GENEL BİLGİLER
advertisement
T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI HEYBELİADA SANATORYUMU GÖĞÜS HASTALIKLARI VE GÖĞÜS CERRAHİSİ EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ Klinik Şefi: Dr. Melahat KURUTEPE TÜBERKÜLOZ HASTASI İLE TEMASLI ÇOCUKLARDA, INH PROFİLAKSİSİNİN ELISPOT YÖNTEMİ İLE DEĞERLENDİRİLMESİ DR.ZELİHA ARSLAN UZMANLIK TEZİ İSTANBUL 2005 1 ÖNSÖZ Uzmanlık eğitimim boyunca değerli bilgi, birikim ve deneyimlerinden faydalandığım, ilgi ve şefkatini hep üzerimde hissettiğim, yanında çalışmaktan onur duyduğum değerli hocam Klinik Şefi Dr. Melahat Kurutepe’ye; Asistanlığım boyunca bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım Klinik Şefleri Dr. Armağan Hazar, Doç. Dr. Attila Saygı, Dr. Ö. Ferit Demiröz; Klinik Şef Muavinleri Dr. Filiz Süngün, Dr. Özlem Tümer, Göğüs cerrahisi Klinik Şefleri Doç. Dr. Bülent Arman ve Prof. Dr. Mustafa Yüksel, Şef Muavini Dr. Canan Dudu’ya; Çalışma hayatımda değerli desteklerini gördüğüm, olumlu yönlendirmeleriyle bugüne gelmemde emek sahibi olan şef yardımcımız Dr. Gülfem Yurteri’ye; Eğitimim sırasında kendilerinden pek çok şey öğrendiğim, bana daima destek olan servisimiz uzmanları Dr. Sema Saraç, Dr. Zeynep Banu Ketenci ve Dr. Hacer Ofluoğlu’na; Tez çalışmalarını beraber yürüttüğümüz, yardımlarını asla unutamayacağım Dr. Özlem Malas Oruç ve Dr. Nurçin Çimen Özışık’a; Birlikte çalıştığım eğitimime katkıda bulunan tüm uzman hekimlere; İç hastalıkları rotasyonumu yaptığım Haseki Devlet Hastanesi I. Dahiliye Kliniği Şefi Doç. Dr. Mehmet Kendir, Haseki Hastanesi Radyoloji Klinik Şefi Dr. Murat Ulusoy, Haydarpaşa Numune Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları Klinik Şefi Doç. Dr. Paşa Göktaş’a; Hayatımın en önemli dönemlerinden birini paylaştığım, zor koşullarda birlik, beraberlik ve dostluk içinde çalıştığım sevgili asistan, hemşire arkadaşlarıma, bakteriyoloji laboratuarı çalışanlarına ve hastane personeline; Ayrıca tezimin her aşamasında bilgi, birikim ve deneyimlerinden faydalandığım Marmara Üniversitesi Pediatrik Enfeksiyon Hastalıkları Ana Bilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Mustafa Bakır, Dr. Ahmet Soysal ve ekibine; 2 Bugünlere gelmemi sağlayan sevgili kardeşime, anneme, eğitimim sırasında hayata gözlerini yuman babama ve ailemin tüm fertlerine; Son olarak tavsiyelerim doğrultusunda çocuklarını temaslı kontrollerine götüren hastalarıma; Ve Tüm Dostlarıma; En içten duygularımla teşekkür ederim. Dr. Zeliha ARSLAN 3 İÇİNDEKİLER BÖLÜM SAYFA GİRİŞ VE AMAÇ…………………………………….....: 1 GENEL BİLGİLER…………………………………….: 3 GEREÇ VE YÖNTEM…………………........................: 45 BULGULAR………………………………………….....: 53 TARTIŞMA……………………………………………..: 59 SONUÇLAR…………………………….........................: 68 KAYNAKLAR…………………………………………..: 69 4 SİMGELER VE KISALTMALAR ARB: Aside dirençli basil BCG: Bacille Calmette Guerin CFP–10: Culture filtrate protein DSÖ: Dünya Sağlık Örgütü ELISPOT: Enzyme linked immunospot ESAT–6: Early Secreted Antigenic Target 6kDa protein GTA: Geç tipte aşırı duyarlılık HAİ: Hücre Aracılı İmmünite INF-γ: Interferon gama INH: İsoniazid LTBI: Latent tüberküloz enfeksiyonu MTBE: M. tuberculosis enfeksiyonu NAP: p-nitro-o-asetil-amino–3-hidroksipropifenon NTM: Nontüberküloz mikobakteri PAS: Para-amino salisilikasit ünitesi PPD: Purified Protein Derivative=Saflaştırılmış protein türevi RD: Regions of differences RİF: Rifampin TB: Tüberküloz TCT: Tüberkülin cilt testi TÜ: Tüberkülin Ünitesi PHA: Phitohemaglütinin SKSD: Streptokinase-streptodornase VSD: Verem savaş Dispanserleri USPHS: ABD Halk Sağlığı Servisi 5 GİRİŞ VE AMAÇ: Yoğun küresel çabalara karşın yeni Tüberküloz (TB) olgularının sayısı tüm dünyada giderek artmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü’nün (DSÖ) tahminlarine göre her yıl 8,5 milyon kişi TB hastalığına yakalanmakta ve 3 milyon insan ölmektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık 1/3’ünün, başka bir deyişle 1,7 milyar kişinin M. tuberculosis ile enfekte olduğu düşünülmektedir (1,2). Ülkemizda ise TB insidansı yüzbinde 27 olup, nüfusumuzun 1/4’ü TB basili ile enfektedir (3,4,5). TB enfeksiyonu için en önemli risk faktörü TB hastası ile temastır. TB olguları ile temas eden sağlıklı kişilerin %5’inde ilk 2 yıl içinde aktif TB, %95’inde ise sessiz enfeksiyon yani latent TB enfeksiyonu (LTBI) gelişmektedir. Ayrıca LTBI olgularının %5’i yaşamlarının bir döneminde aktif akciğer tüberkülozuna yakalanmaktadır. Bu nedenle, tüberkülozun önlenmesinde koruyucu tedavi uygulanması, yeni terminoloji ile LTBI tedavisi aktif akciğer tüberkülozlu olguların tedavisi kadar önem taşımaktadır ve bu amaçla 6–12 ay isoniazid (INH) verilmesi önerilmektedir (2,3,4,5,6,7,8). Oysa INH tedavisinin uzun sürmesi ve hepatotoksisiteye neden olabilmesi uyumu azaltmakta ve tedavinin başarısını özellikle izlemi güç olgularda %5-25’e kadar düşürmektedir (6,9,10). Günümüzde TB enfeksiyonunu saptamak için yaygın olarak kullanılan tek test tüberkülin cilt testidir (TCT). Saflaştırılmış protein derivelerinin (PPD) intradermal yöntemle uygulanması sonucunda oluşan gecikmiş tipte kütanöz aşırı duyarlılık yanıtının ölçülmesi esasına dayanan bu testte pozitif yanıt TB enfeksiyonuna bağlı olabileceği gibi, BCG aşılanmasına ve çevresel mikobakterilere maruz kalmaya bağlı olarak da gelişebilir. Bunun yanında TCT birçok durumda yanlış negatif sonuç verir. TB basili ile karşılaşan kişilerin yani TB enfeksiyonu geliştirenlerin %10’unun ilk 5 yıl içinde hastalık geliştirecekleri göz önüne alınırsa, hastalığın önlenmesi açısından bu kişilerin doğru bir şekilde belirlenmesi ve koruyucu tedaviye alınmasının önemi daha iyi anlaşılacaktır. Son yıllarda geliştirilen T-hücre tabanlı RD1-ELISPOT testi M. tuberculosis’e özgün antijenler kullanılarak yapılmaktadır. Ayrıca bu testin BCG aşılanmasından ve çevresel mikobakterilere maruziyetten etkilenmediği ispatlanmıştır. 6 Çalışmamızda profilaktik INH tedavisi verilen temaslı çocuklarda TB enfeksiyonu seyrini RD1-ELISPOT testi ile takip ederek, testin dolayısı ile spesifik T hücre yanıtlarının LTBI tedavisi sonrasında nasıl değişim gösterdiğini, bu değişimin enfeksiyonun seyri ve hastalığa gidiş hakkında belirleyici bir yaklaşım açısından yararlılığını saptamayı amaçladık. Buna ilaveten bu ve benzer testlerin TB tanı ve tedavisinde potansiyel yararları konusunda daha geniş bilgi sahibi olmayı planladık. 7 GENEL BİLGİLER TARİHÇE Tüberküloz yüzyıllardır bilinen bir hastalıktır. Almanya’da bulunan ve M.Ö. 8000 yılına dek uzanan tarih öncesi insana ait iskelet kalıntılarının hastalık izi taşıdığı bulunmuş, Eski Mısır Uygarlığına ait iskeletlerde ve İnka dönemi insanlarında Pott hastalığına bağlı kesin bulgular saptanmıştır (11). Tüberkülozun klinik bulgularının ve epidemiyolojik özelliklerinin ilk sistematik tanımlanması M.Ö. 400–350 civarında derlenen Hipokrat koleksiyonunda kayıtlıdır. İlk olarak Aristo (M.Ö. 354–322) bu hastalığın bulaşıcı olduğunu düşündüren bir paternin farkına varmıştır. Pierre Desault (1675–1737) hastalığın bulaşıcı olduğunu, temel bulaştırıcı unsurun ise balgam olduğunu belirtmiştir. Pierre Charles Alexander Louis diğer nedenlerle ölen hastaların akciğerlerinde latent TB delillerini bulmuştur (12). Robert Koch 1882 yılında tüberkülozdan ölen bir hastanın akciğerindeki lezyonlarda basili göstermiş, bunu kültürde üretmiş ve üretilen basil ile deney hayvanlarında verem oluşturmuştur (13). Koch TB tedavisinin de aşı ile yapılabileceğini düşünmüş; basilin ısıtılarak öldürülen atıklarının hastaların bağışıklık sistemini güçlendireceğine inanmış ve Old tüberkülinin (tüberküloz basilinin bir gliserin ekstresi) tedavi amacı ile kullanılmasını Clemence von Pirquet ile birlikte yapmıştır. Kullanılan tüberkülin dozu bugün uyguladığımız dozun 12000 katıdır. Bu tür tedavi, sadece hafif vakalarda etkili olmasına rağmen, ileri vakalarda fayda yerine zarar vermiştir. TB aşısı için gerekli olan zararsız basil, M. bovis suşunun seri halde 231 pasajından sonra oluşturulmuş ve 1920’ lerin sonunda bulan iki araştırıcının adına atfen Bacille Calmette-Guerin (BCG) adı verilmiştir (14). ABD’li Waksman’ın 1946 yılında Streptomycin’i bulmasıyla TB tedavisinde kemoterapi dönemi başlamıştır. Bunu 1950–53 yılları arasında Para-amino salisilik asit (PAS), isoniazid (INH) ve 1969 yılında rifampinin (RIF) bulunması takip etmiştir. Tüm dünyada uygulanan standart bir tedavi olmamakla birlikte başlangıçta 2 yıl olan TB tedavi süresi, İNH ve RIF’in birlikte kullanımıyla 9 aya ve çok ilaçlı tedavi yaklaşımları 8 ile 6 aya düşmüştür. Ancak TB Dünya’da halen en yaygın ve ölüme en çok yol açan enfeksiyon hastalığı olarak varlığını devam ettirmektedir (15). Ülkemizde TB ile etkin mücadele 1950’li yıllarda başlatılmıştır. Çıkartılan bir yasa ile 1960 yılında Verem Savaş Dispanserleri (VSD) kurulmuştur. Bu çalışmalar sayesinde 1965’te yüz binde 172 olan tüberküloz insidansı 1975 yılında yüzbinde 50’ye düşmüştür. Doksanlı yıllarla birlikte ‘Göğüs Hastalıkları ve Tüberküloz’ alanında bilimsel dernek örgütlenmeleri gerçekleşmiş; düzenli, disiplinli bir şekilde bilimsel çalışmalar, mezuniyet sonrası mesleki eğitimler yapılmaya başlanmıştır. Böylece ulusal tüberküloz insidansı ilk defa 2000 yılında yüz binde 30’un altına düşmüştür. Ancak Türkiye’nin resmi olgu bulma oranı dikkate alındığında gerçek insidansının yüz binde 50–60 arası olması gerektiği hesap edilmektedir (16,17,18). EPİDEMİYOLOJİ Dünya’da halen en yaygın ve ölüme en çok yol açan infeksiyon hastalığı tüberkülozdur (19). Dünya Sağlık Örgütü’nün (DSÖ) 2002 yılı küresel tüberküloz kontrolü raporunda; Dünya’da halen 8,42 milyon yeni TB ve 3,67 milyon balgam yayma pozitif hasta olduğu tahmin edilmektedir (20). Dünya’da 1995–1999 yılları arasında TB artış hızı eğilimi dikkate alındığında, 2005 yılında 10,2 milyon yeni TB olgusu ile karşı karşıya kalacağımız anlaşılmaktadır. Tüm dünyada DSÖ’ye bildirilen toplam TB olgu sayısı, tahmin edilen rakamın sadece üçte birini oluşturmaktadır. Olgu bulma oranı olarak adlandırılan bu epidemiyolojik veri, DSÖ’ nün son raporunda Türkiye için % 40 olarak belirtilmektedir. TB, çok büyük çoğunlukla Mycobacterium tuberculosis olmak üzere, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis tarafından oluşturulan, kronik granülomatöz bir infeksiyon hastalığıdır. Olguların %98’inden M. tuberculosis sorumludur. Tüm organlarda görülebilen TB hastalığında en sık tutulan organ %85 oranıyla akciğerlerdir (21). 9 MİKROBİYOLOJİ Mycobacterium Yunanca fungus ‘fungus’ (myces) ve ‘küçük çubuk’ (bakterion) kelimelerinden türemiştir. İsmin fungus kısmı bu mikroorganizmanın sıvı besi yerlerinde büyüme paterninin mold benzeri olmasından kaynaklanmaktadır (22). Şekil 1:Mikobakterilerin toksonomik ağacı 10 Mycobacterium genusu içinde yer alan Mycobacterium tuberculosis complex beş bakteri türü içerir. Bunlar; M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum, M. canetti’dir (Şekil 1). İnsan M. tuberculosis için tek kaynaktır ve bu mikroorganizma insanlar arasında hastalık yapar. M. tuberculosis 0,2–0,6 mikron kalınlığında, 1,0–10 mikron uzunluğunda, aerobik, sporsuz, hareketsiz, kapsülsüz hafif kıvrık veya düzgün çomak şeklinde bir basildir (23). Mikobakteriler gram (+) ya da (-) olarak sınıflandırılamaz. %95 etil alkol ve %3 hidroklorik asit (asit- alkol) mikobakteri hariç tüm bakterileri dekolarize eder. Dolayısıyla “asit dirençli basil” olarak adlandırılır. Bunun nedeni hücre duvarındaki lipid düzeyinin yüksek olmasıdır. Lipid içeriği gram (+) bakterilerde %0,5, gram (-) bakterilerde %3 iken, mikobakterilerde %25’ tir (24). Basiller Ziehl-Nielsen boyası ile boyanır ve mavi zemin üzerinde kırmızı renkte tek tek ya da gruplar halinde çizgiler oluşturmuş olarak izlenir (25). M. tuberculosis bilinen bakteriler arasında en kompleks yapılı hücre duvarına sahiptir. Biyokimyasal çalışmalar, mikobakteri hücre duvar iskeletinin 3 makromolekülden ibaret olduğunu göstermiştir. Bunlar peptidoglikan, arabinogalaktan ve mikolik asitlerdir. Mikobakteri hücre duvar yapısı Şekil 2’de gösterilmiştir (26). 11 Şekil 2: Hücre duvarı Peptidoglikan tabakası bakteriye şekil ve dayanıklılık verir. Bu tabakanın üzerinde arabinoz ve galaktozdan oluşan bir polisakkarid olan arabinogalaktan tabakası bulunur. Burası hücre duvarının en az karakteri bilinen tabakasıdır. Arabinogalaktanın zincirlerindeki uç arabinoz birimlerine mikolik asitler bağlanmıştır. Total lipid miktarının %11’i mikolik asit olup hücre duvar kalınlığı ve asit rezistansından sorumludur (25,27). Mikolik asitler trehalose gibi şekerlere bağlandığında “kord faktörü” oluştururlar. Virülans ile ilgili olduğu düşünülen bu faktör hücrelerin birbirine dolanmış demetler oluşturarak paralel zincirler halinde üremelerine neden olur. Ayrıca fagositlerin göçünü engelleyip granülom oluşmasını sağlar, toksik etkileri de vardır (28,29). M. tuberculosis’ in üremesi yavaştır, replikasyon süresi 15-20 saattir. Görünür koloni büyümesi en az 3 hafta; genellikle standart kültür ortamlarında 4–6 haftadır (30,31). Yumurtalı besi yerinde (Löwenstein –Jensen besi yeri) optimal 33–39C ısıda, pH 6,5- 6,8’de, % 5–10 CO2’li ortamda çoğalırlar. M. tuberculosis olumsuz koşullara oldukça dayanıklı olup bu koşullarda uzun süre canlı kalabilir. +4C’de haftalarca, -70C’de yıllarca canlılığını korur. +60C’de 20 dakikada ölür (31). 12 TÜBERKÜLOZ TANI YÖNTEMLERİ I-BAKTERİYOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Tüberkülozun spesifik klinik ve radyolojik bulguları olmadığından ve her zaman doğru sonuç verebilen, kolay uygulanır, ucuz serolojik ve moleküler tanı yöntemleri bulunmadığından, bakteriyolojik tanı yöntemleri dünyanın her yerinde vazgeçilmez yöntemlerdir. Bakteriyolojik muayene, örneklerin direk muayenesi ve kültürü olmak üzere iki şekilde uygulanmaktadır. Direk muayene ucuz, çabuk sonuç veren bir yöntem olması açısından tüberküloz tanısında önemli yer tutar (32). a-Direk mikroskopik inceleme: M. tuberculosis aranması için alınan materyaller balgam, açlık mide suyu, solunum sistemine ait diğer örnekler (bronş lavajı, bronkoalveolar lavaj, transbronşial biyopsi gibi), idrar, beyin omurilik sıvısı, gayta, doku ve diğer vücut sıvılarıdır. Akciğer tüberkülozu tanısı için en sık balgam örneğine başvurulur. Balgam ard arda 3 gün, sabah erken saatlerde, steril, geniş ağızlı, kapağı sıkı kapatılabilen plastik kutulara alınmalıdır ve alınan tüm örnekler hızla laboratuara ulaştırılmalıdır (33). Yaymalar direk materyalden hazırlanabileceği gibi, dekontaminasyon işlemi sonrası örnek santrifüj edildikten sonra (homojenizasyon) teksif hazırlanabilir. Steril bölgelerden alınan materyallere dekontaminasyon işlemi uygulamaya gerek yoktur. Mikobakteriler kimyasal ajanlara daha dayanıklı olduklarından, bu özellikleri kullanılarak dekontaminasyon işlemi gerçekleştirilir. En sık kullanılan yöntem, Nasetil-L-sistein %2 NaOH (NALC-NaOH) yöntemidir. NALC disülfid bağlarını kopararak mukolitik etki, NaOH ise dekontaminasyon yapar (33,34). Hazırlanan yaymalar boyanır. Boyama metodları karbolfuksin ve florokrom metodları olarak ikiye ayrılır. Karbolfuksin metodları; Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) ve Kinyoun metodudur. Florokrom metodunda ise preparat Auramin-0 ile boyanır ve floresan mikroskopta incelenir. 13 Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) metodunda; üzerine materyal alınan lam alevde tespit edilir, üstüne tam örtecek şekilde karbolfuksin boyası konur. Kaynatmadan 3–4 dakika ısıtılır, sonra boya dökülür, %5 asit-alkol ile dekolorize edilir. Distile su ile yıkanır. Metilen mavisi ile 20–30 sn boyanır, distile su ile tekrar yıkanır ve kurutulur. Preparatlar 100X imersiyon objektifinde incelenir. Bu işlemler sonunda mikobakteriler mavi zemin üzerinde kırmızı çomaklar halinde görülür (33,35) (Resim 1). Resim 1:EZN boyama ile M. tuberculosis (36) Direk balgam mikroskopisinde en önemli sorunlar yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçlar ile farklı okuyucuların aynı örnekte farklı sonuçlar bildirmesidir (37). Yanlış pozitif sonuçlar: Balgamdaki yemek artıkları, boya parçacıkları, saprofit aside dirençli bakteriler, atipik mikobakteriler, nokardia, çam poleni, iplikçik, lamdaki çizikler, başka balgamdan bulaşma, imersiyon yağı ile bulaşma, aynı lamın tekrar kullanımı. Yanlış negatif sonuçlar: Balgam toplanmasındaki yetersizlikler, balgam örneklerinin ve boyanmış preparatların uygunsuz korunmaları, homojenize edilmeyen balgamda uygun yerden örnek alınmaması, tekniğe uygunsuz boyama, okuma hataları. 14 b- Kültür: Direk incelemede ARB görülmesi tanıyı kesinleştirmez. Kesin tanı M. tuberculosis’in kültür ortamında üretilmesi ile konur. Tanımlama parametrelerini uygulamak, ilaç duyarlılık testlerini yapabilmek ve epidemiyolojik çalışmalarda kullanılan genotipleme için kültür gereklidir (33). Kültür için kullanılan besi yerleri sıvı besi yerleri, yumurtalı besi yerleri ve agar içeren besi yerleri olmak üzere üçe ayrılır. Bu besi yerlerinin tümüne bakteriyel ve fungal kontaminasyonu engellemek için antibiyotik eklendiğinde, selektif besi yeri haline gelirler (Tablo I). Tablo I: Mikobakterilerin üremeleri için kullanılan farklı kültür ortamları ve inhibitör ajanları (38) Yumurtalı besi yerlerinden en çok kullanılan Löwenstein-Jensen (L-J) besi yeridir. Petragnani inhibitör madde olarak malaşit yeşilini daha yüksek konsantrasyonlarda içerir ve bu nedenle kontaminasyonun yüksek olduğu örneklerde tercih edilir. ATS besi yeri ise malaşit yeşilini en düşük konsantrasyonda içerir ve vücut sıvıları gibi steril örneklerde önerilmektedir. Yumurtalı besi yerinin bir avantajı üremenin birçok mikobakteri türlerinde daha iyi gözlenmesidir. Ancak kontaminasyon halinde besi yerinin tüm yüzeyi etkilenebilir ve hatta tüm besi yeri likefaksiyona 15 uğrayabilir. L-J besi yeri opak olup koloniler 18–24 günde saptanmaya başlar (38). Agar içeren Middlebrook besi yerleri; hazır satılan şeffaf besi yerleri olup, koloniler 10–12 günde saptanmaya başlar. Ticari sıvı besi yerlerinin kullanımı mikobakteri tanısında kolaylık sağlamıştır. Bu sistemler arasında BACTEC 460 (Becton Dickinson Microbiyology Systems, Sparks MD), Mycobacteria Growth İndicator Tube (MGIT) sistemi (BBL, Becton Dickinson Microbiology systems, Hunt Valley, MD), MB REDOX (Heipna diagnostica), Extrensensing Power (ESP), Myco-ESP culture system II (Trek Diagnostica Systems Inc, Westlake, OH) ve BACT/ALERT MB susceptibility kit (Organon Teknika, Durham, NC) sayılabilir. Bu sistemler sıvı middlebrook 7H12 içermekte olup mikobakterileri saptamak için radyometrik ya da kolorimetrik materyal eklenerek elde edilmişlerdir. Sıvı besi yerlerinde üreme 1–3 haftada saptanabilir. Ticari sistemler arasında en sık kullanılanlardan biri BACTEC 460’dır (33). BACTEC: İlk olarak 1977 yılında Middlebrook tarafından, 14C işaretli palmitik asit içeren 7H12 sıvı besi yerinde mikobakteri üremesi saptanmıştır (39). Mikobakteri varlığında kullanılan palmitik asitten açığa çıkan 14C işaretli CO2 (radyoaktif CO2) otomatize cihaz tarafından saptanmaktadır. Saptanan CO2 miktarındaki artış basilin üremesi olarak değerlendirilmektedir. Bu sistemle M. tuberculosis saptama süresi 4–25 gündür. M. tuberculosis basilini nontüberküloz mikobakterilerden (NTM) ayırmak için besi yerine p-nitro-0-asetil-amino–3-hidroksipropifenon (NAP) eklenir. NAP varlığında üreme olmaması M. tuberculosis lehinedir (38,40,41). II.SEROLOJİK TANI YÖNTEMLERİ İmmünolojik tanı için hem klinik örneklerde mikobakteriyel antijenlerin gösterilmesi, hem de bu antijenlere karşı oluşan antikorların saptanmasına çalışılmaktadır. Geliştirilen yöntemler arasında immunodiffüzyon, pasif hemaglütinasyon, ELİSA fluoresan antikor, solid faz radyoimmünoassay bulunmaktadır (34,39,42). Serolojinin yüksek tanı değerine sahip olduğu diğer hastalıklardan farklı olarak tüberkülozda, klinik kullanım için duyarlı, özgül ve pratik bir yöntem geliştirme çabaları başarısız kalmıştır. Özgüllük konusunda temel sorun, infekte olmak ile hastalık varlığı ayrımının yapılamamasıdır. Daha önce yapılmış olan BCG aşısına bağlı olarak 16 serolojik reaksiyon da sorun oluşturmaktadır. Bu durum, serolojik inceleme gibi basit bir testin yarar sağlayacağı gelişmekte olan ülkelerde özellikle anlamlıdır. Bu gibi ülkelerde nüfusun yaklaşık %40’ında LTBI vardır ve önemli sayıda insan M. bovis BCG’si ile aşılanmıştır. Diğer önemli bir konu da NTM’lere bağlı infeksiyondan M. tuberculosis infeksiyonunun ayrımıdır. Tüberkülozun serolojik tanısında hangi antijenin kullanılması gerektiği, sadece antijen tanınması ile sınırlı değildir. Antijen tanınması ile aynı öneme sahip 3 konu daha vardır: 1-Antijen kokteyleri: TB sırasında serumda ortaya çıkan antikorlar tarafından tanınan tek bir antijen veya sık rastlanan bir antijen kombinasyonu olmaması nedeniyle, serolojik tanı testlerinde antijen kokteyleri kullanılmalıdır. Farklı hastalarda, çok az miktarda antikor üretilen immünsüpresyonlu hastalar dahil, çeşitli antikor yanıtları oluşur. Antijen kombinasyonları, bu TB olgularının yakalanma şansını arttırmaktadır. 2- Katı faz: Kokteyl esasına dayanan testlerde solid faz kullanılarak, kokteylde bulunan her antijenin serolojik aktivitesinin tespiti sağlanır. Bu amaca ulaşabilmek için, nitrosellüloz temelli metodlar geliştirilmiştir. 3- Özgül antijen: Çapraz reaksiyon veren epitoplara bağlı yanlış pozitif test sonuçlarından kaçabilmek için, antijenler M. tuberculosis’e (veya M. tuberculosis complexi) özgül olmalıdır. Ayrıca, tüberkülozun karakteristik özelliği olan heterojen antikor repertuvarını karşılayacak şekilde birden fazla antijen seçilmelidir. Panellerdeki antijenlerin seroaktivitesi incelenmiş; 38kd PhoS ve 14 kd alfa kristali’ ninki en fazla bulunmuştur. Bu iki antijene eklenen diğer antijenler (ESAT–6, MPT64, MPT63, 19 kd lipoprotein, MTSA–10) duyarlılığın artmasını sağlar (43). 17 İmmünolojik tanıda kullanılan testler; a-Antijen tespitine dayanan testler: Lipoarabinomannan, mikobakterinin hücre duvarında bulunan bir lipopolisakkarittir ve doğal mikobakteri infeksiyonu sırasında antikor yanıtını indüklediği bilinmektedir. Antijen olarak kord faktörü kullanan ELİSA testinin, akciğer tüberkülozu tanısında duyarlılığı %66,6–74,1 ve özgüllüğü %95,2–99,0 olarak bulunmuştur (39). b-Antikor tespitine dayanan testler: Tüberkülozlu hastaların serumunda mikobakteri antijenlerine karşı oluşan antikorlar monoklonal veya poliklonal antikorlar kullanılarak tespit edilebilir (Tablo II). Çevredeki mikobakterilere çapraz reaksiyonlar nedeniyle yanlış pozitif test sonuçları alınabilmektedir. Ayrıca mikobakteri hastalıklarında ortaya çıkan bağışık yanıtlar; HLA klas II allotipleri ile ilişkili olup farklı hastalarda aynı antijenler tanınmayabilir. Tüberkülozlu hastalarda özgül antikorları tespit etmek için birçok serolojik test incelenmiştir. Bu tür serolojik testlerde, antijenik proteinler (A65, A60, A38, A14, A19, A90, A34, A55 kd’luk antijenler) ve polisakkaritler dışında ısı şok proteinleri, diaçil trehaloz gibi ELİSA tekniğine uygun birçok antijen denenmiştir. Tablo II: Akciğer tüberkülozu tanısında kullanılan antikor tespit temeline dayanan ticari testler (43) c-İnterferon gamma (IFN-) üretiminin ölçülmesi: TB infeksiyonunu doğru bir şekilde tespit edebilmek için M. tuberculosis’e karşı duyarlılaşmış T lenfositlerinin, 18 in vitro kan testleri ve in vivo deri testleri ile tespit edilmesine dayalı testler geliştirilmiştir. Periferik kandan elde edilen mononükleer hücreler, in vitro şartlarda uyarılır ve duyarlılaşan T lenfositlerinden salınan interferon gama (IFN-) üretimi ELİSA ile ölçülür. PPD yanıtından sonra, kanda IFN- tespiti yapan testler (CSL/ QUANTİFERON TB testi) geliştirilmiş ve bunların TB tanısında yayma ve kültür yerine kullanılabileceği bildirilmiştir. Bu testte; M. tuberculosis, M. avium ve M. bovis’den elde edilen PPD’lerle stimülasyondan sonra, tam kandaki T lenfositleri tarafından üretilen IFN- ölçülür. IFN- ELİSA sonuçları ile hasta ve kontrol grubundan elde edilen tüberkülin deri testi sonuçları arasında iyi bir korelasyon vardır. QUANTİFERON-TB testinin duyarlılığı %90 ve özgüllüğü %95–98 bulunmuştur (39). Plevra tüberkülozunda, IFN- duyarlılığının %85,7 ve özgüllüğünün %97,1 olduğu kültür ve plevra biyopsisi ile doğrulanmıştır. HIV pozitif ve negatif hasta sonuçları da benzerdir. Rekombinant antijenler kullanılarak BCG aşılılarda etkileşim engellenmiştir. İn vivo deri testlerinden PPD’ye alternatif olarak kullanılan ESAT–6 (erken salınan tüberküloz antijeni, early secretory antigen target) ve CFP–10 (koloni oluşturan protein, culture filtrate protein) gibi antijenler de, IFN- indüksiyonu amacıyla kullanılmıştır. ESAT-6, özgül bir antijen ve tüberkülozlu hastalarda T lenfositleri tarafından üretilen IFN-’nın güçlü bir indükleyicisidir. M. tuberculosis genomunda RD ile gösterilen farklı bölgeler bulunur, M. bovis genomundaki RD bölgeleri silinmiştir. RD1 bölgesi, tüberküloza bağışıklık yanıtı sırasında ortaya çıkan ESAT–6 salınımını sağlar. ESAT–6 antijeni TB hastalarının T lenfositleri tarafından tanınırken, BCG ile aşılı veya aşısız sağlıklı kişilerin T lenfositlerince tanınamamaktadır. Tedavi edilmeyen hastalara göre tedavi edilen tüberkülozlu hastalarda IFN- düzeyi artar ve bu durum tüberküloza bağışıklık yanıtını gösterir (44). Seroloji, özellikle klinik ve radyolojik TB bulguları olmayan hastaların hızlı tanısını sağlar. Röntgen bulguları doku hasarından sonra ortaya çıkarken hastalığın başında üretilen antikorlar serolojik olarak erkenden tespit edilebilir. Ayrıca çocuklarda serumun elde edilmesi balgamdan daha kolay olduğu için daha çok tercih edilebilir. Seroloji akciğer dışı TB tanısına da yardım eder. BCG ile aşılılarda gelişen hücresel yanıtlardan da etkilenmemesi önemli bir avantajıdır. Serolojik kitler, humoral yanıt 19 sonunda üretilen antikorları tespit ettiğinden BCG’den etkilenmez. Bazı serolojik tanı kitleri kantitatif sonuçlar vermektedir. Tedavi sırasındaki titre değişimleri hastaların izlenmesinde kullanılabilir. Bu testlerin dezavantajlarından biri; yüksek infeksiyon hızı olan ülkelerde, AİDS’li ve yayma negatif hastalarda duyarlılığının düşük olmasıdır. Ayrıca pahalı, deneyimli personel gerektiren ve M. tuberculosis ile NTM’leri her zaman birbirinden ayırt ettiremeyen testlerdir. III. MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLER a-Nükleik asit çoğaltma yöntemleri: Nükleik asit çoğaltma yöntemleri iki prensip üzerine oturtulmuştur. Bunlar; nükleik asit prob hibridizasyon ve nükleik asit amplifikasyon (NAA) yöntemleridir. Nükleik asit prob hibridizasyon yöntemleri: Örnekteki hedef nükleik asit dizisi, komplemanteri olan işaretli bir prob ile hibritlenmekte ve tanı konmaktadır. Nükleik asit amplifikasyon yöntemleri: Nükleik asit teknolojisinin en kompleks ve duyarlı olanıdır. Hedef DNA’yı çoğaltmak için enzim kullanılır. Ortaya çıkarılan amplikonu tespit için nükleik asit probları kullanılması ve agaroz jelde amplikonların boyanarak gösterilmesi yoluna gidilir. Üç modifikasyonu bulunur (45): · Hedef amplifikasyon yöntemleri: Polimeraz zincir reaksiyonu · Prob hibridizasyon bazlı NAA: Ligaz zincir reaksiyonu · Sinyal amplifikasyona dayalı yöntemler 20 Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nükleik asitlerin in vitro şartlarda replikasyonu için geliştirilmiş bir test tüp sistemidir. Hedef DNA/RNA’nın selektif olarak amplifikasyonuna imkan verir. TB laboratuvarlarında klinik örneklerde bulunabilecek etkenin kısa sürede gösterilmesi, erken identifikasyonu, moleküler tiplendirilmesi ve ilaç direncinin saptanmasında kullanılmaktadır (45). b- Restriction fragment length polimorfism (RFLP): Restriksiyon enzimleri; DNA’yı çok özgül olarak belli bölgelerden keserek genellikle 1000–20000 baz çiftlik parçalar oluşturan enzimlerdir. DNA’nın bu enzimlerin bir ya da birkaçı ile kesime uğratıldıktan sonra, agaroz jel elektoforezine tabii tutulması ve sonra etidyum bromür ile boyanan jelde oluşan DNA bantlarının yeri ve sayısı kıyaslanarak elde edilen çeşitliliğe RFLP adı verilir. Epidemiyolojik çalışmalarda kullanılır. Dört temel adım vardır: DNA izolasyonu, DNA’nın restriksiyon enzimleri ile kesimi, kesilen DNA’nın elektroforezi ve jeldeki DNA parçalarının görüntülenmesi (46). Bu yöntemle M. tuberculosis complex içinde tip tayini ve M. tuberculosis suşlarında nokta mutasyonları saptanarak ilaç direncini saptamak mümkündür. TÜBERKÜLOZDA BULAŞMA YOLLARI TB, kronik granülomatöz bir infeksiyon hastalığıdır. Olguların %98’inden M. tuberculosis sorumludur. Tüm organlarda görülebilen TB hastalığında en sık tutulan organ %85 oranla akciğerlerdir (21). Uzun yıllar genetik geçişli bir hastalık olduğu düşünülen tüberkülozun bulaşıcı olduğu görüşü 16. yüzyılın ortalarında ortaya konulmuş ve bu dönemde hastaların toplumdan izolasyonu başlamıştır. 1843’te insandan alınan kazeöz materyalin tavşanlara enjeksiyonu ile tüberkülozun bulaştığı deneysel olarak gösterilmiştir. Flugge 1907’de, solunum salgılarındaki küçük damlacıkların yeni konakçılara basili taşıdıklarını öne sürmüş ve sınırlı çalışmada, TB hastalığı olanların solunumla 21 verdikleri damlacıkların inhalasyonu ile kobay infeksiyonlarını göstermiştir (47). Wells 1934 yılında hastalığın hava yolu ve damlacık çekirdekleri ile hastalardan sağlam bireylere geçtiğini varsaymıştır. Riley ve arkadaşları damlacık çekirdeği modeli ve TB bulaşmasındaki ilişkiyi incelemişlerdir (48). BULAŞI ETKİLEYEN FAKTÖRLER: 1- Kaynak Olgunun Özellikleri Tüberkülozlu bir hastanın öksürme, hapşırma ve konuşması ile havaya bol miktarda basil yüklü damlacıklar atılmaktadır. Damlacıkların parçalanması ve içerdiği suyun buharlaşması ile damlacık çekirdekleri denilen daha küçük parçacıklar oluşmaktadır. Kaynak olgunun konuşma ile 0–210, öksürme ile 0–3500, hapşırma ile 4500–1000000 partikül oluşturduğu saptanmıştır. Bir kez öksürme ile oluşturulan partikül miktarı, ortalama 5 dakika konuşma ile oluşturulan miktara eşittir. Ayrıca bu fonksiyonların sayısı arttıkça bulaş olasılığı da artmaktadır (49,50). Hava yolu ile bulaşta; içinde 1–3 canlı TB basili içeren ve birkaç saat havada asılı kalabilen, 1–5 mikron büyüklüğünde damacık çekirdekleri önemli rol oynar. Nadiren lenfatik ve hematojen bulaşma, kontamine aletlerin taşıyıcı olduğu bulaş yolu, bakterinin direkt inokülasyonu ve lokal bulaşma olduğu gösterilmiştir. TB hastalığında en bulaştırıcı olan kaynak, aside dirençli basil (ARB) pozitif olan akciğer ve larenks tüberkülozlu olgulardır. Kaynak olgunun kültür ve yayma durumuna bakılmaksızın uygulanan TB tedavisi ile bulaştırıcılık azalır. Doğru ve etkili bir tedavi başlandıktan sonra olguların bulaştırıcılıkları pratik olarak 2–3 haftada sona erer. 2- Çevresel Faktörler 22 Kaynak olgu ile paylaşılan ortamın havalandırması yetersiz kapalı bir mekân olması bulaşmayı arttırır. 3-Karşılaşma Süresi ve Yoğunluğu Kaynak olgunun karşılaşma süresi ne kadar uzunsa ve basil yoğunluğu ne kadar fazla ise bulaş o kadar fazla olur. 4- Tüberküloz Basilinin Özellikleri Basilin vürülansındaki kantitatif değişiklikler arasında, tutulan organ sayısı ya da yaygın hastalık yapma eğilimi, organlardaki basil sayısı ve oluşan doku reaksiyonu veya hasarının şiddeti sayılabilir. Örneğin H37Ra M. tuberculosis suşu avirülandır ve insanlarda hastalıkla ilgisi olmadığı gibi hayvan modellerinde de ilerleyici enfeksiyon yapma yeteneği çok azdır. Buna karşın Oshkosh suşunun diğer suşlardan daha bulaştırıcı olduğu tespit edilmiştir (51). Basilin fiziksel ve kimyasal yapısındaki küçük değişiklikler, aerosol hale gelme, damlacık çekirdeği ortamında yaşama, ya da akciğerlerdeki primer savunmalara direnebilme yeteneği bulaşıcılığı etkileyebilir. 5- Hedef Kişinin Özellikleri Temaslının daha önce TB geçirip geçirmediği, BCG durumu, TB hastalığı gelişimini arttıran bir durum varlığı (Diabetes Mellitus, Silikozis, kortikosteroid kullanımı, transplantasyon, HIV pozitifliği vb.) kaynak olguyla karşılaşma sonrası gelişecek durumun belirlenmesinde önemlidir. Bulaştırıcı özellikteki balgam yayması pozitif tüberkülozlu bir hasta ile karşılaşılaşan, PPD negatif temaslıların %30’unda klinik ve radyolojik olarak hiçbir bulgu olmaksızın PPD pozitifleşir (Primer İnfeksiyon). İnfekte olan kişilerin %5’inde 23 infeksiyonu izleyen ilk 5 yıl içinde erken hastalık gelişir. İnfekte olup primer tüberküloz gelişmeyen geri kalan %95’i oluşturan latent infeksiyonlu kişilerin de yaşamlarının herhangi bir döneminde geç reaktivasyon hastalığı %5’inde (Sekonder Tüberküloz) gelişir. TB infeksiyonu, kaynak olgu ile karşılaşma sonrası, 1–3 basil içeren damlacık çekirdeklerinin alveole ulaşmasıyla başlar. Alveolde 4 olay gerçekleşebilir: 1- Basiller güçlü bir konakçı yanıtı ile herhangi bir lezyon oluşturmadan, alveoler makrofajlar tarafından yok edilebilir. 2- Basil başlangıçta çoğalabilir, fakat immün yanıtla birkaç milimetre çapında küçük kazeöz lezyonlar oluşturur ve koruyucu immünite gelişir. Bu durumda klinik ve radyolojik hiçbir bulgu olmaksızın PPD pozitifleşerek primer enfeksiyon oluşur. Az sayıda basilde dorman halde kalarak latent infeksiyonu oluşturabilir. 3- Basiller çoğalmaya devam eder, geniş kazeöz lezyonlar oluşur, kan ve lenf damarları yoluyla özellikle akciğer, böbrek ve kemik doku başta olmak üzere tüm vücuda dağılır, primer TB ya da erken hastalık olarak isimlendirilen tabloyu oluşturur. 4- Primer infeksiyon sonrası dorman halde kalan basillerin çoğalmaya başlaması ile geç reaktivasyon hastalığı (sekonder TB ) gelişir (50). Tüberküloz bulaşını etkileyen faktörler Tablo III’te verilmiştir (50). Tablo III: Tüberküloz bulaşını etkileyen faktörler 24 TÜBERKÜLOZ PATOGENEZİ TB patogenezi ile ilgili ilk çalışmalar Koch’un basil antijenine karşı gecikmiş tip hipersensitivite olduğu anlaşılan Koch fenomeninin tanımlanmasıyla başlamış, Max B. Lurie’nin tavşanlarda yaptığı çalışmalar ile büyük ilerleme kaydedilmiştir. Bu çalışmalardan elde edilen verilerle birlikte A.M. Dannenberg’in yaptığı çalışmalar, ilk infeksiyondan kavite oluşumuna kadar devam eden olayların tanımlanmasını sağlamıştır (52). Evre I: Başlangıç Evresi (Birinci Hafta) TB basilinin inhalasyonu ile başlar. İnsanlarda erken dönemdeki lezyonlardan örnek almak pek mümkün olmadığından, erken histopatolojik lezyonlar sadece deney hayvanlarında yapılan çalışmalar ile tanımlanmıştır. Bu evrede alveolar makrofajların mikrobisidal gücü ve basilin virülans özellikleri sonucu belirler. Alveoler makrofajlar basilin akciğere yerleşip yerleşmemesinde belirleyici rol oynar. İnfeksiyonun gelişmesine karşı konak direnci ise kısmen genetik kontrol altındadır. Sıçanlarda tüberküloz duyarlılığının otozomal dominant bir gen (Bcg geni) tarafından kontrol edildiği ve benzer bir uzantının insnalarda ikinci kromozomun uzun kolunda olduğu 25 ileri sürülmüştür. Bcg geni T lenfositlerden bağımsız olarak makrofaj aktivasyon düzeyini belirlemektedir. Evre II: Basillerin Çoğalma ve Yayılma Evresi (2-3. Hafta) (simbiozis) Bu evrede TB basili yaşamak için kendisinin makrofajca alınmasına yardımcı olmak zorundadır. Güçlü virülan basil alveolar makrofaj içinde çoğalır, makrofajı parçalar ve sekrete edilen kemotaktik faktörlerin etkisi ile dolaşımdaki inaktif makrofajların lezyon bölgesine gelmesine neden olur. İnaktif makrofajların sitoplazmalarındaki sitoplazmik vaküoller, basilin çoğalması için ideal bir ortamdır. Bu aşama konak ve basilin tam bir ortak yaşam sergiledikleri dönemdir, her ikisi de birbirine zarar vermemektedir. Basil yüklü makrofajlar, lenfatiklerle bölgesel lenf nodlarına taşınır, burada da kontrol altına alınamazlarsa lenfohematojen yol ile tüm vücuda yayılarak çoğalmaya devam ederler. Çünkü hücresel immün yanıt henüz gelişmemiştir. Evre III: Hücre Aracılı İmmün Yanıt ve Geç Tip Aşırı Duyarlılığın Gelişimi (3–9 hafta) Bu evrede lezyonlardaki basil sayısı hücresel immün yanıt ile yok edilemeyecek kadar fazladır. Gelişen geç tip aşırı duyarlılık yanıtı basillerin logaritmik çoğalmasını durdurur ve oluşan granülomların merkezinde kazeöz nekroz odaklarının gelişmesine yol açar. Bu odaklarda basiller canlılıklarını sürdürebilir, fakat uygun olmayan ortam koşulları nedeniyle artık çoğalamazlar. Kazeöz dokulardaki basillerin bir kısmı ölür, bir kısmı dorman halde kalırlar. Basil çoğalmasının önlenmiş olmasının bedeli doku hasarı olmuştur. Basilin akciğerlerde ilk yerleştiği orta alt akciğer zonlarındaki primer lezyon (Ghon odağı), hiler ve paratrakeal lenfatiklerle birlikte primer kompleksi oluşturur. Hücre aracılı immünite (HAİ), geç tip aşırı duyarlılık (GTA) gelişmesi ile ilgili bugünkü kavramsal yaklaşım Şekil 3 ve 4’te gösterilmiştir (53): 26 Şekil 3: Edinsel hücre direnci ve doku hasarı yapan immün yanıtın gelişmesi ile ilgili bugünkü kavrayış Şekil 4: Tüberkülozda erken immün yanıtın bir sonucu olarak aşağıdakiler olur: 27 28 Tüberküloz immünopatogenezinde temel rol oynadığı düşünülen kemokinler ve sitokinler Tablo IV’te özetle belirtilmiştir. Tablo IV: Temel sitokinler ve bunların tüberküloz immünite ve patogenezindeki belirgin rolleri 29 Yukarıda sözü edilen faktörlerin etkisi altında TB basilinin çoğalma yerine/yerlerine çekilen makrofajlar aktif hale gelirler. Aktivasyon, basil çoğalmasını durdurma ya da hücre içi mikropları öldürme yeteneği de dahil değişik morfolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel değişiklikleri tanımlamak için kullanılan geniş bir terimdir. Bu olay sonuçta cilde enjekte edilen tüberküloproteinlere gecikmiş tipte aşırı duyarlılık olayına yol açar. Bu, tüberkülin cilt testinin (TCT) temelini oluşturur. TCT primer infeksiyondan sonra yaklaşık 3–8 hafta içinde genellikle pozitifleşir. Normal konakçıların çoğunda, akciğerdeki primer lezyon ve aynı zamanda mikropların yayıldığı distal yerler edinsel hücresel direnç ya da HAİ etkisi ile sınırlanır. Ancak bazı konakçılar, tüberkülozu kontrol edebilecek immün yanıtı oluşturmada özellikle daha az yeteneklidirler. Bu kişilerde basil yayılması ilerleyici, kesintiye uğramamış bir şekilde görülür, primer infeksiyonu izleyerek haftalar-aylar içerisinde klinik olarak açık TB ile hasta hale gelirler. Primer infeksiyona dayanabilen bireylerde bir reaktivasyon riski devam etmektedir. Bu, değişik doku bölgelerinde canlı basillerin varlıklarını sürdürmesine bağlıdır. Tüberkülozun reaktivasyonunda en sık ve anlamlı yer akciğerlerin apeksleridir. 30 Evre IV: Hücre Aracılı İmmün ve Geç Tip Aşırı Duyarlılık Yanıtları Arasındaki Karşılıklı Etkileşim İmmün sistemi yeterli kişilerde eğer kazeöz odak erimezse, gelişen süreç hücre aracılı immün yanıt ile durdurulur. Tüberkülün etrafı fibröz bir duvarla çevrilerek ortadaki kazeöz odak koyulaşır ve süreç yaşam boyu durdurulur. Ancak kazeöz odaktan basil kaçışı olur ve basil aktive makrofajlar tarafından tutulup yok edilemezse geç tip aşırı duyarlılık yanıtı tekrarlanarak makrofajlar öldürülmeye devam edilecek, gelişen kazeöz nekroz daha geniş ve şiddetli olacaktır. Gelişen 0,1–1,3 mm çapındaki kazeöz odaklar makrofajlar tarafından hiç iz bırakmadan temizlenir, 2–8 mm çapında olanlar hidrolitik enzimlerle eritilir ve geride fibröz bir doku oluşur, 5–20 mm çapındakiler ise çevresi fibröz bir kapsülle çevrili tüberkülomları oluşturur. Sonuçta immün sistemi yeterli kişilerde basillerin yok edilmesi ile süreç durdurularak, sadece PPD pozitifliği ile primer infeksiyon ortaya çıkmaktadır. İmmün sistemi baskılanmış kişilerde ise genişleyen kazeöz nekrozların akciğerde doku hasarına neden olduğu ve klinik olarak primer TB geliştiği bildirilmiştir. Evre V: Erime ve Kavite Oluşumu Bu evre genellikle primer infeksiyon veya hastalık sonrası endojen reaktivasyon ya da eksojen reinfeksiyon sonrası gelişen yetişkin tip akciğer tüberkülozunda görülmektedir. Nadiren primer tüberkülozda hücresel immün yanıt yeteri kadar güçlü olsa bile süreç ilerleyip kavite oluşabilir. Kavite gelişiminin nedeni tam bilinmemekle birlikte lezyon bölgesine gelen makrofajlardan salınan hidrolitik enzimlerin etkisiyle geç tip aşırı duyarlılığın sorumlu olabileceği düşünülmektedir. Son zamanlarda mikobakterilerin makrofajları uyararak matriks metalloproteinazlarının yapımını arttırdıkları ve bu enzimlerin de kollojen I-IV’ü harap ederek kavite oluşturdukları ileri sürülmektedir (54). 31 M. TUBERCULOSIS’ E SPESİFİK ANTİJENLERİN PATOGENEZDEKİ ROLLERİ M. tuberculosis complex’ine karşı özgül antijen ilk kez Harboe ve arkadaşları tarafından gösterilen 24 kDa ağırlığındaki MPT64 antijeni olup M. bovis ve M tuberculosis kültür filtratlarında gösterilmiş fakat BCG örneklerinde gösterilememiştir (55). Bu gözlem daha sonra PCR hibridizasyon yöntemiyle MPT64’ü kodlayan genin bulunmasını sağlamış ve bu genin bazı BCG alt suşlarında olmadığı bulunmuştur. İnsanlarda yapılan çalışmalarda MPT64 antijeninin orta derecede lenfosit yanıtına yol açtığı ve TB hastalarında düşük oranda cevap alındığı gözlenmiştir (56). Başka bir çalışmada PPD reaktif TB hastalarının sadece %6’sında MPT64’e karşı gecikmiş tip hipersensitivite yanıtı saptanırken, ortak antijen Ag85B’a (MPT59) karşı %50 yanıt bildirilmiştir (57). Bunun yanında, yapılan çalışmalarda yüksek doz MPT64 patch testinin hasta ile sağlıklı birey ayırımında %100 spesifite ve %98,1 sensitiviteye sahip olduğu gözlenmiştir (58). Fakat bu antijenin bazı BCG suşlarında da mevcut olması tanısal değeri açısından sorun yaratmaktadır. Son yıllarda ise daha düşük moleküler ağırlıklı bir antijen olan ESAT–6 kültür filtratlarında izole edilmiştir (59,60). Bu antijeni kodlayan genin M. tuberculosis complex’ te bulunduğu, BCG suşlarında bulunmadığı ve M. kansasii, M. marinum, M. szulgai ve M. flavescens haricindeki diğer mikobakteri türlerinde bulunmadığı gösterilmiştir (61,62). Bu çalışmaların devamında ESAT–6 geninin promotor bölgesi belirlenmiş ve diğer bir antijenin (culture filtrate protein 10 kDA, CFP–10) aynı gen ile kodlandığı tespit edilmiştir. Bu antijenlerin TB tanısında kullanılması söz konusu olduğunda, bu geni taşıyan diğer mikobakteri türleri içinde sadece M. kansasii’nin TB benzeri hastalığa neden olduğu da bilinmektedir. Ancak bu da çok nadir olarak infeksiyona neden olmaktadır. Danimarka’da yapılan bir çalışmada NTM ile infekte olan hastalardan elde edilen izolatların %0,5’inde M. kansasii bulunmuştur (62). İn vitro pasajlar sırasında BCG suşunda bazı bölgelerin delesyona uğradığı gözlemlenmiştir regions of differences (RD). Bu bölgeler RD1, RD2 ve RD3 olarak adlandırılmış ve ESAT–6, CFP–10 ve MPT64 ( yeni antijenler eklenmeye devam 32 etmektedir) için genlerin bu delesyona uğrayan bölgelerde olduğu gözlenmiştir (63). RD1 immunolojik olan Early Secreted Antigenic Target 6-kDa protein (ESAT–6) ve Culture Filtrate Protein 10 (CFP–10) proteinlerini kodlamaktadır. ESAT–6/CFP–10 (Rv3875/Rv3874): Bu proteinler ESAT–6 ailesine bağlı proteinlerdir ve M. tuberculosis kültür filtratları içinde sekrete edilen küçük moleküllerdir. Bu iki molekül TB hastalarının çoğunluğunda tespit edilen immünodominant proteinlerdir (64). Guinea piglerde yapılan bir çalışmada M. bovis’in bu proteinlerini kodlayan genlerin tahrip edilmesiyle infeksiyonun daha ağırlaştığı gözlenmiştir (63). Bu hayvan modelinde bu proteinlerden hangisinin bakteri virülansı ile ilişkili olduğu ayırt edilememiştir. Rv3874 ve Rv3875, RD1 gen delesyon bölgesinde yer almaktadır. RD1, M. bovis BCG ile M. bovis vahşi-tip arasında belirlenen ilk farklı delesyon bölgesidir. RD1 yapısal 9 proteini kodlayan genleri içeren bölgedir. Bu proteinler Rv3971 ile Rv3979 arasında adlandırılmıştır (64,65). RD1 bölgesi patojenik tüm M. tuberculosis ve M. bovis suşlarında bulunmasına karşılık M. bovis BCG suşlarının hiçbirinde bulunmamaktadır (66). Bu nedenle bu gen bölgesinin virülans ile ilişkili olabileceği düşünülmüştür. Bu amaçla yapılan çalışmalardan birinde RD1 gen bölgesi kaldırılmış olan M. tuberculosis H37Rv’nin M.bovis BCG ile aynı derecede virülansa sahip olduğu gözlenirken diğer bir çalışmada ise M.bovis BCG suşuna RD1 geni yerleştirilerek daha virülan hale geldiği görülmüştür (67). Bununla birlikte bu gen bölgesinin gerçekten virülans ile ilişkili olup olmadığı yönünde kesin bir sonuç elde edilebilmiş değildir. Tablo V’te TB antijenleri ve bunların diğer mikobakteri türlerindeki varlık durumları gösterilmiştir. 33 Tablo V: Tüberküloz antijenlerinin tüberküloz suşlarında varlıklarının dağılımı Antijenler ESAT–6 CFP–10 MPT 64 M. tuberculosis + + + M. africanum + + + M. bovis + + + Gothenburg - - - Moreau - - + Tice - - + Tokyo - - + Danish - - - Glaxo - - - Montreal - - - Pasteur - - - M. abcessus - - - M. avium - - - M. branderi - - - M. celatum - - - M. chelonae - - - M. fortuitum - - - M. gordonii - - - Tüberküloz complex BCG suşları Çevresel mikobakteriler 34 M. intracellulare - - - M. kansasii + + - M. malmoense - - - M. marinum + + - M. oenavense - - - M. scrofulaceum - - - M. szulgai + + - M. terrae - - - M. vaccae - - - M. xenopi - - - Ex vivo- ELISPOT ESAT–6/CFP–10 testi (RD1-ELISPOT testi) Son yıllarda spesifik mikobakteriyel antijenler ile stimüle edilen T hücrelerinin salgıladıkları INF- yanıtlarının belirlenmesi ilkesi ile çalışan bazı deneysel tanı yöntemleri kullanılmaya başanmıştır. Bunlardan biri olan ELISPOT testi, kişinin periferik mononükleer hücrelerinin in vitro şartlarda bu antijenlerle uyarılıp daha sonra oluşan IFN- yanıtının çift sandviç ELİSA yöntemi ile belirlenmesi ilkesine dayanmaktadır. Bu testin TCT ile karşılaştırıldığı ilk klinik çalışma Lalvani ve arkadaşları tarafından yapılmıştır. Bu çalışmada araştırmacılar kültür ile doğrulanmış aktif TB hastalarında ve TB dışı hastalığı olan bireylerde RD1-ELISPOT testi ile TCT’yi karşılaştırmışlardır. Aktif TB hastalığı olan bireylerde ELISPOT testinin duyarlılığı %96 bulunurken, TCT’nin duyarlılığı %69 olarak saptanmıştır. ELISPOT testinin özgüllüğü bu çalışmada %92 olarak bulunmuştur (68). Son dönemde yapılan çalışmalarda M. tuberculosis ESAT–6’ya cevap %35 ile %92 arasında tespit edilmiştir (56,69,70,71,72,73,74). Ayrıca tüberküloz hastalarının büyük bir kısmının da IFN-γ cevabı oluşturuyor olmalarından yola çıkarak ESAT–6’yı 35 tanıdıkları ancak sağlıklı temas hikayesi olmayan bireylerin böyle bir cevap oluşturmadıkları görülmüştür (56,69,70,72,73,74). TÜBERKÜLİN CİLT TESTİ (TCT) Tüberkülin cilt testi, TB enfeksiyonunu gösteren cilt testlerinin genel adıdır. Bu testler basilin belirli bileşenlerinin TB basili ile enfekte olan kişilerde geç tip bir aşırı duyarlılık yapması temeline dayanır. Duyarlılığın oluşması için basil ile karşılaştıktan sonra 3–8 hafta gibi bir sürenin geçmesi gerekir. TCT için en sık kullanılan antijen PPD’dir (Purified Protein Derivative=saflaştırılmış protein derivesi). PPD solüsyonu tüberküloz basili kültüründen protein presipitatlarının filtrasyonu ile elde edilir. Elde edilen protein presipitatlarına tüberkülinler denir. İçeriğinin çoğu 10000 Da molekül ağırlığındaki proteinlerdir. Ayrıca bazı polisakkarit ve lipidlerde solüsyonda bulunur. İlk PPD Seibert ve Gleen tarafından 1939 yılında üretilmiştir ve PPD-S adıyla bilinmektedir. Bütün dünya da PPD-S standart olarak kabul edilmektedir. Üretilen diğer PPD’lerin PPP-S ile eşit güçte oldukları biyolojik olarak gösterilmelidir. PPD-S’in standart 5 tüberkülin ünitesi (TÜ) dozunun tanımı şöyledir: 0,1mg/ 0,1ml dozundaki bir PPD-S’in gecikmiş deri testi aktivitesi. Ticari PPD solüsyonlarındaki standart test dozu, PPD-S’deki 5 TÜ’e eşdeğer doz olarak tanımlanır. Ticari preparatlara Tween eklenerek cam ve plastiğe yapışması azaltılmıştır. Bu nedenle solüsyon kaptan kaba aktarılmamalı, enjektöre çekildikten sonra en kısa sürede kullanılmalıdır. Solüsyon ışık ve ısıya dayanıksızdır. Karanlıkta bulundurulmalıdır. Buzdolabında +2 ile +8 C’de saklanmalıdır. Donmamasına özen gösterilmelidir. Tüberkülin cilt testi, PPD solüsyonu ile sol ön kolun 2/3 üst iç kısmına, mümkün olduğunca kılsız ve venlerden uzak bir bölgeye yapılmalıdır. Solüsyonun 5 TÜ eşdeğer olan 0,1 ml’si insülin enjektörüyle (27 gauge iğne) deri içine (intradermal) verilmelidir. Bu yönteme Mantoux yöntemi denir. Enjeksiyon yapılırken iğnenin kesik ucunun yukarı gelmesine özen gösterilmelidir. Enjeksiyondan sonra test deri içerisine yapıldıysa 6- 10 mm’lik beyaz renkli bir kabarcık oluşur. Bu oluşmadıysa hemen ikinci test dozu birkaç cm uzak bir yere yapılmalıdır. Test yapıldıktan sonra geç tip bir hücresel yanıtın tetiği çekilmiş olur. Kişi TB basili ile daha önce karşılaştıysa bellek T hücreleri 36 oluşmuştur. PPD solüsyonunun enjekte edilmesi ile bellek T hücreleri ortama gelir ve lenfokinler salgılamaya başlarlar. Bu lenfokinler o bölgede vazodilatasyona, ödeme, fibrin birikimine ve diğer inflamatuar hücrelerin toplanmasına yol açar; bu reaksiyonlar deride kendini endürasyon olarak gösterir. Reaksiyon ortalama 5–6 saatte başlar ve 4872 saatte maksimuma ulaşır. Kaybolması günler alır. İlk 24 saatte ortaya çıkan reaksiyonlar aşırı duyarlılık reaksiyonu olarak algılanmalı; geç tip yanıtla karıştırılmamalıdır. İlk 24 saatte ortaya çıkan aşırı duyarlılık reaksiyonu kendini deride kızarıklık olarak gösterir. TCT okunurken, oluşan kızarıklık değil, sertlik (endürasyon) incelenmelidir. Endürasyon varlığı inspeksiyonla saptanabilirse de kalem ucuyla endürasyonun sınırlarının belirlenmesi daha duyarlı bir yöntemdir. Kalem deriye 45 derece açıyla test yapılan bölgeye doğru ilerletilir. Endürasyonun sınırına gelindiğinde kalem ucu deriye takılır. Bu nokta endürasyonun sınırı olarak kabul edilir. Test çevresinde bu işlem tekrarlanır. Şeffaf bir cetvelle kalemin takıldığı noktalar ölçülerek TCT sonucu milimetre cinsinden rapor edilir. Endürasyon çevresinde ölçülen kola göre dikey ve yatay çapların rapor edilmesi önerilmektedir. Eğer bu süre içinde ölçülmediyse 96 saate kadar ölçüm yapılabilir. Endürasyon oluşmadıysa negatif yerine 0 mm olarak rapor edilmesi daha doğrudur. Test yerinde bül, vezikül gibi lezyonlar oluşabilir. Bunların klinik önemi yoktur. Lokal tedavi gerektirmez. Ağrı olursa anti inflamatuar ilaçlar oral yoldan önerilir. TCT değerlendirmesinde günümüzde kabul edilen değerler kişinin aşılama ve bağışıklık durumu göz önüne alınarak belirlenir. Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığı’na göre tüberkülin cilt testinin yorumlanması aşağıdaki gibidir (75): A. BCG skarı yok: 0–5 mm ise: Negatif olarak kabul edilir. 37 6–9 mm ise: Şüpheli kabul edilir, 1 hafta sonra test tekrarlanır, yine 6–9 mm bulunursa negatif kabul edilir; 10 mm ve üzeri pozitif kabul edilir*. 10 mm ve üzeri: Pozitif kabul edilir**. *Booster fenomeni (hatırlatma fenomeni): Tek bir TCT ile ufak bir endürasyon oluşabilir, fakat önceden oluşmuş bir bağışıklık yanıtını uyarabilir. Böylece bir haftadan bir yıla kadar bir sürede yapılacak ikinci TCT ile daha büyük yanıt oluşur. Konversiyondan ayırmak için bir haftadan sonra (en erken dönemde) TCT yapılmalıdır. **Bağışıklığı baskılanmış kişilerde 5 mm ve üzeri pozitif kabul edilir: Kızamık veya boğmaca geçirenler, HIV, AIDS, diabetes mellitus, lenfoma ve lösemi gibi hematolojik bozukluklar, kronik peptik ülser, kronik malabsorpsiyon sendromları, orofarenks ve üst gastrointestinal sistem karsinomları, gastrektomi, barsak rezeksiyonu, kronik alkolizm, silikozis, pnömokonyoz, kronik böbrek yetmezliği, uzun süre yüksek doz kortikosteroid ve diğer bağışıklığı baskılayıcı tedavi gerektiren durumlar (2–4 hafta süreyle, günde 15 mg veya üstü prednizon dozuna eşdeğer steroid dozları yeterli yüksek doz kabul edilmektedir) (76). B. BCG skarı var: 0–5 mm: Negatif kabul edilir. 6–14 mm: BCG’ye atfedilir. 15 mm ve üzeri: Pozitif kabul edilir, enfeksiyon olarak değerlendirilir. Tüberkülin cilt testi uygun bir test olmasına rağmen mükemmel bir test değildir. Çünkü yanlış pozitiflik ve yanlış negatiflik oranları oldukça yüksektir. 38 Fonksiyonel olarak, TCT’lerinin önemi, duyarlılığı, özgüllüğü ve prediktif değeridir. Testin duyarlılığı, pozitif değeri olanlardan hastalığı olanların yüzdesini göstermesidir. Yalancı pozitifler duyarlılığı etkilemez çünkü önemli olan sadece hastalığı olanlardan teste pozitif reaksiyon verenlerdir. Hastalığı olanlardan pozitif testi olmayanların yanlış negatif sonuçları olduğu söylenir. TCT’de yanlış negatiflik oranları azımsanmayacak düzeydedir. Yapılan çalışmalarda bu oranların %12–32 düzeyinde olduğu görülmektedir (77,78). Yanlış negatiflik nedenleri Tablo VI’da gösterilmiştir (75). Tablo VI: Tüberkülin cilt testinde yanlış negatiflik nedenleri Yanlış pozitif yanıt genellikle PPD antijeni ile paylaşılan diğer mikobakterilerden kaynaklanmaktadır. Bu da NTM ile infeksiyona bağlı çapraz reaksiyon veya BCG aşılamasına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Mycobacterium avium veya diğer mikobakteriler ile infeksiyon tüberkülin reaktivitesine yol açabilir. Bu çapraz reaksiyonların birbirlerinden ayırt edilebilmesi mümkün değildir. Bunun yanında endürasyon çapının büyük olması durumunda, tüberkülozlu birey ile temas hikayesi olan olguda, ailede TB hastalığı varlığında, ülkede TB enfeksiyonu prevalansının yüksek 39 olması durumunda, aşı zamanı ile test arasında uzun bir süre geçmiş olması halinde (aşıya bağlı tüberkülin yanıtı zamanla azalma gösterir ve 10 yıldan daha uzun sürmesi beklenmez) reaksiyonun Mycobacterium tuberculosis’e bağlı olma ihtimali yüksektir. TCT’nin duyarlılığı farklı toplumlarda karşılaştırıldığında çok fazla değişkenlik göstermemektedir. Bunun yanında farklı ülkelerde çevresel mikobakteriler farklı dağılımlar gösterebileceğinden TCT’nin özgüllüğü hakkında yorumda bulunmak mümkün olmamaktadır. DSÖ’nün 1950’li yıllarda 10 farklı ülkeyi içine alan ve 3600 TB hastasını içeren çalışmasında TCT’nin 16–17 mm arasında yoğunlaştığı ve TB enfeksiyonu için duyarlılığın 10 mm endürasyon kriter olarak kullanıldığında %93, 14 mm kriter olarak kullanıldığında %78 olduğu saptanmıştır (79). Şekil 5’te TCT endürasyon çaplarının varsayılan dağılımı görülmektedir. Mikobakteriyel enfeksiyonu olmayan veya anerjisi olanlarda TCT reaksiyonu birkaç mm’yi geçmez. TCT pozitifliği için eşik değeri 14 mm ve üzeri alındığında gerçek enfeksiyonu olan bazı bireyler tespit edilememiş olacaktır (Şekil 5, A bölgesi; yanlış negatif). Bunun yanında enfeksiyonu olmayan bazı bireyler ise enfekte olarak değerlendirilecektir (Şekil 5, B bölgesi; yanlış pozitif). Bu şekil incelendiğinde 4–21 mm arasında bir değer TCT pozitifliği için eşik olarak kabul edilirse yanlış negatif ve yanlış pozitif oranlarının değişeceği görülecektir. Bu nedenle M. tuberculosis enfeksiyonu için TCT’nin duyarlılığı ve özgüllüğü eşik değerine göre değişkenlik göstermektedir. Bununla birlikte TCT endürasyon çapları toplumun BCG aşılı olup olmamasına veya aşı sayısına göre de değişkenlik gösterebilir (80,81). 40 Şekil 5: Toplumda TCT endürasyon çaplarının varsayılan dağılımı. LATENT TÜBERKÜLOZ İNFEKSİYONU Yayma pozitif akciğer tüberkülozlu bir olgu, kendisine tanı konulup tedavi başlanana kadar 3–5 kişiyi enfekte etmektedir. TB olguları ile temas eden sağlıklı kişilerin %5’inde ilk 2 yıl içinde aktif TB hastalığı, %95’inde ise sessiz enfeksiyon yani latent TB infeksiyonu (LTBI) gelişmektedir. Ayrıca LTBI olgularının %5’i yaşamlarının bir döneminde aktif akciğer tüberkülozuna yakalanmaktadır. Tablo VII’de aktif TB hastalığı gelişimi için bazı klinik durumlardaki relatif risk verilmiştir (7). Tablo VII: Aktif tüberküloz hastalığı gelişimi için bazı klinik durumlarda relatif risk Klinik Durum Silikozis Diabetes Mellitus Kronik böbrek yetmezliği/ hemodializ Relatif Risk 30 2,0–4,1 10,0–25,3 41 Gastrektomi 2-5 Jejunoileal Bypass 27–63 Böbrek Transplantasyonu 37 Kalp Transplantasyonu 20–74 Baş-Boyun Kanserleri Transplantasyonu 16 Günümüzde LTBI belirlenmesinde TCT kullanılmaktadır. Bu testin de sensitivitesi ve spesifisitesi düşüktür. BCG aşılamasının yaygın olarak kullanıldığı ülkelerde TCT yorumlanması aşılanmadan etkilenir. Ayrıca çevresel mikobakterilerin etkisini TCT ile ayırt etmek de pek mümkün değildir. Ek olarak infeksiyon hastalıkları, lenfoid organları etkileyen hastalıklar, metabolik bozukluklar, aşılar, anerji kullanılan tüberküline ait faktörler ve uygulama yöntemi, okuma ve kayıt ile ilişkili faktörler nedeniyle yanlış negatif sonuçlar verebilmektedir(Tablo VII). Dolayısı ile M. tuberculosis ile BCG aşılanması ve çevresel mikobakteriler arasında ayırım yapacak, hatta LTBI ile aktif hastalığı ayırt edecek bir teste ihtiyaç vardır. Hastalık Kontrol Merkezi (CDC) son dönemde LTBI tanısında quantiFERON’un (Celletis Limited, Carnegie, Victoria, Australia) kullanımını önermektedir. QuantiFERON, PPD’ye cevap olarak periferik kanda oluşan IFN-γ düzeyini ölçmektedir. Özellikle TB hastalığı geliştirme riski yüksek kişilerde (Göçmenler, bakımevleri veya hapishanelerde yaşayanlar, vs..) veya LTBI için düşük risk altında olup LTBI için risk oluşturacak aktivitelerde bulunanlarda (sağlık personeli, askeri personel, Amerika Birleşik Devletleri’ nde doğmuş kolej öğrencileri) önerilmekte, ancak aktif TB hastalığı şüphesi olanlarda ve aktif hastalığa progresyon açısından risk altındakiler de önerilmemektedir (HIV, organ transplantasyonu, vs…) (82). Tablo VIII’de TCT’si pozitif olan bireylerin aktif hastalık geliştirme insidansları verilmiştir. 42 Tablo VIII: TCT’si pozitif bireylerin aktif hastalık geliştirme insidansları Risk Faktörleri TB vakaları/1000 kişi-yıl Yeni TB enfeksiyonu Enfeksiyon<1 yıl 12,9 Enfeksiyon1–7 yıl 1,6 HIV enfeksiyonu 35,0–162 IV ilaç kullanımı HIV + 76,0 HIV – veya bilinmiyor 10,0 68 Silikozis Geçirilmiş TB ile uyumlu radyolojik bulgular 2,0–13,6 Vücut ağırlığının standartlar göre durumu %15 ten daha düşük ağırlıkta 2,6 %10–14 arası düşük ağırlıkta 2,0 %5–9 arası düşük ağırlıkta 2,2 %5 daha ağır 1,1 % 5’ten fazla daha ağır 0,7 TB ile mücadelede yapmamız gereken, olguları bulup onları etkili bir şekilde tedavi etmektir. Hasta bulma hızı fabrika vb. yerlerin taranmasında %0,11 (relatif hız=1) iken, temaslı muayenesinde %5,6 (relatif hız=51,3), semptomlu muayenesinde %4,99 (relatif hız=45,4) bulunmuştur. Görülüyor ki temaslı muayenesi semptomlu muayenesi kadar hatta ondan daha önemlidir. Öte yandan her temaslı PPD pozitif olmaz ve her PPD pozitif olan da hasta olmaz (83). Bireyleri TB gelişmesine daha yatkın yapan belirli faktörler vardır. Potansiyel risk faktörleri arasında (1) yeni enfeksiyonları 43 almayı arttıran dış risk faktörleri, (2) yeni enfeksiyon almada intrinsik yatkınlık ve (3) progresif hastalık ya da LTBI’nun reaktivasyonu için intrinsik risk faktörleri yer alır. I- ENFEKSİYON ALMA RİSKİNİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER Diğer yaşam alanlarına göre TB basiliyle karşılaşma ve infekte olma olasılığının çok daha fazla olduğu kolayca belirlenebilen ortamlar vardır. Bunların bazıları Tablo IX’da belirtilmiştir (84). Tablo IX: M. tuberculosis enfeksiyonu almada risk faktörleri II- YENİ ENFEKSİYONLARA YATKINLIK Stead, bakımevleri ve hapishanelerdeki temaslı muayenelerinin sonuçlarını incelerken aynı koşullarda, zencilerde tüberkülin cilt testi konversiyonunun beyazlardan anlamlı olarak daha yüksek olduğunu bulmuştur. Ancak klinik aktif tüberküloza ilerleme riski benzer koşullardaki beyazlardan daha fazla değildir (85). Bu ve benzeri çalışmalar tüberküloza ırklar arasında farklı yatkınlıklar olduğunu gösteriyorsa da, ırkların kendi içinde de çaşitli farklılıklar vardır (86). 44 III- REAKTİVASYONU ARTTIRAN RİSK FAKTÖRLERİ tuberculosis ile yeni enfekte olmuş normal immünitesi olan 100 erişkinden, yaşam boyunca 15’inden azı aktif hastalık geliştirecektir. İnfekte olan kişilerde yaşların tipik bir dağılım göstereceğini varsayarak, infeksiyonu izleyen ilk 2 yılda 5 ile 10 tanesinde belirgin hastalık ortaya çıkacaktır. Hastalığın erken ortaya çıkmasında seçici rol oynayan faktörler netleşmemiştir. Ancak, aşağıdaki faktörlerin etkili olabileceği kabul edilmektedir: (a) inokulum büyüklüğü ile progresif infeksiyon olasılığı daha yüksektir, (b) doğuştan preimmün savunmalar, ilk savunmayı ve inhale edilen basillerin yayılmasını belirler ve (c) genetik olarak kontrol edilen immün yollar da konağın M. tuberculosis’e karşı yanıtını etkiler. Yeterince iyi çalışılmamış fakat muhtemelen bu seçme olayına katkıda bulunan şey infekte eden basilin bağıl virülansıdır. Ya da M. tuberculosis dışında çevresel mikobakterilere maruziyetle oluşan çapraz immünizasyon bir miktar koruma sağlayabilir (87). Tablo X’da risk faktörleri özetlenmiştir (84). 45 Tablo X: Latent tüberkülozun endojen reaktivasyonu için risk faktörleri TÜBERKÜLOZDAN İLAÇLA KORUNMA Enfeksiyon prevalansının düşük olduğu ülkelerde, TB, yeni enfekte olmuş kişilerden çok, daha önce infekte olmuş PPD pozitif kişiler arasından (enfeksiyon havuzu) reaktivasyon sonucunda gelişmektedir. Bu nedenle, tüberkülozun önlenmesinde kemoprofilaksi veya koruyucu tedavi uygulanması yeni terminoloji ile LTBE tedavisi aktif akciğer tüberkülozlu olguların tedavisi kadar büyük önem taşımaktadır ve bu amaçla 6-12 ay INH verilmesi önerilmektedir (2,8). Oysa, INH tedavisinin uzun sürmesi ve hepatotoksisiteye neden olabilmesi uyumu azaltmakta ve tedavinin başarısını özellikle izlemi güç olgularda %5-25’e kadar düşürmektedir (6,9,10). 46 İlaç verilerek tüberkülin negatif kişilerin korunması primer korunma olarak tanımlanır. Amaç yeni alınan basillerin henüz daha PPD pozitifleşmeden yok edilmesidir. Sekonder koruma ise, tüberkülin pozitif kişilerin ilaçla korunmasıdır ve inaktif basillerin reaktivasyonla hastalık oluşturmasını önlemeyi amaçlamaktadır. Her iki durumda da olay aslında subklinik, latent enfeksiyonun tedavisidir. İlacın koruyucu etkisi organizmada bulunan ancak henüz daha hastalık tablosu oluşturmamış basillerin yok edilmesi veya sayılarının azaltılması yolu ile olur. İnfeksiyon havuzunda yer alan yüksek riskli kişilerin ilaçla koruma altına alınması 40 yıldır önerilen bir stratejidir. İlk resmi Amerikan Toraks Derneği Rehberi ‘’Tüberkülozda Koruyucu Tedavi’’ 1965’te yayınlanmıştır (88). İsoniazid (INH) ise TB tedavisine 1952’de girmiştir. Bu ilacın çok ilerlemiş olguları bile kür edici kapasitesi kısa sürede görülmüştür. Ayrıca ilaç çok ucuzdur. Tüberkülozlu ailelerin 500 çocuğunda INH kemoterapisinin kullanımı ile ilgili çalışma 1956’da yayınlanmıştır (89). İlk ABD Halk Sağlığı Servisi (USPHS) çalışması 1957’de başlatılmıştır (90). USPHS INH kemoterapilerinin çoğunun bir derlemesini 1970’te yayınlamıştır (91). 1951’den 1970’e kadar LTBI’nun INH ile tedavisi konusunda birçok randomize kontrollü klinik çalışma yapılmıştır. Bu çalışmalar birçok ülkeden TB riski olan 100000’den fazla kişiyi incelemiştir. Bu kişiler içinde primer tüberkülozlular, aktif TB hastalarının temaslıları, TCT reaksiyonu pozitif olanlar ve inaktif TB olanlar mevcuttur. INH tedavisinin etkinliği bu çalışmalarda %25 ile %92 arasında değişmektedir, ancak analizler tedaviye uyumlu hastalarda yapıldığında koruyucu etkinlik yaklaşık %90’dır. Ek olarak ilaçlar düzensiz kullanılsa dahi uzun süre kullanımda koruyucu etkinin devam ettiği bildirilmiş, bu da intermitan rejimlerin kullanılabilirliğini ortaya koymuştur (7). LTBI tedavisi ile ilgili en büyük çalışma Tüberküloza Karşı Uluslararası Birlik (IUAT) tarafından yürütülmüş ve bu çalışmada inaktif fibrotik lezyonları olan ve TCT’leri pozitif tespit edilen 27830 kişi incelenmiştir. Vakalar Avrupa’nın 7 ülkesinden 47 seçilmiştir. Tedavi sürelerine göre değerlendirirldiğinde 52 hafta verilen tedavinin TB hastalığında %75 azalma sağladığı, 24 haftalık tedavi ile bu azalmanın %65’e düştüğü ve 12 haftalık tedavi ile sadece %21 azalma olduğu gösterilmiştir (8). INH genal olarak güvenilir ve iyi tolere edilen bir ilaç olmakla birlikte 2321 vakanın incelendiği koruyucu tedavi ile ilgili bir çalışmada 19 vakada karaciğer hastalığı gelişip, bunların 2’si ölümle sonuçlanınca (92) USPH INH ilişkili hepatit konusunda 21 şehirden 13838 kişinin katıldığı bir çalışma yapmış ve bu çalışmada INH ilişkili hepatit riski yılda 1000 kişide 10,2 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca hepatit için yüksek risk yaş, alkol tüketimi, ve Asyalı erkek olmakla ilişkili bulunmuştur. Bu çalışmada 8 (%0,8) ölüm rapor edilmiştir. Bunun üzerine CDC koruyucu tedavi verilen kişilerin aylık kontrollerinin yapılmasını, tedavinin 35 yaş üzeri risk altındaki kişilerle sınırlandırılmasını önermiştir (93). Ayrıca LTBI tedavisi verilen hastaların %1020’sinde asemptomatik transaminaz yükseklikleri tespit edildiği ancak bunun klinik hepatit ile ilişkili olmadığı da vurgulanmıştır (94). 1971’den 1991’e kadar koruyucu tedavinin risk ve yararları konusunda 6 çalışma yapılmıştır (95,96,97,98,99,100). 1983 yılında Amerikan Toraks Derneği 35 yaşın üzerindekilere düzenli karaciğer fonksiyon testleri takibini ve transaminaz düzeylerinde 3–5 katlık artış halinde tedavinin kesilmesini önermiştir (50). Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığı’na göre koruyucu ilaç tedavisi uygulaması ise Tablo XI’de belirtildiği gibidir (101). 48 Tablo XI: Ülkemizde koruyucu ilaç tedavisi endikasyonları Kemoprofilaksi için INH erişkinlerde günde 5 mg/kg (maksimum 300 mg), çocuklarda 10 mg/kg/ gün hesabıyla 300 mg’ı geçmeyecek şekilde 6 ay süreyle verilir. HIV pozitifler, silikozis olanlar, bağışıklığı baskılayıcı tedavi alanlar, eski TB sekeli olanlara 9 ay önerilmektedir (76). Kaynak olgu isoniazide dirençli ise rifampin (birlikte INH da olabilir) en az 4 ay; rifampin ve pirazinamid verilirse 2 ay süreyle verilmelidir. TB hastalarının temaslılarına koruyucu tedavi verilirken, hastaya verilen tedavi süresinden daha uzun olmamasında yarar vardır. Koruyucu ilaç tedavisine başlamadan, o kişide TB hastalığı olmadığı gösterilmelidir. Bunun için hastanın tıbbi öyküsü alınır, akciğer filmi, fizik muayene ile hasta değerlendirilir. TB hastalığı düşündüren bulgu saptanırsa, bakteriyolojik inceleme yapılır. TB hastalığı varsa ve saptanmazsa, koruyucu tedavi ilaç direnci gelişimine neden olabilir. Koruyucu tedaviye başlamadan önce, o kişinin ev içi temaslılarının TB 49 açısından taranması gerekir; öyküsünde ev dışında kuşkulu kişiler varsa onların da taranması uygundur. Koruyucu tedavinin 19 yıla kadar etkili olabildiği gösterilmiştir (102). Koruyucu tedavinin sonunda tüberkülin cilt testinin değişime uğraması beklenmez. İlaçları düzenli kullanması ve süreyi tamamlaması için hastayı eğitmek ve desteklemek gerekir. Gerekirse koruyucu tedavi doğrudan gözetimli verilir. Koruyucu tedavinin aralıksız sürdürülmesi esastır. Eğer kısa süreli aralar verilmişse, bu aralar koruyucu tedavinin sonuna eklenir. Yapılmış araştırmalara dayanarak 12 ayda toplam 6 ay koruyucu tedavinin yeterli olduğu kabul edilmektedir (103). Diabet, üremi, alkolizm, malnütrisyon, gebelik, epilepsi varlığında INH ile birlikte pridoksin (vitamin B6) kullanımı endikasyonu vardır. Günde 10 mg verilir (104). Temaslı koruyucu ilaç tedavisini reddederse, 3.–6.–12.–24. aylarda akciğer filmi çekilir. Film ya da semptomlarında TB şüphesi doğarsa balgam incelenir; hastalık açısından izlenir. INH kemoterapisi konusunda günümüzdeki uygulama aşağıdaki gibidir (105): Aktif tüberkülozlu olgular, önceden düzenli tedavi almış olanlar, daha önce isoniazide bağlı ciddi yan etki görülen kişiler ile akut karaciğer yetmezliği durumunda koruyucu ilaç kullanımı kontrendikedir. Diabetli, alkolik, böbrek yetmezliği veya kronik karaciğer hastalığı olan kişiler ile gebeler ve önceden isoniazide bağlı minör yan etki görülmüş kişiler ve çok yaşlılarda mutlak kontrendikasyon olmamakla birlikte tedavi süresince yakın izlem gerekir. Gebelerde yüksek hastalık gelişme riski yoksa koruyucu tedavi doğum sonrasına bırakılmalıdır. 50 Gelişebilecek hepatotoksisiteyi saptamak üzere INH profilaksisi uygulanan kişiler izlenmelidir. 35 yaşın altındakilere, aylık semptom sorgulaması; 35 yaş veya üzerindekilere ise buna ilaveten tedavinin başlangıcında periyodik olarak karaciğer enzimlerinin takibi önerilmektedir. Başka bir nedene bağlı olmaksızın hepatit semptomları gösteren bir olguda transaminazların yükselmesi, SGOT değerinin başlangıç düzeyinin 5 katı veya normal üst sınırın 3 katı yükselmesi ve başka nedeni olmaksızın transaminazlar ile birlikte bilirubin artışı gibi durumlarda INH tedavisi kesilmelidir. INH kesildikten sonra, eğer verilmesi gereken dozun %80’i verilmişse, yeterli kabul edilebilir; eğer daha az ilaç kullanmışsa, rifampin ile devam edilebilir. INH’a yüksek direnç, INH’a bağlı yüksek hepatit riski, 6–12 aylık INH tedavi süresinin uygun olmadığı durumlar gibi nedenlerle farklı ilaçlarla koruyucu tedavi yaklaşımları denenmiştir. Haftada iki kez aralıklı olarak yüksek doz (15mg/kg) INH, doğrudan gözetim altında verilmek koşuluyla uyumsuz kişiler için bir alternatif olabilir. Rifampin veya diğer rifampin grubu ilaçlar (rifabutin, rifapentin) koruyucu tedavide diğer seçeneklerdir. Günlük 10 mg/ kg dozda, maksimum 600 mg’ı geçmeyecek şekilde 4 ay süreyle rifampin, 2 ay süreyle rifampin+pirazinamid gibi farklı protokoller farklı hasta gruplarında önerilmektedir. Rifapentin uzun yarı ömrü ile haftada bir doz uygulama imkanı verebilir. INH’a dirençli basille infeksiyon söz konusu ise veya INH kullanımı mümkün değilse, rifampin alternatif olabilir. Çok ilaca dirençli bir basil ile infeksiyon varsa pirazinamid+etambutol veya pirazinamid+kinolon kombinasyonu ile koruyucu tedavi önerilmektedir. TÜBERKÜLOZU ÖNLEMEK İÇİN AŞI UYGULAMASI Calmette ve Guerin safranın M. bovis suşunun virülansını azalttığını ve seri halde 231 pasajdan sonra, bu zayıflatılmış basillerin hayvan modellerinde belirgin koruma sağladığını gösterdiler ve 1920’lerin başlarında bu bir insan aşısı olarak sunuldu (106). 51 BCG canlı bir aşıdır. Genellikle sol deltoid bölgeye, tipik olarak cilt altına veya cilt içine inokülasyonla uygulanır; oral yoldan ya da aerosol olarak uygulanması son derece nadirdir. Sulandırılmadan oda sıcaklığında bir ay, buzdolabında +2 ile +8C’de 1–2 yıl etkinliğini korur. Işığa ve ısıya karşı çok dayanıksızdır. Sulandırıldıktan sonra 6 saat içinde kullanılması gerekir. Kendi sulandırıcısı dışında herhangi bir sulandırıcı ile kesinlikle sulandırılamaz. Basil yerel bir infeksiyon yapar, seyrek olarak yerel lenfadenit ile birliktedir. Basilin büyüme hızının yavaşlığı nedeniyle, bu olay tipik olarak 6–8 haftada gerçekleşir. Tüberküloproteine geç tip aşırı duyarlılık sıklıkla bu dönemde gelişir. Tüberkülin testi aşılananların tümünde değil, fakat çoğunluğunda pozitifleşir. Bu aşının koruyucu etkisi geç tip aşırı duyarlılığa neden olma derecesi ile ilişkili değildir (107). Yerel akciğer yerleşmesini engelleyememesine rağmen, BCG teorik olarak, akciğer ve akciğer-dışı tüberkülozun her ikisini de azaltabilmektedir. İlk kontrollü aşılama çalışmalarından biri 1935 yılında yürütülmüş ve bu çalışmada, hastalığa karşı %75 bir koruyucu etki görülmüştür (108). Bunu izleyerek çok sayıda çalışma yürütülmüş ve BCG aşısının etkilerinin yukarıya doğru %80 koruma ile aşağıya doğru %56 etkiye kadar değişmekte olduğu görülmüştür (109). BCG’ NİN YAN ETKİLERİ BCG tüberkülin cilt testini bozarak, yeni infeksiyonu ve böylece koruyucu tedaviye adaylığı gösteren tek pratik aracı sıfırlamaktadır. Yeni infeksiyon, geleneksel olarak tüberkülin negatifliğinden çeşitli düzeylerde endürasyonlu yanıta kadar konversiyon ile belirlenir. Bununla birlikte BCG yapılanlardan, %15-90’ının başlangıçta tüberkülin pozitifliği yoktur (107). Aşıdan sonra zaman geçtikçe pozitiflerin yüzdesi azalmakla birlikte, bebekken aşılananlarda veya 5 yaşında aşılananlarda TCT’ye genç erişkin iken reaksiyon verme sırası ile %8 ile %25’tir (110). Başlangıç TCT’ye cevap 52 vermeyen BCG aşılıların, sonraki TCT’lerinde ilk teste bağlı önemli reaktiviteyi arttırma (boosting) riski taşıdıkları bulunmuştur. Bu durum bireylerin peş peşe cilt testi ile izlenmesini engellemektedir. BCG aşısı, yan etkileri az olan bir aşıdır. Aşıdan sonra görülen komplikasyonlar daha çok aşının dozu, aşılama yeri ve derinliği, aşılanan kişinin yaşı ve bağışıklık sisteminin durumuyla ilgilidir. En sık görülen komplikasyonlar, aksiller ve servikal adenopatilerle lokal apselerdir. Adenopatiler genellikle aşıdan 1–2 ay sonra meydana gelmektedir, fakat nadir de olsa 8–12 ay sonra ortaya çıkabilir. Tedavi uygulamak gerekmez. Büyük adenopatiler blok halinde cerrahi olarak çıkarılabilir. Fluktuasyon vermeyen adenopatiler için bir şey yapmak gerekmez. Süpüre olanlar ise iğne ile aspire edilir ve drenaj sağlanır, ya da eksize edilebilir. İsoniazid verilmesi tedavi süresini kısaltmaz. Aşı yerinde meydana gelen geniş ve deriden kabarık hasır örgüsü görünümündeki anormal skarların genetik nedenlerle olduğu düşünülmektedir. Erken aşı reaksiyonu: aşıdan sonraki bir hafta içinde aşı yerinde akıntı yara ve şişlik oluşur. Bu, çocuğun daha önce TB basili ile enfekte olduğunu (TCT pozitifliği) gösterir (111). Bu nedenle üç aylıktan büyük çocuklara BCG aşısı yapmadan önce TCT yapmak gereklidir. Erken aşı reaksiyonuna Koch fenomeni ya da akselere reaksiyon da denilebilir. Koch fenomeni, TB basili ile daha önce enfekte olmuş ve tüberkülin allerji düzeyleri yüksek kişilerin basille tekrar karşılaştıklarında basilin girdiği yerde 1–3 gün içinde meydana gelen kuvvetli spesifik reaksiyondur. Akselere reaksiyon, basille karşılaşmış ancak henüz ante-alerjik devrede olan ya da uzun yıllar önce karşılaştığı için tüberkülin alerjisi zayıflamış olan kimselerde görülür. Böyle kimselere aşı yapıldığında aşı yerinde 3. günden sonra kızarıklık ya da akıntı olabilir. Erken aşı reaksiyonu oluşursa, TCT pozitif gibi davranılır; TB hastalığı araştırılır. Hastalık yoksa koruyucu tedavi verilir, kaynak olgu araştırılır. 53 BCG aşısının nadir de olsa diğer komplikasyonları, aşı yerinde lupus vulgaris, aşı suşuyla sistemik TB infeksiyonu (özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda), aşı suşu ile olan osteomiyelit, diffüz lenfadenit, hepatosplenomegali ve genitoüriner lezyonlardır. BCG AŞISI ŞU HALLERDE YAPILMAMALIDIR: 1. Ateşli hastalığı olanlar 2. Kızamık salgını sırasında (kızamık aşısı yapılmamış olanlar) 3. İmmün yetmezliği olan hastalar 4. Tüberküloz hastalığı geçirenler 5. Deri hastalığı olanlar (egzema vs...) 6. Kortizon grubu ilaçlarla tedavi görenler 7. Tüberkülin cilt testi pozitif olanlar TÜRKİYE’ DE BCG UYGULAMASI Ülkemizde 1981–1982 yıllarında yapılan prevalans çalışmalarının verilerine göre, BCG’nin Türkiye’de bütün yaş gruplarında koruyuculuğu %72,7 bulunmuştur; özellikle de 0–6 yaş grubunda %85 olarak hesaplanmıştır (112). 54 Sağlık Bakanlığı biri doğumdan 2 ay sonra, diğeri ilkokul birinci sınıfta olmak üzere, çocuklarda iki kez BCG yapılmasını kararlaştırmıştır. Doğumdan hemen sonra BCG yapılabilir fakat bebeğin cildi çok ince olduğu için teknik zorlukları vardır. Ayrıca komplikasyonların daha fazla olması ve bağışıklık yanıtının yeterli gelişmemesi nedeniyle pek tercih edilmez. Ülkemizde TCT kontrolü ile BCG aşısı yapılırken karar yaklaşımı Tablo XII’de verilmiştir (113). Tablo XII: Tüberkülin cilt testi kontolü ile BCG aşısı yapılırken karar yaklaşımı TCT ölçümü BCG Skarı Yok BCG Skarı Var 0-5 mm Aşılanır Aşılanır 1 haftadan sonra TCT 6-9 mm tekrarlanır. 10mm’ den az Bir şey yapılmaz ise aşılanır Ailesi ile birlikte tetkik 10-14 mm edilir, hasta bulunmazsa Bir şey yapılmaz koruyucu tedaviye alınır.* 15 mm ve üstü Ailesi ile birlikte tetkik Ailesi ile birlikte tetkik edilir, hasta bulunmazsa edilir, hasta bulunmazsa koruyucu tedaviye alınır.* koruyucu tedaviye alınır.* * BCG aşısı için TCT 0–6 yaş grubuna yapıldığı için burada koruyucu tedavi verilen kişiler 6 yaş altındakilerdir. BCG diğer aşılarla aynı anda yapılabilir. Canlı virüs aşıları ile birlikte, aynı anda farklı kollardan uygulanabilir. Birlikte uygulanmamışsa, dört hafta ara ile yapmak uygun olur. İmmün yetmezliği olan çocuklara BCG yapılmaz. 55 GEREÇ VE YÖNTEM GEREÇLER 1. ELİZA PLAKLARI 15 µg/ml anti-IFN-gamma mAb 1-DIK (Mabtech, Stackholm, Sweden) kaplanmış 96 kuyucuklu poliviniliden diflorid ELİZA plakları (MAIPS45:Millipore Bedford, MA) 2. RPMI–1640 (Sigma) 3. Fetal Bovine Serum ( Sigma) 4. L-Glutamine ( Sigma) 5. Ficoll-Paque plus (Amershom Biosciences, Sweden) 6. Phosphate buffered saline with tween 20, (Sigma) 7. Alkaline-phosphatese (Moss Inc, UK) 8. In vitro PPD tuberculin Batch RT 49 ( Statemens Serum Instıtut, Denmark) 9. Tuberculin PPD RT 23 SSI ( Statemens Serum Instıtut, Denmark) 10. Phitohemagglutin leukoaglutinin ( ICN Biomedicals, Aurora, OH) 56 11. Gentamisin solusyon (Sigma) 12. Ampisilin Na tuzu ( Sigma) 13. Na pyruvate (Sigma) 14. rESAT–6 peptid( VLA, Addlestone, UK) 57 ARAÇLAR 1. Santrifüj (Hettich Zentrifugen Rotina 35, Germany) 2. C02 etüv (ThermoFarma, Direct Heat C02 incubator Hepa Filter, USA) 3. Laminar flow steril kabin (Tez-San Türkiye) 4. Finnpipette 100–1000 µl (Therma Labsystems, Finland) 5. Finnpipette ve multistepper (Therma Labsystems, Finland) 6. Ipipet (Gentry, Tokyo, Japan) 7. Falcon tüp 15 cc (Becton-Dickinson, USA) 8. Falcon tüp 50 cc (Becton-Dickinson, USA) 9. Pasteur pipet 3 cc (I.A.S.A. Espena) 10. Plastik steril pipet 10 cc (Falcon, Becton-Dickinson, USA) 11. Tüp-ependorf 1,5 ml, 0,5 ml 58 YÖNTEM Bu çalışma Ocak 2003-Aralık 2004 tarihleri arasında Heybeliada Sanatoryumu Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi ve bölge Verem Savaş Dispanserlerine başvuran yayma pozitif pulmoner TB hastalarının 0–15 yaş arasındaki temaslılarının Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Enfeksiyon Hastalıkları Polikliniği ve Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Prof. Dr. Müjdat Başaran Pediatrik Enfeksiyon Hastalıkları Araştırma Labaratuvarına yönlendirilmeleri sonucunda “UNDP/world Bank/ WHO special programme for research and training in tropical diseases 2001–2002, grant A10665” araştırma bursu ile yapılmıştır. Çalışma popülasyonun sağlanması: Çalışmaya Sağlık Bakanlığı Heybeliada Sanatoryumu Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesinde yayma pozitif akciğer TB tanısı ile tetkik ve tedavi edilen hastaların, İstanbul Anadolu yakasında faaliyet gösteren Kadıköy, Üsküdar, Beykoz, Maltepe, Kartal, Pendik ve Ümraniye Verem Savaş Dispanserleri polikliniklerince takipleri yapılan ev içi temaslısı, 0–15 yaş arası çocuklar dahil edildi. Tüm bu çocukların listeleri faks yolu ile Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Enfeksiyon hastalıklarına bildirildi. Görevli hemşire tarafından temaslı çocukların evlerine telefon edilerek Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Enfeksiyon hastalıkları polikliniğine gelmeleri istendi ve bu amaçla randevu tarihleri belirlendi. İndeks vakalara daha önce, temaslılar hakkında bilgi alınırken, çalışma ile ilgili olarak bilgi verildi, yapılacak tüm tetkiklerin ücretsiz olacağı ve geliş gidişleri sırasındaki yol masraflarının Türk Lirası bazında peşin olarak karşılanacağı belirtildi. Son 6 aylık dönemde ARB teksif müspet indeks vaka ile ev içi temaslı 4 ay ve üzeri süre ile INH profilaksisi alan 0–15 yaş arasında çocuklar çalışma popülasyonunu oluşturdu. Ayrıca ELISPOT pozitifliği olup, TCT negatif olan ve profilaksi almayan 38 temaslı da kontrol grubu olarak incelendi. 59 Olgu kabul edilme kriterleri: 0–15 yaş arası, asemptomatik, son 6 ay içerisinde aile içi yayma pozitif pulmoner tüberkülozlu kişi ile teması olan çocuklar. Olgu çıkarma kriterleri: 1. Bilgilendirilmiş onamın alınamaması 2. Başvuru anında yapılan incelemeler neticesinde aktif TB hastalığı tanısının konulması 3. Ev içi TB teması olmayan çocuk 4. İndeks olgunun balgamının M. tuberculosis için yayma ve kültür negatif olması. Kayıtlar: Başvuran çocukların yakınlarından tam izin belgesi yazılı olarak alındı. Çocukların yaşları, BCG aşı durumları, indeks vakanın kültür ve majör direnç sonuçları sorgulama formuna kayıt edildi. Klinik uygulamalar: Çalışmaya alınan her çocuğa fizik muayene yapıldı. Akciğer filmleri çekildi. Tüberkülin cilt testi yapıldı. Klinik çalışma formları dolduruldu ve cilt testi yapılmadan önce, aynı gün RD1-ELISPOT testi için 5–10 cc arasında değişen heparinli kan alındı. Herbir çocuğun testi kanın alındığı gün çalışıldı. Çalışmaya katılan her çocuk ilk 6 aylık 60 dönem içinde her iki ayda bir düzenli olarak kontrole çağrıldı. Her kontrol vizitinde çocuklar TB semptomları açısından sorgulandı, kemoprofilaksi alanların profilaksiye uyumları değerlendirildi ve fizik muayeneleri yapıldı. Profilaksi alan çocukların INH koruyucu tedavi dozları, 2 aylık toplam dozlar halinde, 10 mg/ kg/ gün hesabıyla, 300 mg’ı geçmeyecek şekilde verildi. (Bu ilaçlar T.C. Verem Savaş Daire Başkanlığı’na bağlı İstanbul 6. grup Verem Savaş Başkanlığı tarafından ücretsiz olarak karşılandı). Her iki ayda bir çocuklar kontrole geldiklerinde ilaçları tekrar sağlandı. 6 aylık koruyucu tedavi protokolü uygulandı. İlk başvuru anında TB olduğundan şüphe edilen çocuklar Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Enfeksiyon hastalıkları tarafından izleme alındı; şüphe edilen her çocuktan 3 kez açlık mide suyu örneği veya verebiliyor ise balgam örneği alındı. Bu örnekler Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji bölümü mikobakteriyoloji laboratuvarında TB kültürleri dahil olmak üzere ücretsiz olarak çalışıldı. Gerekli görülen hastalara akciğer tomografileri ücretsiz olarak çekildi. Tüm bulgular ile ilk başvuru anında TB tanısı alan çocuklar veya takiplerimizde TB tanısı alan çocuklar bağlı olduğu verem savaş dispanseri ile ortak olarak takip ve tedaviye alındı. Tüberkülin Cilt testi uygulaması: Tüberkülin cilt testi için 5 IU PPD (Tuberculin PPD RT 23 SSI, Statens Serum Instıtut, Denmark, 5 PPD- S tüberkülin aktivitesinde) kullanıldı. PPD tüm çocukların kollarının volar yüzeyine intadermal olarak yapıldı ve test 48–72 saat sonra değerlendirildi. BCG skarı olanlarda 15 mm ve üstü, BCG skarı olmayanlarda 10 mm ve üstündeki endürasyon çapları pozitif TCT olarak kabul edildi. Cilt testi pozitif olarak kabul edilen çocuklara isoniazid 10 mg/kg/gün dozunda maksimum 300 mg olacak şekilde 6 ay süre ile verildi. Cilt testi negatif olan 6 yaşından küçük temaslı çocuklara da INH profilaksisi verildi. 61 Akciğer filmlerinin değerlendirilmesi: Tüm olguların akciğer grafileri Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyoloji Ana Bilim Dalı Öğretim üyeleri, Doç.Dr. Nihat Kodallı ve Yard. Doç.Dr. İhsan Akpınar tarafından değerlendirildi. Akciğer grafilerinde TB şüphesi olan hastalar TB açısından tekrar değerlendirmeye alındı. Bu hastaların açlık mide suları veya balgam örneklerinden ARB yayma ve TB kültürleri gönderildi. Gerekli görülen hastalara toraks bilgisayarlı tomografi görüntülemesi yapıldı. Laboratuvar uygulamaları: Her klinik vizit sonrasında alınan heparinli kan Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Prof.Dr. Müjdat Başaran Pediatrik İnfeksiyon Hastalıkları Araştırma Labarotuvarında RD1-ELISPOT testi için aşağıda sıralanan çalışma protokolüne uygun olarak çalışıldı. EX VİVO ELISPOT PROTOKOLÜ 1. Anti-IFN- antikorla kaplanmış ELISPOT plakları herbir kuyucuğa 100µl hücre kültür medyumu eklenerek 37C de %5’lik CO2 etüvünde 1 saat inkübe edildi. 2. 10 ml tam kan steril falkon tüp içinde medyumla sulandırıldı. 20 ml sulandırılmış kan fikol üzerine yayıldı (15 ml’lik falkon tüpüne 5 ml). 22 dk süre ile 2000 devirde santrifuj edildi. 3. Fikol içindeki hücre tabakası pastör pipet ile medyum için alınıp 10 dk süre ile 1700 devirde santrifüj edildi. 62 4. Süpernatan hücrelerden ayrılıp medyum eklenip karıştırıldı. Sonra hücre sayımı için 10–50µl ayrılıp, tüpe 20 ml RPMI eklenerek 1200 devirde 7 dakika santrifüj edildi. 5. Hücre sayım işlemi otomatik sayım cihazı veya mikroskopi ile yapıldı. 6. Süpernatan hücrelerden ayrıldı, 2.5x106/ml hücre olacak şekilde medyum eklendi. 7. Hücreler hazırlandıktan sonra, ELISPOT plağındaki herbir çukura 100µl olacak şekilde hücre solüsyonunu eklendi. 8. Antijenler belirtilen oranda çukurlara çiftler halinde eklendi: 20µml/peptid çukur ESAT–6 ve CFP–10 2µml/çukur PPD 5µml/çukur PHA ve streptokinase-streptodornase Negatif kontrol çukurlarına hiçbir şey ilave edilmedi. 9. Plaklar 37C de %5’lik CO2 etüvünde bir gece inkube edildi. 10. 6 kez PBS/tween ile yıkama yapıldı. 63 11. İkinci antikor (direk olarak biotin işaretli alkalen fosfataz bağlanmış) 50µml/çukur içerisine eklenip oda sıcaklığında 90 dak. süre ile inkübe edildi. 12. 6 kez PBS/tween ile yıkandı. 50µl kromojen substrat herbir çukur içine eklenip oda sıcaklığında 10–15 dakika bekleyerek lekelerin oluştuğu gözlendi. 13. Plaklar musluk suyu ile yıkanarak reaksiyonlara son verildi. 14. Sayma işlemi için Oxford Üniversitesi Jhon Radcliffe Hospital, Nuffield Department of Clinic Medicine bölümünde ELISPOT optik okuyucu (AIDGmbH, Strassberg, Germany) kullanıldı. Pozitif RD1-ELISPOT testi: Spot sayısının, negatif kontrol çıkarıldığında ESAT–6 ve CFP–10 için > 40 spot, peptidler için > 20 spot ve ek olarak negatif kontrolün 2 katından fazla olası durmu olarak belirlendi. 300’den fazla spot içeren kuyucukların tam anlamıyla değerlendirilmesi yapılamamaktadır. Çünkü 300’den fazla spot olduğunda birbirleri ile birleşmektedirler. Bu nedenle bu testin üst sınırı bir milyon periferik kan mononükleer hücrelerinde 1000 hücre olarak kabul edilmektedir. Profilaksi verilen olgularda 6 ay ara ile ELISPOT testleri yapıldı. Testi oluşturan ESAT–6, CFP–10 antijenleri, bu antijenleri oluşturan peptidlerden oluşan 6 peptid kokteyli (POOL1,2,3,4,5,6) ve ek olarak PPD, PHA, SKSD ve negatif kontrolde meydana gelen değişiklikler hem pozitiflik, negatiflik açısından hem de T hücrelerince oluşturulan spot sayılarındaki değişim açısından incelendi. Zamana bağlı olarak T hücre özgün yanıtının azalıp azalmadığını araştırmak amacı ile de INH almayan ancak başlangıçta ELISPOT pozitif olan temaslıların 6. ay ELISPOT yanıtları da tekrarlanarak bulgular tekrarlandı. 64 Şekil 6’da şematize edilmiş RD1-ELISPOT testi yöntemi, Resim 2’de ELISPOT plağının görünümü ve Resim 3’te ELISPOT plağında oluşan noktaların görünümü verilmiştir. Şekil 6: Şematize edilmiş RD1-ELISPOT testi yöntemi 65 Resim 2: ELISPOT plağının görünümü Resim 3: ELISPOT plağında oluşan noktaların görünümü İstatistiksel analiz: Çalışmada elde edilen bulgular değerlendirilirken, istatistiksel analizler için STATA 7.0 (Stata Corporation Texas, USA) işletim programı kullanıldı. Çalışma verileri değerlendirilirken tanımlayıcı istatistiksel metodların (Ortalama, Standart 66 sapma) yanısıra niteliksel verilerin karşılaştırılmasında Ki-Kare testi ve McNemar testi, niceliksel verilerin karşılaştırılmasında Wilcoxon ranksum testi kullanıldı. Sonuçlar % 95 güven aralığında, anlamlılık p<0,05 düzeyinde değerlendirildi. Araştırma Etik Kurul Onayı: Çalışmamız b.30.MAR.0.01.00.02/aek/135 protokol no’lu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanan çalışmanın alt kolu olarak yürütüldü. T.C. Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığından gerekli izinler alındı. 67 BULGULAR Ocak 2003- Aralık 2004 tarihleri arasında 0–15 yaş arası, son 6 aylık dönemde balgam müsbet 433 erişkin akciğer tüberkülozlu birey ile ev içi teması olan 1024 çocuk takip edildi. İndeks olguların 426’sının (%98) balgam ARB teksifleri pozitifti. Bunların 256’sında (%59) kültürde M. tuberculosis üremesi oldu. İlk değerlendirmede temaslıların 12’sinde (%1,2) aktif tüberküloz hastalığı tespit edildi. Bu olguların 9’unda (%75) TCT pozitif iken, 11 olguda (%92) RD1-ELISPOT testi pozitifti ve RD1ELISPOT testi negatif olan bir olgunun TCT de negatifti. Tablo XIII’te TB hastalığı tespit edilen temaslıların epidemiyolojik ve klinik özellikleri özetlenmiştir. Tablo XIII: İlk başvuruda tüberküloz hastalığı tespit edilen temaslıların epidemiyolojik ve klinik özellikleri Hasta Cinsiyet BCG RD1 Yaş TCT Organ TB (ay) sonucu tutulumu tanısı no K/E skarı ELISPOT 489 10 E Var Negatif Negatif Pulmoner C+R 535 168 E Yok Negatif Pozitif Pulmoner C+R 776 18 K Yok Negatif Pozitif Pulmoner K+R 975 24 E Yok Pozitif Pozitif Pulmoner K+R 532 36 E Yok Pozitif Pozitif Pulmoner C+R 531 48 K Yok Pozitif Pozitif Pulmoner C+R 773 84 K Yok Pozitif Pozitif 542 96 K Var Pozitif Pozitif 772 120 E Var Pozitif Pozitif Pulmoner (milier) Pulmoner (plörezi) Pulmoner K+R C+R C+R 68 28 132 K Yok Pozitif Pozitif Pulmoner K+R 536 144 E Yok Pozitif Negatif Pulmoner C+R 626 48 K Yok Pozitif Pozitif Pulmoner C+R C: Klinik, R:Radyolojik, K: Kültür Diğer temaslı 1012 olgunun 380’ine (%37,5) INH profilaksisi verilmesi uygun görüldü. Çalışma popülasyonunu bu olgular oluşturuyordu. Ek olarak profilaksi verilmeyen, RD1-ELISPOT testi pozitif ve TCT negatif 38 temaslı da kontrol grubunu oluşturdu. Ev içi temaslı profilaksi verilen 380 çocuğun yaşları 1 ay ile 180 ay arasında değişmekte olup ortalama yaş 91,67±51,53 aydı. Temaslıların 240’ı (%52,6) kız, 180’i (%47,4) erkekti. Kontrol grubunu oluşturan 38 çocuğun yaşları 106,6843,21 aydı. Bu grubun 21’i (%55,3) kız, 17’si (%44,7) erkekti. Test Sonuçlarının Değerlendirilmesi: Temaslıların ilk başvuruda 313’ünde (%82,4) TCT pozitif bulunurken, RD1ELISPOT testi ilk başvuruda 279 (%74,0) olguda pozitif tespit edildi. Her iki testle de pozitif olan 261 (%83,4) olgu vardı ve olguların 47’si (%12,4) her iki testte de negatif tespit edildi. 69 Tablo XIV: Profilaksi alanların ilk ve 6. ay RD1-ELISPOT pozitifliğinin değerlendirilmesi İLK ELISPOT P0ZİTİF (%) NEGATİF (%) 279 (74,0) 98 (26,0) Mc Nemar Test p 0,2831 6. AY ELISPOT 293 (77,1) 87 (22,9) Çalışma grubunda ilk başvuruda RD1-ELISPOT testi pozitifliği görülme oranı ile 6. ayda RD1-ELISPOT pozitifliğinin görülme oranları arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. İlk başvuruda olguların %74’ünde RD1-ELISPOT pozitifken; 6. ayda bu oran % 77’ ye yükselmiştir (Tablo XIV). Tablo XV: Kontrol grubunun ilk ve 6. ay RD1-ELISPOT pozitifliğinin değerlendirilmesi P0ZİTİF (%) NEGATİF (%) İLK ELISPOT 38 (100) 0(0) 6. AY ELISPOT 18 (47,4) 20(52,6) Mc Nemar Test p <0.0001 70 Kontrol grubunda ilk başvuruda RD1-ELISPOT pozitifliği görülme oranı ile 6. ayda RD1-ELISPOT pozitifliğinin görülme oranları arasındaki fark istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı bulunmuştur. İlk başvuruda olguların %100’ünde RD1-ELISPOT pozitifken, 6. ayda bu oran %47,4’e düşmüştür (Tablo XV). Tablo XVI: TCT durumuna göre ilk başvuruda RD1- ELISPOT değerlerinin dağılımı TCT İlk ELISPOT Pozitif (%) Negatif (%) Pozitif (%) 261(%83,4) 52(%16,6) Negatif (%) 19(%28,8) 47(%11,2) Ki-Kare: 84,197 p:0,001 p< 0,05 TCT pozitifliği ile ilk başvurudaki RD1-ELISPOT pozitifliği arasında istatistiksel olarak ileri derecede ilişki tespit edilmiştir. TCT pozitifliği varlığında RD1ELISPOT pozitifliği çok yüksek oranda görülmekte; TCT negatif olgularda ise RD1ELISPOT negatifliği yüksek oranda görülmektedir (Tablo XVI). 71 Tablo XVII: Profilaksi verilen grupta 6 aylık takip sonucunda RD1-ELISPOT§ Testine profilaksinin etkisi Antijen n INH Proflaksisi Öncesi INH Proflaksisi sonrası Median Min-Max Ortalama SD No (%) Pozitif Median Min-Max Ortalama SD No (%) Pozitif Antijen spesifik T hücre sayıları için p Değerleri Pozitif test için p değerleri PPD 379 286 0-1250 341 265 337 (89) 212 0-1088 264 236 309 (81) <0.0001 0.0011 ESAT–6 374 49 0-922 134 180 187 (50) 34 0-758 92 133 164 (43) <0.0001 0.0164 CFP–10 378 44 0-1066 144 222 180 (47) 22 0-884 93 152 144 (38) <0.0001 0.0044 POOL1 378 10 0-778 60 104 154 (41) 0 0-438 35 61 119 (31) <0.0001 0.0003 POOL2 378 6 0-760 37 91 76 (20) 4 0-548 24 72 42 (11) <0.0001 <0.0001 POOL3 378 16 0-784 78 137 146 (39) 14 0-652 55 95 155 (41) 0.002 0.4042 POOL4 378 8 0-1210 45 120 97 (26) 4 0-406 22 50 76 (20) <0.0001 0.0167 POOL5 377 16 0-956 71 140 155 (41) 10 0-1056 43 96 117 (31) <0.0001 0.0001 POOL6 376 19 0-1004 104 184 166 (44) 12 0-1004 64 121 139 (37) <0.0001 0.0016 PHA 379 584 0-1250 584 284 NA 464 0-1286 456 239 NA <0.0001 NA SKSD 378 92 0-1004 147 174 242 (64) 30 0-970 107 173 160 (42) <0.0001 <0.0001 72 NEG 379 2 0-188 7,0 19 NA 2 0-310 5 18 NA <0.0001 NA *Wilcoxon ranksum test. ** McNemar test § NA: Uygulanabilir değil. Çünkü negatif ve pozitif kontrol sonuçları referans değerleridir. INH proflaksisi alan grupta ELISPOT cevabındaki değişim : %74’ten (n:279) %77’ye (n:293) yükselmiştir. McNemar p:0,28 73 Tablo XVIII: Başlangıçta ELISPOT pozitif TCT negatif olan temaslılarda 6 aylık takip sonrası RD1-ELISPOT§ cevabındaki değişim Antijen n INH Proflaksisi Öncesi INH Proflaksisi sonrası Median Min-Max Ortalama SD No (%) Pozitif Median Min-Max Ortalama SD No (%) Pozitif Antijen spesifik T hücre sayıları için p Değerleri Pozitif test için p değerleri PPD 38 46 0-820 93 144 19 (50) 37 2-966 86 173 15 (39) 0.2828 0.1573 ESAT–6 38 35 0-268 51 50 16 (41) 10 0-82 13 15 1 (3) <0.0001 0.0001 CFP–10 38 30 0-644 64 116 12 (32) 17 0-154 24 32 5 (13) 0.0076 0.0348 POOL1 38 8 0-166 17 29 6 (16) 3 0-22 5 6 0 (0) 0.0012 0.0143 POOL2 38 8 0-42 11 12 4 (11) 2 0-30 4 6 0 (0) 0.0060 0.0455 POOL3 38 6 0-58 13 14 4 (11) 3 0-582 65 149 10 (26) 0.8556 0.0833 POOL4 38 8 0-150 23 31 11 (29) 2 0-24 11 36 2 (5) 0.0029 0.0126 POOL5 38 8 0-66 14 17 7 (18) 2 0-140 9 26 2 (5) 0.0147 0.0588 POOL6 38 10 0-148 20 31 6 (16) 4 0-142 10 24 3 (8) 0.0068 0.2568 PHA 38 555 66-1160 566 273 NA 454 80-1030 458 217 NA 0.0857 NA SKSD 38 169 2-964 255 251 29 (76) 71 0-956 140 194 21 (55) 0.0029 0.0325 74 NEG 38 6 0-30 7 7 NA 2 0-24 4 5 NA 0.0388 NA *Wilcoxon ranksum test. ** McNemar test § NA: Uygulanabilir değil. Çünkü negatif ve pozitif kontrol sonuçları referans değerleridir. INH proflaksisi almayan grupta ELISPOT cevabındaki değişim : %100’den (n:38) %47,4’e (n:18) düşmüştür. McNemar p<0,0001 Tablo XIX: Takiplerimiz sırasında tüberküloz hastalığı geliştiren olguların özellikleri 75 Hast a Cinsiyet BCG Yaş (ay) no TCT sonucu K/E skarı İlk ELISPO T 6. ay ELISPO T INH Profilaksisi Organ TB tanısı Tutulumu 66 42 K Yok Negatif Negatif Pozitif 4 ay pulmoner C+R 174 48 K Yok Negatif Pozitif Pozitif 4 ay pulmoner C+R 290 36 E Yok Negatif Pozitif Pozitif 4 ay pulmoner C+R 472 48 E Var Pozitif Pozitif Pozitif 6 ay pulmoner C+R 573 36 K Var Pozitif Pozitif Pozitif 4ay pulmoner C+R 138 12 E Yok Negatif Pozitif Pozitif 4 ay Pulmoner (milier) K C: Klinik, R: Radyolojik, K: Kültür Çalışmamızda profilaktik tedavi verdiğimiz 380 olgunun 6’sında (%1,6) takiplerimiz sırasında TB hastalığı gelişmiştir. Bu olguların 2’sinde (%33,3) başlangıçta TCT pozitifken, 5’inde (%83,3) RD1-ELISPOT testi pozitifti. 6. ay kontrollerinde ise takiplerimiz sırasında TB tanısı almış olan tüm vakalarımız RD1-ELISPOT testi ile pozitif olarak tespit edildi. Bu olguların özellikleri Tablo XIX’da verilmiştir. 76 TARTIŞMA Son yıllarda yapılan çalışmalarda ELISPOT testi ile ESAT–6 ve CFP-10’a pozitif cevabın yakın zamanda TB basili ile enfekte olmuş kişileri ayırt ettiği gösterilmiştir (114,115,116,117). Çalışmamızda son 6 aylık dönemde ARB teksif müsbet indeks vaka ile ev içi temaslı INH profilaksisi alan çocuklarda TB enfeksiyonu seyri ELISPOT testi ile değerlendirilmiştir. Ek olarak ELISPOT testi pozitif, TCT negatif olan INH profilaksisi almayan 38 kişilik bir temaslı grubu da kontrol grubunu oluşturmuştur. Kontrol grubu oluşturulurken TCT pozitifliğine neden olması muhtemel TB enfeksiyonu dışı nedenlerin yok edilebilmesi açısından bu grup seçilmiştir. Başvuru anında temaslı çocukların tüberküloz hastalığı açısından değerlendirilmesi: Tüberküloz hastası ile ev içi teması olan bireylerin değerlendirilmesi TB hastalığının toplumda kontrolü açısından oldukça önemlidir. Amerikan Halk Sağlığı Servisi 1962 yılında 479 TB hastasının aile temaslılarını incelemiş, olguların %1,9’unda aktif TB hastalığı tespit etmiştir (118). Wang ve arkadaşları 3903 TB hastası ile teması olan 11873 bireyi incelemişler; bunların %6,2’sinde ilk değerlendirme sonrasında aktif TB hastalığı saptamışlardır (119). Ülkemizden Kolsuz ve arkadaşlarının yapmış oldukları çalışmada 60 TB vakası ile temaslı 223 kişi incelenmiş ve ilk kontrolde 4 (%1,8) kişide TB saptanmıştır (120). Aynı araştırmacının temaslıların 10 yıllık retrospektif olarak değerlendirildiği başka bir çalışmasında ise ilk kontrolde hasta bulma oranı %2,6 olarak gerçekleşmiştir (121). 77 Sarımurat ve arkadaşlarının 15 yaşın üzerindeki temaslılarda yaptıkları çalışmada TB hastası bulma oranı ilk kontrolde % 3,0 olarak saptanmıştır (122). Çalışmamızda incelenen 1024 temaslının başvuru anında 12’sinde (%1,2) aktif TB hastalığı tespit edildi. Yukarıdaki çalışmalarda incelenen temaslı popülasyonu çocuk ve erişkinlerden oluşmaktayken, bizim çalışmamızda değerlendirilen grubun yaş dağılımı 0–15 yıl arasındadır. Bu nedenle bahsi geçen çalışmalardaki oranlardan daha düşük bir oranda hasta buluyor olmamız doğal kabul edilebilir. Başvuru anında tüberküloz hastalığı olan temaslıların test sonuçları açısından değerlendirilmesi: Lalvani ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada bakteriyolojik olarak kanıtlanmış TB hastalığı olan 47 olgunun 45’inde ESAT–6 ex vivo ELISPOT testi pozitif bulunmuş ve testin duyarlılığı bu hasta grubunda %96 %95 güven aralığında (CI), 92-100 olarak bildirilmiştir. Aynı çalışmada nontüberküloz hastalığı olan bireylerin oluşturduğu kontrol grubundaki 47 vakanın 36’sı (%77) BCG aşılı olmasına rağmen sadece 4 tanesi ESAT–6 ex vivo ELISPOT testine pozitif cevap vermiş ve bu teste cevap vermiş olanların sadece 1 tanesi BCG pozitif bulunmuştur ki böylece testin özgüllüğü de %92 (%95 CI, 86–97) olarak belirlenmiştir. Yine aynı çalışmada TB hastalığı olan 26 hastaya TCT yapılmış ve bunların 18’i (%69) pozitif bulunmuştur. Bu 26 hastanın 24’ü (%92) ESAT–6 ex vivo ELISPOT testine pozitif yanıt vermiştir. Bu çalışmada TCT’nin sensitivitesi %69 olarak bulunurken, ESAT–6 ex vivo ELISPOT testinin sensitivitesi %96 olarak tespit edilmiştir ve iki tanı yöntemi arasında istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı fark bulunmuştur (p=0,003) (68). Arend ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada TB tanısı alan 37 hastanın 34’ü (%92) ESAT-6’ya, 33’ü (%89) CFP-10’a ve 32’si (%95) her iki antijene IFN-γ yanıtı oluşturmuşlardı. Ayrıca ESAT–6 ve CFP–10’a cevaplar yaş ve cinsiyetten bağımsız bulunmuştu (70). 78 Ulrichs tarafından yapılan başka bir çalışmada 16 sağlıklı (8 aşılı,8 aşısız), 12 aşısız son 6 aylık dönemde TCT konversiyonu tespit edilmiş ve tedavisi başlamış temaslı ve henüz tedavisi başlamamış 15 TB hastası ELISPOT pozitifliği açısından incelenmiştir. ELISPOT testi 12 temaslının 10’unda (%83,3), 15 TB hastasının 8’inde (%53,3) yanıt verirken, sağlıklı hiçbir olguda pozitif yanıt vermemiştir. Ek olarak 15 TB hastasının 11’inde testi oluşturan hücrelerin sayısı daha yüksek bulunmuştur. TCT negatif sağlıklılarda tespit edilen düşük IFNγ seviyeleri geçirilmiş TB infeksiyonunu, latent tüberkülozu veya PPD cevabı ile henüz değerlendirilemeyecek seviyedeki M. tuberculosis infeksiyonunu gösteriyor olabilir şeklinde yorumlanmıştır. Bu çalışmanın sonucu olarak TB hastalarında ve temaslılarda ESAT-6’ya karşı IFN-γ salgılayan hücrelerin sayısının arttığı tespit edilmiştir ve bu vakaların tespitinde ESAT–6 kullanılabilirliği vurgulanmıştır (74). Ravn ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada da Etiyopya’dan ve Danimarka’dan TB hastalarının immün sisteminin ESAT–6’yı tanıma oranları sırası ile %35 ve %56 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca Etiyopya’dan TB hastası ile temaslı sağlıklı bireylerin %58’ i de pozitif yanıt vermiştir. Tedavi altında ESAT–6 pozitif Danimarkalı vakaların büyük kısmı 6 aylık takip süresi sonunda pozitif kalmış, benzer durum ESAT–6 negatif vakalar için de geçerliliğini korumuştur. Bu çalışmada ayrıca şöyle bir yorum mevcuttur; bu iki gruba Amerika (Lein D. ve arkadaşları, yayınlanmamış veri) ve Kuveyt’ten iki çalışmanın da vakaları eklendiğinde, - Kuveyt ve Etiyopya’ dan katılan hastalar genellikle ileri hastalığa sahipken, Danimarka ve Amerika’dan alınanlar hafif hastalığa sahipti- görülmüştür ki PPD’ye yanıt verenlerin cevabı %54 ile %100 arasında değişmekte olup (in vitro yanıt), Etiyopya ve Kuveyt’ ten PPD’ye cevap verenlerin sıklığı %54-65 arasında, Danimarka ve Amerika’da ise %85-100 arasındadır. ESAT-6’ya cevap verenler her iki durumda da PPD’ye cevap verenler içinde yer almakta ve PPD pozitif vakaların %55-84’ü ESAT-6’ya cevap vermiş bulunmaktadır. Bu 4 çalışmadan elde edilen veriler ele alındığında PPD pozitif vakalar arasından ESAT–6’ya cevap verenlerin oranı ortalama %65’tir (56,72). Etiyopya gibi TB açısından yüksek endemik olan bölgelerde ESAT–6’nın temaslı taraması amacı ile kullanımı latent tüberküloz infeksiyonlu birçok kişinin saptanmasını sağlayabilir. Temaslıların %5’inin 2 yıllık süre dahilinde TB hastalığı geliştirecekleri öngörülmektedir ve olasılıkla ESAT–6 pozitiflerin daha yüksek bir oranı hastalık geliştirecektir (123). Önemli olan ESAT–6 pozitif sağlıklı kişilere profilaktif kemoterapi 79 verilmesinin hastalık gelişimini engelleyip engellemediğidir şeklinde yorum yapılmaktadır. Burada bahsi geçen ELISPOT pozitif olanların daha yüksek bir oranı hastalık geliştirecektir şeklindeki yorum Doherty ve Demissie’nin çalışmasında ispatlanmış durumdadır (124). Bizim çalışmamızda da ELISPOT pozitif olup profilaksi alan temaslılar incelenmiş ve 6 aylık izlem sonucunda profilaksiye rağmen 6 olguda TB hastalığı gelişmiştir. Cardoso ve arkadaşlarının yapmış oldukları çalışmada ise TB hastalarının 36’sı (%60) ESAT-6’ya yanıt vermiştir. Bu çalışmada ek olarak, TCT pozitif olan sağlıklı vakaların incelenen antijenlerin her birine (ESAT–6, PPD ve Ag85B) karşı oluşan IFN-γ cevabı istatistiksel olarak anlamlı daha yüksek bulunmuştur (p<0,05) (125) . Çalışmamızda TB hastalığı saptanan 12 çocuğun 9’unda (%75) TCT pozitifken, RD1ELISPOT testi 11’inde (%92) pozitif bulundu. Her iki testle de pozitif olan 6 (%50) vaka mevcuttu. Olgularımızın ELISPOT ve TCT durumlarının değerlendirilmesi: Lalvani ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada TCT pozitif olan ve TB hastası ile ev içi teması olan 26 sağlıklı bireyin 22’sinde (%84,6) ESAT–6 yanıtı pozitif iken diğer sağlıklı ve temas öyküsü olmayan 26 olgunun hiçbirinde ESAT–6 yanıtı pozitif bulunmamıştır (68). Pathan ve arkadaşlarının çalışmasında ESAT–6 yanıtları farklı olgu gruplarında incelenmiştir. TB lenfadenitli 11 hastanın 10’unda (%90,1), kültür negatif 8 pulmoner TB’lu hastanın 7’sinde (87,5), kültür müspet 25 pulmoner TB’lu hastanın 23’ünde (%92) ve kültür müspet pulmoner TB’lu hasta ile ev içi teması olan TCT pozitif sağlıklı 27 bireyin 23’ünde (%85,1) ESAT–6 yanıtları pozitif olarak bulunmuştur. Bunun yanında kontrol grubu olarak aldıkları ve TB temas öyküsü olmayan sağlıklı 32 bireyin (bunlardan 28’inin BCG aşılı olduğu biliniyor) hiçbirinde ESAT–6 yanıtı pozitif olarak bulunmamıştır (126). 80 Hindistan ve Gambia’da yapılan iki çalışmada TB temaslılarda ESAT–6 cevabı sırası ile %80 ve %30 olarak bulunmuştur (127,128). Çalışmamızda da yukarıda ki çalışmalara benzer şekilde, 380 temaslının 313’ünde (% 82,4) TCT pozitifti. Ayrıca, TCT pozitif olan bu 313 temaslının 261’inde (%83,3) RD1ELISPOT testi pozitif bulundu. Bu sonuç diğer çalışmalarla benzerlik göstermektedir. Takiplerimiz sırasında tüberküloz hastalığı geliştiren çocukların değerlendirilmesi: Plasebo kontrollü çalışmalar 6–12 aylık INH tedavisinin enfekte bireylerde aktif TB gelişme riskini %80’den fazla azalttığını göstermiştir (129,130). INH profilaksisinin koruyucu etkisi ile ilgili geniş kapsamlı çalışmalar ise 1955 yılından itibaren yapılmaya başlanmış ve Ferebee 1970’te USPHS isoniazid koruyucu tedavi denemelerinin bir derlemesini yapmıştır. Yeni olguların ev içi temaslılarını içeren ve 12 ay süreyle günde 5-6mg/kg INH alınmasını gerektiren çalışmada 12439 profilaksi alan temaslının 18’inde (%0,1) ve plasebo grubunu oluşturan 12594 temaslının 78’inde (%0,6) TB hastalığı gelişmiştir (91). Ülkemizden Kolsuz ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada ilk başvuruda 223 temaslının 4’ünde (%1,8) TB hastalığı tespit edilmiş ve 137 temaslıya (%61,5) profilaktik tedavi verilmiştir. Temaslıların 6 aylık izlemi sonucunda 3. ayda 1 kişide(%1,2), 6. ayda 3 kişide (%4,2)olmak üzere izlem sonunda 4 kişide (%4,9) TB hastalığı saptanmıştır. Bu çalışmada TB hastalığı saptanan temaslıların hepsi 15 yaşın üzerindedir. Profilaksi alan temaslıların hiçbirinde aktif hastalık saptanmamış, ancak profilaksi almayan grupta %4,9 aktif hastalık saptanmıştır. Tüm temaslılar değerlendirildiğinde ise ilk 6 ayda 8 (%3,6) vakada TB hastalığı bulunmuştur (120). 81 Sarımurat ve arkadaşlarının 15 yaşın üzerindeki temaslılarla yaptıkları çalışmada, TB hastası bulma oranı ilk kontrolde %3,9; ikinci kontrolde %3,0; son kontrolde %0 ve tüm temaslıların değerlendirilmesinde de %4,5 olarak saptanmıştır (122). Çalışmamızda profilaktik tedavi verdiğimiz 380 olgunun 6’sında (%1,6) takiplerimiz sırasında TB hastalığı gelişmiştir. Takiplerimiz sırasında TB hastalığı geliştiren bu 6 temaslının 2’sinde (%33,3) TCT pozitifken, RD1-ELISPOT testi 5’inde (%83,3) pozitif bulundu. Her iki testle de pozitif olan 2 olgu vardı. Bu olguların özellikleri Tablo XVII’de verilmiştir. Temaslı tüm olgular göz önüne alınacak olursa toplam 18 (%1,8) olguda ilk 6 ayda TB hastalığı tespit edilmiştir. Kontrol grubumuzu oluşturan 38 vakanın hiçbiri (%0) 6 aylık takip sonucunda TB hastalığı geliştirmemiştir. Doherty ve Demissie’nin çalışmasında 24 temaslı 2 yıl boyunca takip edilmiş ve bunlardan hiçbirinin ilk başvuruda yapılan tetkiklerle TB hastası olmadığı tespit edilmiştir. Temaslılar ortalama 2 yıl sonra tekrar değerlendirilmişler ve 12’sinin (%50) halen sağlıklı olduğu tespit edilmiştir. Diğer 12 temaslının 7’si (%59) TB hastalığı geliştirmiş, 5 tanesi de (%41) TB dışı hastalık olarak nitelendirilmiştir. Bu çalışmada daha sonra hastalık geliştirenlerin tamamının (%100) PPD’ye yanıt verdiğini (in vitro yanıt), ancak diğer 17 hastanın 14’ünün (%83) de aynı şekilde PPD’ye pozitif yanıt verdiğini bulmuşlardır. Buna karşılık daha sonra TB hastalığı geliştiren 7 temaslının 6’sı (%86) çalışma başlangıcında ESAT–6’ ya pozitif yanıt vermiş, diğer grupta ise sadece 3 temaslı (%18) pozitif bulunmuştur. İlginç olarak bu 3 temaslının 2’si semptomları olan ancak TB hastası oldukları kanıtlanamayan gruptadır. Sonuç olarak PPD’ye cevaptan farklı olarak ESAT–6’ya cevap büyük oranda TB geliştiren grupla sınırlı kalmıştır (r<0,0001) (124). Bu sonuçlar ESAT-6’ya in vitro cevabın sağlıklı TB temaslılarında tüberküloza progresyonu belirlemek açısından oldukça yüksek ilişkili olduğunu göstermektedir. Buna zıt olarak periferik kan mononükleer hücreleri bu antijene cevap vermeyen temaslılar maruziyet altında kalmış olsalar dahi inceleme süresi dahilinde sağlıklı kalmışlardır. Bu bulgudan yola çıkarak ESAT-6’ya immün cevabın subklinik infeksiyonu göstermek açısından yararlı olduğu sonucu çıkarılabilir. 82 Çalışmamızda ise takipleri sırasında TB hastalığı geliştiren vakaların 2 tanesinin (% 33) TCT pozitifti. TCT negatif olan 4 (%67) vakanın 2’si in vitro PPD’ye pozitif yanıt verdi. İlk başvuruda hem TCT hem de in vitro PPD testi ile negatif yanıt veren bir olgunun 6. ay kontrolünde in vitro PPD yanıtı pozitifleşmişti. Hastalık geliştiren 5 (%83) temaslının ilk başvuru RD1-ELISPOT tetkikleri pozitif olup, 6. ay kontrollerinde tamamının (%100) RD1ELISPOT tetkikleri pozitif olarak tespit edildi. Sonuç olarak bizim çalışmamızda da Doherty ve Demissie’nin çalışmasında olduğu gibi ESAT–6 testinin subklinik enfeksiyonu tespit etmede oldukça faydalı olduğu gözlendi. Temaslıların ELISPOT ölçümleri ve INH profilaksisi alma durumu ile ilişkisi: Pathan ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada temaslıların ESAT–6 spesifik CD4 T hücre cevapları kültür negatif TB hastalarınınkinden ileri derecede anlamlı yüksek (p=0.009), kültür pozitif TB hastalarınınkinden ise anlamlı yüksek (p=0.044) bulunmuştur. Kültür negatif pulmoner TB hastalarının CD4 T hücre frekanslarının düşüklüğü hastalık ilişkili non spesifik immün baskılanmaya bağlı olsa, tedavi ile spesifik T hücre frekanslarında yükseliş beklenir hipotezi ortaya atılarak çalışmaya katılan TB hastalarının 12’si takip edilmiş ve ortalama 18,6 haftalık tedavi süresi sonrasında tüm ESAT–6 peptid spesifik T hücre frekanslarında % 95 güven aralığında (CI) 0,62 oranında (0,37–0,76) azalma tespit edilmiştir. Bu azalma başlangıç değerinin %38’ine eşittir. Haftalık azalma oranı %5,5’tir (%95 CI, 2,4–8,4). Böylece ESAT–6 spesifik T hücrelerinin bu kişilerde M. tuberculosis basilinin in vivo varlığı ile ilişkili olduğu varsayımı doğrudur şeklinde bir sonuca varılmıştır (126). Carrara ve arkadaşlarının çalışmasında da mikrobiyolojik olarak ispatlanmış TB olan 18 hastanın tedavi başlangıcında ESAT–6 peptidlerine ve PPD’ye ELISPOT cevapları incelenmiş ve tamamı pozitif bulunmuştur. Bu vakalardan 3 ay düzenli TB tedavisine yanıt alınanlarda ESAT–6 peptidlerine ELISPOT cevabının kaybolduğu ancak tedaviye yanıt vermeyen 5 vakada cevabın halen devam etmekte olduğu gösterilmiştir (p<0,0001) -makalede gösterilmemiş olmakla birlikte ayrıca bu 5 vakanın tedavilerinin 6. ayında klinik yanıt vermiş oldukları ve ELISPOT değerlerinin de negatifleştiği belirtilmiştir-. Üçüncü ay kontrolünde PPD’ye ELISPOT ile pozitif cevap veren hastaların sonuçlarında tedavi sonrasında anlamlı değişim tespit edilmemiştir(131). Beklenen ESAT–6’nın metabolik olarak aktif yaşayan 83 tüberküloz basilleri tarafından salgılanıyor olmasıdır (132). Dolayısı ile basillerin aktif olarak replike oldukları dönemde ESAT-6’ya spesifik IFN- salgılayan T hücrelerinin sayısının yüksek olması doğaldır. Ancak yeterli tedavi sonrasında M. tuberculosis replikasyonu duracak ve dolayısı ile T hücre sayıları düşecektir varsayımı da bu çalışmada elde edilen sonuçlarla doğrulanmıştır. Cardoso ve arkadaşlarının Brezilya’da yaptıkları çalışmada tedavi edilen ve edilmeyen hastalar ile kontrol grubu ele alındığında IFN- düzeyleri açısından TB hastaları ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark elde edilirken (kontrol grubundaki değerler daha düşük olarak tespit edilmiş), TB hastalığı olan vakalar arasında (tedavi alanlar ve henüz tedavisi başlamamış olanlar) IFN- düzeyi açısından fark bulunmamıştır (125). Nicol ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada ise kesin veya olası TB tanısı ile tedavisi başlamış olan 42 çocuk TB vakasının 1. ay kontrollerinde ELISPOT ile median PPD cevabı tanıdan daha yüksek oranda tespit edilmiştir (p=.0004). ESAT–6 ve CFP-10’un median cevapları ise ilk ayda farklılık göstermemiştir. Ayrıca istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birlikte TB tanısı kesin olan grupta cevabın daha yüksek olması yönünde bir eğilim tespit edilmiştir. Bu çocuklardan 10 vakanın 3. ve 6. ay takipleri de yapılabilmiş ve başlangıçta bir aylık tedavi sonrası tespit edilen yükselişin akabinde tedavinin 3. ve 6. ayında antijen cevaplarında düşüş tespit edilmiştir (tekrarlanan ölçümler ANOVA PPD için p=.003; ESAT–6 için p=.039 ve CFP–10 için p=.0697) (133). TCT negatif sağlıklı temaslı çocuklarda ESAT–6, CFP–10 ve PPD antijenlerinin her birine cevaplar hastalıklı gruba göre anlamlı düşük bulunmuştur (p<.0001). Negatif TCT sonucu olan sadece 2 çocuk ESAT-6’ya pozitif cevap vermiştir ve hiçbirinin CFP–10 cevabı pozitif değildir. Hill ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada balgam yayma pozitif 188 TB hastası ile temaslı 1382 sağlıklı olgu incelenmiş; 1052 (%89) vakaya ELISPOT testi yapılmıştır. Bunların 313’ünde (%30) ESAT–6/CFP–10 ELISPOT sonuçları pozitif bulunmuştur. PPD test sonuçları ESAT–6/CFP–10 pozitif vakalarda negatiflere göre anlamlı daha yüksek tespit edilmiştir. Bu çalışmada ek olarak indeks vaka ile birlikte geçirilen zaman artışına paralel 84 olarak PPD ELISPOT sayısında da istatistiksel olarak anlamlı artış olduğu tespit edilmiş (p= 0.009) ve bunun da mikobakteri yükü ile paralellik gösterdiği varsayılmıştır. Buna istinaden INH profilaksisinin T hücre sayılarını düşüreceği hipotezi ile profilaksi verilen 300 TB temaslısı araştırmacılar tarafından takibe alınmıştır (134). Çalışmamızda profilaksi verdiğimiz 380 temaslının tüm antijenlere ve tüm peptidlere cevabı oluşturan T hücre sayıları 6. ayın sonunda ilk başvurularına göre anlamlı derecede düşüş gösterdi. Ek olarak POOL3’ü oluşturan peptidlere cevap dışında (p=0,4042) tüm antijen ve peptid cevaplarında ELISPOT ile anlamlı düşüş vardı (Tablo XVII). Ancak RD1-ELISPOT test pozitifliği ele alındığında ilk başvuru ile 6. ay kontrolü arasında profilaksi verilen bu grupta, test pozitifliği açısından anlamlı fark tespit edilmedi (p=0,2831). RD1-ELISPOT testi pozitif olup, TCT negatif olan ve INH profilaksisi verilmeyen 38 kişilik grupta ise PPD’ye ve POOL3’ü oluşturan peptidlere yanıt veren T hücre sayısında ilk ve 6. ay arasında anlamlı farklılık yoktu (PPD için p=0.283; POOL3 için p=0.856). Ancak diğer tüm antijen ve peptidlere yanıt veren T hücre sayılarında anlamlı düşüş vardı. Ayrıca ELISPOT ile PPD’ye ve POOL3’e ve POOL6’ya pozitif cevapta da anlamlı değişim tespit edilmedi (PPD için p=0.157; POOL3 için p=0.083; POOL6 için p=0.257) (Tablo XVIII). Fakat diğer peptid ve antijenlerde ELISPOT ile anlamlı düşüş vardı. RD1-ELISPOT test pozitifliği incelendiğinde ise, ilk başvuru ile 6. ay kontrolü arasında profilaksi almayan bu grupta test pozitifliği açısından ileri derecede anlamlı düşüş tespit edildi (p<0,0001). Profilatik tedavi sonrası ELISPOT testinin pozitif devam etmesi ancak değerlerin düşüş göstermiş olması dorman basillerin halen antijen salgılıyor olmalarından kaynaklanabilir. İkinci bir ihtimal olarak ta gerçekte salgılanan antijenler olan Esat–6 ve CFP– 10 hücre sitoplazmasında da yoğun miktarda bulunduklarından hücre lizisi sonucu periferik kana karışmış olabilir. Zira hastaların altıncı ay kontrol kanları profilaksi tedavilerinin bitiminde alınmıştır. Bu varsayımın geçerliliğinin değerlendirilebilmesi için ikinci altı aylık periyotta test sonuçlarındaki değişiklikler incelenmelidir. Profilaksi verilmeyen TCT negatif olguların oluşturduğu grupta PPD’ye verilen cevabın azalma eğilimi olmakla birlikte anlamlı değişim göstermemiş olması bu grubun 85 sayısının azlığı nedeniyle olabileceği gibi INH profilaksisinin özellikle PPD antijeni ile ilişkili bir mekanizmayı etkilemesinden de kaynaklanabilir. Bunun nedeninin belirlenmesi için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. T hücre sayısının antijen yüküne paralellik gösterdiği çalışmalarla gösterilmiştir. Dolayısıyla T hücrelerinin azalması antijen yükünün azaldığı anlamına gelir. TCT pozitifliğinin elde edilebilmesi için belli bir antijen yüküne ulaşılmış olması gerekmektedir. Gerçekten de ELISPOT pozitif, TCT negatif olan grupta T hücre sayıları diğer temaslılardan daha düşük bulunmuştur. Zaman içinde hücre sayılarındaki azalış immün sistemin bu kişilerde düşük antijen yükünü yok edip enfeksiyonu baskıladığı anlamına gelebilir. SONUÇLAR 1- RD1-ELISPOT testi profilaksi alan ve almayan temaslılarda 6 aylık takip sonucunda farklı sonuçlar vermiştir: a) RD1-ELISPOT testi tüberküloz geliştiren vakaları TCT’ye oranla daha doğru bir şekilde tespit etmiştir. RD1-ELISPOT ile vakaların %83’ü tespit edilirken TCT ile sadece %33’ü tespit edilmiştir. b) RD1-ELISPOT testinin subklinik enfeksiyonu tespit etmede oldukça faydalı olduğu saptanmıştır ve klinik pratikte TCT yerine başarıyla kullanılabilir. c) Her iki grupta da zaman içinde her bir antijene cevap veren T hücre sayılarında düşüş tespit edilmiştir. 86 d) Profilaksi alan grupta (380 kişi) RD1- ELISPOT testi pozitifliğinde zaman içinde azalma görülmekle birlikte bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. e) Profilaksi almayan ve başlangıçta tamamı RD1-ELISPOT testi ile pozitif olan ancak TCT negatif olan grupta ise (38 kişi), test pozitifliğinde zaman içinde anlamlı düşüş tespit edilmiştir. f) Her iki grupta da PPD antijenine cevap veren T hücre sayılarında azalma görülmekle birlikte profilaksi alan grupta bu azalma istatistiksel olarak ileri derecede anlamı bulunurken, profilaksi almayan grupta anlamlı değildir. g) Profilaksi alan grupta, tedaviye rağmen tüberküloz hastalığı gelişmiş olmasına rağmen alamayan grupta gelişmemiş olması bu antijenlerin, özellikle de PPD antijenin hastalığa gidişte etkili olabileceğini düşündürmektedir. 2- RD1-ELISPOT testinin klinikte kullanımı için standardize edilmesi, maliyetinin düşürülmesi ve hastalığa gitme olasılığı daha yüksek olan vakaları tespit amacı ile kullanılması için ileri çalışmalara gerek olduğu kanısındayız. 87 KAYNAKLAR: 1- Frieden TR, Sterling TR, Munsiff SS, Watt CJ, Dye C. Tuberculosis. Lancet. 2003 Sep 13;362(9387):887–99. 2- Jasmer RM, Nahid P, Hopewell PC. Clinical practice. Latent tuberculosis infection. N Engl J Med. 2002 Dec 5;347(23):1860–6. 3- Özkara Ş, Aktaş Z, Özkan S, Ecevit H. Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığı, Türkiye’de Tüberküloz Kontrolü İçin Başvuru Kitabı. Ankara. Rekmay Ltd. Şti. 2003. 4- Kiter G, Uçan ES. Tüberkülozdan korunma. Toraks dergisi 2001;2:85–90. 5- Soysal F, Aras G, Kadakal F,Bayram N,Çetinkaya E,Çıkrıkçıoğlu U. PPD, BCG ve kemoprofılaksi konusunda hekimlerimizin görüşleri. Solunum 2001;3:27–30. 88 6- American Thoracic Society, Centers for Disease Control and Prevantion, Targeted tuberculin testing and treatment of latent tuberculosis infection. Am j Respir crit Care Med 2000;161:221–47. 7- Cohn DL. Treatment of latent tuberculosis infection: renewed opportunity for tuberculosis control. Clin Infect Dis. 2000 Jul;31(1):120–4. 8- International union Against Tuberculosis infection: renewed opportunity for tuberculosis control. Clin Infect Dis 2000;31: 20–4. xis. Efficacy of various durations of isoniazid preventive therapy for tuberculosis: five years of follow-up in the IUAT trial. Bull WHO 1982;60:555–64. 9- Burman WJ, Reves RR. Hepatotoxicity from rifampin plus pyrazinamide: lessons for policymakers and messages for care providers. Am J Respir Crit Care Med. 2001 Oct 1;164 (7):1112–3. 10- Horsburgh CR Jr. Priorities for the treatment of latent tuberculosis infection in the United States. N Engl J Med. 2004 May 13;350(20):2060–7. 11- Kılıçarslan Z. Dünyada ve Türkiye’de tüberküloz epidemiyolojisi ve kontrolü. İnfeksiyon hastalıkları serisi, 2001. 4(1) p: 5–13. 12- Webb, GB: Tuberculosis: Clio Medica, Paul. B. Hoeber, New York; 1936. 13- Koch R. Die aetiologie der tuberculose. Berl Klinische Wochenschr 1882;19.221–230. 14- Gubrin C. The history of BCG. In: Rosenthal S, ed. BCG Vaccination against tuberculosis. Boston: Little, Brown. 1957: 48–53. 15- 21. yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu Kitabı. Samsun. 2003: 74–75. 89 16- Koçoğlu F. Verem Savaşı. Ankara: Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Halk Sağlığı Anabilim Dalı Yayını. 1986; 36–86. 17- Özcan C. Türkiye’de Tüberkülozun Bugünkü Durumu. Ankara. Türkiye’de Sağlık ve Tedavi Vakfı, Semih Ofset Matbaacılık Ltd. Şti. 1988; 5–10. 18- Özkara Ş, Aktaş Z, Özkan S, Ecevit H. Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığı, Türkiye’de Tüberküloz Kontrolü İçin Başvuru Kitabı. Ankara. Rekmay Ltd. Şti. 2003. 19- 21. yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu Kitabı. Samsun. 2003: 74–75. 20- Global TB Control. WHO Report 2002: 1–4, 161–6. 21- Arseven O. Akciğer Hastalıkları: İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Temel ve Klinik Bilimler Ders Kitapları. Nobel Tıp Kitapevleri Ltd. Şti. 2002; 285–304. 22- Iseman MD. Klinisyenler İçin Tüberküloz Klavuzu. Çeviren: Ş. Özkara. Nobel Tıp Kitapevleri Ltd. Şti. 2002: Bölüm 2: 21–49. 23- Parker T, Deverden B (ed):Topley Wilson’s principles of Bacteriology, Virology and İmmunity. Vol II. 1990: 74–97. 24- Ernest Jawetz, Joseph L. Melnick, Edward A. Adelberg (ed): Mycobacteria, Medical Microbiology, Lange 1991: 272–80. 25- Barış İ. Son bilgiler Işığında Tüberküloz. İnfeksiyon Bülteni, 1996; 23–9. 26- 21. yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu Kitabı. Samsun. 2003: 414. 90 27- Kocabaş A (ed). Tüberküloz kliniği ve kontrolü. Çukurova Üniversitesi, 1991. 28- Parker T, Deverden B (ed):Topley Wilson’s principles of Bacteriology, Virology and İmmunity. Vol II. 1990: 74–97. 29- Bilgehan H. Klinik Mikrobiyoloji, Özel Bakteriyoloji ve Bakteri Enfeksiyonları, 1986: 407–37. 30- Zahra Tossi, Jerrold J, Elner R; Mycobacterium Tuberculosis and Other Mycobacteria. In Gerold L. Mandell (ed): Principles and Practice of İnfectious Disease. Churchill- Livingstone; 1995 p: 2229. 31- Kocabaş A. Akciğer Tüberkülozu. İliçin G, Ünal S, Biberoğlu K, Akalın S (ed): Temel İç Hastalıkları, Güneş Kitabevi, 1996: 456–76. 32-Tahaoğlu K. Toraks derneği Tüberküloz Çalışma Grubu, Tüberküloz Ders Notları, 1998:13–9. 33- Çöplü N. Tüberkülozda Mikrobiyolojik Tanı. Enfeksiyon Hastalıkları serisi 4 (1): 30–40. 34- Schlossberg D. Tüberküloz. Bilimsel ve Teknik Yazı Çeviri Vakfı 1995: 39–47. 35- Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığı: Tüberküloz hastalarının tanı, tedavi, izlenmesi, 1998. 36- Luis M de La Maza, Marie T. Pezzlo, Ellen Jo Baron. Color atlas of diagnostic microbiyology. Mossby-Yearbook. 1997; 11:95. 91 37- ATS: Diagnostic Standarts and classification of Tuberculosis and other Mycobacterial diseases. Am Rev Resp Dis, 1981; 123: 343- 58. 38- Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger CP, Winn CW (ed): Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiyology 5th ed, New York: Lippincott Philadelphia, 1997: 893–952. 39- Khomenko AG, Bayensky AV, Chernousova LN, Kulikovskaya NV, Demianenko NV, Litvinov VI. Serodiagnosis of tuberculosis: detection of mycobacterial antibodies and antigens. Tuber Lung Dis. 1996 Dec;77(6):510–5. 40- Heifets LB, Good RC, Current laboratory methods for diagnosis of tuberculosis. In Bloom RB(ed): Tuberculosis: Pathogensesi, protection, control. Washington DC, ASM press, 1994:85–110. 41- Ellner PD, Kiehn TE, Cammarata R, Hosmer M. Rapid detection and identification of pathogenic mycobacteria by combiningradiometric and nucleic acid probe methods.J Clin Microbiol. 1988 Jul;26(7):1349–52. 42- Özdemir Ö. Tüberküloz tanı yöntemleri. Türkiye Klinikleri Tıp bilimleri dergisi, Tüberküloz özel sayısı, 1994: 420–4. 43- 21. yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu Kitabı. Samsun. 2003: 411-427. 44- Charpin D, Herbault H. Value of ELISA using A60 antigen in diagnosis of active pulmonary tuberculosis. Am Rev Resp Dis, 1990, 142: 380–4. 45- Durmaz R. Uygulamalı Moleküler Mikrobiyoloji. Nobel Tıp Kitapevleri 2001, 15–35. 92 46- Imboden P, Cole S, Bodmer T, Telenti A. Detection of rifampin resistance mutation in Mycobacterium tuberculosis and M. Leprae. In: Persing DH, Smith TF, Tenover FC (eds): Diagnostic molecular Microbiology: Principles and Applications. ASM Press, Washington DC 1993: 519–26. 47- Corper HJ. Founders of our knowledge of tuberculosis. Hygeia 1929; October- November: 1–13. 48- Riley R, Mills C, O’ Grady F, Sultan LU, Wittstadt F, Shivpuri DN. Infectiousness of air from tuberculosis ward: ultravioket irradiation of infected air- comperative infectiousness of different patients. Am Rev Respir Dis 1962; 85: 511–525. 49- Duguid J. The numbers and sites of origin of the droplets expelled during respiratory activities. Edinburgh Med J 1945; 52: 385. 50- 21. yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu Kitabı. Samsun. 2003:50- 58. 51- Valway SE, Sanchez MPC, Shinnick TF, et al. An outbreak involving extensive transmission of a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis. N Engl J Med 1998; 338: 633- 639. 52- Dannenberg Am. Delayed- type hypersensitivity and cell- mediated immunity in the pathogenesis of tuberculosis. Immunol Today 1991; 12: 228- 233. 53- Iseman MD. Klinisyenler İçin Tüberküloz Klavuzu. Çeviren: Ş. Özkara. Nobel Tıp Kitapevleri Ltd. Şti. 2002: Bölüm 4: 63–96. 54- 21. yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu Kitabı. Samsun. 2003: 48–58. 93 55- Li H, Ulstrup JC, Jonassen TO, Melby K, Nagai S, Harboe M. Evidence for absence of the MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG. Infect Immun. 1993 May;61 (5):1730–4. 56- Mustafa AS, Amoudy HA, Wiker HG, Abal AT, Ravn P, Oftung F, Andersen P. Comparison of antigen-specific T-cell responses of tuberculosis patients using complex or single antigens of Mycobacterium tuberculosis. Scand J Immunol. 1998 Nov;48(5):535–43. 57- Wilcke JT, Jensen BN, Ravn P, Andersen AB, Haslov K. Clinical evaluation of MPT–64 and MPT–59, two proteins secreted from Mycobacterium tuberculosis, for skin test reagents. Tuber Lung Dis. 1996 Jun;77(3):250–6. 58- Nakamura RM, Velmonte MA, Kawajiri K, Ang CF, Frias RA, Mendoza MT, Montoya JC, Honda I, Haga S, Toida I. MPB64 mycobacterial antigen: a new skin-test reagent through patch method for rapid diagnosis of active tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 1998 Jul;2(7): 541–6. 59- Andersen P, Andersen AB, Sorensen AL, Nagai S. Recall of long-lived immunity to Mycobacterium tuberculosis infection in mice. J Immunol. 1995 Apr 1;154(7):3359–72. 60- Sorensen AL, Nagai S, Houen G, Andersen P, Andersen AB. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 1995 May;63(5):1710–7. 61- Harboe M, Oettinger T, Wiker HG, Rosenkrands I, Andersen P. Evidence for occurrence of the ESAT–6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG. Infect Immun. 1996 Jan;64(1):16–22. 62- Non-tuberculosis mycobacteria. 1995–1996 EPINEWS 1997; Week 50, http//www.ssi.dk/dk/epinyt/1997/uge50.html 94 63- Mahairas GG, Sabo PJ, Hickey MJ, Singh DC, Stover CK. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. J Bacteriol. 1996 Mar;178(5):1274–82. 64- Skjot RL, Oettinger T, Rosenkrands I, Ravn P, Brock I, Jacobsen S, Andersen P. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT–6 family as immunodominant T-cell antigens. Infect Immun. 2000 Jan;68(1):214–20. 65- Brosch R, Gordon SV, Marmiesse M, Brodin P, Buchrieser C, Eiglmeier K,Garnier T, Gutierrez C, Hewinson G, Kremer K, Parsons LM, Pym AS, Samper S, van Soolingen D, Cole ST. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Mar 19;99(6):3684–9. 66- Lewis KN, Liao R, Guinn KM, Hickey MJ, Smith S, Behr MA, Sherman DR. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation. J Infect Dis. 2003 Jan 1;187(1):117–23. 67- Pym AS, Brodin P, Brosch R, Huerre M, Cole ST. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti. Mol Microbiol. 2002 Nov;46(3):709–17. 68- Lalvani A, Pathan AA, McShane H, Wilkinson RJ, Latif M, Conlon CP, Pasvol G, Hill AV. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigenspecific T cells. Am J Respir Crit Care Med. 2001 Mar;163(4):824–8. 69- Pollock JM, Andersen P. The potential of the ESAT–6 antigen secreted by virulent mycobacteria for specific diagnosis of tuberculosis. J Infect Dis 1997;175:1251–54. 95 70- Arend SM, Andersen P, van Meijgaarden KE, Skjot RL, Subronto YW, van Dissel JT, Ottenhoff TH. Detection of active tuberculosis infection by T cell responses to early-secreted antigenic target 6-kDa protein and culture filtrate protein 10. J Infect Dis. 2000 May;181(5): 1850–4. 71- Mustafa AS, Oftung F, Amoudy HA, Madi NM, Abal AT, Shaban F, Rosen Krands I,Andersen P. Multiple epitopes from the Mycobacterium tuberculosis ESAT–6 antigen are recognized by antigen-specific human T cell lines. Clin Infect Dis. 2000 Jun;30 Suppl 3:S201–5. 72- Ravn P, Demissie A, Eguale T, Wondwosson H, Lein D, Amoudy HA, Mustafa AS, Jensen AK, Holm A, Rosenkrands I, Oftung F, Olobo J, von Reyn F, Andersen P. Human T cell responses to the ESAT–6 antigen from Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 1999 Mar;179(3):637–45. 73- Smith SM, Klein MR, Malin AS, Sillah J, Huygen K, Andersen P, McAdam KP, Dockrell HM. Human CD8(+) T cells specific for Mycobacterium tuberculosis secreted antigens in tuberculosis patients and healthy BCG-vaccinated controls in The Gambia. Infect Immun. 2000 Dec;68(12):7144–8. 74- Ulrichs T, Munk ME, Mollenkopf H, Behr-Perst S, Colangeli R, Gennaro ML, Kaufmann SH. Differential T cell responses to Mycobacterium tuberculosis ESAT6 in tuberculosis patients and healthy donors. Eur J Immunol. 1998 Dec;28(12):3949–58. Erratum in: Eur J Immunol 1999 Feb;29(2):725. 75- Özkara Ş, Aktaş Z, Özkan S, Ecevit H. Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığı, Türkiye’de Tüberküloz Kontrolü İçin Başvuru Kitabı. Ankara. Rekmay Ltd. Şti. 2003. 56–57 76- A Joint Statement of the American Thoracic Society (ATS) and the Centers for Disease Control and Prevention(CDC). Targeted tuberculin testing and treatment of latent tuberculosis infection. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161(4 Pt 2): 221–247. 96 77- Holden M, Dubin MR, Diamond PH. Frequency of negative intermediate-strenght tuberculin sensitivity in patients with active tuberculosis. N Engl J Med 1971; 285: 1506– 1509. 78- Nash DK, Douglass JE. A Comparison between positive and negative reactors and an evaluation of 5-TU and 250- TU skin test doses. Chest 1980; 77: 32- 37. 79- WHO tuberculosis Research Office. further studies of geographic variation in naturally acquired tuberculin sensitivity. Bull World Health Organ 1955;22:62–83. 80- Bass JB Jr. The tuberculin test. In: Reichman LB. Hershfield ES. Eds. Tuberculosis. An international approach. New York: Marcel Dekker, 1993:144. 81- Rieider HL. Methodological issues in the estimation of the tuberculosis problem from tuberculin surveys. Tubercle and Lung Disease 1995;76:114–21. 82- Centers for Disease Control and Prevention: Guidlines for using the QuantiFERON-TB test for diagnosing latent Mycobacterium tuberculosis infection. MMWR: Morb Mortal Wkly Rep 52:15–18, 2003. 83- XXIII. Ulusal Tüberküloz ve Göğüs Hastalıkları Kongresi Tüberküloz Ve Kontrolü Kongre Kitabı. Malatya. 2003.21–5. 84- Iseman MD. Klinisyenler İçin Tüberküloz Kılavuzu. Çeviren: Ş. Özkara Nobel Tıp Kitapevleri Ltd. Şti. 2002: Bölüm 5: 111–128. 85- Stead W, Senner J, Reddick W, Lofgren J. Racial differences in susceptibility to infection by Mycobacterium tuberculosis: N Engl J Med 1990; 322: 422- 427. 86- Stead W. Genetics and resistance to tuberculosis. Ann Intern Med 1992; 116: 937–941. 97 87- Comstock G. Tuberculosis in twins: a re-analysis of the Prophit Survey. Am rev Respir Dis 1978; 117: 621- 624. 88- American Thoracic Society. Preventive treatment in tuberculosis. A statement by the Commitee on the Therapy. Am Rev Respir Dis 1965; 91: 297- 298. 89- Zorini AO. Recent developments in the chemoprophylaxis of tuberculosis with isoniazid (historical vignette). Cardiopulm Med. 1978. 15 –16. 90- United States Public Health Service. United States Public Health Service tuberculosis prophylaxis trial. Prophylactic effects of isoniazid on primary tuberculosis in children: preliminary report. Am Rev Tuberc 1957; 76: 942. 91- Iseman MD. Klinisyenler İçin Tüberküloz Klavuzu. . Çeviren: Ş. Özkara Nobel Tıp Kitapevleri Ltd. Şti, İstanbul 2002: Bölüm 12.360. 92- Garibaldi RA, Drusin RE, Ferebee SH, Gregg MB. Isoniazid-associated hepatitis. Report of an outbreak. Am Rev Respir Dis. 1972 Sep;106(3):357–65. 93- Centers for Disease Control: Report of the ad hoc committee on isoniazid on liver disease. Am. Rev Respir Dis 1971;104: 254–59. 94- Scharer L, Smith JP. Serum transaminase elevations and other hepatic abnormalities in patients receiving isoniazid. Ann Intern Med. 1969 Dec;71(6):1113–20. 95- Israel HL. Editorial: Isoniazid-associated hepatitis. Reconsideration of the indications for administration of isoniazid. Gastroenterology. 1975 Aug;69(2):539–42. 96- Comstock GW, Edwards PQ. The competing risks of tuberculosis and hepatitis for adult tuberculin reactors. Am Rev Respir Dis. 1975 May;111(5):573–7. 98 97- Taylor WC, Aronson MD, Delbanco TL. Should young adults with a positive tuberculin test take isoniazid? Ann Intern Med. 1981 Jun;94(6):808–13. 98- Rose DN, Schechter CB, Silver AL. The age threshold for isoniazid chemoprophylaxis. A decision analysis for low-risk tuberculin reactors. JAMA. 1986 Nov 21;256(19):2709–13. 99- Tsevat J, Taylor WC, Wong JB, Pauker SG. Isoniazid for the tuberculin reactor: take it or leave it. Am Rev Respir Dis. 1988 Jan;137(1):215–20. 100- Jordan TJ, Lewit EM, Reichman LB. Isoniazid preventive therapy for tuberculosis. Decision analysis consideringethnicity and gender. Am Rev Respir Dis. 1991 Dec;144(6): 1357–60. 101- Özkara Ş, Aktaş Z, Özkan S, Ecevit H. Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığı, Türkiye’de Tüberküloz Kontrolü İçin Başvuru Kitabı. Ankara. Rekmay Ltd. Şti. 2003.58- 59. 102- Comstock GW, Baum C, Snider De Jr. Isoniazid prophylaksis among Alaskan Eskimos: a final report of the Bethel studies. AM Rev Respir Dis 1979;119:827–830. 103- Iseman MD. Klinisyenler İçin Tüberküloz Klavuzu. Çeviren: Ş. Özkara. Nobel Tıp Kitapevleri Ltd. Şti, İstanbul. 2002; Bölüm 12:390. 104- Snider DE Jr. Pyridoxine supplementation during isoniazid therapy. Tubercle 1980;61:191–196. 105- 21. yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu Kitabı. Samsun. 2003: 208-215. 106- Gubrin C. The history of BCG. In: Roesnthal S, ed. BCG vaccination against tuberculosis. Boston: little, Brown, 1957: 48- 53. 99 107- Comstock GW. Field trials of tuberculosis vaccines: how could we have done them better? Control Clin Trials 1994; 15: 247- 276. 108- Townsend J, Aronson J, Saylor R. Tuberculosis control among North American Indians. Am Rev Tuberc 1942; 45: 41- 52. 109- Iseman MD. Klinisyenler İçin Tüberküloz Klavuzu. Çeviren: Ş. Özkara. Nobel Tıp Kitapevleri Ltd. Şti, İstanbul. 2002;Bölüm 13:401–402. 110- Menzies R, Vissandjee B. Effect of Bacillus Calmette- Guerin vaccination on tuberculin reactivity. Am Rev Respir Dis 1992; 145: 621–625. 111- Gocmen A, Kiper N, Ertan U, Kalayci O, Ozcelik U. Is the BCG test of diagnostic value in tuberculosis? Tuber Lung Dis. 1994 Feb;75(1):54–7. 112- Koçoğlu F. Tüberküloz Sorununun Çözümünde Günümüzde Uygulanan Kontrol Yöntemlerinin Etkinliği. In: Kocabaş A. (Ed). Tüberküloz, Kliniği ve Kontrolü. Emel Matbaası, Ankara. 1991: 439- 443. 113- Özkara Ş, Aktaş Z, Özkan S, Ecevit H. Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Verem Savaş Daire Başkanlığı Türkiye’de Tüberküloz Kontrolü İçin Başvuru Kitabı. Ankara. Rekmay Ltd. Şti. 2003:62. 114- Ewer K, Deeks J, Alvarez L, Bryant G, Waller S, Andersen P, Monk P, Lalvani A. Comparison of T-cell-based assay with tuberculin skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosis outbreak. Lancet. 2003 Apr 5;361(9364):1168– 73. 100 115- Lalvani A, Nagvenkar P, Udwadia Z, Pathan AA, Wilkinson KA, Shastri JS, Ewer K, Hill AV, Mehta A, Rodrigues C. Enumeration of T cells specific for RD1-encoded antigens suggests a high prevalence of latent Mycobacterium tuberculosis infection in healthy urban Indians. J Infect Dis. 2001 Feb 1;183(3):469–77. 116- Demissie A, Ravn P, Olobo J, Doherty TM, Eguale T, Geletu M, Hailu W,Andersen P, Britton S. T-cell recognition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate fractions in tuberculosis patients and their household contacts. Infect Immun. 1999 Nov;67(11):5967–71. 117- Hill PC, Brookes RH, Fox A, Fielding K, Jeffries DJ, Jackson-Sillah D, Lugos MD, Owiafe PK, Donkor SA, Hammond AS, Otu JK, Corrah T, Adegbola RA, McAdam KP. Large-scale evaluation of enzyme-linked immunospot assay and skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection against a gradient of exposure in The Gambia. Clin Infect Dis. 2004 Apr 1;38(7):966–73. 118- Ferebee SH, Mount FW. Tuberculosis morbidityn a contolled trial of the prophylactic use of isoniazid among household contacts. Am Rev Resp Dis 1962;85:940–510. 119- Wang PD, Lin RS. Tuberculosis transmission in the family. J Infect Dis 2000;41:249– 251. 120- Kolsuz M, Küçükkebapçı C, Demircan N, Uçgun İ, Metintaş M, Erginel S. Akciğer tüberkülozu olgularının yakın temaslılarının 6 aylık izlem sonuçları. Toraks Dergisi 2003;4:127–32. 121- Kolsuz M, Uçgun İ, Metintaş M ve ark. Eskişehir Deliklitaş Verem Savaş Dispanserinde akciğer tüberkülozu ile temas eden kişilerin özellikleri. Toraks Derneği 4. Yıllık Kongresi 2001;97–110. 101 122- Sarımurat N, Küçük G, KılıçarslanZ. 1998–99 yıllarında tedaviye alınan yayma (+) akciğer tüberkülozu olgularında temas edenlerin değerlendirilmesi Toraks Derneği 4. Yıllık Kongresi 2001;97–110. 123- Ellnerr JJ. Review: the immune response in human tuberculosis–implications for tuberculosis control. J Infect Dis 1997;176:1351–9. 124- Doherty TM, Demissie A, Olobo J, Wolday D, Britton S, Eguale T, Ravn P, Andersen P. Immune responses to the Mycobacterium tuberculosis-specific antigen ESAT–6 signal subclinical infection among contacts of tuberculosis patients. J Clin Microbiol. 2002 Feb;40 (2):704–6. 125- Cardoso FL, Antas PR, Milagres AS, Geluk A, Franken KL, Oliveira EB,Teixeira HC, Nogueira SA, Sarno EN, Klatser P, Ottenhoff TH, Sampaio EP. T-cell responses to the Mycobacterium tuberculosis-specific antigen ESAT–6 in Brazilian tuberculosis patients. Infect Immun. 2002 Dec;70(12):6707–14. 126- Pathan AA, Wilkinson KA, Klenerman P, McShane H, Davidson RN, Pasvol G, Hill AV, Lalvani A. Direct ex vivo analysis of antigen-specific IFN-gamma-secreting CD4 T cells in Mycobacterium tuberculosis-infected individuals: associations with clinical disease state and effect of treatment. J Immunol. 2001 Nov 1;167(9):5217–25. 127- Launois P, DeLeys R, Niang MN, Drowart A, Andrien M, Dierckx P, Cartel JL, Sarthou JL, Van Vooren JP, Huygen K. T-cell-epitope mapping of the major secreted mycobacterial antigen Ag85A in tuberculosis and leprosy. Infect Immun. 1994 Sep;62(9):3679–87. 128- Vekemans J, Lienhardt C, Sillah JS, Wheeler JG, Lahai GP, Doherty MT, Corrah T, Andersen P, McAdam KP, Marchant A. Tuberculosis contacts but not patients have higher gamma interferon responses to ESAT–6 than do community controls in The Gambia. Infect Immun. 2001 Oct;69(10):6554–7. 102 129- Migliori GB, Raviglione MC, Schaberg T, Davies PD, Zellweger JP, Grzemska M, Mihaescu T, Clancy L, Casali L. Tuberculosis management in Europe. Task Force of the European Respiratory Society (ERS), the World Health Organisation (WHO) and the International Union against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD) Europe Region. Eur Respir J. 1999 Oct;14(4):978–92. 130- O’Brien RJ, Preventive therapy of tuberculosis. In: Porter JDH, McAdam KPWJ, eds. Tuberculosis: back to the future. John Wiley Sons Ltd. United Kingdom, 1994. 131- Carrara S, Vincenti D, Petrosillo N, Amicosante M, Girardi E, Goletti D. Use of a T cellbased assay for monitoring efficacy of antituberculosis therapy. Clin Infect Dis. 2004 Mar 1;38(5):754–6. 132- Andersen AB, Brennen P. Proteins and antigens of Mycobacterium tuberculosis. In Bloom B, eds. Tuberculosis. Washington, DC: ASM Press,1994; 307–32. 133- Nicol MP, Pienaar D, Wood K, Eley B, Wilkinson RJ, Henderson H, Smith L, Samodien S, Beatty D. Enzyme-linked immunospot assay responses to early secretory antigenic target 6, culture filtrate protein 10, and purified protein derivative among children with tuberculosis: implications for diagnosis and monitoring of therapy. Clin Infect Dis. 2005 May 1;40(9): 1301–8. 134- Hill PC, Fox A, Jeffries DJ, Jackson-Sillah D, Lugos MD, Owiafe PK, Donkor SA, Hammond AS, Corrah T, Adegbola RA, McAdam KP, Brookes RH. Quantitative T cell assay reflects infectious load of Mycobacterium tuberculosis in an endemic case contact model. Clin Infect Dis. 2005 Jan 15;40(2):273–8. 103
