her ihtiyacım olduğunda yanımda olan,
sevgili arkadaşım Arş. Gör. Uzm. Ecz. Serdar TORT’a,
TPA, mukoadezyon ve yardıma ihtiyaç duyduğum her
konuda desteğini ve katkılarını sunan Arş. Gör. Dr. Ecz. Fatmanur
TUĞCU-DEMİRÖZ’e,
Tüm alçak gönüllülükleri, sevgi dolu kalpleri ve iyi niyetleriyle
yardıma ihtiyacım olan her an, hiç çekinmeden kapılarını çalabildiğim
sevgili hocalarım Arş. Gör. Dr. Ecz. Tuba İNCEÇAYIR’a ve Arş. Gör. Dr.
Ecz. Sibel İLBASMIŞ-TAMER’e,
Çalışmalarım sırasında ihtiyacım olan zamanlarda destek
olan Arş. Gör. Dr. Ecz. Başaran MUTLU AĞARDAN’a, Arş. Gör. Dr.
Ecz. Can SARISÖZEN’e,
Arş. Gör. Dr. Ecz. Şeyda AKKUŞ’a,
ve
sevgili Fatma ÇELİK’e,
Onları görmek bile yüzümde kocaman bir gülümseme
oluşturan, yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen Arş. Gör. Ecz. Emre
YALÇIN’a, Arş. Gör. Ecz. Alptuğ KARAKÜÇÜK’e ve Arş. Gör. Ecz.
Gülen Melike DEMİR’e,
Her türlü konuda yardım ve desteğini esirgemeyen, ilgisiyle
bilimsel çalışma konusunda motive eden, sevgili yöneticim Dr. Tamer
PEHLİVAN’a ve tüm yüksek lisans dönemini birlikte atlattığım, her türlü
sıkıntımı paylaşan ve yardımlarını esirgemeyen Uzm. Ecz. Demet
KADIOĞLU’ya,
227
Bana yüce Allah’ın lütfu olan, her koşulda yanımda olan,
inanan, güvenen CANIMDAN ÇOK SEVDİĞİM AİLEME:
Tezimin düzenlenmesinde elinden gelen yardımları tüm iyi
niyeti, tertemiz kalbi ve büyük sabrıyla düşünmeksizin veren, dert ortağım,
hayattaki dostlarımdan ilki CANIM ABİM’e,
Her zaman yanımda olan, küçük yaşına rağmen olgunluğuna
ve düşüncelerine büyük değer verdiğim, elinden gelen her türlü yardımı ve
desteği sergileyen, can dostum CANIM KARDEŞİM’e,
Kız kardeşim yok diye üzülürken, abim sayesinde hayatıma
giren, her türlü üzüntümü ve sıkıntımı gözleri dolarak benimle paylaşan
CANIM MERVEM’e,
Laboratuvar çalışmalarım süresince, akşam iş çıkışlarında
yanımda olan, ekstrüksiyon çalışmalarımda benimle yöntem geliştiren,
çoğu zaman iş çıkışı girdiğimiz laboratuvardan birlikte sabaha karşı
çıktığımız, dürüstlüğü, çalışkanlığı, karakteri, sabrı ve tertemiz yüreğiyle
CANIM BABAM’a,
Melekler katına yaraşacak kadar iyi niyete ve tertemiz kalbe
sahip, öğrencisi olma şansına da sahip olduğum değerli öğretmenim,
yaşadığım her gün böyle bir insanın kızı olma şerefine nail olduğum için
şükretme sebebim, çalışkanlığına ve sabrına hayran olduğum, dostum,
sırdaşım, biriciğim, HERŞEYİM, CANIM ANNEM’e,
SONSUZ TEŞEKKÜRLERİMİ SUNARIM…
228
12. ÖZGEÇMİŞ
Adı
Meltem
Soyadı
KAPLAN
Doğum Yeri ve Tarihi
Ankara, 23.08.1984
Eğitimi
Lisans: Hacettepe Üniversitesi Eczacılık
Fakültesi, Ağustos 2007
Yabancı Dili
İngilizce (ileri seviye)
Almanca (başlangıç)
Üye Olduğu Bilimsel
Kuruluşlar
--- KAPLAN M, ÇELEBİ N. Preparation and
Characterization of Ovalbumin
Containing Gels for Nasal Vaccination.
ILARUD 2013.
Bilimsel Etkinlikleri
- ÇELEBİ N, KAPLAN M, VURAL I.
Evaluation of In vitro Cytotoxicity of
Nasal Ovalbumin Formulations on Calu-3
cells. FIP PSWC 2014, Melbourne,
Avustralya, Kabul edildi.
229